專利名稱：工程改造的肉毒桿菌神經(jīng)毒素的制作方法
工程改造的肉毒桿菌神經(jīng)毒素相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考本申請(qǐng)要求2009年4月14日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/169，031的優(yōu)先權(quán)， 其通過(guò)弓I用全文納入本文用于所有目的。關(guān)于聯(lián)邦資助研究或開(kāi)發(fā)的聲明本發(fā)明在美國(guó)政府支持下由以下機(jī)構(gòu)資助進(jìn)行NIH基金1-TO4-AI-057153。美國(guó)政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
肉毒梭菌(Clostridium botulinum)產(chǎn)生七種不同神經(jīng)毒素(BoNT)，其在血清學(xué)上通過(guò)缺少抗血清的血清交叉中和來(lái)區(qū)分。已知BoNT是對(duì)人類最有效的毒素，且是肉毒中毒病的病原體(1)。BoNT發(fā)揮作用是通過(guò)在神經(jīng)肌肉連接處抑制所述神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的釋放，引起松弛性癱瘓狀態(tài)。BoNT通過(guò)靶向神經(jīng)元并切割神經(jīng)元特異的SNARE蛋白而引起神經(jīng)元特異的松弛性癱瘓。SNARE蛋白(可溶性NSF附著蛋白受體)是一個(gè)大的蛋白超家族。SNARE蛋白的主要功能是介導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)分子胞外分泌到突觸后連接。SNARE較小、含量豐富且是囊泡和質(zhì)膜結(jié)合蛋白。BoNT是含二硫鍵連接的IOOkDa重鏈和50kDa輕鏈的150kDa多肽鏈。BoNT分成 3種功能結(jié)構(gòu)域N末端鋅金屬蛋白酶輕鏈(LC)、轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域(HCT)、C末端受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(HCR) (1，2)。BoNT的毒性作用(神經(jīng)中毒)通過(guò)三種關(guān)鍵事件的相互作用完成。一，受體與膽堿神經(jīng)細(xì)胞在所述神經(jīng)細(xì)胞膜上特異結(jié)合需要所述重鏈的羧基部分。結(jié)合后，所述 BoNT的其他部分將更小的催化結(jié)構(gòu)域移入所述細(xì)胞，其中所述催化結(jié)構(gòu)域結(jié)合并切割神經(jīng)元SNARE蛋白，“致毒”所述神經(jīng)細(xì)胞，使其不能“發(fā)作”或發(fā)送信號(hào)?！按呋Y(jié)構(gòu)域”指觸發(fā)所述底物切割的所述分子的一部分。所述毒素通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用內(nèi)化入內(nèi)涵體，且在突觸囊泡和所述質(zhì)膜的融和后，所述毒素結(jié)合突觸囊泡相關(guān)蛋白的閾限結(jié)構(gòu)域(liminal domains) (3-5)。簡(jiǎn)言之，BoNT內(nèi)化入內(nèi)涵體中且酸化反應(yīng)后，所述LC轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)中，SNARE 蛋白在其內(nèi)被切割(1，2)。哺乳動(dòng)物神經(jīng)元胞外分泌由所述囊泡SNARE、VAMP2和所述質(zhì)膜以及SNARE、SNAP 25和突觸融合蛋白Ia的蛋白復(fù)合體的形成來(lái)推動(dòng)(6)。共有七種BoNT血清型(稱為A-G)， 其切割三種SNARE蛋白之一的特異殘基血清型B、D、F和G切割VAMP-2，血清型A和E切割SNAP 25，和血清型C切割SNAP 25和突觸融合蛋白Ia(I)。因此，神經(jīng)元特異性是基于 BoNT結(jié)合神經(jīng)元和切割所述SNARE蛋白的神經(jīng)元同種型。例如，BoNT/A切割人SNAP25但不切割所述人非神經(jīng)原同種型SNAP 23(7,8)。