專利名稱：一種治療人宮頸癌的樹突狀細(xì)胞疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療人宮頸癌的樹突狀細(xì)胞疫苗。
背景技術(shù)：
1995年6月，國際癌癥研究中心(IRAC)公布的研究結(jié)果證實(shí)人類乳頭瘤病毒 (humanpapillomavirus, HPV)與宮頸癌有非常密切的因果關(guān)系。HPV至少存在100個(gè) 型別，可分為低危型(如HPV6、 ll等)和高危型(如HPV16、 18、 31、 33、 45和58 等)。高危型HPVs的持續(xù)性感染，其中一部分可導(dǎo)致宿主細(xì)胞發(fā)生宮頸上皮內(nèi)瘤樣 病變(CIN)、宮頸癌以及其它腫瘤，而HPV16、 18是主要高危型別，在HPVs所致的宮 頸癌中占70%左右。高危型HPVs的基因組編碼早期蛋白El、 E2、 E4-7和晚期衣殼蛋 白L1、 L2，但不編碼E3和E8蛋白。早期蛋白主要涉及病毒基因組的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié) 和誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，晚期蛋白L1具有自我組裝成病毒樣顆粒(virus-like particle, VLP)的特性。2006年6月，F(xiàn)DA批準(zhǔn)宮頸癌預(yù)防性疫苗上市，該疫苗利用L1 蛋白能形成VLP，在人和動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生中和性抗體，這是繼HBV之后的癌癥預(yù)防性疫 苗。從長遠(yuǎn)來看，將會減少宮頸癌的發(fā)生。目前臨床上宮頸癌的傳統(tǒng)治療方法療效 不佳，宮頸癌患者化療有效率一般小于20%，放療或手術(shù)后約四成復(fù)發(fā)，且預(yù)后極 差(5年生存率僅3.2%—13%，只能姑息治療)。目前公認(rèn)治療后殘余的HPV病毒顆 ?；駾NA可能是其高復(fù)發(fā)的主要原因之一。研究證明該疫苗不能治療宮頸癌及被 HPVs感染的患者，因此研發(fā)治療宮頸癌的藥物或疫苗是非常必要的，也是宮頸癌研 究的熱點(diǎn)。
宮頸癌的發(fā)生是一個(gè)漸進(jìn)的過程，主要是由于癌蛋白E6和E7分別與p53和RB相 互作用后，基因組在E2區(qū)斷裂，并整合到宿主細(xì)胞染色體上，這一過程使抑癌基因 功能受損、DNA修復(fù)發(fā)生障礙、細(xì)胞凋亡減少、最終導(dǎo)致細(xì)胞永生化；染色體的突 變、雜合子的缺失、原癌基因和端粒酶的激活在HPV誘導(dǎo)的宮頸癌的致病機(jī)制中起 重要作用。HPV感染的CIN和宮頸癌患者體內(nèi)普遍存在免疫缺陷、病人外周血活化T 淋巴細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞總數(shù)下降、CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯減少、MHC表達(dá)下降、NK 細(xì)胞活性下降和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移播散的現(xiàn)象。Langerhan細(xì)胞數(shù)目減少使它遞呈病毒抗原 -HLA給CD4+的功能受損。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的存在，有證據(jù)表明HPV16持續(xù)性感染的患者 體內(nèi)循環(huán)的CD4+CD25hiCTLA4+FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增加，宮頸癌患者宮頸病變處有CD4+CD25hiCTLA4+FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的浸潤，說明宮頸癌患者存在對HPVs感染的 免疫耐受。因此，宮頸癌治療性疫苗的關(guān)鍵是如何增強(qiáng)宿主對HPVs感染的細(xì)胞免疫 和粘膜免疫反應(yīng)，打破免疫耐受。
此外，HPV是一個(gè)多型別的病毒，且缺乏群抗原決定簇，必須要開發(fā)多價(jià)疫苗 才能真正起到防治效果。不同地區(qū)HPV感染型別構(gòu)成比存在差異。大多數(shù)地區(qū)是 HPV16和18型，少數(shù)地區(qū)如西非以HPV45型占優(yōu)勢，在南美則以HPV39型和HPV59型多 見。HPV58型在非洲、北美、南美洲、東南亞及歐洲均較為罕見，在宮頸癌中的感 染率只有2%;而在中國臺灣和香港的宮頸癌患者中，感染率卻相對較高，尤其在香 港的宮頸癌患者中，HPV58的檢出率直追HPV16，高達(dá)33.3%。 Huang等在對中國上海 部分宮頸癌患者腫瘤組織的研究中發(fā)現(xiàn)，HPV陽性標(biāo)本中，HPV52和58的檢出率達(dá)48 %，而通常認(rèn)為的主要致癌的HPV16和18型的陽性率僅為4296。最近陜西等地的統(tǒng)計(jì) 報(bào)導(dǎo)，宮頸癌患者中HPV58檢出率亦高達(dá)近2(m。由于多價(jià)疫苗開發(fā)不僅受載體容量 及生產(chǎn)成本等限制，不常見亞型的保護(hù)效果也很難證實(shí)，目前國外研究仍以l-2價(jià) 最常見病毒類型疫苗為主，國內(nèi)對HPV58型感染亦未足夠重視。迄今國際上進(jìn)入臨 床試驗(yàn)階段的HPV候選疫苗中沒有一個(gè)是針對58亞型的(包括Merck公司的HPV四價(jià) 疫苗)，這極可能導(dǎo)致相當(dāng)長時(shí)間內(nèi)進(jìn)口疫苗在我國不適用。因此，自主開發(fā)針對 我國國情的HPV疫苗迫在眉睫。
