相關申請的交叉引用

本申請要求以下優(yōu)先權：于2014年7月17日提交的美國臨時申請序列號62/025,673的優(yōu)先權，于2015年5月22日提交的美國臨時申請序列號62/165,445的優(yōu)先權，于2014年7月17日提交的美國臨時申請序列號62/025,685的優(yōu)先權，以及于2014年7月24日提交的美國臨時申請序列號62/029,774的優(yōu)先權，在此將每一項優(yōu)先權的內容以全文引入的方式并入本文。

背景技術：

樹突狀細胞(dcs)是從微生物或者甚至癌細胞獲得蛋白質抗原并予以顯示，或將這些抗原遞呈給t細胞的白細胞。因此被所述樹突狀細胞激活的所述t細胞之后發(fā)起系統性免疫應答來挑戰(zhàn)威脅。傳統的針對微生物的疫苗包含被稱為“佐劑”的添加劑，其通過若干可能的方法在接種疫苗的個體內增強樹突狀細胞活性并擴大疫苗誘導的免疫應答。然而針對癌癥的疫苗需求，存在許多特殊的問題。例如，傳統的佐劑不會給樹突狀細胞提供允許其發(fā)起針對癌癥的最佳免疫的適當信號。并且，腫瘤自身會產生一種影響樹突狀細胞適當激活的環(huán)境。

對于該問題的流行解決方案是從癌癥患者中提取樹突狀細胞，在體外使其加載上腫瘤抗原，然后在將其重新施用于身體之前對此細胞提供獨特的激活信號。這樣保證了去除了腫瘤環(huán)境影響的適當的樹突狀細胞激活。當返回到身體時，所述樹突狀細胞可以與t細胞相互作用并發(fā)起強有力的抗腫瘤免疫。鑒于使用額外的有形化的樹突狀細胞已經解決了許多有效性問題，其歷史上是以現實局限性為代價的。例如，由于樹突狀細胞疫苗包含活細胞，在施用治療的醫(yī)療中心的實際位置處需要特殊的細胞加工和疫苗生產的設備。由于每個給予所述治療的機構必須建設并維持其自身的具有該特殊用途的設施，因此，這是一種昂貴且低效的遞送治療的方式。

乳腺癌的管理目前依賴于早期診斷和積極治療，其可以包括一種或多種治療，例如手術，放射治療，化學療法和激素療法。赫塞汀(曲妥單抗)被開發(fā)作為her2/erbb2陽性乳腺癌細胞的靶向治療方法，常常與其他療法聯合應用，其他療法包括有絲分裂抑制劑紫杉醇(其出售的商品名為taxol)。

赫塞汀作為單一療法的功效被評估為小于30％；與微管穩(wěn)定藥物，例如紫杉醇，進行組合治療的功效提高至約60％(burrisetal.,2000,seminoncol27:19-23)。用赫塞汀治療導致cdk抑制劑p27的積累和隨后的g1/s細胞周期停滯，并且紫杉醇停止有絲分裂的進入，其可以導致細胞死亡。盡管具有巨大前景，然而高劑量的赫塞汀或紫杉醇導致不良副作用。進一步，癌癥經常對赫塞汀和/或紫杉醇產生抗性。

因此，仍然迫切需要用于生產最大化治療的樹突狀細胞疫苗的組分和有效方法，以及迫切需要使用赫塞汀治療癌癥的新方法。相應地，本領域需要額外的免疫治療途徑來治療或預防乳腺癌和其他惡性腫瘤。本發(fā)明滿足了這種需求。

附圖說明

當結合附圖進行閱讀時，如下優(yōu)選實施例的具體描述將得到更好地理解。為了說明本發(fā)明，在附圖中示出了目前優(yōu)選的實施例。然而，應該理解，本發(fā)明不是受限于附圖中示出的實施例的精確排列和手段。

圖1是一個圖表，其示出了冷凍保存的dc1的生活力和產率。當細胞被直接解凍和計數時，細胞的復蘇平均為89％和生活力為95％。

圖2是一個圖表，其示出了細胞間的生活力(p＝.4807)和復蘇(p＝.1220)沒有顯著差異。

圖3是一個圖表，其示出了兩個種群具有相似的初始(添加lps7小時后)il-12p70的分泌(p＝.0768)。所述種群在30小時的觀察期內繼續(xù)展示出相當的il-12p70的分泌水平，在所述種群之間沒有顯著差異。

圖4是一個圖表，其示出了在種群之間和il-1β(p＝0.7690)，il-1α(p＝0.0841)，rantes(p＝0.902)，mdc(p＝0.1514)，il-10(p＝.1937)，mip-1α(p＝.2673)，ip-10(p＝0.7366)，il-6(p＝0.24)，il-5(p＝0.0735)，tnf-β(p＝0.9422)，il-15(p＝0.8878)，mip-1β(p＝0.9217)，tnf-α(p＝0.8972)，il-8(p＝0.7844)的生產中沒有顯著差異。

圖5是一個圖表，其示出了從冷凍保存的和非冷凍保存的樹突狀細胞的ifn-γ的分泌。

圖6.th1細胞因子tnf-α和ifn-γ協同誘導乳腺癌細胞的衰老并且需要的劑量與her2的表達呈負相關。圖6a.將sk-br-3乳腺癌細胞株與10ng/ml的tnf-α和100u/ml的ifn-α孵育5天，在無細胞因子的條件下培養(yǎng)2代以上，然后用于sa-β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)表達(衰老標記)的染色并與未處理的對照細胞進行對比。只有成對的細胞因子誘導了衰老。頂部圖，是來自3個獨立試驗中的1個代表數據。底部圖，是光密度分析。數據以sa-β-gal-陽性細胞的百分比呈現和以平均值±s.d.(n＝3)呈現。圖6b.在a中描述的細胞的細胞溶解物通過蛋白質印記分析用于p15inkb和p16ink4a的表達。黏著斑蛋白用作加載對照。圖6c.t-47d乳腺癌細胞未經處理(1)或與如下濃度的tnf-α和inf-γ孵育5天和在無細胞因子的條件下培養(yǎng)2代以上：10ng/ml和100u/ml(2),50ng/ml和500u/ml(3),75ng/ml和750u/ml(5),100ng/ml和1000u/ml(5)。進而所述細胞用于sa-β-gal染色并與未經處理的對照細胞進行對比，或所述用8um的依托泊苷作為陽性對照(6)。頂部圖，是來自3個獨立試驗的1個代表數據。底部圖，是光密度分析。數據以sa-β-gal-陽性細胞的百分比呈現和以平均值±s.d.(n＝3)呈現。圖6d.使用th1細胞因子ifn-γ和tnf-α聯合治療，與未處理的對照組相比，sk-br-3(10ng/mltnf-α+100u/mlifn-γ)和t-47d(100ng/mltnf-α+1000u/mlifn-γ)細胞導致更大的衰老，mda-mb-231細胞(200ng/mltnf-α+2000u/mlifn-γ)保持大部分未受雙重ifn-γ+tnf-α處理的影響。數據以sa-β-gal-陽性細胞的百分比呈現和以平均值±s.d.(n＝3)呈現。

圖7.her2誘導mda-mb-231乳腺癌細胞的衰老與凋亡。圖7a.在使用wther2(pcdnaher2)轉染或者使用列出的tnf-α和ifn-γ的濃度處理的空載體(pcdna3)轉染的mda-mb-231細胞進行sa-β-gal染色5天并在缺乏細胞因子的條件下培養(yǎng)2代以上，左側圖，光密度分析。數據以sa-β-gal-陽性細胞的百分比呈現和以平均值±s.d.(n＝3)呈現。右側圖，是3個獨立試驗中的1個代表數據。圖7b.在a中描述的細胞的細胞溶解物通過蛋白質印記分析用于p15inkb和裂解的半胱天冬酶-3的表達。黏著斑蛋白用作加載對照。插圖。使用pcdnaher2或者通過her2特異性抗體進行探測的pcdna3穩(wěn)定轉染mda-mb-231細胞進行蛋白質印跡。黏著斑蛋白用作加載對照。在3個獨立的試驗中觀察到相似的結果。

圖8.組合的her2和her3阻斷表達增強了在sk-br-3乳腺癌細胞中的th1細胞因子tnf-α和ifn-γ衰老誘導和細胞凋亡。圖8a.在使用非靶標(nt)，her2，her3或her2和her3sirna的組合轉染的sk-br-3細胞進行sa-β-gal染色5天并在缺乏細胞因子的條件下培養(yǎng)2代以上，左側圖，光密度分析。數據以sa-β-gal-陽性細胞的百分比呈現和以平均值±s.d.(n＝3)呈現。右側圖，是3個獨立試驗中的1個代表數據。圖8b.在a中描述的細胞的細胞溶解物通過蛋白質印記分析用于p15inkb或裂解的caspase-3的表達。插圖。使用her2和her3特異性抗體進行探測的nt,her2或her3sirna轉染fsk-br-3細胞進行蛋白質印跡。黏著斑蛋白用作加載對照。在3個獨立的試驗中觀察到相似的結果。

圖9.組合的her2抑制和her2-her3二聚化抑制增強了在sk-br-3乳腺癌細胞中th1細胞因子tnf-α和ifn-γ衰老誘導和細胞凋亡。圖9a.在未處理(1)或使用10ng/ml的tnf-α和100u/ml的ifn-γ(2)，或使用10ug/ml曲妥單抗(tzm)，帕妥珠單抗(per)(3)或使用二者聯合處理(4)在sk-br-3細胞進行sa-β-gal染色5天并在缺乏抗體和細胞因子的條件下培養(yǎng)2代以上，左側圖，光密度分析。數據以sa-β-gal-陽性細胞的百分比呈現和以平均值±s.d.(n＝3)呈現。右側圖，是3個獨立試驗中的1個代表數據。圖9b.在a中描述的細胞的細胞溶解物通過蛋白質印記分析用于p15inkb或裂解的半胱天冬酶-3的表達。黏著斑蛋白用作加載對照。在3個獨立的試驗中觀察到相似的結果。圖9c.通過染色膜聯蛋白v和pi以及通過流式細胞術分析誘導未處理或如上所述處理的sk-br-3細胞的細胞凋亡頂部圖，是3個獨立試驗中的1個代表數據的圖。底部圖，光密度分析。數據以從三個獨立試驗的膜聯蛋白v⁺pi⁺細胞的平均值±sem(n＝3)呈現。

圖10.與曲妥單抗和帕妥珠單抗的聯合治療增強了her2-過表達的人乳腺癌細胞的cd4⁺th1介導的衰老與凋亡。圖10a.使用transwell體系，將0.5x10⁵sk-br-3細胞單獨與5x10⁵cd4⁺t-細胞(僅僅cd4⁺)，cd4⁺t-細胞+0.5x10⁵每種her2二類肽(dch)-或不相關的二類braf或生存素肽(dcb或dcs)-脈沖一型分化成熟的樹突狀細胞，和cd4+t-細胞+her2(idch)-脈沖未成熟的樹突狀細胞,在使用或不使用10ug/ml的曲妥單抗(tzm)和帕妥珠單抗(per)共培養(yǎng)5天。然后所述細胞在缺乏封閉抗體和免疫系統細胞的條件下進行培養(yǎng)2代以上，并染色用于sa-β-gal的表達和與未處理的對照細胞進行對比。頂部圖，光密度分析。數據以sa-β-gal-陽性細胞的百分比呈現和以平均值±s.d.(n＝3)呈現。底部圖，是3個獨立試驗中的1個代表數據。圖10b.在存在曲妥單抗和帕妥珠單抗，但不是來自dcb,dcs和idch組，分別與dch/cd4⁺t-細胞共培養(yǎng)時，增強的p15ink4b或裂解的半胱天冬酶-3的表達暗示了誘導的sk-br-3細胞的衰老與凋亡。黏著斑蛋白用作加載對照。結果代表3個獨立試驗。

圖11.th1細胞因子tnf-α和inf-γ使曲妥單抗和帕妥珠單抗抗性乳腺癌細胞對衰老與凋亡的誘導變得敏感。圖11a.在hcc-1419和jimt-1細胞進行sa-β-gal染色，分別未處理(1)或用50ng/mltnf-α和500u/mlifn-γ(2)處理，或用10ug/ml的曲妥單抗(tzm)處理，帕妥珠單抗(per)(3)，或用相同濃度的曲妥單抗、帕妥珠單抗和tnf-α，ifn-γ(4)的組合進行處理5天并在缺乏抗體和細胞因子的條件下培養(yǎng)兩代以上。頂部圖，光密度分析。數據以sa-β-gal-陽性細胞的百分比呈現和以平均值±s.d.(n＝3)呈現。底部圖，是3個獨立試驗中的1個代表數據。圖11b.在圖11a中描述的細胞的細胞溶解物通過蛋白質印跡分析用于p15inkb或裂解的半胱天冬酶-3表達。黏著斑蛋白用作加載對照。在3個獨立的試驗中觀察到相似的結果。

圖12.獨立于它們的her2水平，在乳腺細胞系中表達出相似的水平的ifngr和tnfr。由蛋白質印跡檢測ifngr，tnfr和her2在無限增殖化mcf-10a乳腺上皮細胞和乳腺癌細胞系(sk-br-3，bt-474，mcf-7，t-47d和mda-mb-231)的表達。黏著斑蛋白用作加載對照。在3個獨立的試驗中觀察到相似的結果。

圖13.組合的her2和her3阻斷表達增強了在mcf-7乳腺癌細胞中th1細胞因子tnf-α和ifn-γ的衰老誘導。圖13a.在使用非靶標(nt)，her2，her3或her2和her3sirna的組合轉染的mcf-7細胞進行sa-β-gal染色，然后使用列出的tnf-α和ifn-γ的濃度處理5天并在缺乏細胞因子的條件下培養(yǎng)2代以上，左側圖，光密度分析。數據以sa-β-gal-陽性細胞的百分比呈現和以平均值±s.d.(n＝3)呈現。右側圖，是3個獨立試驗中的1個代表數據。圖13b.在a中描述的細胞的細胞溶解物通過蛋白質印記分析用于p15inkb或裂解的半胱天冬酶-3的表達。插圖。使用her2和her3特異性抗體進行探測的nt,her2或her3或her2和her3sirna的組合轉染mcf-7細胞進行蛋白質印跡。黏著斑蛋白用作加載對照。在3個獨立的試驗中觀察到相似的結果。

圖14.th1-細胞因子對sk-br-3衰老與凋亡的影響。圖14a.使用transwell體系，將0.5x10⁵sk-br-3細胞單獨與5x10⁵cd4⁺t-細胞(僅僅cd4⁺)，cd4⁺t-細胞+0.5x10⁵每種her2二類肽(dch)-或不相關的二類braf肽(dcb)-脈沖一型分化成熟的樹突狀細胞，和cd4⁺t-細胞+her2(idch)-或braf(idcb)脈沖未成熟的樹突狀細胞5天。然后所述細胞在缺乏免疫系統細胞的條件下進行培養(yǎng)2代以上，并染色用于sa-β-gal的表達和與未處理的對照細胞進行對比。與igg同型對照進行對比，在使用cd4⁺/dch處理的sk-br-3中誘導的衰老在使用特異性抗體中和ifn-γ和tnf-α得以部分拯救(75.27％拯救)，頂部圖，光密度分析。數據以sa-β-gal-陽性細胞的百分比呈現和以平均值±s.d.(n＝3)呈現。底部圖，是3個獨立試驗中的1個代表數據。圖14b.在與dcb，idch和idcb組進行對比，當與dch/cd4⁺t-細胞進行共培養(yǎng)時，增強的p15ink4b或裂解的半胱天冬酶-3的表達暗示了誘導的sk-br-3細胞的衰老與凋亡。與igg同型對照進行對比，通過中和ifn-γ和tnf-α抗體使得使用cd4⁺/dch處理的sk-br-3中誘導的衰老與凋亡得以部分拯救(75.27％拯救)。黏著斑蛋白用作加載對照。結果代表3個獨立試驗。

圖15.通過乳腺癌細胞系中的調蛋白，曲妥單抗和帕妥珠單抗對akt激活的影響。圖16a.使用曲妥單抗(tzm)和帕妥珠單抗(每10ug/ml,90分鐘)處理血清饑餓t-47d，hcc-1419和jimt-1細胞，然后使用hrg進行刺激(20ug/ml,5分鐘)。頂部圖，是3個獨立試驗中的1個代表數據。底部圖，光密度分析。數據以sa-β-gal-陽性細胞的百分比呈現和以平均值±s.d.(n＝3)呈現。

詳細說明

本發(fā)明提供了用于生產個性化治療和預防癌癥或其他失調癥的、fda批準的可注射的多劑量抗原脈沖樹突狀細胞疫苗的組合物和方法。在一個實施例中，本發(fā)明提供了用于生產fda-批準的可注射的多劑量抗原脈沖i型極化樹突狀細胞疫苗(dc1)。

在一個實施例中，本發(fā)明提供了以多劑量等份的形式冷凍保存樹突狀細胞的方法，所述樹突狀細胞是處于加載有抗原的、“準備好注射的”的預活化狀態(tài)，即，適合立即注射到患者體內而并不需要要求(即，通過fda規(guī)定)額外設施和質量控制/保證步驟的任何進一步的細胞處理。