所述非神經(jīng)元SNARE同種型涉及不同的細(xì)胞過(guò)程，包括細(xì)胞生長(zhǎng)中的融合反應(yīng)、膜修復(fù)、胞質(zhì)分裂和突觸傳遞。BoNT中毒后，用新神經(jīng)替換受毒素影響神經(jīng)的肌肉功能的可逆性質(zhì)(10，11)將 BoNT從致死的試劑變?yōu)樯窠?jīng)肌肉病癥的新治療方法。早在1989年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)BoNT/A用于治療斜視、臉痙攣、偏側(cè)面肌痙攣以及之后用于宮頸肌張力障礙、美容用途、眉間皺紋和腋窩多汗(1 。BoNT/A在肌張力障礙和其他疾病中的效果與不隨意骨骼肌活性有關(guān)，伴隨令人滿意的安全概況，并促進(jìn)在各種分泌物和疼痛和美容病癥中的經(jīng)驗(yàn)性/標(biāo)示外應(yīng)用(13)。BoNT的臨床應(yīng)用限于靶向影響神經(jīng)肌肉活性的傷害(12，13)。BoNT結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的闡明可以設(shè)計(jì)使BoNT重靶向獨(dú)特神經(jīng)元和非神經(jīng)元細(xì)胞的新療法。用神經(jīng)生長(zhǎng)因子、雞冠刺桐(Erythrina cristagalli)的凝集素、或表皮生長(zhǎng)因子替代BoNT HCR結(jié)構(gòu)域可使BoNT/A重靶向神經(jīng)元或非神經(jīng)元細(xì)胞如疼痛傳入和氣道上皮細(xì)胞(14-16)。然而，通過(guò)BoNT進(jìn)行神經(jīng)元特異SNARE蛋白的選擇性切割限制了這些非神經(jīng)元系統(tǒng)的新療法的開(kāi)發(fā)。開(kāi)發(fā)新療法的先決條件需要所述BoNT催化活性重靶向非神經(jīng)元SNARE同種型。因此，需要切割非神經(jīng)元SNARE蛋白的工程改造的BoNT和其使用方法。發(fā)明概述在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供改良的BoNT/E催化結(jié)構(gòu)域，其中輕鏈殘基224、或?qū)?yīng)殘基2M的殘基被改變。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述殘基2M改變?yōu)樘於彼峄蚬劝彼帷?所述的改良催化結(jié)構(gòu)域切割SNAP23但不切割SNAP^或SNAP47。在另一實(shí)施方式中，所述改良催化結(jié)構(gòu)域還包含用于蛋白質(zhì)遞送系統(tǒng)的靶向分子。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供含改良BoNT/E催化結(jié)構(gòu)域的工程肉毒桿菌神經(jīng)毒素E或肉毒桿菌神經(jīng)毒素輕鏈或肉毒桿菌毒素催化結(jié)構(gòu)域，其中輕鏈殘基2M被改變。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供治療需要肉毒桿菌毒素療法的對(duì)象的方法，所述方法包括將治療有效量的改良BoNT/E催化結(jié)構(gòu)域給予對(duì)象的步驟，其中輕鏈殘基2M被改變。所述需要肉毒桿菌毒素療法的對(duì)象可能患有但不限于哮喘、CF、慢性阻塞性肺病、胃酸流出病和炎癥、有細(xì)胞因子成分的免疫失調(diào)或有細(xì)胞因子成分的癌癥。盡管本發(fā)明公開(kāi)了多個(gè)實(shí)施方式，但是通過(guò)以下的詳述，本發(fā)明的其它實(shí)施方式對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。顯然，可以在不背離本發(fā)明精神和范圍的前提下，對(duì)本發(fā)明各個(gè)方面進(jìn)行修改。因此，詳細(xì)說(shuō)明在其本質(zhì)上應(yīng)當(dāng)視作是說(shuō)明性的而不是限制性的。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1.人SNAP23的K185有助于BoNT/E的底物識(shí)別。(a) LC/E的底物識(shí)別。