宮頸癌的致病因子為外源性高危型HPVs的感染，其早期蛋白E6和E7為癌蛋白， 其持續(xù)表達(dá)為腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化和維持惡性特征所必需，是理想的藥物和治療性疫苗作 用的靶位。治療性疫苗主要以E6和E7作為靶蛋白，其目的是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì) 胞免疫反應(yīng)，清除己感染的HPV，治療由感染引起的癌前病變和腫瘤。但高危型HPV 的E6和E7是公認(rèn)的致癌因子，在HPV相關(guān)的永生化和致瘤性中起著重要作用。E7蛋 白能失活腫瘤抑制蛋白Rb，并有激活端粒酶、活化周期素E和A的作用；E6可通過 E6AP-泛素途徑降解P53蛋白，使P53蛋白控制的G1/S節(jié)點(diǎn)失去控制，導(dǎo)致細(xì)胞染色 體不穩(wěn)定和基因突變增加，使外源DNA整合到染色體中的機(jī)率大大升高；同時(shí)還可 以作用于凋亡相關(guān)蛋白抑制細(xì)胞凋亡、激活端粒酶、維持端粒長度使細(xì)胞永生化。 所以，必須去除E6和E7的轉(zhuǎn)化活性方能用于疫苗構(gòu)建。
研究表明，E6的N端主要與蛋白的穩(wěn)定性有關(guān)，N端發(fā)生缺失突變會顯著影響蛋 白在體外的半衰期。E6的兩個(gè)鋅指區(qū)都是病毒轉(zhuǎn)化活性和引起蛋白反式激活所必需 的，均與蛋白間的相互作用有關(guān)。許多資料證實(shí)，E6的C端含有大多數(shù)的抗原表位。
5Nakagawa等詳細(xì)研究了HPV18型E6蛋白各位點(diǎn)與HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)化和p53失活的關(guān)系， 發(fā)現(xiàn)除鋅指結(jié)構(gòu)外，L-52突變對其影響也非常顯著。
E7蛋白為全長105個(gè)氨基酸殘基的酸性蛋白，是HPV18的主要轉(zhuǎn)化蛋白。E7蛋白 分為3個(gè)功能區(qū)1區(qū)和2區(qū)與腺病毒E1A的第1、 2保守區(qū)高度同源；3區(qū)為鋅指區(qū)。2 區(qū)中的"L-X-E-X-C"被認(rèn)為是結(jié)合Rb的關(guān)鍵位點(diǎn)。研究表明，該位點(diǎn)突變可明顯 降低E7蛋白對猴CA-1細(xì)胞系的轉(zhuǎn)化活性，但并不影響人角化細(xì)胞的永生化，而鋅 指區(qū)的突變則可完全破壞E7蛋白的轉(zhuǎn)化和永生化能力。E7蛋白可能是二聚體的形式 存在，此二聚體以"Cys-X-X-Cys"基序與Zine結(jié)合，l個(gè)鋅指突變會減弱其與Zine 的結(jié)合能力、縮短半衰期、降低穩(wěn)定性、喪失其轉(zhuǎn)化性；而2個(gè)鋅指突變則徹底失 去其與Zine結(jié)合的能力、引起半衰期的嚴(yán)重縮短、完全喪失其轉(zhuǎn)化性，并有可能喪 失抗原性。此外，有研究報(bào)導(dǎo)對HPV16型E7蛋白進(jìn)行T20V突變，可以提高其所誘導(dǎo) 的CTL反應(yīng)，但不影響E6和E7蛋白的功能活性。
近10年來HPV疫苗研究非常活躍，合成多肽疫苗、蛋白質(zhì)疫苗與DNA疫苗一 樣，免疫功效較差，即使輔以各種佐劑，仍不能完全預(yù)防同型HPV感染或使已生成 腫瘤消退，多肽疫苗的應(yīng)用還受MHC-1類分子限制，短期內(nèi)難有大的進(jìn)展。相比之 下，具有長期、大規(guī)模人類接種史的病毒載體疫苗才是目前發(fā)展中國家可行性最強(qiáng) 的HPV疫苗策略。其中腺病毒載體不但外源基因表達(dá)水平高，引起免疫反應(yīng)強(qiáng)而持 久，制備方法成熟，免疫途徑方便，還能誘發(fā)有效粘膜免疫的病毒載體，已取代逆 轉(zhuǎn)錄病毒成為當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的載體。加之近年來復(fù)制缺陷腺病毒不斷重組改良， 其使用安全性已大大增強(qiáng)，用以開發(fā)HPV疫苗的條件進(jìn)一步成熟。
增強(qiáng)宿主的免疫反應(yīng)、突破機(jī)體對腫瘤的自身耐受是成功研發(fā)宮頸癌治療性疫 苗的重要一環(huán)。專業(yè)的APCs網(wǎng)絡(luò)控制免疫和耐受，通過提供前炎性細(xì)胞因子和加工 處理抗原并遞呈給T細(xì)胞，介導(dǎo)對病毒感染和癌細(xì)胞的先天性和獲得性免疫反應(yīng)。 在組織中能捕獲病原體編碼的抗原的DCs被病原體誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)激活，DCs的激活 分為兩期，即成熟期和執(zhí)行功能期，使裝載抗原的DCs遷移到外周淋巴結(jié)激活T細(xì)胞 是—個(gè)基本步驟(Gliboa E. DC-based cancer vaccines丄Clin. Invest. 2007; 117: 1195-1203.)。腫瘤不同于感染性病原體，不產(chǎn)生有助于DCs激活的有效的炎癥反應(yīng)， 結(jié)果是其免疫反應(yīng)非常弱且無效。對于腫瘤患者，免疫治療的主要目的在于克服這 種缺陷，提供使DCs成熟的條件，使之成為有免疫刺激功能的APCs。DCs含有Toll樣受體(Toll-like receptor, TLRs) ， TLR信號通過激活絲裂原激 活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)和核因子-kB (NF-kB)使DCs 成熟，DCs介導(dǎo)各種細(xì)胞因子的表達(dá)。S0CS1在DCs中表達(dá)，SOCSl作為一個(gè)假底物 抑制劑介導(dǎo)JAK2的降解，抑制STAT (signal transducer and activator of transcription) 信號，是諸如IFN-y、 IL-2、 IL-7、 IL-12和IL-15等細(xì)胞因子的重要負(fù)調(diào)節(jié)因子