在一個實施例中，本發(fā)明提供了有效生產可注射的多劑量抗原脈沖樹突狀細胞疫苗的方法，優(yōu)選地，提供了展示出最大功效的可注射的多劑量抗原脈沖i型極化樹突狀細胞疫苗。

在一個實施例中，通過在單獨的患者白細胞除去法中收集樹突狀細胞來生產fda-批準的可注射的多劑量抗原脈沖樹突狀細胞疫苗。優(yōu)選的，白細胞除去法和樹突狀細胞疫苗的生產在第一位置進行，其中第一位置可以是集中的疫苗生產設施，在此生產設施中操作樹突狀細胞以生產包含其初始免疫劑量和多個“加強”劑量的活化的抗原加載的樹突狀細胞疫苗。本申請的優(yōu)勢在于所有的fda規(guī)定的質量控制/質量保證步驟將在中心設施進行，在完成和釋放后，所有的疫苗劑量被冷凍保存和運輸到遠距醫(yī)療中心用于對患者的連續(xù)施用。在一個實施例中，在施用位置，本發(fā)明所述的fda-批準的可注射的多劑量抗原脈沖樹突狀細胞疫苗不需要任何任何規(guī)定的質量控制/質量保證步驟。

在另一方面，本發(fā)明基于發(fā)現了一種治療癌癥的有效療法，其包括改變腫瘤中的免疫應答從而使得腫瘤位點的免疫細胞更有效的攻擊腫瘤細胞。在一些實例中，有效的治療包括提高腫瘤位點中免疫細胞的遷移和活性。相應地，本發(fā)明提供了樹突狀細胞疫苗與抑制一種或多種her-2和her-3的組合物(例如，曲妥單抗，帕妥珠單抗等)聯合使用的方法和組合物，作為治療癌癥的治療方案。在一個實施例中，所述治療方案包括使用樹突狀細胞疫苗，her-2抑制劑，和趨化因子調節(jié)劑。

在一個實施例中，本發(fā)明提供了樹突狀細胞疫苗與一種或多種her-2和her-3阻斷進行聯合使用的方法和組合物，作為治療癌癥的治療方案。在另一個實施例中，本發(fā)明提供了樹突狀細胞疫苗與her-2和her-3的阻斷以及tnf-α和inf-γ的添加進行聯合使用的方法和組合物。在另一個實施例中，本發(fā)明提供了tnf-α和ifn-γ的添加和一種或多種her-2和her-3的阻斷的方法和化合物，作為治療癌癥的治療方案。

在一個實施例中，本發(fā)明的治療方案包含誘導抗-癌驅動th1免疫應答(例如，tnf-α和ifn-γ)和針對一種或多種her-2和her-3的癌驅動阻斷的聯合治療。

在一個實施例中，本發(fā)明的治療方案可以被用于治療癌癥并且從而可以被認為是一種抗癌治療。在另一個實施例中，本發(fā)明的治療方案可以與另一種抗癌治療聯合使用，所述另一種抗癌治療包括但不限于的手術，化學療法，放射治療(例如，x射線)，基因治療，免疫療法，激素治療，病毒治療，dna治療，rna治療，蛋白質治療，細胞治療，納米治療等。

在一個實施例中，本發(fā)明的治療方案用于接受其他抗癌治療之前。在另一個實施例中，本發(fā)明的治療方案與接受其他抗癌治療同時使用。在另一個實施例中，本發(fā)明的治療方案用在接受其他抗癌治療之后。

定義

除非定義，否則這里所使用的所有技術術語和科學術語具有與本領域的普通技術人員對本發(fā)明所屬的一般理解的意思相同的意思。雖然類似或等同于本文所述的任何方法和材料可用于本發(fā)明的實踐或測試，但是現描述優(yōu)選的方法和材料。

通常，在此使用的術語和在細胞培養(yǎng)，分子遺傳學，有機化學，和核酸化學以及雜交中的實驗室步驟是本領域公知和常規(guī)使用的。

標準技術用于核苷酸和肽的合成。所述技術和步驟一般地按照本領域常規(guī)方法和各種普遍參考文件進行(例如，sambrookandrussell,2012,molecularcloning,alaboratoryapproach,coldspringharborpress,coldspringharbor,ny,andausubeletal.,2012,currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,ny)，其通過這篇文獻提供。

在此使用的術語和在分析化學中使用的實驗室步驟以及在如下描述的有機合成是那些本領域公知和常規(guī)使用的。其標準技術或變型用于化學合成和化學分析。

如這里使用的，每個如下術語的含義與其在此部分的含義相關。

在此使用的冠詞“一種”指的是冠詞語法上一個或多于一個(也就是至少一個)的客體。例如，“一種元素”指的是一個元素或多于一個元素。

i.在此使用的“約”，當指的是例如數量，持續(xù)時間等可測值時，意思是包括離給定的值±20％或±10％，或±5％，或±1％，或±0.1％的變化范圍，這樣的變化對于實施所公開的方法是適當的。

ii.當術語“不正常的”用在生物體，組織，細胞或其成份的語境中時，指的是那些生物體，組織，細胞或其成份與顯示“正常的”(預期的)各自特征的那些生物體，組織，細胞或其成份在至少一種可觀察到的或可檢測到的特征中(例如，年齡，治療，時間等)存在不同之處。對于一種細胞或組織類型是正?；蝾A期的特征，對于不同的細胞或組織類型可能是不正常的。

在此使用的術語“抗原”或“ag”被定義為引起免疫應答的分子。該免疫應答可能涉及抗體生產或者特異免疫活性細胞的激活，或者兩者都包括。本領域技術人員將理解，實質上包括所有蛋白質或肽的任何大分子，可以作為抗原。進一步，抗原可以從重組的或基因組dna獲得。本領域技術人員將會理解，任何dna，包括編碼引發(fā)免疫應答的蛋白質的部分核苷酸序列或核苷酸序列，編碼在這里使用的術語“抗原”。進一步，本領域技術人員將理解抗原不需要僅依靠基因全長核苷酸序列進行編碼。很顯然地，本實施例包括，并不限于，使用多于一個基因的部分核苷酸序列，并將這些核苷酸序列進行不同的組合以引發(fā)期望的免疫應答。而且，本領域技術人員將理解，抗原完全不需要“基因”的編碼。很顯然地，抗原可以合成產生或者從生物樣本獲得。這樣的生物樣本可以包括但不限于組織樣本，腫瘤樣本，細胞或生物體液。

“抗原遞呈細胞”(apc)是一種能夠激活t細胞的細胞，其包括，但不限于單核細胞/巨噬細胞，b細胞和樹突狀細胞(“dcs”)。

“抗原-加載apc”或者“抗原-脈沖apc”包括已經向抗原暴露和被抗原激活的apc。例如，在有抗原存在的培養(yǎng)期間，apc可以在體外加載抗原。通過向抗原暴露，apc也可以在體內被加載?！翱乖虞dapc”傳統上通過兩種方法中的一種制備：(1)小肽片段，公知作為抗原肽，被直接脈沖到抗原遞呈細胞的外部；或(2)將apc與整蛋白質或蛋白質顆粒孵化，隨后這些蛋白質或蛋白質顆粒被apc消化。這些蛋白質被apc消化成小的肽段并最終運輸到和遞呈到apc表面。另外，也可以通過將編碼抗原的多聚核苷酸引入細胞來產生抗原-加載apc。

在此使用的術語“自身免疫疾病”定義為由自身免疫應答造成的失調。自身免疫疾病是對自身抗原不適當的和過度的應答的結果。自身免疫疾病的例子其中包括但不限于，艾迪森疾病，斑禿，強直性脊柱炎，自身免疫肝炎，自身免疫腮腺炎，克羅恩氏病，糖尿病(i型)，表皮松解癥，附睪炎，血管球性腎炎，格雷福斯氏病，吉蘭-巴雷綜合癥，橋本氏病，溶血性貧血，全身性紅斑狼瘡，多發(fā)性硬化癥，重癥肌無力，尋常性天胞瘡，牛皮癬，風濕熱，類風濕性關節(jié)炎，肉狀瘤病，硬皮病，干燥綜合征，脊椎關節(jié)病，甲狀腺炎，血管炎，白癜風，粘液腺瘤，惡性貧血，潰腸性結腸炎。

在此使用的“自體的”指的是從與之后被引入的個體相同的個體中所獲取的任何物質。

這里使用的術語“b細胞”被定義為從骨髓和/或脾臟獲得的細胞。b細胞可以發(fā)展成為生產抗體的漿細胞。

這里使用的術語“癌癥”被定義為細胞的過度增殖，其具有獨特的特點-正?？刂频膿p失、導致沒有節(jié)制的增長、缺乏分化、局部組織浸潤、和/或轉移。例子包括但不限于，乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，宮頸癌，皮膚癌，胰腺癌，大腸癌，腎癌，和肺癌。

在此使用的術語“冷凍保存的”或“低溫貯藏”指的是已經在冷凍劑中重懸并在約-70℃或更低的溫度下結冰的細胞。

在此使用的術語“冷凍劑”指的是為冷凍做準備的與細胞樣品混合的任何介質，這樣使得至少在細胞樣品中的一些細胞在解凍后可以復蘇和保持活性。

術語“樹突狀細胞”(dc)是存在于體內，體外，離體或者在宿主或受試者內，或者可以從造血干細胞或單核細胞獲得的抗原遞呈細胞。樹突狀細胞和他們的前體可以從多種淋巴器官中分離，例如，脾臟，淋巴結，以及來自骨髓和外周血。樹突狀細胞具有一種形態(tài)學特點，其有向多個方向擴展遠離樹突狀細胞體的薄片(片狀偽足)。典型地，樹突狀細胞表達高水平mhc和共刺激分子(例如，b7-1和b7-2)。樹突狀細胞可以在體外誘導t細胞的抗原特異性分化，并且可以發(fā)起體內和體外的最初的t細胞應答。

在此使用的“活化的樹突狀細胞”是已經暴露給toll樣受體激動劑的樹突狀細胞?；罨膁c可能加載有或可能沒加載有抗原。

在此使用的術語“成熟dc”定義為表達包括高水平ii類mhc，cd80(b7.1)和cd86(b7.2)分子的樹突狀細胞。相反地，未成熟的樹突狀細胞表達低水平的ii類mhc，cd80(b7.1)和cd86(b7.2)分子，然而依舊能攝取抗原?！俺墒靌c”也指存在于體內，體外，離體，或在宿主或者是受試者內的dc1極化的抗原遞呈細胞(即，其完全能夠促進細胞-介導的免疫)。

疾病是動物的一種健康狀態(tài)，其中動物不能維持體內平衡，以及如果所述疾病沒有得以改善，此動物的健康持續(xù)惡化。

動物的“失調”是一種健康狀態(tài)，其中動物能夠維持體內平衡，但是所述動物的健康狀態(tài)不如沒有失調時的健康狀態(tài)良好。如果不經處理，失調未必引起動物健康狀態(tài)的進一步降低。

如果患者經歷的疾病或失調的至少一種跡象或癥狀的嚴重性或頻率是縮減的，則疾病或失調是“減輕”的。

“治療有效量”或者“有效量”在這里可交換使用，指的是這里描述的化合物，制劑，物質或組合物的數量，能夠有效實現特殊的生物效果。所述效果可以包括但不限于通過本領域任何適當的方法確定的病毒感染的抑制。

在此使用的“內源的”指的是來自或在生物體，細胞，組織或系統內產生的任何物質。

在此使用的術語“外源性的”指的是從生物體，細胞，組織或系統外部引入的或在其外部產生的任何物質。

“雌激素受體(“er”)陽性”癌癥是雌激素受體表達檢測為陽性的癌癥。相反地，“er陰性”癌癥是對于此表達檢測為陰性的癌癥。er狀態(tài)的分析可以通過本領域已知的任何方法實施。

“her受體”是受體蛋白質酪氨酸激酶，其屬于her受體家族，并包括egfr(erbb1,her1)，her2(erbb2)，her3(erbb3)和her4(erbb4)受體。所述的her受體通常包含可以結合her配體和/或與另一個her受體分子二聚化的胞外結構域，親脂性的跨膜結構域；保守的胞內酪氨酸激酶結構域；和存有幾個可以被磷酸化的酪氨酸殘基的羧基-末端信號結構域。所述的her受體可以是“原始序列”her受體或其“氨基酸序列變體”。優(yōu)選的，所述的her受體是原始序列人類her受體。

所述的“her通路”指的是通過her受體家族介導的信號網絡。

“her激活”指的是任一種或多種her受體的激活或磷酸化。通常，her激活導致信號傳導(例如，由her受體或底物多肽內的her受體磷酸化酪氨酸殘基的細胞內激酶結構域所導致的)。her激活可以由與包含感興趣的her受體的her二聚體相結合的her配體所介導。與her二聚體結合的her配體可以激活二聚體中的一種或多種her受體的激酶結構域，從而導致一種或多種her受體中酪氨酸殘基的磷酸化和/或在附加的基質多肽中的酪氨酸殘基的磷酸化作用，例如akt或mapk細胞內激酶。

術語“過度增殖疾病”定義為由細胞的過度增殖導致的疾病。典型的過度增殖疾病包括，但不限于，癌癥或自身免疫性疾病。其他的過度增殖疾病可以包括血管閉塞，再狹窄，動脈粥樣硬化或炎癥性腸病等。

在此時用的術語“抑制”意思是抑制或阻斷活性或功能，例如，相對于對照值約為10％。優(yōu)選的，與對照值相比，所述活性被抑制或阻斷50％，更優(yōu)選的，75％，并且甚至更優(yōu)選的95％。在此使用的“抑制”也表示以可測量值減少或完全阻止分子，反應，相互作用，基因，mrna，和/或蛋白質的表達，穩(wěn)定性，功能或活性。抑制劑是與之結合會，例如，部分或完全阻斷刺激，減少，預防，延遲激活，使失去活性，使不敏感或下調蛋白質，基因和mrna穩(wěn)定性，表達，功能和活性的化合物，例如，拮抗劑。

在此使用的“教材”包括出版物，記錄，圖表或任何其他的可以用于傳達本發(fā)明的組合物和方法的有用性的表達介質。本發(fā)明的試劑盒的教材可以，例如，貼到包含有本發(fā)明的核酸，肽，和/或組合物的容器上，或者與包含有核酸，肽，和/或組合物的容器一起運送?？蛇x的，所述教材可以與所述容器分開運送，其目的是接收者可以協同使用所述教材和所述化合物。

“分離的”意思是從自然狀態(tài)中被改變或被移除。例如，自然存在于活的動物內的核酸或肽不是“分離的”，然而被部分或者全部從其自然狀態(tài)的共存物質中分離的同樣的核酸或者肽是“分離的”。分離的核酸或蛋白質可以以基本上純化的形式存在，或者可以在非天然環(huán)境存在，例如，宿主細胞。

在此使用的術語“調節(jié)”，意思為與未接受治療或未使用化合物的受試者的應答水平相比，和/或與其他完全相同但未接受治療的受試者的應答水平相比，調節(jié)受試者的應答水平可檢測的增加或下降。所述術語包含擾亂和/或影響原始信號或應答從而在受試者內調節(jié)有益的治療反應，優(yōu)選的，人類。

在此使用的“種群”包括提及包括同質，基本上同質或異質細胞培養(yǎng)物的分離培養(yǎng)物。通常，“種群”也可以被認為是“分離的”細胞培養(yǎng)物。

在此使用的“重組細胞”是包含重組多核苷酸的宿主細胞。

在此使用的“樣本”或“生物樣本”意思是來自受試者的生物材料，包括但不限于器官，組織，外來體，血液，血漿，唾液，尿液和其他體液。樣本可以是獲取自受試者的任何來源的材料。

在此使用的“信號1”通常指的是從激活的樹突狀細胞傳遞到t細胞的第一生物化學信號。信號1是由樹突狀細胞表面表達的抗原提供的，其通過t細胞受體使得t細胞得以感知。

在此使用的“信號2”通常指的是由樹突狀細胞提供給t細胞的第二信號。信號2是由激活的樹突狀細胞上的“共刺激”分子提供的，通常為cd80和/或cd86(盡管也有其他已知的共刺激分子)，信號2通過表面受體cd28使得t細胞得以感知。

在此使用的“信號3”通常指的是由激活的樹突狀細胞生產的可溶性蛋白質(通常指細胞因子)產生的信號。這些是通過t淋巴細胞上的受體感知到的。信號3指導t細胞其需要哪些表型或功能特征從而最好的處理當前的威脅。

在此使用的術語“特異地結合”意思是分子，例如抗體，其識別并結合到另一個分子或特征，但在樣本中其沒有實質識別或結合其他分子或特征。

術語“受試者”，“患者”，“個體”等在這里可交換使用，指的是適用于在這里描述的方法的任何動物，或其無論在體外或在原位的細胞。在某種非限制實施例中，患者，受試者或者個體是人類。

在此使用的術語“t細胞”被定義為參與許多細胞介導的免疫反應的胸腺衍生細胞。

在此使用的術語“t-輔助細胞”是關于能被本領域技術人員識別的包括不同細胞類型的淋巴細胞(一種白血細胞或白血球)亞組。特別地，根據本發(fā)明所公開的t-輔助細胞包括效應器th細胞(例如th1，th2和th17)。這些th細胞分泌出刺激其他白細胞或與其他白細胞相互作用的細胞因子，蛋白質或肽類。