SNAP25 中的兩種亞位點(diǎn)有助于底物結(jié)合“B”(Km)和催化15”(^，其中？3、？2、和卩1'殘基有助于LC/E的識(shí)別。(b)人SNAP25 (SN25)和人SNAP23 (SN23)的序列比對(duì)。(c)(上圖) LC/E SNAP25的模型復(fù)合物結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)LC/E對(duì)SNAP25的P位點(diǎn)殘基的識(shí)別。(下圖)LC/ E (K224D) -SNAP23的模型復(fù)合物結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)LC/E (K224D)對(duì)SNAP23的P位點(diǎn)殘基的識(shí)別。使用 LC/E晶體結(jié)構(gòu)(PDB:3d3x)通過(guò)SWISS-MODEL生成模型，并用PyMol生成圖像。圖2.用 LC/E (K224D)切割 SNAP23。(a) 5 μ m SNAP23 與指示量的 LC/E (K224D) 一起孵育并進(jìn)行SDS-PAGE (染色凝膠在插入物中顯示，SNAP23 (152-211)稱為(SN23 (152-211)) 且所述切割產(chǎn)物SNAP23 (152-186)標(biāo)為*。用密度分析確定％ SNAP23切割。(b)LC/E切割 SNAP25和LC/E (K224D)切割SNAP23的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。圖 3. LC/E (K224D)切割 SNAP23 的位點(diǎn)(a) 5 μ m SNAP23 與 2 μ m LC/E (K224D)孵育并進(jìn)行MALDI-T0F質(zhì)譜。y軸的強(qiáng)度(100%)設(shè)為觀12. 5的條帶且χ軸代表荷質(zhì)比單位m/ ζ. (b)SNAP23 (I187D)與指示量的LC/E (K224D) —起孵育并進(jìn)行SDS-PAGE?？捡R斯藍(lán)染色凝膠顯示LC/E (K224D和SNAP23 (I187D)的遷移(在左側(cè)指示)。
圖4. SNAP25同種型上的LC/E (K224D)和Wt_LC/E的序列比對(duì)和底物特異性。(a) SNAP23a, b、SNAP25a, b、SNAP29 和 SNAP47 (ClustaIW2)在對(duì)應(yīng) SNARE 蛋白的區(qū)域的比對(duì)， 所述SNARE蛋白與LC/E的結(jié)合區(qū)域和激活位點(diǎn)區(qū)域相互作用。指示SNAP25同種型之間的保守殘基(*)和相似殘基(，.)。指示SNAP25的LC/E切割位點(diǎn)(箭頭)和P位點(diǎn)殘基。 SNAP25的指示同種型的LC/E (K224D) (b)和Wt_LC/E(c)的線性速率分析。5ym SNAP25同種型與指示量的LC 一起孵育、進(jìn)行SDS-PAGE并用考馬斯藍(lán)染色凝膠。用密度分析確定SNAP25 同種型切割量。圖5. TGF- α刺激的海拉(HeLa)細(xì)胞中LC/E (K224D)切割SNAP23并抑制粘蛋白和 IL-8分泌。㈧用GFP-LC/E (K224D)或GFP_Wt_LC/E轉(zhuǎn)染海拉細(xì)胞。M小時(shí)后，制備細(xì)胞裂解物并用SDS-PAGE分離，使用抗SNAP-23小鼠單克隆抗體用western印跡3檢測(cè)SNAP23的切割。(B，C)。用編碼GFP-LC/E(K224D)或GFP-Wt-LC/E的DNA轉(zhuǎn)染海拉細(xì)胞。24小時(shí)后， 用無(wú)血清MEM培養(yǎng)基清洗細(xì)胞兩次且通過(guò)添加補(bǔ)充有20ng/ml TNF- α的無(wú)血清MEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)分泌。36小時(shí)后，收集上清液并使用ELISA形式測(cè)量粘蛋白和IL-8分泌。對(duì)照細(xì)胞分泌的粘蛋白和IL-8含量調(diào)整為1. 0并用作TNF-α處理細(xì)胞的參比。圖6. TGF- α刺激的海拉細(xì)胞中重組LC/E (K224D)切割SNAP23并抑制粘蛋白和 IL-8分泌。