(Kubo M, Hanada T and Yoshimura A. Suppressors of cytokine signaling and immunity.Nat.Immunol. 2003; 4: 169-176; Alexander WS and Hilton DJ. The role of suppressors of cytokine signaling (SOCS) proteins in regulation of the immune response.Annu. Rev. Immunol. 2004; 22: 503-529) 。 S0CS1基因敲除的新生小鼠死于 不可控制的大量產(chǎn)生的IFN- y (Marine JC， Topham DJ, McKay C, Wang D, Parganas E, Stravopodis D, Yoshimura A， Ihle JN. SOCS1 deficiency causes a lymphocyte-dependent perinatal lethality. Ce〃. 1999; 98:609—616; Alexander WS, Starr R, Fenner JE， Scott CL, Handman E, Sprigg NS, Corbin JE, Cornish AL, Darwiche R, Owczarek CM, Kay TW, Nicola NA， Hertzog PJ， Metcalf D, Hilton DJ. SOCS1 is a critical inhibitor of interferon gamma signaling and prevents the potentially fatal neonatal actions of this cytokine. Ce〃. 1999; 98:597-608)。有研究用RNAi技術(shù)使S0CS1沉默， 處理后的DCs能使已建立黑色素瘤的小鼠腫瘤的生長受到抑制(ShenL， Evel-kabler K， Strube R and Chen SY. Silencing of SOCS 1 enhances antigen presentation by dendritic cells and antigen-specific anti-tumor immunity. Nature Biotechnology. 2004; 22(12): 1546-1553; Evel-kabler K， Song XT, Aldrich M, Huang XF and Chen SY, SOCS1 restricts dendritic cell's ability to break self tolerance and induce antitumor immunity by regulating aIL-12 production and signaling丄Clin. Invest. 2006; 116: 90-100)，表明S0CS1可以作為靶標(biāo)進(jìn)行腫瘤的基因治療，有利于突破機(jī)體對腫瘤 的免疫耐受。
S0CS1的作用的原理為抑制抑制因子或抑制免疫減弱因子。實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)有 不同的方法，如化學(xué)合成RNAi、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、多肽或其相應(yīng)的抗體。但抗體及質(zhì)粒轉(zhuǎn) 染如何進(jìn)入細(xì)胞的問題，多肽和化學(xué)合成的RNAi存在穩(wěn)定性問題，其中合成的RNAi 還存在對細(xì)胞的毒性問題，而復(fù)制缺陷型的腺病毒能有效地解決這個(gè)問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種復(fù)制缺陷型重組腺病毒rAd-RNAi-S0CS1。本發(fā)明所提供的復(fù)制缺陷型重組腺病毒rAd-RNAi-S0CS1是能夠表達(dá)如下雙鏈 RNA的復(fù)制缺陷型重組腺病毒，所述雙鏈RNA的正義鏈的序列如序列表中序列11 所示；所述雙鏈RNA的反義鏈的序列如序列表中序列12所示。
所述雙鏈RNA的編碼shRNA的一條鏈的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列9 所示，所述雙鏈RNA的編碼shRNA的互補(bǔ)鏈的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列 10所示。
所述復(fù)制缺陷型重組腺病毒rAd-RNAi-SOCSl是用Adeno-X表達(dá)系統(tǒng)制備得到的。
上述復(fù)制缺陷型重組腺病毒rAd-RNAi-SOCSl按照如下方法制備
1) 將所述雙鏈RNA的編碼DNA插入Adeno-X表達(dá)系統(tǒng)的RNAi-Ready pSIRN-Shuttle的多克隆位點(diǎn)，得到重組表達(dá)載體RNAi-SOCSl-pShuttle;
2) 用PI-Sce I與I-Ceu I雙酶切所述重組表達(dá)載體RNAi-SOCSl-pShuttle,將得 到的含有所述雙鏈RNA的編碼DNA的酶切片段與Adeno-X表達(dá)系統(tǒng)的Adeno-X病毒 DNA連接，將得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，得到重組腺病毒DNA， 再將該重組腺病毒DNA轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，得到復(fù)制缺陷型重組腺病毒。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種修飾的樹突狀細(xì)胞。 本發(fā)明所提供的修飾的樹突狀細(xì)胞是用復(fù)制缺陷型重組腺病毒
rAd-HPV16, 18， 58mE67和上述復(fù)制缺陷型重組腺病毒rAd-RNAi-SOCSl感染樹突狀
細(xì)胞得到的；
所述重組腺病毒rAd-HPV16， 18， 58mE67是將轉(zhuǎn)錄融合三基因片段插入復(fù)制缺陷 型腺病毒表達(dá)載體得到重組腺病毒載體，再將該重組腺病毒載體導(dǎo)入細(xì)胞中得到重 組腺病毒rAd-HPV16, 18， 58mE67;