在此使用的“th1t細胞”指的是生產高水平的細胞因子ifn-γ并被認為高效地對抗在宿主細胞內生存的引起疾病的微生物以及癌癥的t細胞。

在此使用的“th17t細胞”指的是生產高水平的細胞因子il-17和il-22并被認為高效地對抗生存在粘膜表面的引起疾病的細菌的t細胞。

這里使用的“治療有效量”指的是當給患者施用時，改善所述疾病的癥狀的本發(fā)明化合物的數量。構成“治療有效量”的本發(fā)明化合物的數量會根據化合物，疾病狀態(tài)及其嚴重性，被治療患者的年齡等而變化。治療有效量通過本領域技術人員參考他/她自己的知識以及此公開可以常規(guī)確定。

這里使用的術語“治療”指的是這里描述的治療性的或預防性的措施?！爸委煛狈椒ú捎脤π枰景l(fā)明中的治療、組合物的受試者采取措施的方式，例如，受疾病或失調折磨的受試者，或最終可能獲得此疾病或失調的受試者，為了預防、治療、延期、降低嚴重性或改善失調或復發(fā)失調的一種或多種癥狀，或者延長受試者的存活使其超出不施用此治療時的預期存活。

在此使用的術語“toll樣受體”或“tlr”被定義為在先天免疫系統中起作用的蛋白質種類。tlrs是識別來源于微生物的結構保守分子的單一跨膜，非催化受體。一旦結合配體，tlrs激活免疫細胞應答。

在此使用的術語“toll樣受體激動劑”或“tlr激動劑”被定義為激活免疫細胞應答的結合到tlr的配體。

在此使用的術語“疫苗”被定義為用來向動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人類施用材料后引起免疫應答的物質。一旦引入受試者體內，疫苗可以引起免疫應答，該免疫應答包括但不限于，抗體，細胞因子的生產和/或其他細胞應答。

范圍：貫穿本公開，本發(fā)明的不同方面可以通過范圍形式來表示。應該理解的是范圍形式的描述僅僅是為了方便和簡潔，并不應該被解釋為對本發(fā)明范圍的刻板的限定。因此，范圍的描述應該被認為已經明確公開所有可能的子范圍以及在所述范圍內的所有可能個體數值。例如，從1到6的范圍的描述應該被認為已經具體公開了例如從1到3，從1到4，從1到5，從2到4，從2到6，從3到6等的子范圍，以及在所述范圍內的個體數值，例如1，2，2.7，3，4，5，5.3和6。無論所述范圍的寬度如何，此解釋都適用。

描述

本發(fā)明包括樹突狀細胞的制備。在一個實施例中，所述的樹突狀細胞制劑純度高于90％。在另一個實施例中，所述樹突狀細胞制劑是被完全激活的。例如，使用細胞因子和/或toll樣受體配體將所述的樹突狀細胞激活，通過本發(fā)明的低溫貯藏技術使激活狀態(tài)完全保持。本發(fā)明樹突狀細胞制劑的好處在于所述細胞在從單個的白細胞除去法(患者采集物)到最初的疫苗加多個“加強”劑量(例如，10或更多)的過程中被有效的冷凍保存，其可以在遠端的治療地點按需解凍并不需要任何專業(yè)的細胞處理設施或進一步必需的質量控制檢測。

如本文所考慮的，本發(fā)明提供了一種用于產生和冷凍保存樹突狀細胞的方法，所述樹突狀細胞在對t細胞產生更強的信號方面具有優(yōu)異功能并因此產生更有效的基于樹突狀細胞的疫苗。通過有效地冷凍保存所述細胞，樣品可以儲藏和解凍供之后使用，從而在疫苗生產期間減少重復的提取法和淘洗過程的需求?？梢詢鼋Y樹突狀細胞然后在后期將其解凍是有優(yōu)勢的，因為其意味著疫苗生產的單個循環(huán)可以分成小部分，凍結，然后對患者在周療程，月療程或年療程的過程中每次施用一個，從而提供加強免疫力的“加強的”疫苗接種。

在一個實施例中，本發(fā)明包括一種fda-批準的可注射的多劑量抗原脈沖樹突狀細胞疫苗，其通過在單一患者白細胞除去法中收集樹突狀細胞來生產。所述的fda-批準的可注射的多劑量抗原脈沖樹突狀細胞疫苗包括最初的免疫劑量和多個“加強”劑量。所述fda-批準的可注射的多劑量抗原脈沖樹突狀細胞疫苗是冷凍保存的并且可以被運到遠程醫(yī)療中心為患者連續(xù)施用，在施用地點沒有特殊要求。(例如，fda規(guī)定的qc/qa步驟)。

本發(fā)明還涉及這些激活的樹突狀細胞的低溫貯藏，該低溫貯藏的方式保留了其呈遞抗原以及其在解凍后產生各種細胞因子和趨化因子的效力和功能，使得冷凍保存的和隨后解凍的活化的樹突狀細胞像新鮮收獲和激活的樹突狀細胞一樣臨床有效。

本發(fā)明還涉及通過阻斷her-2和her-3中的一種或多種與活化抗her-2cd4th1細胞的聯合使用來誘導細胞中的腫瘤衰老和細胞凋亡。相應地，為了促進her-2表達的乳腺癌中的腫瘤衰老，本發(fā)明包括促進抗-癌驅動th1免疫應答和針對her-2的癌驅動阻斷的組合和方法。在一個實施例中，促進抗-癌驅動th1免疫應答包括tnf-α和ifn-γ。在一個實施例中，針對her-2的癌驅動阻斷包括阻斷her-2的任何組合物，該組合物包括但不限于曲妥單抗和帕妥珠單抗。

在一個實施例中，本發(fā)明包括一種或多種her-2和her-3的阻斷與誘導her-2表達乳腺癌的衰老的tnf-α和ifn-γ一起聯合的方法和組合物，tnf-α和ifn-γ從cd4th1細胞分泌。

在一個實施方案中，在乳腺癌細胞中tnf-α和ifn-γ誘導衰老和凋亡的機制需要her2。

在一個實施例中，tnf-α和ifn-γ恢復乳腺癌抗性細胞對曲妥珠單抗和帕妥珠單抗的敏感性。在一個實施例中，th1細胞因子，ifn-γ和tnf-α，逆轉對廣泛影響癌癥患者的治療劑的抗性。

基于樹突狀細胞的免疫治療

樹突狀細胞源自于作為抗原遞呈細胞(apc)的多能性單核細胞。樹突狀細胞在外周組織中是普遍存在的，在外周組織中它們被制備以捕獲抗原?？乖东@一旦發(fā)生，樹突狀細胞將抗原加工成小肽并移向次級淋巴器官。在淋巴器官內，樹突狀細胞向初始t細胞呈遞抗原肽，從而引發(fā)極化t細胞分化的信號級聯。一旦暴露，樹突狀細胞遞呈與mhci類或ii類結合肽結合的抗原分子，并分別激活cd8⁺或cd4⁺t細胞(steinman,1991,annu.rev.immunol.9:271–296；banchereauetal.,1998,nature392,245–252；steinman,etal.,2007,nature449:419–426；ginhouxetal.,2007,j.exp.med.204:3133–3146；banerjeeetal.,2006,blood108:2655–2661；sallustoetal.,1999,j.exp.med.189:611–614；reidetal.,2000,curr.opin.immunol.12:114–121；bykovskaiaetal.,1999,j.leukoc.biol.66:659–666；clarketal.,2000,microbesinfect.2:257–272)。

樹突狀細胞負責適應性免疫應答的誘導，協調和調節(jié)，并且還用于協調免疫系統的先天方式效應器和適應性方式效應器之間的溝通。這些特征使得樹突狀細胞成為免疫治療的強有力的候選者。樹突狀細胞具有通過巨胞飲和受體介導的胞吞作用對環(huán)境進行取樣的獨特能力(gerneretal.,2008,j.immunol.181:155–164；stoitzneretal.,2008,cancerimmunol.immunother57:1665–1673；lanzevecchiaa.,1996,curr.opin.immunol.8:348–354；delamarreetal.,2005,science,307(5715):1630–1634)。

樹突狀細胞還需要成熟信號以增強其抗原遞呈能力。樹突狀細胞通過提供額外的成熟信號例如tnf-α，cd40l或鈣信號傳導劑來上調表面分子的表達，例如cd80和cd86(也稱為第二信號分子)(czernieckietal.,1997,.j.immunol.159:3823–3837；bedrosianetal.2000,j.immunother.23:311–320；mailliardetal.,2004,cancerres.64,5934–5937；brossartetal.,1998,blood92:4238–4247；jinetal.,2004,hum.immunol.65:93–103)。已經確定包括tnf-α，il-1β，il-6和前列腺素e2(pge2)的細胞因子的混合物具有使樹突狀細胞成熟的能力(jonuleit,etal.,2000,arch.derm.res.292:325–332)。在用抗原脈沖之前，樹突狀細胞還可以用鈣離子載體使之成熟。

除了病原體識別受體，例如pkr和mda-5(kalalietal.,2008,j.immunol.181:2694–2704；nallagatlaetal.,2008,rnabiol.5(3):140–144)，樹突狀細胞還含有一系列受體，稱為toll樣受體(tlr)，其也能夠感測來自病原體的危險。當這些tlr被觸發(fā)時，在樹突狀細胞中誘導一系列激活變化，其導致t細胞的成熟和信號傳導(boullartetal.2008,cancerimmunol.immunother.57(11):1589–1597；kaishoetal.,2003,curr.mol.med.3(4):373–385；pulendranetal.,2001,science293(5528):253–256；napolitanietal.,2005,nat.immunol.6(8):769–776)。樹突狀細胞可以激活和延長細胞介導的應答的各種方式，例如天然殺傷γ-δt和α-βt細胞，并且一旦激活，樹突狀細胞保持其免疫能力(steinman,1991,annu.rev.immunol.9:271–296；banchereauetal.,1998,nature392:245–252；reidetal.,2000,curr.opin.immunol.12:114–121；bykovskaiaetal.,1999,j.leukoc.biol.66:659–666；clarketal.,2000,microbesinfect.2:257–272)。

本發(fā)明包括由toll樣受體激動劑激活的成熟的，抗原加載的樹突狀細胞，其誘導臨床有效的免疫應答，優(yōu)選在疾病過程中較早時使用。本發(fā)明的樹突狀細胞產生所需水平的細胞因子和趨化因子，并且還進一步具有誘導腫瘤細胞凋亡的能力。

在一個實施例中，本發(fā)明提供了大規(guī)模生產抗原脈沖樹突狀細胞疫苗的方法。在一個實施例中，所述方法包括快速使樹突狀細胞成熟，冷凍保存樹狀細胞和解凍冷凍保存的細胞，其中解凍的樹突狀細胞產生有效量的至少一種細胞因子以產生t細胞應答。

在一個實施例中，樹突狀細胞的成熟包括使細胞與ifn-γ和lps接觸。

在一個實施例中，解凍的細胞維持dc1表型以驅動th1極化的免疫應答。

在一個實施例中，解凍的細胞保持了主要敏化t細胞的能力。

加載(脈沖)免疫細胞的生產

本發(fā)明包括已經向抗原暴露的細胞或另外用抗原“脈沖”的細胞。例如，apc，如：樹突狀細胞，可以在體外加載抗原，例如在抗原存在下通過離體培養(yǎng)，或通過在體內暴露于抗原的培養(yǎng)。

本領域技術人員還將容易地理解，apc可以通過將apc暴露于抗原的方式被“脈沖化”，暴露的時間要足以促進該抗原在apc表面上呈遞。例如，apc可以暴露于被稱為抗原肽的小肽片段形式的抗原，其直接“脈沖”到apc的外部(mehta-damanietal.,1994)；或apc可以與完全蛋白質或蛋白質顆粒一起孵育，完全蛋白質或蛋白質顆粒然后被apc攝取。這些完全蛋白被apc消化成小的肽片段，最終攜帶至并呈遞在apc表面上(cohenetal.,1994)。肽形式的抗原可通過本文所述的標準“脈沖”技術被暴露于細胞。

不希望受任何特定理論的束縛，外源或自身抗原形式的抗原由本發(fā)明的apc加工以保留抗原的免疫原性形式?？乖拿庖咴孕问揭馕吨ㄟ^片段化處理抗原以產生可被免疫細胞(例如t細胞)識別并刺激免疫細胞的抗原形式。優(yōu)選地，這種外源或自身抗原是通過apc加工成肽的蛋白質。由apc產生的相關肽可以被提取和純化以用作免疫原性組合物。由apc處理的肽也可用于誘導對由apc處理的蛋白質的耐受性。

加載抗原apc，或者稱為本發(fā)明的“脈沖apc”，是通過在體外或體內將apc暴露于抗原產生的，。在apc在體外被脈沖的情況下，可以將apc鋪在培養(yǎng)皿上并以足夠的量和足夠的時間暴露于抗原，以允許抗原結合至apc。實現抗原與apc結合所需的量和時間可以通過使用本領域已知的或本文另外公開的方法來確定。本領域技術人員已知的其它方法，例如免疫分析或結合測定，可用于在apc暴露于抗原后檢測apc上抗原的存在。

在本發(fā)明的另一個實施例中，apc可以用允許apc表達特異性蛋白質的載體轉染。然后可以將由apc表達的蛋白質加工并遞呈到細胞表面上。然后可以將轉染的apc用作免疫原性組合物，以產生對載體編碼的蛋白質的免疫應答。

如本文其他地方所討論的，可以制備載體使其包括特定多核苷酸，該特定多核苷酸編碼和表達需要免疫原性應答的蛋白質。優(yōu)選地，使用逆轉錄病毒載體感染細胞。更優(yōu)選地，使用腺病毒載體感染細胞。

在另一個實施例中，通過修飾編碼被apc上的受體識別的蛋白質或其部分的病毒載體從而使得載體能夠以apc為靶向，由此載體占據apc受體將啟動載體的內吞作用，從而允許由病毒載體的核酸編碼的抗原的加工和遞呈。由病毒遞送的核酸對病毒而言可以是本來就有的，當在apc上表達時，核酸編碼病毒蛋白，然后病毒蛋白被加工并被呈遞至apc的mhc受體上。

如本文所考慮的，多種方法可用于將多核苷酸轉染至宿主細胞中。所述方法包括但不限于磷酸鈣沉淀，脂質轉染，粒子轟擊，顯微注射，電穿孔，膠體分散系統(即大分子復合物，納米膠囊，微球，珠和基于脂質的系統，包括水包油乳劑，膠束，混合膠束和脂質體)。這些方法在本領域中是已知的，并且在公開的文獻中描述，以使得本領域技術人員能夠執(zhí)行這些方法。

在另一個實施例中，編碼抗原的多核苷酸可以克隆到表達載體中，并且可以將載體引入apc中，另外產生加載的apc。將載體的各種類型和將核酸引入細胞的各種方法在可獲得的公開文獻中有所討論。例如，表達載體可以通過物理，化學或生物手段轉移到宿主細胞中。參見，例如，sambrook等人。(2001,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,newyork)和ausubel等人(1997,currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,newyork)。容易理解，引入包含編碼抗原的多核苷酸的表達載體產生脈沖細胞。

本發(fā)明包括用于脈沖apc的各種方法，包括但不限于用蛋白質，cdna或mrna形式的完整抗原加載apc。然而，本發(fā)明不應被解釋為限制用于脈沖apc的抗原的特定形式。相反，本發(fā)明包括本領域已知的用于產生抗原加載apc的其它方法。優(yōu)選地，用編碼限定的抗原的mrna轉染apc。對應的基因產物序列已知的mrna使用合適的引物和與轉錄反應偶聯的逆轉錄酶-聚合酶鏈反應(rt-pcr)在體外可以快速產生。用mrna轉染apc提供了優(yōu)于其它產生脈沖apc的抗原加載技術的優(yōu)點。例如，從微量組織，即微量腫瘤組織擴增rna的能力將apc在疫苗接種中的應用擴展給大量患者。

對于可用作疫苗的抗原組合物，抗原組合物必須在細胞，組織或哺乳動物(例如人)中誘導針對抗原的免疫應答。如本文所用，“免疫組合物”可包含抗原(例如肽或多肽)，編碼抗原(例如抗原表達載體)的核酸或表達或遞呈抗原的細胞或細胞組分。在具體實施例中，抗原組合物包含或編碼本文所述的全部抗原或部分抗原，或其免疫功能等價物。在其它實施方案中，抗原組合物處于包含額外的免疫刺激劑或編碼此類試劑的核酸的混合物中。免疫刺激劑包括但不限于額外的抗原，免疫調節(jié)劑，抗原呈遞細胞或佐劑。在其它實施例中，一種或多種另外的試劑以任何組合與抗原或免疫刺激劑共價鍵合。在某些實施例中，抗原組合物結合至或包含hla錨定模序氨基酸。

如本文所考慮的，疫苗可以在其核酸和/或細胞組分的組成方面不同。在非限制性實例中，編碼抗原的核酸也可以與佐劑一起配制。當然，應當理解，本文所述的各種組合物可以進一步包含另外的組分。例如，一種或多種疫苗組分可以包含在脂質或脂質體中。在另一個非限制性實例中，疫苗可包含一種或多種佐劑。根據本公開，本發(fā)明的疫苗及其各種組分可以通過本文公開的或本領域普通技術人員已知的任何方法制備和/或施用。