用地高辛處理海拉細(xì)胞，然后與His-LC/E (K224D)或His-Wt-LC/E (3-Xflag標(biāo)記蛋白)一起孵育。過(guò)夜孵育后，清洗細(xì)胞，然后用補(bǔ)充有20ng/mlTNF-a的無(wú)血清MEM培養(yǎng)基孵育36小時(shí)，然后收集細(xì)胞上清并制備細(xì)胞裂解物。(a)細(xì)胞裂解物進(jìn)行SDS-PAGE并用 Western印跡檢測(cè)LC/E表達(dá)和SNAP23切割，分別使用α -3Xflag抗體和α -SNAP23抗體； *指示所述SNAP23切割產(chǎn)物的遷移。用ELISA檢測(cè)培養(yǎng)物上清的IL-8(b)和粘蛋白(c)分泌，用1. 0作為重組LC/E處理細(xì)胞的參比。發(fā)明詳述I.概述在本說(shuō)明書和權(quán)利要求書中，術(shù)語(yǔ)“包括”和“包含”是開(kāi)放式的術(shù)語(yǔ)，應(yīng)認(rèn)為其表
示“包括，但不限于......”。這些術(shù)語(yǔ)涵蓋了限定性更強(qiáng)的術(shù)語(yǔ)“主要由......組成”和
“由......組成”。本文和所附權(quán)利要求書所用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“所述”包括復(fù)數(shù)含義， 除非上下文另有明確說(shuō)明。同樣，術(shù)語(yǔ)“一個(gè)”(或“一種”)、“一種或多種”和“至少一種” 在本文中可以互換使用。還應(yīng)當(dāng)注意，術(shù)語(yǔ)“包括”、“包含”、“特征在于”以及“含有”可以互換使用。除非另有說(shuō)明，否則本文所用的所有科技術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的通常含義相同。本文具體描述的所有出版物和專利都通過(guò)引用全文納入本文并用于所有目的，包括描述和公開(kāi)所述出版物報(bào)道的化學(xué)物質(zhì)、設(shè)備、統(tǒng)計(jì)分析和方法，其可與本發(fā)明關(guān)聯(lián)使用。本說(shuō)明書引用的所有參考文獻(xiàn)都應(yīng)看作對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)水平的指示。本文中所有內(nèi)容均不應(yīng)解釋為承認(rèn)本發(fā)明不具有先于在先發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容的權(quán)利。II.本發(fā)明本發(fā)明提供切割非神經(jīng)元SNARE蛋白的新型工程改造的肉毒桿菌神經(jīng)毒素 (BoNT)和其使用方法。由于毒性對(duì)神經(jīng)元的趨向性和神經(jīng)元SNARE蛋白的特異切割，所以BoNT對(duì)各種神經(jīng)病癥如斜視、臉痙攣、偏側(cè)面肌痙攣和宮頸肌張力障礙是有效的治療方法。改良BoNT以結(jié)合非神經(jīng)元細(xì)胞需要使BoNT的催化劑活性重靶向非神經(jīng)元SNARE同種型以提供有效的非神經(jīng)元治療。在此，通過(guò)工程改造催化衍生物切割所述非神經(jīng)元SNARE蛋白SNAP23，將其作為治療非神經(jīng)元人分泌疾病新方法的平臺(tái)，我們擴(kuò)大了 BoNT/E的底物特異性?！胺巧窠?jīng)元人分泌疾病”指例如，過(guò)度的氣道粘液分泌、粘液分泌過(guò)多的疾病或病癥可導(dǎo)致粘液積累，其與人臨床病癥如哮喘和慢性阻塞性肺病相關(guān)聯(lián)，其中粘液積累造成呼吸疾病。具體地，我們首次報(bào)道BoNT/E衍生物的工程改造，其切割一種非神經(jīng)元SNARE蛋白SNAP23。SNAP23介導(dǎo)囊泡-質(zhì)膜融合過(guò)程，包括氣道粘膜、抗體、胰島素、胃酸和離子的分泌。本發(fā)明的突變BoNT/E輕鏈LC/E(K224D)顯示出擴(kuò)大的底物特異性以切割SNAP23和所述天然底物SNAP25，但沒(méi)有顯示出對(duì)SNAP^或SNAP47的特異性且也不對(duì)其切割。將蛋白直接遞送到培養(yǎng)的人上皮細(xì)胞中后，LC/E(K2MD)切割抑制粘蛋白和IL-8分泌的內(nèi)源性 SNAP23。