所述轉(zhuǎn)錄融合三基因片段包括HPV16mE67、 HPV18mE67和HPV58mE67以及連接 三者的短核苷酸片段；
所述HPV16mE67編碼的氨基酸序列是序列表中序列6;所述HPV18mE67編碼的 氨基酸序列是序列表中序列7;所述HPV58mE67編碼的氨基酸序列是序列表中序列 8;所述連接HPV16mE67、 HPV18mE67和HPV58mE67的短核苷酸片段為核糖體內(nèi)部進(jìn) 入位點(diǎn)。
所述HPV16mE67的脫氧核糖核苷酸序列為序列表中序列1;所述HPV18mE67的 脫氧核糖核苷酸序列為序列表中序列2;所述HPV58mE67的脫氧核糖核苷酸序列為序列表中序列3;所述核糖體內(nèi)部進(jìn)入位點(diǎn)的脫氧核糖核苷酸序列是序列表中序列4。
所述轉(zhuǎn)錄融合三基因片段的脫氧核糖核苷酸序列為序列表中序列5。 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種治療人宮頸癌的重組樹突狀細(xì)胞疫苗。 本發(fā)明所提供的治療人宮頸癌的重組樹突狀細(xì)胞疫苗，它的活性成分是上述重 組樹突狀細(xì)胞細(xì)胞。
含有復(fù)制缺陷型重組腺病毒rAd-HPV16, 18， 58mE67和上述復(fù)制缺陷型重組腺病 毒rAd-RNAi-S0CS1的重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
上述修飾的樹突狀細(xì)胞或重組菌可用于制備預(yù)防和/或治療人宮頸癌疫苗。
根據(jù)我國HPV感染型別的分布特點(diǎn)，選擇HPV16、 18和58這三個(gè)最常見的亞型， 對影響其轉(zhuǎn)化活性和提高CTL反應(yīng)的位點(diǎn)進(jìn)行突變，對E6基因，選擇突變其P53結(jié)合 位點(diǎn)及其中一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)；對E7基因，選擇突變其Rb結(jié)合位點(diǎn)和其中一個(gè)鋅指，在 不影響蛋白穩(wěn)定性和免疫原性的前提下，徹底去除其轉(zhuǎn)化活性。構(gòu)建了各亞型HPV 的E6和E7蛋白的融合基因，并將其轉(zhuǎn)入腺病毒載體中構(gòu)建成重組腺病毒 rAd-HPV16，18， 58mE67。
為了突破機(jī)體對腫瘤的免疫耐受，選用諸如IFN-Y、 IL-2、 IL-7、 IL-12和IL-15 等細(xì)胞因子的負(fù)調(diào)節(jié)因子S0CS1為靶標(biāo)，用RNA沉默技術(shù)(RNA silencing)使S0CS1基 因沉默，然后將其轉(zhuǎn)入腺病毒載體中構(gòu)建成重組腺病毒rAd-RNAi-SOCSl。將重組腺 病毒rAd-RNAi-SOCSl與重組腺病毒rAd-HPV16， 18， 58mE67同時(shí)感染分離培養(yǎng)的DCs， 不需要多肽或蛋白質(zhì)的脈沖，避免了在脈沖過程中加入RNA而導(dǎo)致的降解。然后用 LPS使DCs成熟，回輸體內(nèi)，對荷瘤的個(gè)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，突破機(jī)體對腫瘤細(xì) 胞或病毒感染細(xì)胞的免疫耐受，在小鼠腫瘤模型的治療性實(shí)驗(yàn)中，具有良好的治療 效果。
本發(fā)明的總體方案路線圖如圖l所示。


圖1為實(shí)驗(yàn)的總體方案路線圖
圖2為HPV16、 18和58型E6和E7基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 圖3為重組質(zhì)粒pAdeno-X-HPV16, 18， 58mE67轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞8天后細(xì)胞的形
態(tài)圖4為重組腺病毒rAd-HPV16, 18， 58mE67轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后的Western Blot 檢測結(jié)果
圖5為重組腺病毒rAd-RNAi-S0CS1感染DCs細(xì)胞兩天后細(xì)胞的形態(tài)
圖6A為RT-PCR分析重組腺病毒rAd-RNAi-S0CS1或rAd-RNAi-mS0CSl感染DCs 細(xì)胞48h后S0CS1的表達(dá)
圖6B為感染重組腺病毒rAd-RNAi-SOCSl或rAd-RNAi-mSOCSl的DCs細(xì)胞中 S0CS1 mRNA的相對比例
圖7為荷瘤小鼠的存活率
圖8為CTL檢測結(jié)果
圖9A為產(chǎn)IFN- y脾細(xì)胞的染色結(jié)果
圖9B為ELISPOT試劑盒分析IFN- y的結(jié)果
圖10為各組小鼠血清中IL-12的p40亞單位的水平
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見
《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》 (Sambrook， J. ， Russell, David W.， Molecular Cloning: A Laboratoiy Manual, 3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harbor)。
所用引物及DNA序列如無特別說明均由上海生工合成。 實(shí)施例1、 HPV E6和E7基因的來源及其突變