應當理解，本發(fā)明的抗原組合物可以通過本領域公知的方法制備，包括但不限于通過固相合成的化學合成和通過hplc從化學反應的其它產物中純化，或通過在體外翻譯系統或活細胞中表達核酸序列(例如，dna序列)產生，該核酸序列編碼包含本發(fā)明抗原的肽或多肽。另外，抗原組合物可以包含從生物樣本中分離的細胞組分。將抗原組合物分離并廣泛透析以除去一種或多種不希望的小分子量分子，和/或將抗原組合物在所需賦形劑中凍干形成更好的制劑。還應當理解，在疫苗組分中制備的額外的氨基酸，突變，化學修飾等，如果有的話，優(yōu)選基本上不干擾抗原決定基序列的抗體識別的。

對應于本發(fā)明的一個或多個抗原決定簇的肽或多肽通常長度至少為5個或6個氨基酸殘基，并且可以含有高達約10，約15，約20，約25，約30，約35，約40，約45或約50個殘基左右。肽序列可以通過本領域普通技術人員已知的方法合成，例如使用自動肽合成儀的肽合成，例如可從加利福尼亞州福斯特市應用生物系統公司獲得自動肽合成儀(fostercity，ca)。

較長的肽或多肽也可以通過例如重組的方法制備。在某些實施例中，為了實現本發(fā)明的各種組合物和方法，編碼本文所述的抗原組合物和/或組分的核酸可用于例如在體外或體內產生抗原組合物。例如，在某些實施例中，編碼抗原的核酸包含在例如重組細胞中的載體中?？梢员磉_核酸以產生包含抗原序列的肽或多肽。肽或多肽可以從細胞分泌，或作為細胞的一部分或在細胞內包含。

在某些實施例中，通過用編碼抗原的核酸轉染或接種哺乳動物可以促進免疫應答。在向哺乳動物施用核酸后，包含在靶向哺乳動物中的一種或多種細胞隨后表達了由核酸編碼的序列。疫苗還可以是以例如編碼抗原的全部或部分的肽或多肽序列的核酸(例如，cdna或rna)的形式存在。核酸在體內的表達可以是例如通過質粒型載體，病毒載體或病毒/質粒構建載體。

在另一個實施例中，核酸包含編碼適當抗原的全部或部分序列或其免疫功能等價物的編碼區(qū)。當然，這些核酸可以包含和/或編碼另外的序列，另外的序列包括但不限于包含一種或多種免疫調節(jié)劑或佐劑的那些。

抗原

如本文所考慮的，本發(fā)明可以包括適合加載到apc中以引發(fā)免疫應答的任何抗原的應用。在一個實施例中，可以使用腫瘤抗原。腫瘤抗原可以分為兩大類：共享的腫瘤抗原；和獨特的腫瘤抗原。共享抗原由許多腫瘤表達，而獨特的腫瘤抗原可由物理或化學致癌物誘導的突變產生，因此僅由單個腫瘤表達。在某些實施例中，共享的腫瘤抗原被裝載到本發(fā)明的樹突狀細胞中。在其它實施例中，將獨特的腫瘤抗原裝載到本發(fā)明的樹突狀細胞中。

在本發(fā)明的上下文中，“腫瘤抗原”是指特異性過度增殖性失調所共有的抗原。在某些方面，本發(fā)明的過度增殖性失調抗原來源于癌癥，包括但不限于原發(fā)性或轉移性黑素瘤，胸腺瘤，淋巴瘤，肉瘤，肺癌，肝癌，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，白血病，子宮癌，子宮頸癌，膀胱癌，腎癌和腺癌如乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，胰腺癌等。

惡性腫瘤表達許多可以作為免疫攻擊的靶抗原的蛋白質。這些分子包括但不限于組織特異性抗原，例如黑素瘤中的mart-1，酪氨酸酶和gp100，以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(pap)和前列腺特異性抗原(psa)。其他靶分子屬于與轉化相關的分子的組，例如致癌基因her-2/neu/erbb-2。另一組靶抗原是癌胚抗原，例如癌胚抗原(cea)。在b細胞淋巴瘤中，腫瘤特異性獨特型免疫球蛋白構成了對個體腫瘤獨特的真正的腫瘤特異性免疫球蛋白抗原。b細胞分化抗原，例如cd19，cd20和cd37，是b細胞淋巴瘤中靶抗原的其它候選物。這些抗原中的一些(cea，her-2，cd19，cd20，獨特型)已經用作僅有限次成功的使用單克隆抗體的被動免疫治療的靶標。

腫瘤抗原及其抗原性癌癥抗原決定基可以從天然來源例如來自初級臨床分離物，細胞系等中進行純化和分離。癌肽和它們的抗原決定基也可以通過本領域已知的化學合成或通過重組dna技術獲得。化學合成的技術描述于steward等(1969)；bodansky等。(1976)；meienhofer(1983)；和schroder等(1965)。此外，如renkvist等人(2001)描述的，存在許多本領域已知的抗原。盡管沒有具體描述類似物或人工修飾的抗原決定基，但是本領域技術人員知道如何通過本領域的標準方法獲得或產生它們。在ludwig癌癥研究所的數據庫中鑒定了已通過抗體鑒定的和通過serex技術(參見sahin等人(1997)和chen等人(2000))檢測的其它抗原。

在另一個實施例中，本發(fā)明可以包括由apc遞呈的微生物抗原。如本文所考慮的，微生物抗原可以是病毒，細菌或真菌來源。感染性病毒的實例包括：逆轉錄病毒科(例如人免疫缺陷病毒，例如hiv-1(也稱為htlv-iii，lav或htlv-iii/lav或hiv-iii)；和其他分離株，如hiv-lp；小核糖核酸病毒科(例如脊髓灰質炎病毒，甲型肝炎病毒；腸道病毒，人柯薩奇病毒，鼻病毒，?？刹《?；杯狀病毒科(例如引起腸胃炎的菌株)；披膜病毒科(例如馬腦炎病毒，風疹病毒)；黃病毒科(例如登革熱病毒，腦炎病毒，黃熱病毒)；冠狀病毒科(例如冠狀病毒)；彈狀病毒科(例如水泡性口炎病毒，狂犬病病毒)；絲狀病毒科(例如埃博拉病毒)；副粘液病毒科(例如副流感病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(例如流感病毒)；布尼亞病毒科(例如漢坦病毒，布尼亞病毒，白蛉病毒和內羅病毒)；砂粒病毒科(出血熱病毒)；呼腸孤病毒科(例如呼腸孤病毒，環(huán)狀病毒和輪狀病毒)；雙核糖核酸病毒科；肝脫氧核糖核酸病毒科(乙型肝炎病毒)；細小病毒科(細小病毒)；乳多空病毒科(乳頭瘤病毒，多瘤病毒)；腺病毒科(多數腺病毒)；皰疹病毒科(單純皰疹病毒(hsv)1和2，水痘帶狀皰疹病毒，巨細胞病毒(cmv)，皰疹病毒)；痘病毒科(天花病毒，牛痘病毒，痘病毒)；和虹彩病毒科(例如非洲豬瘟病毒)；和未分類的病毒(例如海綿狀腦病的病原體，δ型肝炎(被認為是乙型肝炎病毒的有缺陷附屬物)的病原體，非甲型非乙型肝炎的病原體(1類＝內部傳播；2類＝腸胃外傳播(即丙型肝炎)；諾瓦克和相關病毒，和星狀病毒。

感染性細菌的實例包括：幽門螺桿菌，博氏疏螺旋體，嗜肺軍團桿菌，分枝桿菌(例如結核分枝桿菌，鳥分枝桿菌，胞內分枝桿菌，堪薩斯分枝桿菌，戈氏分枝桿菌)，金黃色葡萄球菌，淋病奈瑟氏球菌，腦膜炎奈瑟菌單核細胞增生李斯特菌，釀膿鏈球菌(a組鏈球菌)，無乳鏈球菌(b組鏈球菌)，鏈球菌(草綠色鏈球菌組)，糞鏈球菌，牛鏈球菌，鏈球菌(厭氧菌)，肺炎鏈球菌，致病性彎曲桿菌種，腸球菌種，流感嗜血桿菌，炭疽桿菌，白喉棒狀桿菌，棒狀桿菌種，紅斑丹毒絲菌，產氣莢膜梭菌，破傷風桿菌，產氣腸桿菌，肺炎克雷伯氏菌，多殺巴斯德氏菌，擬桿菌種，核梭桿菌，念珠狀鏈桿菌，密螺旋體病毒，極細密螺旋體病毒，鉤端螺旋體和衣氏放線菌。

感染性真菌的實例包括：新型隱球菌，莢膜組織胞漿菌，粗球孢子菌，皮炎芽生菌，沙眼衣原體，白色念珠菌。其它感染性生物體(即原生生物)包括：惡性瘧原蟲和剛地弓形蟲。

樹突狀細胞的激活

盡管傳統的基于樹突狀細胞的疫苗(其具有的臨床試驗之前占優(yōu)勢)包括使用細胞因子混合物產生的成熟樹突狀細胞，所述細胞因子混合物包括tnf，il-6，pge2和il-1β的組合，其最終刺激無菌性炎癥，但是本發(fā)明利用tlr激動劑使樹突狀細胞成熟并刺激信號的產生。

根據本發(fā)明的一個方面，用tlr配體的組合刺激樹突狀細胞導致產生增加量的il-12。此外，用tlr激動劑的組合激活樹突狀細胞可產生更顯著的cd4和cd8t-細胞應答(wargeretal.,2006,blood108:544–550)。因此，本發(fā)明的樹突狀細胞可通過暴露于觸發(fā)tlr的這些配體而分泌th1驅動細胞因子，例如il-12。例如，il-1β，tnf-α和ifn-γ的tlr3激動劑聚(i：c)的加入可以產生有效的1型極化樹突狀細胞，其特征在于強水平的il-12產生(heifleretal.,1996,eur.j.immunol.26:659–668)。在某些實施例中，可以在暴露于tlr激動劑之前將抗原加載到樹突狀細胞中。在其他實施例中，可以在暴露于tlr激動劑之后將抗原加載到樹突狀細胞中。

根據本發(fā)明的一個方面，可注射的多劑量抗原脈沖樹突狀細胞疫苗通過在單個患者白細胞分離術中收集樹突狀細胞而產生，其中細胞被模擬細菌感染的生物分子(例如lps)激活。這種獨特的激活方法使樹突狀細胞具有了在用tnf，il-6，pge2和il-1β的細胞因子混合物成熟(“傳統成熟”)的樹突狀細胞中未發(fā)現的品質，所述細胞因子混合物也模擬無菌性炎癥(lombardietal.,2009,j.immunol.182:3372–3379)。

在一個實施例中，本發(fā)明的樹突狀細胞可以用tlr4激動劑，細菌脂多糖(lps)，tlr7/8激動劑，resimiquod(r848)和/或ifn-γ的組合激活(amatietal.,2006,curr.pharm.des12:4247-4254)。通過用tlr4激動劑和細菌lps激活樹突狀細胞，產生的樹突狀細胞至少實質上與通過傳統成熟方法產生的dc1相同(在表型上)。這些樹突狀細胞具有高表達的表面分子，包括cd83，cd80，cd86和hla-dr。在其他實施例中，可以使用tlr2激動劑，例如脂磷壁酸(lta)，tlr3激動劑，例如聚(i：c)，和/或其它tlr4激動劑，例如mpl。如本文所考慮的，任何tlr激動劑或tlr激動劑的組合可用于有活性的樹突狀細胞，前提是這些配體通過激活的樹突狀細胞刺激細胞因子和趨化因子信號的產生。許多其他本領域已知的和公開文獻中找到的tlr激動劑可以用于本發(fā)明。

即使樹突狀細胞和傳統上成熟的樹突狀細胞之間在表型上存在相似性，本發(fā)明的樹突狀細胞顯示出許多顯著的優(yōu)點。

冷凍保存

在培養(yǎng)開始和激活后，收獲細胞，并冷凍保存疫苗。例如，通過白細胞分離法獲得外周血單核細胞。將細胞在含有gm-csf和il-4的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間，然后用所需抗原脈沖細胞。在用所需抗原脈沖細胞后，將抗原脈沖的樹突狀細胞與ifn-γ一起孵育，然后與tlr激動劑(例如lps)一起孵育。收集活化的抗原脈沖的樹突狀細胞并在冷凍培養(yǎng)基中冷凍保存，并儲存在液氮中。在一個實施例中，冷凍培養(yǎng)基包含55％的勃脈力(plasmalyte)，40％的人血清白蛋白和5％的dmso。

本發(fā)明的冷凍保存方面允許fda批準的可注射多劑量抗原脈沖樹突狀細胞疫苗的產生。本發(fā)明的優(yōu)點是多劑量抗原脈沖的樹突細胞保留其在解凍后產生對t細胞功能關鍵的信號的能力。如本文所考慮的，本發(fā)明包括如本領域技術人員將理解的多種冷凍保存技術和低溫培養(yǎng)基。例如，在某些實施例中，冷凍培養(yǎng)基包含55％的勃脈力，40％的人血清白蛋白和5％的dmso。因此，本發(fā)明提供了在集中區(qū)域產生本發(fā)明的多劑量抗原脈沖的樹突狀細胞疫苗的能力，疫苗包括初始免疫劑量和多個“加強”劑量的。因此，多劑量抗原脈沖樹突狀細胞疫苗可以運送到遠程醫(yī)療中心，用于對患者進行連續(xù)施用，而對施用場所不要求特殊的fda質量控制/質量保證。

在一個實施例中，本發(fā)明的樹突狀細胞疫苗以多個劑量的等分試樣冷凍保存。例如，細胞以30×10⁶個細胞/ml的濃度冷凍保存。例如，制備一袋體積等于細胞體積的冷凍培養(yǎng)基?？焖俟ぷ鳎瑢⒗鋬雠囵B(yǎng)基加入到細胞袋中，并將細胞轉移到標記的冷凍瓶。在一個實施例中，使用速率控制的冷凍器冷凍小瓶。例如，使用自動速率控制的冷凍器以1℃/min冷凍冷凍瓶，并儲存在氣相氮氣中。

在一個實施例中，使用速率控制的冷凍器冷凍小瓶。將小瓶放置在冷凍室中，液氮通過電子電磁閥進入該室。由于蒸發(fā)幾乎是瞬時的，控制液氮進入室的速率直接控制著從冷凍室及其內容物吸收和移除熱量的速率。

如本文所考慮的，本發(fā)明包括如本領域技術人員將理解的多種冷凍保存技術和冷凍培養(yǎng)基。例如，在某些實施例中，用于培養(yǎng)細胞的冷凍培養(yǎng)基可以包括約55％的勃脈力，約40％的人血清白蛋白和約5％的dmso。在其他實施例中，低溫培養(yǎng)基可以是無血清的。在某些實施例中，可以使用控制速率冷凍，而其他實施方案可以包括絕熱容器的使用，絕熱容器中將混合有冷凍培養(yǎng)基的細胞小瓶置于冷凍器中，例如在約-70℃至-80℃的溫度范圍內。本發(fā)明提供了以這樣的方式保存激活的樹突狀細胞的方法，以便進一步促進這些細胞的臨床應用，并且減少對廣泛和重復的提取法和淘洗步驟的需要。如本文所考慮的，冷凍保存技術可用于小規(guī)模和大規(guī)模批次。

當考慮用于活化樹突狀細胞的廣泛效用時，冷凍保存的活化樹突狀細胞的穩(wěn)定供應的能力是可以促進這樣的細胞的各種治療用途的顯著優(yōu)點。例如，根據本發(fā)明的方法，能夠以包含初始免疫劑量和多個“加強”劑量的適當大小的等分試樣冷凍保存大規(guī)模培養(yǎng)的活化樹突狀細胞，使得單個劑量的細胞可以隨后用于任何特定的免疫治療方案。在某些實施例中，活化的樹突狀細胞可以在約-70℃或更低的溫度下冷凍保存2-24周。在較低溫度下，例如在約-120℃或更低，活化的樹突狀細胞可以冷凍保存至少一年或更長時間。

在一個示例性實施例中，將樹突狀細胞懸浮在人血清和約5％dmso(v/v)中?？蛇x地，可以使用其他血清類型，例如胎牛血清。懸浮的細胞可以等分成更小的樣品，例如在1.8ml小瓶中，并且儲存在大約-70℃或更低。在其他實施例中，所述冷凍培養(yǎng)基可以包括約20％血清和約10％dmso，懸浮細胞可以在約-180℃下儲存。另外的實施例可以包括含有約55％的勃脈力和約5％的dmso的培養(yǎng)基。其他示例性冷凍培養(yǎng)基可以包括約12％dmso和約25-40％血清。

盡管本文所述的本發(fā)明可以包括特定濃度的血清，但是本領域技術人員應當理解，冷凍培養(yǎng)基中血清的確切量可以變化，并且在一些實施方案中可以完全不存在，但通常為在約1％至30％的范圍內。當然，使細胞生活力為約50％和/或細胞復蘇為約50％的任何血清濃度以及本文所述的任何冷凍保存方法可以用于本發(fā)明的任何樹突狀細胞組合物中。當回收所選冷凍培養(yǎng)基中冷凍保存的細胞時，優(yōu)選的，期望的細胞生活力和復蘇為至少60％，更優(yōu)選至少約70％，或甚至80％。