這些研究首次顯示了遺傳改良的BoNT靶向非神經(jīng)元SNARE蛋白的可行性，其用于治療人過(guò)度分泌疾病如哮喘和慢性阻塞性肺病的新方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明制備工程改造的肉毒桿菌神經(jīng)毒素E的催化結(jié)構(gòu)域， 其可特異切割SNAP23。所述毒素優(yōu)選切割SNAP25但不切割SNAP^或SNAP47。LC/E (K224D) 可切割SNAP25和SNAP23，但約10倍低于Wt_LC/E切割SNAP25。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明中改良的肉毒桿菌神經(jīng)毒素E在輕鏈殘基2M或?qū)?yīng)殘基224的殘基上有突變?！皻埢?24”表示處于SEQ ID NO 7的2 編號(hào)位置的賴氨酸。SEQ ID NO :7是沒(méi)有第一個(gè)甲硫氨酸殘基的DNA序列SEQ ID NO :1的蛋白轉(zhuǎn)換?！皩?duì)應(yīng)殘基224的殘基”表示位于SEQ ID NO :7的殘基210-240的基序內(nèi)的賴氨酸。具體地， 我們指殘基MHELIHSLHGLYGAKGITTKYTITQKQNPLI (SEQ ID NO 8)內(nèi)突出顯示的賴氨酸。其他E型肉毒桿菌亞型具有一樣的對(duì)應(yīng)殘基和基序，盡管亞型間的編號(hào)可能不同。然而，所述基序殘基將有至少90%對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 8的基序?？稍贕eneBank上找到登錄號(hào)為)(62089的肉毒桿菌毒素E亞型博魯格株(Beluga) 輕鏈的示例序列(SEQ ID NO :1)。我們期望其他亞型的血清型E可用作可切割SNAP23的工程改造LC的模板?？捎萌绫景l(fā)明所公開(kāi)的相同方法改良任何肉毒桿菌毒素E亞型的編號(hào)2 殘基。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明制備在輕鏈殘基2M上具有突變的改良肉毒桿菌毒素E。本發(fā)明的另一實(shí)施方式制備在輕鏈殘基2M上具有突變的肉毒桿菌神經(jīng)毒素E輕鏈。本發(fā)明的另一實(shí)施方式制備在輕鏈殘基2M上具有突變的肉毒桿菌神經(jīng)毒素催化結(jié)構(gòu)域(殘基1-400)。本發(fā)明的另一實(shí)施方式是所述催化結(jié)構(gòu)域的截短片段，至少包括殘基 1-390，其包含改良的殘基224。“改良的催化結(jié)構(gòu)域”包括具有殘基2M修飾的所有形式 (包括人源形式)的L/C BoNT催化結(jié)構(gòu)域。另一優(yōu)選實(shí)施方式是突變的肉毒桿菌神經(jīng)毒素E輕鏈或如下所述融合其他肽的改良催化結(jié)構(gòu)域，其用于合適的治療方法。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明是編碼本文所述工程改造的肉毒桿菌神經(jīng)毒素或所述改良的催化結(jié)構(gòu)域的DNA序列?？稍贕eneBank 上找到登錄號(hào)為 CR457212 (SEQ ID NO :2)、NM_130811 (SEQ ID NO:3)、CR456582(SEQ ID NO :4)和 BC011145 (SEQ ID. NO :5)的序列 SNAP23、SNAP25、SNAP29 禾口 SNAP47的示例性參考。本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，殘基224的其他突變也可能合適。LC/E內(nèi)的被保護(hù)的突變是K2MD，其識(shí)別SNAP23的P2賴氨酸殘基。我們預(yù)期K2M的谷氨酸突變也可產(chǎn)生切割SNAP23的功能性LC/E。我們生成了 K224A突變，其具有切割SNAP23和SNAP25的能力， 但效率低于K2MD，這表明R基團(tuán)的電荷和大小影響切割效率。因此，我們預(yù)期其他殘基置換，如用谷氨酸置換SEQ ID NO :7的殘基224的賴氨酸，也可提供具有切割SNAP23能力的突變LC/E。在其他實(shí)施方式中，我們還預(yù)期其他殘基置換，單用或與本發(fā)明的K224D突變聯(lián)用，可產(chǎn)生具有切割SNAP 23的能力且不切割SNAP 25的LC/E。