HPV基因組DNA來自深圳市中醫(yī)院門診病人(年輕女性)的宮頸刮片標(biāo)本，PCR 擴(kuò)增，測序后證實(shí)為HPV的基因組DNA。以該HPV基因組DNA為模板，分別設(shè)計(jì)HPV16、 18和58型E6和E7基因的特異性引物，擴(kuò)增HPV16型E6基因的特異性引物為PI 和P2，擴(kuò)增HPV16型E7基因的特異性引物為P3和P4，擴(kuò)增HPV18型E6基因的特 異性引物為P5和P6，擴(kuò)增HPV18型E7基因的特異性引物為P7和P8，擴(kuò)增HPV58 型E6基因的特異性引物為P9和P10，擴(kuò)增HPV58型E7基因的特異性引物為Pll 和P12 (具體的引物序列如表l所示)，用DNA聚合酶分別擴(kuò)增HPV16、 18和58 型E6和E7基因，并在引物上添加相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，PCR反應(yīng)體系如下
10d證Mixture 1
10XPyrobest Buffer II,
Pyrobest DNA polymerase0.5nl
DNA模板WlOng)
上游引物(20^im)2.5|il
下游引物(20拜)2，
dH2073.5|il
總體積100 pi
PCR反應(yīng)條件先95。C預(yù)變性5min;然后95°C lmin， 56°C lmin， 72°C lmin， 共32個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸lOmin。
對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，具體檢測結(jié)果如圖2所示。其中， M為DL2000 Marker,泳道1-3分別為HPV16、 18和58型E6基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊 脂糖凝膠檢測結(jié)果；泳道4-6分別為HPV16、 18和58型E7基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊 脂糖凝膠檢測結(jié)果。結(jié)果表明，獲得大小為500bp的HPV16、 18和58型E6基因和 大小為300bp的HPV16、 18和58型E7基因。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后分別與pMD18T simple (購自Takara公司)相連并進(jìn)行 測序，測序結(jié)果表明，擴(kuò)增得到的HPV16、 18和58型E6基因的脫氧核糖核苷酸序 列與GenBankAccenssion Number EF029179、 EF202153和D90400的序列一致，擴(kuò) 增得到的HPV16、 18和58型E7基因的脫氧核糖核苷酸序列與GenBankAccenssion Number EU430687、 EF202153和D90400的序列一致。
分別對上述擴(kuò)增得到的HPV16、 18和58型E6和E7基因的與轉(zhuǎn)化活性相關(guān)的 位點(diǎn)以及能增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能的部位進(jìn)行突變，突變后的序列經(jīng)測序分析證實(shí)突變 成功，具體的突變方法如下
以上述HPV16型E6基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以PM1和PM2為引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18T simple相連并進(jìn)行測序，將測序結(jié)果正確的 重組質(zhì)粒命名為pMD18T-16E6ml;再以pMD18T-16E6ml為模板，以PM3和PM4 為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18T simple相連并進(jìn)行測序，將測序 結(jié)果正確的PCR產(chǎn)物命名為HPV16mE6。以上述HPV16型E7基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為 模板，以PM5和PM6為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18T simple相 連并進(jìn)行測序，將測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒命名為pMD18T-16E7ml;再以pMD18T-16E7ml為模板，以PM7和PM8為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 與pMD18T simple相連并進(jìn)行測序，將測序結(jié)果正確的PCR產(chǎn)物命名為HPV16mE7。 以上述HPV18型E6基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以PM9和PM10為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18T simple相連并進(jìn)行測序，將測序結(jié)果正確的重組 質(zhì)粒命名為pMD18T-18E6ml;再以pMD18T-18E6ml為模板，以PM11和PM12 為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18T simple相連并進(jìn)行測序，將測序 結(jié)果正確的PCR產(chǎn)物命名為HPV18mE6。以上述HPV18型E7基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為 模板，以PM13和PM14為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18T simple 相連并進(jìn)行測序，將測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒命名為pMD18T-18E7ml;再以 pMD18T-18E7ml為模板，以PM15和PM16為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物與pMD18T simple相連并進(jìn)行測序，將測序結(jié)果正確的PCR產(chǎn)物命名為HPV18mE7。 