類似地，雖然本文所述的本發(fā)明可以包括特定濃度的dmso，但是本領域技術人員應當認識到，在一些實施例中，dmso可以完全不存在，而在其他實施例中，濃度為約5％至高達約20％的dmso可用于冷凍培養(yǎng)基中并被包括在本文所述的冷凍保存方法中。通常，優(yōu)選較低濃度的dmso，例如約5％至約10％。然而，在解凍后，使得細胞生活力至少50％和細胞復蘇至少50％，優(yōu)選使得細胞活力和復蘇為至少60％，更優(yōu)選約70％，更多優(yōu)選約80％，甚至更優(yōu)選約90％和更高的任何濃度的dmso都可以被使用。

雖然本文所述的本發(fā)明可以包括速率控制冷凍相關的，但是本領域技術人員應當理解，可以常規(guī)使用以速率控制方式或非速率控制方式冷凍的方法。本領域技術人員還應當理解，本文所述的各種冷凍保存培養(yǎng)基可以包含血清或可以是無血清的。無血清培養(yǎng)基的實例可包括xvivo10，xvivo15，xvivo20，stempro，以及任何市售的無血清培養(yǎng)基。當使用無血清冷凍培養(yǎng)基時，本發(fā)明的冷凍保存方法通常不含可能是抗原性的感染劑，抗體和外源蛋白以及通常可在以血清為基本的冷凍培養(yǎng)基中發(fā)現的任何其它外源分子。

在用tlr激動劑激活細胞后的任何時間點，抗原加載的活化的樹突狀細胞的冷凍保存可在任何時間點發(fā)生。在一個實施例中，所述活化的樹突狀細胞在暴露于tlr激動劑后約6-8小時進行冷凍保存。優(yōu)選地，選擇冷凍保存活化細胞的時間點應當基于細胞的信號產生的最大化，特別是il-12產生。

本發(fā)明提供了用于產生大規(guī)模樹突狀細胞疫苗的組合物和方法。在一個實施例中，大規(guī)模生產樹突狀細胞疫苗允許產生fda批準的可注射的多劑量抗原脈沖的樹突狀細胞疫苗，以用于個體化治療和預防癌癥或其他失調。在一個實施例中，本發(fā)明提供了用于產生大規(guī)?？乖}沖的i型極化樹突狀細胞疫苗(dc1)的組合物和方法。

在一個實施例中，本發(fā)明提供了一種冷凍保存處于大規(guī)?？乖虞d的，預活化狀態(tài)的樹突狀細胞的方法，該樹突狀細胞是“注射器即用”的，即，適合立即注射到患者中，而不需要要求(例如，通過fda規(guī)定)額外的設施和質量控制/保證步驟的任何進一步的細胞加工。

在一個實施例中，本發(fā)明提供了一種效率高的大規(guī)模生產可注射的多劑量抗原脈沖的樹突狀細胞疫苗的方法，優(yōu)選顯示最大功效的可注射的多劑量抗原脈沖i型極化樹突狀細胞疫苗的生產方法。

組合物或試劑盒組分的包裝

用于本發(fā)明的組合物(或試劑盒組分)的合適容器包括小瓶，注射器(例如一次性注射器)等。這些容器應是無菌的。

當組合物/組分位于小瓶中時，小瓶優(yōu)選由玻璃或塑料材料制成。小瓶優(yōu)選在將組合物加入其中之前滅菌。為了避免對乳膠敏感的患者的問題，小瓶優(yōu)選用無膠乳的塞子密封，并且優(yōu)選在所有包裝材料中不存在膠乳。小瓶可以包括單劑量的疫苗，或者其可以包括多于一個劑量(“多劑量”小瓶)例如10劑量。優(yōu)選的小瓶由無色玻璃制成。

瓶子可以配一個瓶蓋(例如，魯爾鎖定型的)，這樣預先填充的注射器可以插入瓶蓋中，使得注射器的內容物可以排出到瓶子內，瓶子的內容物也可以被轉移回注射器內。在用注射器從瓶內抽取內容物后，給注射器加上針頭，組合物可以被施用給病人。瓶蓋最好位于密封或者蓋里面，從而在接觸瓶蓋前必須先取下密封或者蓋。瓶子可以有一個允許無菌轉移內容物的瓶蓋，特別是針對多劑量的瓶子。

當組合物/組分被包裝到注射器中時，注射器可以具有連接到其上的針頭。如果沒有連接針頭，可以將單獨的針頭與注射器一起提供進行組裝和使用。這種針頭可以被包覆。安全針頭是優(yōu)選的。1英寸23號，1英寸25號和5/8英寸25號針是典型的。注射器可以與剝離標簽一起提供，其上可以打印內容物的批號，流感季節(jié)和有效期，以便于保存記錄。注射器中的柱塞優(yōu)選地具有塞子，以防止柱塞在抽吸期間意外地移除。注射器可以具有乳膠橡膠蓋和/或柱塞。一次性注射器含有單劑量的疫苗。注射器通常具有尖端帽用來在連接針頭之前密封尖端，并且尖端帽優(yōu)選地由丁基橡膠制成。如果注射器和針頭單獨包裝，則針頭優(yōu)選裝配有丁基橡膠護罩。

容器可以被標記以顯示半劑量體積，例如：為了方便給兒童注射。例如，含有0.5ml劑量的注射器可具有顯示0.25ml體積的標度。

在使用玻璃容器(例如注射器或小瓶)的情況下，優(yōu)選使用由硼硅酸鹽玻璃制成的容器而不是鈉鈣玻璃制成的容器。

試劑盒或者組合物可以和說明書一起包裝(比如，同一個盒子內)，說明書包含有疫苗的詳細信息，比如用藥說明、疫苗內抗原的詳細信息等等。說明書也可包含警告，比如保留現成可用的腎上腺素溶液，預防接種后的過敏反應等。

疾病治療方法

本發(fā)明還包括治療和/或預防由病原微生物，自身免疫失調和/或過度增殖性疾病引起的疾病的方法。

可以通過使用本發(fā)明治療或預防的疾病包括由病毒，細菌，酵母，寄生蟲，原生動物，癌細胞等引起的疾病。本發(fā)明的藥物組合物可以用作廣義免疫增強劑(樹突狀細胞激活組合物或系統)，因此可用于治療疾病?？梢允褂帽景l(fā)明的藥物組合物治療和/或預防的典型性疾病包括但不限于病毒病原學感染，例如艾滋病，流感，皰疹，病毒性肝炎，epsteinbar病毒，脊髓灰質炎，病毒性腦炎，麻疹，水痘，乳頭瘤病毒等；或細菌病原學感染如肺炎，結核病，梅毒等；或寄生蟲病原學感染，例如瘧疾，錐蟲病，利什曼病，滴蟲病，阿米巴病等。

本發(fā)明中可以使用本發(fā)明的藥物組合物(轉導的樹突狀細胞，表達載體，表達構建體等)治療或預防的癌前或增生狀態(tài)包括但不限于例如結腸息肉，克羅恩病，潰瘍性結腸炎，乳腺病變等癌前或增生狀態(tài)。

本發(fā)明中可以使用本發(fā)明的組合物治療的癌癥包括但不限于原發(fā)性或轉移性黑素瘤，腺癌，鱗狀細胞癌，腺鱗狀細胞癌，胸腺瘤，淋巴瘤，肉瘤，肺癌，肝癌，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，白血病，子宮癌，乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，胰腺癌，結腸癌，多發(fā)性骨髓瘤，成神經細胞瘤，鼻咽癌，膀胱癌，子宮頸癌等。

可以使用本發(fā)明的樹突狀細胞激活系統治療的其它過度增殖性疾病包括但不限于類風濕性關節(jié)炎，炎性腸病，骨關節(jié)炎，平滑肌瘤，腺瘤，脂肪瘤，血管瘤，纖維瘤，血管閉塞，血管再狹窄，動脈粥樣硬化，癌前病變(例如腺瘤性增生和前列腺上皮內瘤變)，原位癌，口腔毛狀白斑或牛皮癬。

可以使用本發(fā)明的組合物治療的自身免疫性失調包括但不限于艾滋病，愛迪生氏病，成人呼吸窘迫綜合征，過敏，貧血，哮喘，動脈粥樣硬化，支氣管炎，膽囊炎，克羅恩病，潰瘍性結腸炎，特應性皮炎，皮肌炎，糖尿病，肺氣腫，結節(jié)性紅斑，萎縮性胃炎，腎小球性腎炎，痛風，格雷夫斯氏病，嗜酸性粒細胞增多癥，腸易激綜合癥，紅斑狼瘡，多發(fā)性硬化，重癥肌無力，心肌或心包炎，骨關節(jié)炎，骨質疏松癥，胰腺炎，多肌炎，類風濕性關節(jié)炎，硬皮病，干燥綜合癥和自身免疫性甲狀腺炎；癌癥并發(fā)癥，血液透析和體外循環(huán)；病毒性的、細菌的、真菌的、寄生的、原生動物的和蠕蟲的感染；和外傷。

在治療方法中，本發(fā)明組合物的施用可以是為了“預防疾病的”或“治療性”目的。當為預防疾病提供時，在任何癥狀出現前提供本發(fā)明的組合物，雖然在某些實施例中疫苗是在一個或者多個癥狀發(fā)作后提供以防止發(fā)生進一步的癥狀或者防止現有的癥狀變得更加糟糕。本組合物的預防性施用用于預防或改善任何后續(xù)的感染或者疾病。當為治療目的提供時，在感染或者疾病的癥狀發(fā)作時或之后提供本藥物組合物。從而，本發(fā)明可以在預期暴露于引起疾病的物品或疾病狀態(tài)之前、或者在感染或疾病開始之后提供。

本組合物的有效量為能夠實現增強免疫應答特定效果的數量，并且該數量能夠由本領域的技術人員常規(guī)確定。比如，用于治療針對癌癥或者病原體的免疫系統缺陷的有效量可以為在暴露于抗原時，引起免疫系統激活，使得具有抗原特異性的免疫應答發(fā)展所必須的數量。此術語與“足夠數量”同義。

對于任何具體應用的有效量可以根據諸如所治療的疾病或病癥，所施用的特定組合物，受試者的大小和/或疾病或病癥的嚴重性等因素而變化。本領域普通技術人員可以憑經驗確定本發(fā)明的特定組合物的有效量，而不需要過度的實驗。

治療應用

本發(fā)明包括抗原加載、激活的apc的生產，當其從冷凍保存解凍時產生顯著水平的細胞因子和趨化因子，其中抗原加載和激活的apc用于哺乳動物，優(yōu)選人的免疫治療。對由apc遞呈的抗原的應答可以通過使用本領域熟知的方法監(jiān)測針對抗原的細胞溶解性t細胞應答、輔助性t細胞應答和/或抗體應答的誘導來測量。

本發(fā)明包括增強哺乳動物免疫應答的方法，包括以下步驟：從獲自哺乳動物(例如患者)的單核細胞中生產未成熟的樹突狀細胞；用包含抗原組合物的組合物脈沖未成熟的樹突狀細胞；用至少一種tlr激動劑激活抗原加載的樹突狀細胞；冷凍保存活化的，抗原加載的樹突狀細胞；解凍活化的抗原加載的樹突狀細胞，然后將活化的抗原加載的樹突狀細胞施用于對此有需要的哺乳動物。所述組合物至少包括抗原，并且還可以進一步是用于哺乳動物中的離體免疫和/或體內治療的疫苗。優(yōu)選地，哺乳動物是人類。

離體步驟在本領域是眾所周知的，并且在下面更全面地討論。簡言之，從哺乳動物(優(yōu)選人類)中分離細胞?？梢詫⒓毎┯糜诓溉閯游锝邮苷咭蕴峁┲委熞嫣?。哺乳動物接受者可以是人類，并且細胞可以是接受者自體的?？蛇x的，細胞可以是接受者同種異體的，同基因的或異種的。

在一個實施例中，通過白細胞分離和淘洗聯合法從患者處獲得外周血單核細胞。單核細胞可以在含有gm-csf和il-4的sfm中培養(yǎng)過夜。第二天，未成熟的樹突狀細胞可以用抗原脈沖，然后使樹突狀細胞與ifn-γ和lps接觸。然后可以將激活的樹突狀細胞懸浮在冷凍培養(yǎng)基中并冷凍，直到準備好用于免疫治療。

與新鮮激活的樹突狀細胞相比，在復蘇百分比和細胞存活百分比可以有效形成的條件下，冷凍保存的樹突狀細胞可以離體培養(yǎng)。與新鮮制備的樹突狀細胞相比，從冷凍保存的樣品中產生的樹突狀細胞可以顯示出類似的穩(wěn)定性。此外，將冷凍保存的成熟樹突狀細胞與新鮮制備的樹突狀細胞相比較可以顯示出二者實際上相同的表型以及信號分泌性能。如本文所考慮的，在約-70℃至-80℃的溫度下，在本文所述的各種冷凍培養(yǎng)基中，樹突狀細胞可以小規(guī)模和大規(guī)模的保存大約2至24周。在低于約-120℃的溫度下，儲存的持續(xù)時間可以無限地延長或至少超過24周，而不影響樹突狀細胞的細胞復蘇，生活力和功能性。例如，在某些實施例中，已激活的細胞可以保存至少一年，并且在解凍后仍然可以保持產生信號的能力。本發(fā)明提供了在解凍細胞時有效的復蘇和生活力，此外，如本文全文所述，本文所述的冷凍保存條件不影響樹突狀細胞保持其信號功能的能力。

在示例性實施例中，可以在樹突狀細胞激活后通過將細胞重懸浮在冷凍培養(yǎng)基中來進行冷凍保存，所述冷凍培養(yǎng)基包含約55％的勃脈力，約40％的人血清白蛋白和約5％的dmso的。然后將混合物等分在1.8ml小瓶中，并在約-80℃下在冷凍室中冷凍過夜。然后，小瓶可以在第二天轉移到液氮罐。在約2至24周的冷凍保存后，可以將冷凍的樹突狀細胞解凍并檢查其復蘇和生活力。這樣的樹突狀細胞的復蘇可以大于或等于約70％，生活力大于或等于約70％。在其他實施例中，樹突狀細胞或甚至單核細胞可以在細胞激活之前冷凍保存。

可替換地，造血干細胞和祖細胞離體擴增的步驟在美國專利號5199942中有描述，在此將其列入本文作為參考，此步驟也適用于本發(fā)明的細胞。除了美國專利號5199942中描述的細胞生長因子之外，其他因子比如flt3-l,il-1,il-3和c-kit配體等可用于細胞的培養(yǎng)和擴增。

在從細胞群中識別和分離細胞方面有許多細胞選擇技術。比如，單克隆抗體(或者其他的特定的細胞結合蛋白)可以被用于結合到細胞中發(fā)現的標記蛋白或者表面抗原蛋白質上。一些這樣的標記蛋白和細胞表面抗體在本領域是眾所周知的。

疫苗制劑

本發(fā)明還包括適用于免疫治療應用中的疫苗制劑。在某些實施例中，疫苗制劑用于預防和/或治療疾病，例如癌癥和感染性疾病。在一個實施例中，為預防和/或治療癌癥的目的按照本發(fā)明對病人進行疫苗施用可以在以去除癌癥為目的的手術前或者手術后進行，可以在以治療癌癥為目的的化療前或者化療后進行，可以在以治療癌癥為目的的放射治療前或者放射治療后進行，或其任何組合下進行。在其它實施方案中，疫苗制劑可以與另一種組合物或藥物產品聯合或組合施用于患者。應當理解，本發(fā)明還可以用于在沒有癌癥但可能處于發(fā)展癌癥風險的個體中預防癌癥。

根據本發(fā)明制備的癌癥疫苗的施用廣泛適用于預防或治療癌癥，該癌癥一定程度上取決于對癌癥疫苗的抗原形成部分的選擇?？梢愿鶕景l(fā)明的實踐適當治療的癌癥包括但不限于肺癌，乳腺癌，卵巢癌，子宮頸癌，結腸癌，頭頸癌，胰腺癌，前列腺癌，胃癌，膀胱癌，腎癌，骨癌，肝癌，食道癌，腦癌，睪丸癌，子宮癌和各種白血病和淋巴瘤。

在一個實施例中，根據本發(fā)明的疫苗可以源自待治療的腫瘤或癌細胞。例如，在肺癌的治療中，肺癌細胞將如上文所述進行治療以產生肺癌疫苗。類似地，乳腺癌疫苗，結腸癌疫苗，胰腺癌疫苗，胃癌疫苗，膀胱癌疫苗，腎癌疫苗等，按照實踐，將作為免疫治療試劑被生產和應用，以預防或者治療制備這些疫苗的腫瘤或者癌細胞。

在另一個實施例中，如上所述，通過收集病原體散布在培養(yǎng)基中的相關抗原，按照本發(fā)明的疫苗還可以被制備以治療影響哺乳動物的各種感染性疾病。由于引起相同疾病的不同種類的生物體表達的免疫原性和保護性抗原的類型中存在異質性，可以通過從表達不同的重要抗原的生物體庫制備疫苗來制備多價疫苗。