治療方法在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明提供對(duì)需要用肉毒桿菌毒素處理的對(duì)象進(jìn)行治療的新方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供通過(guò)給予治療有效量的上述改良催化劑結(jié)構(gòu)域來(lái)治療患有人分泌疾病的對(duì)象的方法。“對(duì)象”指需要用肉毒桿菌毒素治療的任何人?！爸委煛被颉疤幚怼敝腹芾砗妥o(hù)理對(duì)象以用于對(duì)抗疾病、病癥、或障礙目的。所述術(shù)語(yǔ)包括預(yù)防性的即預(yù)防和緩解性治療。治療包括給予本發(fā)明的化合物以防止所述癥狀或并發(fā)癥的發(fā)作、緩解所述癥狀或并發(fā)癥、或消除所述疾病、病癥、或障礙。在一個(gè)實(shí)施方式中，我們預(yù)計(jì)本發(fā)明的方法至少能使癥狀減輕 20-50%。我們預(yù)計(jì)有規(guī)律地進(jìn)行治療直到癥狀逆轉(zhuǎn)。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，按需每天、 每周或每月進(jìn)行治療?！爸委熡行Я俊敝附o予對(duì)象用于治療疾病時(shí)，足以實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的治療的化合物用量。根據(jù)所述化合物、治療的疾病狀態(tài)、治療的疾病的嚴(yán)重程度、所述對(duì)象的年齡和相對(duì)健康狀態(tài)、給藥路徑和方式、主治醫(yī)生或獸醫(yī)從業(yè)者的判斷、和其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的因素，所述“治療有效量”可改變GO)。本方法涉及將本發(fā)明的工程改造肉毒桿菌毒素E的改良催化結(jié)構(gòu)域給予對(duì)象?！敖o予”指將本發(fā)明的工程改造BoNT遞送給對(duì)象。盡管所述催化結(jié)構(gòu)域的優(yōu)選形式是所述肉毒桿菌毒素E輕鏈，但是所述催化結(jié)構(gòu)域可包括比所述輕鏈短的形式，如所述催化結(jié)構(gòu)域C末端截短突變體為約1-390殘基(41)，和比所述輕鏈大的形式且包括多至約殘基F12°°的所述轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域或所述轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域的片段，其包括所述HCR結(jié)構(gòu)域N末端。在一個(gè)實(shí)施方式中，我們工程改造了 1-400，其具有良好的可溶性和活性。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述催化結(jié)構(gòu)域通過(guò)共價(jià)鍵或用其他結(jié)合方式如交聯(lián)來(lái)絡(luò)合連接靶向分子(靶向系統(tǒng))。所述靶向分子適于將所述毒素靶向感興趣的細(xì)胞表面受體。如上所述，我們預(yù)想多種形式的所述催化結(jié)構(gòu)域作為K224D突變的有效潛在遞送平臺(tái)。例如，蛋白質(zhì)溶解性可根據(jù)所述應(yīng)用和工程改造的嵌合體而不同，因此不同大小的催化結(jié)構(gòu)域在具體應(yīng)用中可能更加有效。我們預(yù)期有效遞送平臺(tái)的量將會(huì)與臨床療法中所用的BoNT量相似，且基于LC/EK2MD的催化本質(zhì)，有效遞送量可為分?jǐn)?shù)。在其他實(shí)施方式中，合適的遞送系統(tǒng)在一個(gè)實(shí)施方式中會(huì)靶向內(nèi)化的特異細(xì)胞型或細(xì)胞表面受體并遞送LC/E到胞質(zhì)中，如抗體或生長(zhǎng)因子。可被靶向的潛在細(xì)胞表面受體包括根據(jù)靶向疾病而不同的組織特異生長(zhǎng)因子受體。例如，技術(shù)人員會(huì)理解如何基于本領(lǐng)域已知的材料在毛細(xì)胞白血病中靶向⑶22 02)。或者，基于脂質(zhì)的直接蛋白遞送系統(tǒng)可用于直接將LC/E遞送入所述宿主細(xì)胞溶質(zhì)。