以上述HPV58型E6基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以PM17和PM18為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18T simple相連并進(jìn)行測序，將測序結(jié)果正確的重組 質(zhì)粒命名為pMD18T-58E6ml;再以pMD18T-58E6ml為模板，以PM19和PM20 為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18T simple相連并進(jìn)行測序，將測序 結(jié)果正確的PCR產(chǎn)物命名為HPV58mE6。以上述HPV58型E7基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為 模板，以PM21和PM22為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18T simple 相連并進(jìn)行測序，將測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒命名為pMD18T-58E7ml;再以 pMD18T-5犯7ml為模板，以PM23和PM24為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物與pMD18T simple相連并進(jìn)行測序，將測序結(jié)果正確的PCR產(chǎn)物命名為HPV58mE7。 其中，HPV16mE6是將其編碼的氨基酸序列的自氨基末端第57位的亮氨酸(L) 突變?yōu)楦拾彼?G)，第110位的半胱氨酸(C)突變?yōu)楦拾彼?G) ; HPV16mE7是 將其編碼的氨基酸序列的自氨基末端第22位的亮氨酸(L)突變?yōu)楦拾彼?G)， 第91位的半胱氨酸(C)突變?yōu)楦拾彼?G) ; HPV18mE6是將其編碼的氨基酸序列 的自氨基末端第第52位的亮氨酸(L)突變?yōu)楦拾彼?G)，第68位的半胱氨酸(C) 突變?yōu)楦拾彼?G) ， HPV18mE7是將其編碼的氨基酸序列的自氨基末端第第27位的 半胱氨酸(C)突變?yōu)楦拾彼?G)，第98位的半胱氨酸(C)突變?yōu)楦拾彼?G); HPV58mE6是將其編碼的氨基酸序列的自氨基末端第第50位的亮氨酸(L)突變?yōu)楦?氨酸(G)，第66位的半胱氨酸(C)突變?yōu)楦拾彼?G) ; HPV58mE7是將其編碼的 氨基酸序列的自氨基末端第第26位的谷氨酰胺(E)突變?yōu)楦拾彼?G)，第92位的半胱氨酸(C)突變?yōu)楦拾彼?G)。
表l引物設(shè)計(jì)
擴(kuò)增引物引物序列突變引物引物序列
基因編號(5， -3')位點(diǎn)編號(5, -3，)
艦6PlGGG7TWfi4 ATGGACCAAAAGAGA16E6 L57GPM1TTTTCGGGATGGTTGCATAGTATATAG
P2TCTA46T7T CAGCTGGGTTTCTCPM2GCAAAGTCATATACCTCACGTCGC
16E7P3GGC腐C7T CATGGAGATACA16E6 C110GPM3TAATTAGG^GTATTAACTGTCAAAAGCC
P4GG6WCT TTATGGTTTCTGAPM4ACAAATCACACAACGGTTTGTTGTA
16E7 L22GPM5ACTGAT55CTACTGTTATGAGC
PM6TGTCTCTGGTTGCAAATCTAAC
18E6P5TAtf釘7T ATGGCGCGCTTTGA16E7 C91GPM7AGGAATTGTG^^CCCATCTGTTC
P6CGGGC6TC TTCTACTTGTGPM8AGTGTGCCCATTAACAGGTCTTCCAAAG
18E7P7T6Td CATGGACCTAAGG18E6 L52GPM9CATTTAAAGAT迎ATTTGTGGTGTATAGA
P8TTTCTO^C1 TTACTGCTGGGAPM10CAAATTCAAATACCTCTGTAAGTTCCAA
18E6 C68GPM11GCATGCCATAAAgGTATAGATT
PM12AGCATGGGGTATACTGTCTCTA
58E6P9TTAOT(S4ff ATGTTCCAGGACG18E7 C27GPM13GTTGACCTTCTA gGTCACGAGCA
P10GGCft!47TC CACTTGTGTTTGTCPM14CGGAATTTCATTTTGGGGC
58E7PllTC(J雄7T AGAGGAAACAACCC18E7 C98GPM15CTGTCCTTTGTG^GTCCGTGGTGT
P12TGC6K47CT TGTTTATTGCTGPM16GGTGTTCAGAAACAGCTGCTGGAATG
P12'TT6Tft7(X6V: TGTTTATTGCTG58E6 L50GPM17TTGCAGATGGCAGAATAGTGTATAGAG
PM18ATACAAAGTCATATACCTCAGATCGCTG
IRESP13TTC^7CT TTACCTCTCCCTC58E6 C66GPM19AGTATGTAAAGTGgGCTTACGATTGC
P14GCG^77T GGTGGCCATAPM20GCAAATGGATTTCCATCTCTATACAC
P14'TACTCK4C1 TGTGGCCATATTATC58E7 E26GPM21ATTCTGCTACG^CAATTATGTGAC
PM22AGGTCAGTTGGTTCAGGATGTAAATC
58E7 C92GPM23CATTGTGQGCCCTAGCT
PM24GTACATGTGCCCATAAGCA
注表中斜體字部分為酶切位點(diǎn)，帶下劃線部分為突變位點(diǎn)。 實(shí)施例2、融合基因的獲得及mE67基因轉(zhuǎn)化活性去除情況檢測 一、融合基因的獲得