在本發(fā)明的另一個實施例中，疫苗可以通過結節(jié)內注射施用到腹股溝結節(jié)中?；蛘?，根據疫苗靶標，疫苗可以皮內或皮下施用于被治療患者的四肢，手臂和腿部。盡管該方法通常對于黑素瘤和其它癌癥(包括預防或治療感染性疾病)是令人滿意的，但是也可以使用其它施用途徑，例如肌肉內或進入血流。

另外，疫苗可以與佐劑和/或免疫調節(jié)劑一起給予以增強疫苗的活性和患者的應答。這些佐劑和/或免疫調節(jié)劑是本領域技術人員理解的，并且在可獲得的公開文獻中描述。

如本文所考慮的，依據生成疫苗的類型，如果需要，可以通過在生物反應器或發(fā)酵罐或其它適于大量生長細胞的容器或裝置中培養(yǎng)細胞來擴大疫苗的生產。在這樣的裝置中，會定期地，頻繁地或連續(xù)地收集培養(yǎng)基，以便在這些材料和抗原在培養(yǎng)基中被降解之前從中回收所有材料或抗原。

如果需要，根據本發(fā)明生產和回收的適于持續(xù)或間歇釋放的包含疫苗或抗原的裝置或組合物可以有效地植入體內或局部施用于其中，用于將這些材料相對緩慢或定時的釋放進入體內。

疫苗制備中的其它步驟可以個體化以滿足特定疫苗的要求。這些額外的步驟將被本領域技術人員理解。例如，某些收集的抗原材料可以被濃縮并且在一些情況下用洗滌劑處理并超速離心以除去移植的同種異體抗原。

聯合療法

本發(fā)明提供了一種治療癌癥的有效療法，其中這種療法包括改變腫瘤的免疫應答從而使得腫瘤部位的免疫細胞能夠更有效地攻擊腫瘤細胞。在一些實例下，有效的治療包括改善腫瘤部位中免疫細胞的遷移和活性。在一個實施例中，本發(fā)明提供了使用樹突狀細胞疫苗聯合一種或多種her2和her3抑制劑的方法和組合物，作為癌癥治療的方案。在另一個實施例中，治療方案包括使用樹突狀細胞疫苗、一種或者多種her2和her3的抑制劑，和趨化因子調節(jié)劑。在一個實施例中，趨化因子調節(jié)劑是趨化因子激活劑。趨化因子激活劑的實例是tlr8激動劑。

在一個實施例中，本發(fā)明提供了樹突狀細胞疫苗與her-2和her-3阻斷一起聯合使用的方法和組合物，作為治療癌癥的治療方案。在另一個實施例中，本發(fā)明提供了樹突狀細胞疫苗與her-2和her-3的阻斷以及tnf-α和ifn-γ一起聯合使用的方法和組合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了阻斷her-2和her-3二者與加入tnf-α和ifn-γ的方法和組合物，作為治療癌癥的治療方案。

在一個實施例中，本發(fā)明的治療方案可用于治療癌癥，因此可以被認為是一種抗癌治療。在另一個實施例中，本發(fā)明的治療方案可用于與另一種抗癌或抗腫瘤治療的聯合治療，包括但不限于手術，化療，放射治療(例如x射線)，基因治療，免疫治療，激素治療，病毒治療，dna治療，rna治療，蛋白質治療，細胞治療和納米治療。

在一個實施例中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的治療方案與另一種用于治療或預防受試者中的癌癥的癌癥藥物的組合。其它癌癥藥物以本發(fā)明治療方案的協同量或各種劑量或不同的時間表施用。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的治療方案單獨的或其與所需的癌癥藥物組合的試劑盒和組合物。

在一個實施例中，在接受另一種抗癌治療之前使用本發(fā)明的治療方案。在另一個實施例中，本發(fā)明的治療方案與接受另一種抗癌治療同時使用。在另一個實施例中，本發(fā)明的治療方案在接受另一種抗癌治療后使用。

在一些實施例中，本發(fā)明提供了一種受試者中er陰性的乳腺癌的治療方法。在一些實施例中，本發(fā)明提供了一種受試者中er陰性且her2陽性的乳腺癌的治療方法。在一些實施例中，乳腺癌是轉移性乳腺癌。在一些實施例中，乳腺癌處于階段i、階段ii或階段iii。

在另一個實施例中，本發(fā)明的治療方案可以與現有的用于治療癌癥的治療劑聯合使用。為了評估本發(fā)明的治療方案與本文別處描述的抗腫瘤治療劑組合使用的潛在治療功效，可以根據本領域已知的方法測試這些組合的抗腫瘤活性。

在一個方面，本發(fā)明預期到本發(fā)明的治療方案可以與治療劑聯合使用，所述治療劑例如抗腫瘤劑，包括但不限于化療劑，抗細胞增殖劑或任何組合。

本發(fā)明不應限于任何特定的化療劑。相反，任何化療劑可以與本發(fā)明的治療方案一起使用。例如，本發(fā)明包括以下非限制性示例性類別的任何常規(guī)化學治療劑：烷基化試劑、亞硝基脲、抗代謝物、抗腫瘤抗生素、植物堿、紫杉烷類、激素試劑和其他試劑。

烷基化試劑被這樣命名是因為它們能夠在細胞中的條件下向許多電負性基團添加烷基，從而干擾dna復制以阻止癌細胞的繁殖。大多數烷基化試劑是細胞周期非特異性的。在具體的方面，它們通過在dna雙螺旋鏈中交聯鳥嘌呤堿基來阻止腫瘤的生長。非限制性實例包括白消安，卡鉑，苯丁酸氮芥，順鉑，環(huán)磷酰胺，達卡巴嗪，異環(huán)磷酰胺，氮芥鹽酸鹽，美法侖，甲基芐肼，塞替派和烏拉莫司汀。

抗代謝物防止在細胞周期的合成(s)期期間將堿基加入dna，從而阻止正常發(fā)育和分裂?？勾x物的非限制性實例包括諸如5-氟尿嘧啶，6-巰基嘌呤，卡培他濱，阿糖胞苷，氟尿苷，氟達拉濱，吉西他濱，甲氨蝶呤和硫鳥嘌呤的藥物。

有多種抗腫瘤抗生素通常通過干擾細胞分裂所需的酶或通過改變包圍細胞的細胞膜來阻止細胞分裂。該類中包括蒽環(huán)類藥物，例如阿霉素，其通過擾亂dna的結構并終止其功能來阻止細胞分裂。這些試劑是細胞周期非特異性的?？鼓[瘤抗生素的非限制性實例包括放線菌素d、道諾霉素、阿霉素、伊達比星、絲裂霉素c和米托蒽醌。

植物堿抑制或停止有絲分裂或抑制酶，所述酶阻止細胞產生細胞生長所需的蛋白質。常用的植物堿包括長春花堿，長春新堿，長春地辛和長春瑞濱。然而，本發(fā)明不應被解釋為僅限于這些植物堿。

紫杉烷類影響細胞結構中對細胞功能很重要的微管。在正常的細胞生長中，當細胞開始分裂時形成微管，但是一旦細胞停止分裂，則微管被分解或破壞。紫杉烷類抑制微管分解，使得癌細胞被微管變得如此堵塞以至于不能生長和分裂。非限制性的示例性紫杉烷類包括紫杉醇和多西他賽。

激素試劑和類激素藥品用于某些類型的癌癥，包括例如白血病，淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤。他們經常與其他類型的化療藥物一起使用以增強其有效性。性激素用于改變雌性或雄性激素的作用或產生，并用于減緩乳腺癌、前列腺癌和子宮內膜癌的生長。抑制這些激素的產生(芳香酶抑制劑)或作用(它莫西芬)通?？捎米髦委煹妮o助。一些其他腫瘤也是激素依賴性的。它莫西芬是激素試劑的非限制性實例，其干擾促進乳腺癌細胞生長的雌激素的活性。

其它藥劑包括也可用于本發(fā)明的化療劑，例如博來霉素，羥基脲，l-天冬酰胺酶和丙卡巴肼。

抗細胞增殖劑可以進一步定義為細胞凋亡誘導劑或細胞毒性劑。細胞凋亡誘導劑可以是顆粒酶，一種bcl-2家族成員，細胞色素c，一種半胱天冬酶，或其組合。示例性顆粒酶包括顆粒酶a，顆粒酶b，顆粒酶c，顆粒酶d，顆粒酶e，顆粒酶f，顆粒酶g，顆粒酶h，顆粒酶i，顆粒酶j，顆粒酶k，顆粒酶l，顆粒酶m，顆粒酶n，或其組合。在其他具體方面，bcl-2家族成員是例如bax，bak，bcl-xs，bad，bid，bik，hrk，bok，或其組合。

在另外的方面，半胱天冬酶為半胱天冬酶-1，半胱天冬酶-2，半胱天冬酶-3，半胱天冬酶-4，半胱天冬酶-5，半胱天冬酶-6，半胱天冬酶-7，半胱天冬酶-8，半胱天冬酶-9，半胱天冬酶-10，半胱天冬酶11，半胱天冬酶12，半胱天冬酶-13，半胱天冬酶-14，或其組合。在具體方面，細胞毒性劑是tnf-α，白樹毒素，靈菌紅素，核糖體抑制蛋白(rip)，假單胞菌外毒素，艱難梭菌毒素b，幽門螺桿菌vaca，小腸結腸炎耶爾森菌yopt，青紫色素桿菌素、二亞乙基三胺五乙酸、伊洛福芬、白喉毒素、米托潔林、蓖麻毒素、肉毒桿菌毒素，霍亂毒素，皂草素6，或其組合。

在一個實施例中，本發(fā)明的治療方案與抗腫瘤劑組合使用，其中抗腫瘤劑是抗腫瘤烷基化試劑，抗腫瘤抗代謝物，抗腫瘤抗生素，植物來源的抗腫瘤劑，抗腫瘤鉑絡合物，抗腫瘤喜樹堿類衍生物，抗腫瘤酪氨酸激酶抑制劑，單克隆抗體，干擾素，生物反應調節(jié)劑，激素抗腫瘤劑，抗腫瘤病毒劑，血管生成抑制劑，分化劑，pi3k/mtor/akt抑制劑，細胞周期抑制劑，細胞凋亡抑制劑、hsp90抑制劑，微管蛋白抑制劑，dna修復抑制劑，抗血管生成劑，受體酪氨酸激酶抑制劑，拓撲異構酶抑制劑，紫杉烷，her-2靶向藥劑，激素拮抗劑，生長因子受體靶向的藥劑，或其藥學上可接受的鹽。在一些實施例中，抗腫瘤劑是西他濱，卡培他濱，瓦洛他濱或吉西他濱。在一些實施例中，抗腫瘤劑選自由阿瓦斯丁，索坦、索拉非尼、西地尼布、abt-869、阿西替尼、伊立替康、拓撲替康、紫杉醇、多西他賽、拉帕替尼、赫賽汀、拉帕替尼、它莫西芬、甾體芳香酶抑制劑、非甾體芳香酶抑制劑、氟維司群、表皮生長因子受體(egfr)抑制劑、西妥昔單抗、帕尼單抗、類胰島素生長因子1受體(igf1r)抑制劑和cp-751871所組成的組。

在一個實施例中，抗腫瘤劑是化療劑。本文所用的化療劑是在治療癌癥中有效的化合物。化療劑的實例包括烷基化試劑，例如噻替派和環(huán)磷酰胺(癌得星)；烷基磺酸鹽，例如白消安，英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶類，例如苯佐替哌，卡波醌，美妥替哌(meturedopa)和烏瑞替哌(uredopa)；乙烯亞胺和甲基蜜胺(methylamelamines)包括六甲蜜胺，三乙撐蜜胺，三乙烯磷酸胺，三乙烯硫代磷酰胺和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰類(尤其是布拉它辛和布拉它辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氫大麻酚(屈大麻酚，marinol)；β-拉帕錕；拉帕醇，秋水仙堿，樺木酸；喜樹堿(包括合成類似物拓撲替康(hycamtin)，cpt-11(伊立替康，camptosar)，乙酰喜樹堿(acetylcamptothecin)，莨菪亭(scopolectin)和9-氨基喜樹堿(aminocamptothecin))；蘚苔抑制素；多烯酮(callystatin)；cc-1065(包括其阿多來新，卡折來新和比折來新合成類似物)；足葉草毒素；足葉草酸(podophyllinicacid)；替尼泊苷；念珠藻素(cryptophycin)(特別是念珠藻素1(cryptophycin1)和念珠藻素8(cryptophycin8))；多拉司他汀；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成類似物，kw-2189和cb1-tm1)；軟珊瑚醇(eleutherobin)；水鬼蕉堿(pancratistatin)；sarcodictyum；海綿抑制素(spongistain)；氮芥例如瘤可寧、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、二氯甲基二乙胺、鹽酸氧氮芥、美法侖、新氮芥、苯芥膽甾醇、松龍苯芥(prednimustine)、曲磷胺、烏拉莫司??；亞硝基脲類例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素類，例如烯二炔類抗生素(例如卡奇霉素，尤其是卡奇霉素γ1和卡奇霉素ω1(參見例如發(fā)表在agnew,chemintl.ed.engl.，33：183-186(1994)的報道)；達內霉素(dynemicin)，包括達內霉素a；埃斯佩拉霉素；新制癌菌素發(fā)色團和相關有色蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團)，阿克拉霉素(aclacinomysin)、放線菌素、安曲霉素、重氮絲氨酸、博來霉素、放線菌素c(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋紅霉素、嗜癌素、色霉素、放線菌素d、柔紅霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-l-正亮氨酸、阿霉素(包括adriamycin、嗎啉代阿霉素、氰基嗎啉代阿霉素，2-吡咯啉-阿霉素、阿霉素hcl脂質體注射(doxil)、脂質體阿霉素tlcd-99(myocet)、聚乙二醇化(peglylated)脂質體阿霉素(caelyx)和脫氧阿霉素)、表柔比星、依索比星、依達比星、麻西羅霉素、絲裂霉素類例如絲裂霉素c、霉酚酸、諾加霉素、橄欖霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑霉素、鏈脲霉素、殺結核菌素、烏苯美司、凈司他丁、佐柔比星；抗代謝物，例如甲氨蝶呤、吉西他濱(gemzar)、替加氟(uftoral)、卡培他濱(xeloda)、埃博霉素和5-氟尿嘧啶(5-fu)；葉酸類似物，例如二甲葉酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶羅呤、三甲曲沙；嘌呤類似物，例如氟達拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫代鳥嘌呤；嘧啶類似物，例如安息他濱、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷；抗腎上腺藥，例如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦；葉酸補充劑，例如亞葉酸、醋葡醛內酯、醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；思尿嘧啶；安吖啶；比曲比新(bestrabucil)；比生群；依達曲沙(edatraxate)；地佛法明(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依氟鳥氨酸(elfornithine)；依利醋銨(elliptiniumacetate)；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達明(lonidainine)；美登素類例如美登素和安絲菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；噴司他??；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；2-乙肼(2-ethylhydrazide)；甲基芐肼；psk多糖復合物(jhs天然產品，eugene，oreg.)；雷佐生；根霉素；西佐喃；螺旋鍺；細交鏈孢菌酮酸(tenuazoinicacid)；三乙撐亞胺苯醌(triaziquone)；2,2’,2”-三氯三乙胺；單端孢霉烯族毒素(尤其是t-2毒素、疣孢菌素a(verracurina)，桿孢菌素a和蛇形菌素(anguidine))；烏拉坦；達卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷；加西托新(gacytosine)；阿拉伯糖苷(ara-c)；噻替派；紫杉烷，例如紫杉醇(taxol)、紫杉醇白蛋白工程納米顆粒制劑(abraxane)和多西他賽(taxotere)；苯丁酸氮芥；6-硫鳥嘌呤；6-巰基嘌呤；甲氨蝶呤；鉑類藥物，例如順鉑、奧沙利鉑和卡鉑；能夠阻止微管蛋白聚合形成微管的長春花，包括長春花堿(velban)，長春新堿(oncovin)，去乙酰長春酰胺(eldisine，fildesin)和長春瑞濱(navelbine)；依托泊苷(vp-16)；異環(huán)磷酰胺；米托蒽醌；亞葉酸(leucovovin)；諾消靈；依達曲沙；道諾霉素；氨喋呤；伊班膦酸鹽；拓撲異構酶抑制劑rfs2000；二氟甲基鳥氨酸(dfmo)；類維生素a，例如視黃酸，包括貝沙羅汀(targretin)；二膦酸鹽，例如氯膦酸鹽(例如，骨膦或者氯屈瞵酸)，依膦(依替膦酸鈉雙膦酸鹽)、ne-58095、唑來膦酸/唑來膦酸二鈉新型二膦酸鹽制劑(擇泰)、阿侖唑奈(福善美)、氨羥二磷酸二鈉(阿可達)、二膦酸鹽(替魯膦酸鈉片)或者利塞膦酸鹽(利塞膦酸鹽)；曲沙他濱(a1,3-二氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，尤其是那些能夠阻止牽涉到畸形細胞增殖信號通路中的基因表達的，例如，pkc-α，raf，h-ras，和表皮生長因子受體(egf-r)；疫苗，例如theratope.rtm.疫苗和基因治療疫苗，例如allovectin疫苗、leuvectin疫苗和vaxid疫苗；拓撲異構酶1抑制劑(例如，勒托替康)；rmrh(例如，阿巴瑞克)；bay439006(索拉非尼；拜耳)；su-11248(輝瑞)；哌立福辛，cox-2抑制劑(例如，塞來考昔和依托考昔)，蛋白體抑制劑(比如，ps341)；硼替佐米(velcade)；cci-779；替吡法尼(r11577)；索拉非尼,abt510；bcl-2抑制劑，例如反義核苷酸鈉(genasense)；匹克生瓊；egfr抑制劑；酪氨酸激酶抑制劑；和藥物學可接受的鹽，酸或者以上任何一種的衍生物；一起以上兩種或者多種的組合，例如chop，環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿和潑尼松龍的混合療法的縮寫，和folfox，奧沙利鉑(eloxatin)聯合5-fu和亞葉酸治療方案的縮寫。