例如，直接遞送所述催化結(jié)構(gòu)域蛋白或編碼所述LC/EK224D蛋白的DNA的脂質(zhì)體靶向遞送(39)也是遞送本發(fā)明的工程改造BoNT/E以治療各種疾病的有效方法。例如，證明組裝納米顆粒用于有效遞送和降低免疫原性的基于脂質(zhì)的遞送系統(tǒng)可作為有用的靶向載體 (43)。雖然所述不同遞送方法基于靶向疾病可能不具有不同優(yōu)點(diǎn)，但是所述遞送系統(tǒng)的特異性會(huì)是選擇特異遞送系統(tǒng)的關(guān)鍵因素。為了優(yōu)化所述功效，我們預(yù)計(jì)使用本領(lǐng)域已知的多種可能方法之一來(lái)人源化所述改良催化結(jié)構(gòu)域?？紤]多種遞送系統(tǒng)用于給需要治療例如不分泌或高分泌疾病的對(duì)象治療性遞送 LC/E(K224D)或其他合適毒素。示例性遞送系統(tǒng)包括但不限于單鏈蛋白嵌合體，其中所述改良的催化結(jié)構(gòu)域優(yōu)選LC/E(K224D)在DNA水平或通過(guò)蛋白質(zhì)受體交聯(lián)而融合(36)，或是通過(guò)雙重蛋白遞送系統(tǒng)，其中所述催化結(jié)構(gòu)域優(yōu)選LC/E(K224D)連接由雙蛋白遞送系統(tǒng)組成的融合蛋白(37，38)。例如，編碼LC/E(K224D)的基因通常可遺傳融合編碼所述表皮生長(zhǎng)因子的基因以靶向非小細(xì)胞肺癌。下表描述了一些本發(fā)明工程改造毒素的合適應(yīng)用和所述靶向結(jié)構(gòu)域的合適靶標(biāo)。表1:受體/疾病
權(quán)利要求
1.一種改良BoNT/E催化結(jié)構(gòu)域，其特征在于，其中輕鏈殘基224、或?qū)?yīng)殘基2 的殘基被改變。
2.一種包含如權(quán)利要求1所述的改良結(jié)構(gòu)域的經(jīng)工程改造的肉毒桿菌神經(jīng)毒素E或肉毒桿菌神經(jīng)毒素輕鏈或肉毒桿菌毒素催化結(jié)構(gòu)域。
3.如權(quán)利要求1所述的改良催化結(jié)構(gòu)域，其特征在于，所述催化結(jié)構(gòu)域切割SNAP23。
4.如權(quán)利要求1所述的改良催化結(jié)構(gòu)域，其特征在于，所述催化結(jié)構(gòu)域切割SNAP25但不切割SNAP^或SNAP47。
5.如權(quán)利要求1所述的改良催化結(jié)構(gòu)域，其特征在于，所述殘基224、或?qū)?yīng)于殘基224 的殘基變?yōu)樘於彼峄蚬劝彼帷?br> 6.如權(quán)利要求1所述的改良催化結(jié)構(gòu)域，其特征在于，所述結(jié)構(gòu)域還包含用于蛋白質(zhì)遞送系統(tǒng)的靶向分子。
7.一種治療需要肉毒桿菌毒素療法的對(duì)象的方法，所述方法包括將治療有效量的如權(quán)利要求1所述的改良催化結(jié)構(gòu)域給予對(duì)象的步驟。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述對(duì)象患有哮喘、CF、慢性阻塞性肺病、胃酸流出病和炎癥、有細(xì)胞因子成分的免疫失調(diào)或有細(xì)胞因子成分的癌癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型改良BoNT/E催化結(jié)構(gòu)域和其使用方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述改良BoNT/E催化結(jié)構(gòu)域的輕鏈殘基224、或?qū)?yīng)于殘基224的殘基變?yōu)樘於彼峄蚬劝彼?。所述改良催化結(jié)構(gòu)域切割SNAP23但不切割SNAP29或SNAP47，提供了治療疾病的新方法，所述疾病包括但不限于哮喘、CF、慢性阻塞性肺病、胃酸流出病和炎癥、有細(xì)胞因子成分的免疫失調(diào)或有細(xì)胞因子成分的癌癥。
文檔編號(hào)A61K39/08GK102481351SQ201080023825
公開(kāi)日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月14日
發(fā)明者J·T·巴比里, S·陳 申請(qǐng)人:Mcw研究基金會(huì)股份有限公司