用T-Vector載體(購自Takara公司)分別將上述實(shí)施例1獲得的野生型HPV16 的E6和E7基因、HPV18的E6和E7基因、HPV58的E6和E7基因以及突變后的HPV16 的mE6和mE7基因、HPV18的mE6和mE7基因、HPV58的mE6和mE7基因相連接， 產(chǎn)生融合基因HPV16E67、HPV18E67、HPV58E67、HPV16mE67、HPV18mE67和HPV58mE67， 具體的連接方法如下將HPV16E6、HPV16mE6用引物Pl、 P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，HPV16E7、HPV16mE7用引物P3、 P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳產(chǎn)物分別用歷'"dl1進(jìn)行酶切，回收 酶切產(chǎn)物，將HPV16E6與HPV16E7， HPV16mE6與HPV16mE7經(jīng)酶切后的產(chǎn) 物用T4連接酶進(jìn)行連接，然后以連接產(chǎn)物為模板，以P1和P4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18T simple相連，將得到的含有融合基因的載體分別命 名為T-HPV16E67和T-HPV16mE67;同樣的方法，將HPV18E6、 HPV18mE6用引物P5、 P6進(jìn)行PCR擴(kuò)增，HPV18E7、 HPV18mE7用引物P7、 P8進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳產(chǎn)物分 別用進(jìn)行酶切，回收酶切產(chǎn)物，將HPV18E6與HPV18E7， HPV18mE6與HPV18mE7 經(jīng)5"WI酶切后的產(chǎn)物用T4連接酶進(jìn)行連接，然后以連接產(chǎn)物為模板，以引物P5 和P8為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18T simple相連，將得到的含有 融合基因的載體分別命名為T-HPV18E67和T-HPV18mE67;將HPV58E6、 HPV58mE6 用引物P9、 P10進(jìn)行PCR擴(kuò)增，HPV16E7、 HPV16mE7用引物Pll、 P12進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 電泳產(chǎn)物分別用Aco^E進(jìn)行酶切，回收酶切產(chǎn)物，將HPV58E6與HPV58E7， HPV58mE6 與HPV58mE7經(jīng)^bo皿酶切后的產(chǎn)物用T4連接酶進(jìn)行連接，然后以連接產(chǎn)物為模板， 以引物P9和P12為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18T simple相連，將 得到的含有融合基因的載體分別命名為T-HPV58E67和T-HPV58mE67。
對T-HPV16mE67、 T-HPV18mE67和T-HPV58mE67質(zhì)粒進(jìn)行測序，結(jié)果表明 HPV16mE67的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1所示，其編碼的氨基酸序列如 序列表中序列6所示；HPV18mE67的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列2所示， 其編碼的氨基酸序列如序列表中序列7所示；HPV58mE67的脫氧核糖核苷酸序列如 序列表中序列3所示，其編碼的氨基酸序列如序列表中序列8所示。
二、 HPV16mE67、 HPV18mE67和HPV58mE67基因轉(zhuǎn)化活性去除情況檢測
1、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的獲得
將上述步驟一獲得的融合基因HPV16E67、 HPV18E67、 HPV58E67、 HPV16mE67、 HPV18mE67和HPV58mE67用vV力el和5<3// 1酶切后，分別連入真核表達(dá)質(zhì)粒 pIRES2-EGFP (購自BD公司)的^力el和"3/^1酶切位點(diǎn)間，得到含有融合基因 HPV16E67的重組表達(dá)載體pIRES2-HPV16E67，含有融合基因HPV18E67的重組表達(dá) 載體pIRES2-HPV18E67，含有融合基因HPV58E67的重組表達(dá)載體pIRES2-HPV58E67， 含有融合基因HPV16mE67的重組表達(dá)載體pIRES2-HPV16mE67，含有融合基因 HPV18mE67的重組表達(dá)載體pIRES2-HPV18mE67和含有融合基因HPV58mE67的重組表 達(dá)載體pIRES2-HPV58mE67。將上述構(gòu)建的重組表達(dá)載體用脂質(zhì)體法(詳見
14Lipofectamin 2000試劑盒說明)分別轉(zhuǎn)染Balb/c 3T3細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，得到含 有相應(yīng)基因的細(xì)胞克隆。同時(shí)以未轉(zhuǎn)入任何真核表達(dá)質(zhì)粒的Balb/c 3T3細(xì)胞作為 對照，用以觀察去轉(zhuǎn)化活性情況。
2、 常規(guī)體外細(xì)胞培養(yǎng)，觀察其接觸抑制情況
將質(zhì)粒pIRES2-HPV16E67、 pIRES2-HPV18E67、 pIRES2-HPV58E67、 pIRES2-HPV16mE67、 pIRES2-HPV18mE67和pIRES2-HPV58mE67分別轉(zhuǎn)染Balb/c 3T3 細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，得到含有相應(yīng)基因的細(xì)胞克隆。培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞3天后， 進(jìn)行光鏡觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pIRES2-HPV16E67、 pIRES2-HPV18E67、 pIRES2-HPV58E67的細(xì)胞呈融合狀并重疊生長，提示失去生長接觸抑制，而轉(zhuǎn)入質(zhì) 粒pIRES2-HPV16mE67、 pIRES2-HPV18mE67、 pIRES2-HPV58mE67的細(xì)胞始終存在接 觸抑制現(xiàn)象。