本文描述的這些方法絕不是全部包括的，并且適合于具體應用的其它方法對于普通技術人員是顯而易見的。此外，組合物的有效量可以通過類似于已知發(fā)揮所需效果的化合物進一步近似。

示例性實施例

通過參考以下示例性實施例進一步詳細描述本發(fā)明。提供這些實施例僅僅是為了說明的目的，并且不旨在是限制性的，除非另有規(guī)定。因此，本發(fā)明決不應被解釋為限于以下實施例，而是應被解釋為包括作為本文提供的教導的結果變得顯而易見的任何和所有的變化。

無需進一步描述，相信本領域普通技術人員可以使用前述說明和以下說明性實施例來制造和利用本發(fā)明并實踐要求保護的方法。因此，以下實施例具體指出了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，并且不應被解釋為以任何方式限制本公開的其余部分。

實施例1：冷凍保存的、預活化的、多劑量的樹突狀細胞疫苗

為了能夠生產這些大規(guī)模疫苗，開發(fā)了使用腫瘤抗原脈沖的完全激活的dc1疫苗的生產過程，由此將完全激活的dc1疫苗冷凍保存為多劑量的注射器即用的6包裝dc1疫苗。dc1如本文別處所述的那樣被冷凍保存和激活。例如，它們在具有40％人血清白蛋白和5％dmso的55％勃脈力培養(yǎng)基中冷凍保存。這些疫苗已經生成并在實驗室中廣泛測試，并且始終滿足由fda設定的向患者施用的質量標準。

現在描述本文公開的實驗和實施例中使用的材料和方法。

制備用于冷凍保存的完全激活的樹突狀細胞

新鮮淘洗的骨髓單核細胞在6孔微量培養(yǎng)板(12×10⁶個細胞/孔)中培養(yǎng)。培養(yǎng)基由無血清培養(yǎng)基(sfminvitrogencarlsbadca)組成。加入的gmcsf的終濃度為50ng/ml，加入的il4的終濃度為1000u/ml。將細胞在37℃，5％co2中培養(yǎng)過夜。在一些批次中，在16-20小時后用適當的肽脈沖細胞，并再培養(yǎng)6-8小時，之后加入1000u/ml的ifn-γ。用tlr激動劑lps(tlr4,10ng/ml)或r848(tlr8,1μg/ml)使樹突狀細胞成熟。成熟期為至少約6小時。之后，tlr激動劑激活的樹突狀細胞已經準備好用于冷凍保存或立即使用。

為了誘導th1極化細胞因子il-12的產生，用細胞因子ifn-γ或tlr激動劑細菌lps和/或r848的組合激活樹突狀細胞。這應該是產生ifn-γ的誘導的t細胞?？蛇x地，樹突狀細胞可以用atp，細菌lta，lps和前列腺素e2(pge2)的組合激活。這可以導致il-23，il-6和il-1β被擴增，引起由分泌il-17和il-22的th17細胞支配的免疫應答。

樹突狀細胞的低溫貯藏

通過溫和刮擦收獲樹突狀細胞。所有培養(yǎng)基和細胞一直保持在濕冰中。通過約800rpm離心10分鐘輕輕洗滌細胞。將細胞(例如，10×10⁶個細胞)冷凍保存在含55％的勃脈力，5％dmso和40％的人血清白蛋白的冷凍培養(yǎng)基中并儲存在液氮中。

現在描述本文提供的實驗的結果。

多劑量的dc1疫苗

進行實驗以評估細胞的復蘇，生活力和無菌性。簡言之，通過組合的白細胞提取逆流淘析獲得外周血單核細胞，并將其在含有gm-csf和il-4的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。第二天，它們用her-2肽，然后用ifn-γ，隨后用lps脈沖。在40小時收集dc1，并在含55％的勃脈力，5％dmso和40％的人血清白蛋白的冷凍培養(yǎng)基中冷凍保存，并儲存在液氮中。1周后，解凍并通過檢測包括生活力、產量、內毒素和無菌培養(yǎng)獲得發(fā)布標準。所有12個培養(yǎng)物中沒有細菌生長和內毒素<0.1eu。圖1說明了冷凍保存的dc1的生活力和產量。如圖1所示，當細胞直接解凍和計數時，細胞的復蘇平均為89％，生活力為95％。這些數據表明，在低于fda允許的7.5％dmso的培養(yǎng)基中dc1疫苗的冷凍保存和生活力可以維持。

觀察到在冷凍保存之后細胞功能維持著。多劑量dc1疫苗解凍后36小時產生il-12和th1趨化因子。解凍的細胞從解凍后約6小時至36小時產生高水平的il-12。這些il-12水平與由冷凍保存的單核細胞制備的dc1疫苗是相當的。

本文提供的結果表明，對乳腺癌上her-2腫瘤靶向抗原敏感的冷凍保存的，預活化的多劑量樹突狀細胞疫苗是治療性的。然而，本發(fā)明可應用于多種其他的病理生理狀況。

多劑量的注射器即用的包裝dc1疫苗可用于her-2非表達性乳腺癌。her-2在所有乳腺癌的約25％中表達。不產生可檢測水平的her-2的乳腺癌可能不易受接種疫苗的影響。為了解決這個限制，可以向疫苗中加入另外的靶蛋白。例如，許多不產生高水平her-2的乳腺癌產生其它相關蛋白，包括her-1和her-3。不希望受任何特定理論的束縛，人們認為將這些其它蛋白加入疫苗將允許以這些其它乳腺癌表型為靶向。

多劑量的注射器即用的包裝dc1疫苗可用于除乳腺癌以外的其他癌癥類型。預期的靶蛋白如her-1，her-2和her-3也可以存在于其他類型的癌癥，包括卵巢癌，前列腺癌，胰腺癌，結腸直腸癌，胃癌，頭頸癌和非小細胞肺癌，及其他常見癌癥。

多劑量的注射器即用的包裝dc1疫苗可用于治療慢性感染性疾病，包括但不限于慢性感染如hiv或丙型肝炎病毒。這里，對這些病毒特異性的蛋白質將取代her-2或其他癌癥蛋白質以調動患者對這些持續(xù)性感染的免疫應答。增強的免疫力將有可能大大降低病毒載量和伴隨的疾病癥狀和進展，或可能有助于完全清除感染。

多劑量的注射器即用的包裝dc1疫苗可用于治療自身免疫性疾病。當免疫系統錯誤地攻擊身體自身正常組織時，會發(fā)生類風濕性關節(jié)炎和狼瘡等疾病。雖然目前的疫苗/免疫治療制劑被設計為啟動和加強免疫應答，但不希望受任何特定理論的束縛，人們相信在疫苗生產期間可以向樹突狀細胞提供體外信號，誘導這些細胞關閉病理性免疫應答。

實施例2：冷凍保存活化的dc1使大規(guī)模樹突狀細胞疫苗可用于癌癥治療

基于樹突狀細胞的疫苗療法是針對多種癌癥的很有前途的定向療法。雖然已經采用多種策略使得樹突狀細胞成熟為一定表型，該表型優(yōu)化了cd4⁺和cd8⁺t細胞對于識別腫瘤抗原決定基的和引起抗腫瘤免疫的敏化，但是仍設計實驗以利用某方法，該方法使用干擾素γ(ifn-γ)、脂多糖(lps)和toll樣受體(tlr)4激動劑在無血清培養(yǎng)基中應用了單核細胞的快速成熟方法，該方法產生成熟的樹突狀細胞，其能夠通過il-12依賴機制引發(fā)致敏作用和使針對th1型應答的免疫應答極化。結果表明這種疫苗策略用作早期乳腺癌的輔助治療的潛力。成熟狀態(tài)下樹突細胞(dc)的冷凍保存允許更容易地生產和可接近個性化治療。

樹突狀細胞的快速成熟

將新鮮成熟的樹突狀細胞(dc1)和在成熟狀態(tài)(cryodcs)冷凍保存并隨后解凍的樹突狀細胞在細胞表面標記物表達確定的表型成熟度、生活力和復蘇方面通過流式細胞術進行比較。通過測量各種細胞因子，特別是白介素12p70(il-12p70)的產量來測定樹突狀細胞的功能。還評估了這些細胞刺激原始cd4⁺和cd8⁺細胞的能力。

在生活力(p＝0.4807)和復蘇(p＝.1220)方面沒有顯著差異(圖2)。

兩個種群具有相似的初始(lps加入后7小時)il-12p70分泌(p＝.0768)。在30小時觀察期內，種群繼續(xù)表現出相當的il-12p70的分泌水平，并在種群之間沒有顯著差異。(圖3)。

在種群和il-1β(p＝0.7690)，il-1α(p＝0.0841)，rantes(p＝0.902)，mdc(p＝0.1514)，il-10(p＝0.1937)，mip-1α(p＝0.2673)，ip-10(p＝0.7366)，il-6(p＝0.24)，il-5(p＝0.0735)，tnf-β(p＝0.9422)，il-15(p＝0.8878)，mip-1β(p＝0.9217)，tnf-α(p＝0.8972)，il-8(p＝0.7844)的產生之間沒有顯著差異。(圖4)。

在dc1和冷凍保存的dcs之間，表示樹突狀細胞成熟度的細胞表面標記物在表達中沒有表現出顯著差異。兩個種群均通過th1極化應答引起抗原特異性cd8+t細胞識別以及非特異性同種抗原cd4+t細胞應答。cd80,83和86在樹突狀細胞成熟度、表達方面沒有顯示出顯著差異。使用來自每個種群共培養(yǎng)的不同供體的cd4+t細胞誘導功能性能力，引起非特異性同種異體抗原應答和分泌inf-γ(dc1s107.40ng/ml和冷凍保存的dc1s129.23ng/ml)的cd4⁺t細胞。兩個種群與腫瘤抗原特異性cd8+t細胞共培養(yǎng)引發(fā)的抗原特異性敏化作用引起了兩個種群的相當的ifn-γ分泌并導致th1極化反應。(圖5)。

本文提供的結果表明dc1的快速成熟方法可以冷凍保存功能上的成熟和維持表型和功能，因此可以用于制造方便注射器即用的dc1以在世界范圍的癌癥治療中使用。

與維持dc1表型以驅動th1極化的免疫應答相結合，本文提供的結果證明冷凍保存的dcs保持了主要致敏t細胞的能力。這也可能涉及成熟策略，因為與使用細胞因子使其成熟的樹突狀細胞相比，使用ifn-γ和lps使其成熟的樹突狀細胞顯示出增強的主要致敏cd4+t細胞的能力。

涉及冷凍保存的成熟樹突狀細胞制劑的本方案可以容易地適應當前的良好生產實踐指南，從而增加新興療法的可用性。

實施例3：來自cd4t細胞和赫賽汀的細胞因子使高表達her-2的乳腺細胞容易受cd8t細胞的殺傷的影響

已經證明高表達her-2的乳腺癌細胞下調細胞表面上的分子，使得這些癌細胞對cd8t細胞“可見”，并允許它們被這些免疫細胞殺死。已經顯示，當與赫賽汀組合時，cd4細胞產生的細胞因子干擾素-γ(ifn-γ)和腫瘤壞死因子-α(tnf-α)引起中度表達和高表達her-2的乳腺癌細胞增加其i類分子表達。作為其結果，cd8t細胞能夠更好地看到乳腺癌細胞并殺死它們或產生細胞因子以將其殺死。

設計試驗以評估赫賽汀與樹突狀細胞疫苗(例如dc1疫苗)聯合使用的治療效果。

設計了將赫賽汀與dc1疫苗聯合使用的i期dcis疫苗試驗。例如，針對具有高her-2表達dcis的患者設計i期試驗使其接受dc1疫苗，dc1疫苗在第1周和第4周與2劑量的赫賽汀聯合使用。不希望受任何特定理論束縛，人們相信，該組合將在具有her-2表達dcis的患者中將完全應答率從30％增加至大于50％。

此外，設計了iii期dcis疫苗試驗。例如，開發(fā)了一種疫苗試驗以防止乳腺癌在具有雌激素非依賴性(er陰性)，her-2陽性dcis的患者中復發(fā)。在研究中有三個治療方式：1)標準治療(手術和放射)，2)在手術前接受dc1疫苗，和3)在手術前接受dc1疫苗加赫賽汀。不希望受任何特定理論的束縛，對治療具有完全應答的那些患者可以避免手術后的放射。還認為該試驗用于證明使用疫苗預防具有dcis的患者的復發(fā)。

此外，設計了在早期浸潤性her-2陽性乳腺癌患者中赫賽汀與i期新輔助dc1疫苗的聯合使用。例如，設計i期試驗以測試赫賽汀和疫苗以及趨化因子調節(jié)劑(例如，趨化因子激活劑)的組合是否可以在手術前消除小的her-2表達性浸潤性乳腺癌，并避免化療的必要。不希望受任何特定理論的束縛，人們相信這種新輔助(手術前)策略，具有添加免疫抗體從而消除免疫應答阻礙的可能性，其可消除對用于治療乳腺癌的有毒化療的需要，因此使免疫治療成為這種疾病的護理標準。也就是說，本文公開的治療方案提供了在使用天然免疫應答根除乳腺癌中前進的一步，該天然免疫應答可以用本發(fā)明的疫苗方案修復。本文討論的方案可以通過改變腫瘤中的免疫應答而將免疫細胞驅動到腫瘤中，并且通過去除細胞的限制使免疫細胞工作更長時間。人們，將dc1疫苗與赫賽汀組合并且還添加趨化因子調節(jié)劑改善乳腺中腫瘤內的免疫細胞的遷移和活性。

不希望受任何特定理論束縛，人們相信在許多癌癥中，如果存在大量良好的免疫抗爭細胞，那些患者在任何類型的治療中都做得更好。這意味著，如果在腫瘤被移除之前在腫瘤中獲得免疫細胞以抵抗腫瘤，那么患者可能會更好，并更好地響應其他療法，包括手術，化療和放射。

不希望受任何具體的限制，治療癌癥的有效療法將包括藥劑，該藥劑在手術之前快速改變腫瘤中的免疫應答以改善乳腺癌和其他類型癌癥患者的結果。該策略可以應用于多種癌癥，包括但不限于結腸癌，黑素瘤，肺癌，腦癌，胰腺癌，前列腺癌，食道癌等。

設計實驗開發(fā)免疫熒光測定，以測量和定量檢測在接種疫苗后遷移到乳房中的免疫細胞的類型，產生的能引來細胞的趨化因子的類型，以及這些細胞表達的用于幫助消除癌細胞的分子。這些測定允許多個細胞類型在同一時間可視化并顯示它們在腫瘤微環(huán)境中的位置。已經觀察到，至少在一些接種疫苗的患者中，其腫瘤產生趨化因子將細胞募集到環(huán)境中以殺死腫瘤細胞。

實施例4：her-2和her-3的阻斷的組合

本文提供的結果證明對her-2和her-3的組合阻斷與抗her-2cd4th1細胞對于引起表達her-2的乳腺癌的永久腫瘤衰老是極其有效的。

觀察到，her-2和her-3的組合阻斷以及來自cd4th1細胞的tnf-α和ifn-γ的加入導致表達her-2的乳腺癌幾乎完全衰老。這一點已經在高度表達和中度表達her-2+的乳腺癌細胞的幾種不同的細胞系中證實。結果證明這種組合對預防和預防復發(fā)有功效。

現在描述這些實驗中使用的材料和方法。

細胞培養(yǎng)和處理

從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(manassas，va)獲得人類乳腺癌細胞系sk-br-3，bt-474，mcf-7，t-47d，hcc-1419和mda-mb-231，這些人類乳腺癌細胞系在補充有10％fbs(cellgro，herndon，va)的rpmi-1640(lifetechnologies，grandisland，ny)中生長。jimt-1細胞獲自俄亥俄州立大學(俄亥俄州，哥倫布)，并在相同的完全培養(yǎng)基中生長。從karmanoscancerinstitute(detroit，mi)獲得正常無限增殖化mcf-10細胞，其在補充有10mmhepes，10μg/ml胰島素，20ng/mlegf，100ng/ml霍亂毒素，30mm碳酸氫鈉，0.5μg/ml氫化可的松和5％胎馬血清的rpmi-1640中生長。所有細胞在37℃，濕潤的5％co2培養(yǎng)箱中生長。

將30萬個乳腺癌細胞用指定濃度的人重組tnf-α(r&dsystems，明尼阿波利斯，mn)和人重組ifn-γ(r&dsystems)處理5天，然后在不存在細胞因子的條件下培養(yǎng)兩代以上。將細胞進行衰老相關的β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)檢測或裂解，并進行p15ink4b和p16ink4a的蛋白質印跡分析。

在一些情況下，將細胞用10ug/ml的曲妥珠單抗和帕妥珠單抗(基因科技，舊金山，加利福尼亞州)處理指定的時間。將該處理與細胞因子或與人重組調節(jié)蛋白(r&dsystems)組合。

在transwell系統(bd生物科學，圣何塞，加利福尼亞州)的下面的腔室中培養(yǎng)相同量的細胞，與之共同培養(yǎng)的是上面腔室中的10x10⁵個人類cd4⁺t細胞和10⁵個成熟(即1型極化)或未成熟的人樹突狀細胞。樹突狀細胞和cd4⁺t細胞獲自選擇的試驗受試者(sharmaetal.,2012cancer118:4354-4362)。在37℃下用來自ii類的her2或對照無關(braf和存活)肽(20μg/ml)將成熟和未成熟的樹突狀細胞脈沖5天。對照孔僅含有cd4⁺t細胞。此外，將0.5×10⁵個細胞在樹突狀細胞/cd4⁺t細胞共培養(yǎng)上清液存在的條件下在37℃下孵育5天。在兩種方法中，然后在不存在細胞因子的情況下將細胞培養(yǎng)2代以上，并進行衰老研究(sa-β-gal活性在ph6和p15ink4b和p16ink4a蛋白質印跡)或凋亡研究(裂解的半胱天冬酶-3蛋白質印跡)。在與樹突狀細胞和cd4⁺t細胞的共培養(yǎng)物孵育之前的60分鐘，將以下抗體加入細胞，以中和th1涉及的細胞因子：多克隆山羊igg抗人tnf-α(0.06μg/ml每0.75ng/ml的tnfα)和ifn-γ(0.3μg/ml每5ng/ml的ifn-γ)和山羊igg同種型作為相應的陰性對照(均來自r&dsystems)。

質粒轉染

用2μg的野生型her2表達載體(pcdnaher2)瞬時轉染mda-mb-231細胞48小時。作為對照，用2μg空載體(pcdna3)轉染細胞。兩種載體都由markgreene博士(賓夕法尼亞大學，費城，賓夕法尼亞州)友情提供。在不含抗生素的完全培養(yǎng)基中用turbofect(thermoscientific，waltham，ma)轉染細胞。轉染后48小時通過蛋白質印跡評價轉染效率。

rna干擾(rnai)轉染

小干擾rna(sirna)smart庫：靶向加her2sirnasmart庫，靶向加her3sirnasmart庫；靶向加非靶向庫均購自dharmacon-thermoscientific。使用以下靶序列：her2:uggaagagaucacagguua(seqidno.1),gagacccgcugaacaauac(seqidno.2),ggaggaaugccgaguacug(seqidno.3),gcucaucgcucacaaccaa(seqidno.4)；her3:gcgaugcugagaaccaaua(seqidno.5),agauugugcucacgggaca(seqidno.6),gcaguggauucgagaagug(seqidno.7),ucgucauguugaacuaua(seqidno.8)；非靶向的:ugguuuacaugucgacuaa,ugguuuacauguuguguga,ugguuuacauguuuucuga(seqidno.9),ugguuuacauguuuuccua(seqidno.10)。使用rnaimax脂質體(美國生命技術公司)在無血清培養(yǎng)基中將sirna序列(25nm)轉染三十萬個細胞，并且在1小時后，在培養(yǎng)基中補充10％fbs。16小時后，對細胞進行48小時的血清饑餓，接著進行各種指定的處理和蛋白質印跡以檢查表達水平。

sa-β-gal在ph6的活性

將細胞在pbs中洗滌兩次，固定在3％甲醛中，并再次在pbs中洗滌。根據制造商的說明書，將細胞與染色溶液在37℃(無co2)孵育過夜，所述染色溶液是來自millipore(billerica，ma)的新鮮制備的與衰老相關的酸性β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)染色溶液。

蛋白質印跡分析

從mcf-10a，sk-br-3和mcf-7，t-47d或mda-mb-231細胞制備裂解物。將細胞在含有50mmtris(ph7.4)，150mmnacl，1mmedta，1mmegta，10％甘油，70％tergitol，0.1％sds，1mmmgcl2和蛋白酶抑制劑混合物(sigma-aldrichst.louis，mo)的緩沖液中裂解。裂解物在4℃以12,000×g離心15分鐘。將蛋白質溶解在樣品緩沖液(lifetechnologies)中并進行sds-page。將蛋白質電印跡到pvdf上。用以下抗體對膜進行免疫印跡：全半胱天冬酶來自圣克魯茲生物技術公司(santacruz，ca)的p15ink4b(k-18)，p16ink4a(50.1)，ifn-γrα(c-20)，her3(c-17)；來自sigma-aldrich的黏著斑蛋白(v9131)；來自細胞信號技術(danvers，ma)的her2(29d8)，裂解的半胱天冬酶-3(8g10)和tnf-r1(c25c1)。洗滌后，將膜與hrp綴合的第二抗體(bio-rad，hercules，ca)孵育。通過使用增強化學發(fā)光(ecl)蛋白質印跡檢測系統蛋白質印跡分析來觀察條帶。

細胞死亡的流式細胞術分析

sk-br-3細胞未處理，用ifn-γ(100u/ml)和tnf-α(10ng/ml)處理，用曲妥單抗(10μg/ml)和帕妥珠單抗(10μg/ml)處理，或用ifn-γ，tnf-α，曲妥珠單抗和帕妥珠單抗的聯合處理24小時。孵育后，根據制造商的說明書，使用fitc-膜聯蛋白v凋亡檢測試劑盒(bd生物科學)測定誘導凋亡。簡言之，收集未處理和處理的skbr-3細胞，用pbs洗滌并以1×10⁶個細胞/ml的濃度重懸于膜聯蛋白v結合緩沖液中。將100μl細胞懸浮液與5μlpi和5μlfitc-膜聯蛋白v在室溫下在黑暗中一起孵育15分鐘。孵育后，加入150μl膜聯蛋白v結合緩沖液，并使用bdaccuric6流式細胞術(bd生物科學)分析誘導凋亡，并用cflowplus軟件分析數據。將經uv照射的細胞用作陽性對照。

腫瘤發(fā)生研究

對于異種移植實驗，將sk-br-3(在200μlpbs中的2×10⁶個細胞/小鼠)注射到6周齡雌性oathymic(裸)小鼠(foxnnu，harlamlaboratories，5只小鼠/組)的脅腹中。當腫瘤可觸知時時，用曲妥珠單抗和帕妥珠單抗(30ug/kg)皮下處理動物，然后每周兩次用hrtnf-α和hrifn-γ(10ng/kg)對動物進行皮下注射。通過觸診監(jiān)測腫瘤形成，并用卡尺每周兩次測定腫瘤體積(mm³)：寬度2×長度/2。所有動物實驗均按照機構指南進行。

現在描述試驗結果。

th1細胞因子tnf-α和ifn-γ協同誘導乳腺癌細胞中的衰老

sk-br-3細胞與人類重組腫瘤壞死因子α(tnf-α)和干擾素γ(ifn-γ)單獨的或組合的在37℃下孵育5天以研究免疫系統細胞產生的細胞因子是否可以誘導腫瘤細胞的特異性衰老應答。然后將細胞再培養(yǎng)2代以上并進行衰老研究。兩種細胞因子的組合引起sk-br-3細胞的衰老誘導，這通過與衰老相關的酸性β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)染色的增加(圖6a)和衰老相關標記物p15ink4b和p16ink4a的更高表達(圖6b)得以證明，其通過與蛋白質印跡檢測對照未處理細胞或每種細胞因子單獨使用的結果相比較獲得。在bt-474，mcf-7和t-47d乳腺癌細胞系(數據未顯示)中觀察到了相似的結果。因此，用10-100ng/ml的幾種濃度的tnf-α和100-1000u/ml的幾種濃度的ifn-γ或其組合來處理t-47d細胞。觀察到衰老表型的誘導是劑量依賴性的(圖6c)。在sk-br-3，bt-474和mcf-7細胞中發(fā)現類似的結果。

乳腺癌細胞中的her2表達水平與誘導衰老所需的th1細胞因子tnf-α和ifn-γ劑量之間的逆相關

設計試驗以確定her2表達水平是否在衰老中起作用，所述衰老是通過用tnf-α和ifn-γ在37℃下處理5天，隨后沒有細胞因子的sk-br-3，bt-474，mcf-7，t-47d和mda-mb-231乳腺癌細胞傳代2次以上的方式誘導的，事實上，與具有更高細胞因子濃度的、中度表達her2的細胞系(t-47d，圖6d和mcf-7，數據未顯示)相比，在具有較低劑量的tnf-α和ifn–γ的、高度表達her2的細胞系(sk-br-3，圖6d和bt-474，數據未顯示)中sa-β-gal陽性細胞增加。然而，即使最高濃度的tnf-α和ifn-γ也不能在低her2的表達細胞系mda-mb-231中誘導衰老(圖6d)。這些結果清楚地證明了tnf-α和ifn-γ誘導衰老和her2表達水平之間的相關性。

mda-mb-231乳腺癌細胞中，her2是th1細胞因子tnf-α和ifn-γ介導的衰老和凋亡所必需的

僅當用野生型her2質粒(pcdnaher2)穩(wěn)定轉染mda-mb-231細胞并用高濃度的tnf-α(200ng/ml)和ifn-γ(2000u/ml)在37℃下處理5天，然后在不存在細胞因子的情況下再傳代2次以上時，sa-β-gal陽性細胞(圖7a)和p15ink4b表達(圖7b)有強烈增加。值得注意的是，由于發(fā)現當用最高濃度的tnf-α和ifn-γ培養(yǎng)her2-mda-mb-231細胞時，不僅存在相對更高的藍色衰老細胞，而且細胞量顯著更少的，因此重復實驗，并對細胞進行蛋白質印跡以檢測活性半胱天冬酶-3(圖7b)。在上述相同條件下組合使用濃度漸增的tnf-α(75至200ng/ml)和ifn-γ(750至2000u/ml)處理用對照空載體(pcdna3)轉染的細胞，通過sa-β-gal染色(圖7a)或p15ink4b和裂解的半胱天冬酶3表達(圖7b)評估衰老誘導，該處理對衰老誘導沒有影響。這一發(fā)現強化了在乳腺癌細胞中，her2在誘導衰老和凋亡的tnf-α和ifn-γ機制中是必需的。

細胞因子受體在乳腺細胞系中以相似的水平表達

就像低her2正常無限增殖化mcf-10乳腺細胞系那樣，高her2表達細胞系sk-br-3和bt-474，中度her2表達細胞系mcf-7和t-47d和低表達her2的mda-mb-231乳腺癌細胞系，通過蛋白質印跡分析顯示出相似的ifn-γ和tnf-α受體表達(圖12)。該結果證明這兩種細胞因子受體的表達水平與her2表達水平無關。這與描述這些細胞因子在正常乳腺不同階段行動的報告相一致。tnf-α已經涉及正常乳腺的增殖，發(fā)育和分支形態(tài)發(fā)生(lee等人，2000endocrinology141：3764-3773)。受體tnfr1的表達介導了誘導tnf-α的乳腺上皮細胞增殖，并且tnfr2的激活誘導了酪蛋白積聚(varelaetal.,1996endocrinology137:4915–4924)。類似地，ifn-γ的活性形式與其在幾乎所有正常細胞表面上表達的受體相互作用(ealicketal.,1991science252:698–702；farraretal.,1993annu.rev.immunol.11:571–611)。

組合的her2和her3阻斷表達增強了乳腺癌細胞中的th1細胞因子tnf-α和ifn-γ衰老誘導。

先前的結果引起了對用sirna敲低her2和her3的效果的研究，在先前的結果中顯示用細胞因子組合處理的高her2表達和中等her2表達細胞系中衰老和凋亡表型增強了。通過幾個研究(lee-hoeflichetal.,2008cancerres.14:5878-87；berghoffetal.,2014breast14:s0960-9776)證明了在乳腺癌中阻斷her2/her3信號傳導的治療益處。盡管her-3耗盡的細胞中tnf-α和ifn-γ的聯合治療沒有增加衰老或凋亡細胞的數量，但是用her2和her3sirna的雙重敲低大大增加了sk-br-3細胞中的p15ink4b表達水平(圖8b)和sa-β-gal染色水平(圖8a)。同時，通過活性半胱天冬酶-3的蛋白質印跡，觀察到用雙敲低和細胞因子處理的細胞的凋亡誘導更高(圖8a)。在mcf-7細胞(圖13)，bt-474和t47d細胞中發(fā)現類似的結果。

組合的her2抑制和her2-her3二聚化抑制增強了sk-br-3乳腺癌細胞中的th1細胞因子tnf-α和ifn-γ衰老誘導和凋亡

曲妥單抗和帕妥珠單抗是在臨床中廣泛用于治療her2陽性乳腺癌的抗體。為了在直移方法中研究th1細胞因子誘導的衰老和細胞凋亡，設計實驗以用曲妥單抗和帕妥珠單抗預處理sk-br-3細胞，然后在37℃用tnf-α和ifn-γ處理細胞5天，然后在不加細胞因子和抗體的條件下再多傳2代。觀察到，與僅用細胞因子處理的細胞相比，接受完全治療的細胞中藍細胞的量高度增加，如通過sa-β-gal染色(圖9a)和通過蛋白質印跡增強的p15ink4b表達(圖9b)所示。有趣的是，通過蛋白質印跡(圖9b)顯示的增加的活性半胱氨酸蛋白酶3表達和通過流式細胞術分析(圖9c)顯示的增加量的膜聯蛋白v和碘化丙錠陽性細胞，表明雙重處理也對凋亡誘導具有顯著影響。

cd4⁺th1介導的her2過表達人乳腺癌細胞的衰老和凋亡

設計實驗使用transwell培養(yǎng)系統將her2ii型肽引發(fā)的cd4⁺t細胞與sk-br-3乳腺癌細胞共培養(yǎng)，以證實免疫系統細胞在體內產生的細胞因子也可誘導腫瘤細胞中的特異性衰老和凋亡反應。將細胞在37℃下共培養(yǎng)5天，然后在不含免疫系統細胞的完全培養(yǎng)基中再培養(yǎng)2代以上。共培養(yǎng)導致sk-br-3細胞的衰老和凋亡，其通過sa-β-gal染色的增加量(圖10a)和通過蛋白質印跡檢測的p15ink4b和裂解的半胱天冬酶3的表達增加(圖10b)來證明。用未成熟樹突細胞(dcs)或成熟樹突狀細胞加上不相關ii類(braf或存活)肽引發(fā)的cd4⁺t細胞不能誘導sk-br-3細胞的衰老，也不能誘導sk-br-3細胞的凋亡(圖10)。

在transwell中存在曲妥單抗和帕妥珠單抗時，當我們將sk-br-3與her2ii型肽引發(fā)的cd4+t細胞共培養(yǎng)時，觀察到的衰老和細胞凋亡在sk-br-3中高度增強。該結果通過增加的sa-β-gal染色(圖10a)、和p15ink4b和裂解的半胱天冬酶3的表達水平(圖10b)得到清楚地證實。

作為另一種方法，sk-br-3細胞與來自cd4⁺t細胞-成熟樹突狀細胞的共培養(yǎng)物上清液進行共培養(yǎng)，并觀察到類似的特異性衰老反應。從cd4⁺t細胞-成熟樹突狀細胞的共培養(yǎng)上清液中獲得的th1-精制的細胞因子ifn-γ和tnf-α通過先前使用elisa得到了證實。通過兩種實驗方法，sk-br-3衰老和凋亡可以通過中和阻斷抗體的ifn-γ和tnf-α而獲得部分解救(圖14)。

還觀察到，兩種方法中該效應是劑量依賴性的，因為隨著免疫系統細胞數量的增加誘導了sk-br-3細胞中更高的sa-β-gal染色，p15ink4b和裂解的半胱天冬酶3更高的表達水平。

th1細胞因子tnf-α和ifn-γ使曲妥單抗和帕妥珠單抗抗性乳腺癌細胞對衰老和凋亡誘導敏感

為了繼續(xù)解開th1細胞因子可以誘導衰老和細胞凋亡的機制，人們認為tnf-α和ifn-γ可以恢復乳腺癌抗性細胞對曲妥單抗和帕妥珠單抗的敏感性。觀察到與t-47d敏感細胞相反(圖16)，用曲妥單抗和帕妥珠單抗的治療不能防止兩種抗性細胞系hcc-1419(o'brienetal.,2010molcancerther.6:1489-502)和jimt-1(o'brienetal.,2010molcancerther.6:1489-502；tanneretal.,2004molcancerther.12:1585-92)中akt的激活。

在hcc-1419和jimt-1細胞中以劑量依賴性的方式，使用tnf-α和ifn-γ的治療誘導衰老和凋亡。當用曲妥單抗和帕妥珠單抗治療細胞時，即使在較高劑量下也不能證明衰老和細胞凋亡(數據未顯示)(圖11)。然而，通過h1549細胞中的sa-β-gal測定(圖11a，11c)和p15ink4b(圖11b，11d)表達的增加顯示了使用細胞因子和抗體的雙重處理誘導衰老。此外，細胞因子和抗體的組合有效地誘導hcc-1419和jimt-1細胞中的細胞死亡(圖11b，11d)。該結果證明th1細胞因子ifn-γ和tnf-α可以逆轉對廣泛影響癌癥患者的治療劑的抗性。

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