3、 軟瓊脂培養(yǎng)
在直徑為35mm的塑料培養(yǎng)皿上鋪一層0. 35%的瓊脂，每個(gè)培養(yǎng)皿中分別接種5 X 104個(gè)對數(shù)生長期的上述步驟1獲得的轉(zhuǎn)基因的Balb/c 3T3細(xì)胞和未轉(zhuǎn)入任何真 核表達(dá)載體的Balb/c 3T3細(xì)胞，每種處理5個(gè)重復(fù)，37°C 5%0)2常規(guī)培養(yǎng)3周， 倒置顯微鏡下觀察集落形成情況。結(jié)果表明，在軟瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)2-3周后，轉(zhuǎn) 入質(zhì)粒pIRES2-HPV16E67、 pIRES2-HPV18E67、 pIRES2-HPV58E67的細(xì)胞呈集落性生 長，而轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pIRES2-HPV16mE67、 pIRES2-HPV18mE67、 pIRES2-HPV58mE67的細(xì) 胞和未轉(zhuǎn)基因的Balb/c 3T3細(xì)胞一樣，均未見50個(gè)細(xì)胞以上的集落形成。
4、 裸鼠體內(nèi)致瘤實(shí)驗(yàn)
取Balb/c小鼠(購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，每只小鼠皮下接種5 X106個(gè)上述步驟l的獲得的轉(zhuǎn)基因和未轉(zhuǎn)基因的Balb/c 3T3細(xì)胞，每種細(xì)胞接種 5只小鼠，觀察小鼠皮下成瘤情況。結(jié)果表明，接種40天后，用轉(zhuǎn)入質(zhì)粒 pIRES2-HPV16mE67、 pIRES2-HPV18mE67、 pIRES2-HPV58mE67的Balb/c 3T3細(xì)胞接 種的小鼠和用未轉(zhuǎn)基因的Balb/c 3T3細(xì)胞接種的小鼠無一成瘤，而用轉(zhuǎn)入質(zhì)粒 pIRES2-HPV16E67、 pIRES2-HPV18E67、 pIRES2-HPV58E67的Balb/c 3T3細(xì)胞接種的 小鼠有80%皮下成瘤，瘤的平均直徑為2. 5mm。
軟瓊脂培養(yǎng)和裸鼠體內(nèi)致瘤實(shí)驗(yàn)證明，突變后的三個(gè)亞型的mE67基因已經(jīng)失 去E6和E7基因的轉(zhuǎn)化活性，為疫苗的安全使用提供了保障。
實(shí)施例3、重組腺病毒質(zhì)粒pAdeno-X-HPV16， 18, 58mE67的構(gòu)建將上述實(shí)施例2構(gòu)建的HPV16mE67基因經(jīng)順el和fe/dH酶切后與用同樣酶切 的載體pCDNA 3. 1 (+)相連，產(chǎn)生重組質(zhì)粒pCDNA3. 1 (+) 16mE67;以質(zhì)粒pIRES2-EGFP (購自BD公司)為模版，用P13、 P14為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物分離純化后得到 663bp的IRES2片段，對IRES2片段進(jìn)行測序，其脫氧核糖核苷酸序列如序列表中 序列4所示。將該IRES2片段用"^tHI和雙酶切后連入質(zhì)粒 pCDNA3. 1 (+) 16mE67的勘/zHI和AcoW酶切位點(diǎn)間，得到重組表達(dá)載體pCDNA3. 1( + ) 16mE67-IRES2。將上述實(shí)施例2構(gòu)建的HPV18mE67基因經(jīng)&0皿和酶切后與 用同樣酶切的載體pCDNA 3. 1 (+)相連，產(chǎn)生重組質(zhì)粒pCDNA3. 1 (+) 18mE67;以質(zhì)粒 pIRES2-EGFP (購自BD公司)為模版，用P13、 P14，為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用萬朋別和Xhol雙酶切后連入質(zhì)粒pCDNA3. 1 (+) 18mE67的5朋肌和Xhol 酶切位點(diǎn)，得到重組表達(dá)載體pCDNA3. 1 ( + ) 18mE67-IRES2。然后用和iT oI 雙酶切該pCDNA3. 1 ( + ) 18mE67-IRES2質(zhì)粒，回收1471bp的小片段，并將其連入 上述pCDNA3. 1 ( + ) 16mE67-IRES2的和J力o/位點(diǎn)間，將產(chǎn)生的重組表達(dá)載 體命名為pCDNA 3. 1(+) -Kozak 16mE67-IRES2-18mE67-IRES2。將上述實(shí)施例2構(gòu) 建的HPV58mE67基因用P9、P12，為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)化ol和7Vofl 雙酶切后，與用同樣酶切的載體pCDNA3. l(-) (Invitrogen公司)相連，產(chǎn)生重組 質(zhì)粒pCDNA3. 1 (_) 58mE67，然后用順el和勘I雙酶切上述pCDNA 3. 1 (+) - Kozak 16mE67-IRES2-18mE67-IRES2質(zhì)粒，回收2915bp的小片段，并將其連入上述 pCDNA3. l(-)58mE67的順el和J力ol位點(diǎn)間，將產(chǎn)生的重組表達(dá)載體命名為 pCDNA3. 1(-) 16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67。
用順el和tV"I雙酶切重組表達(dá)載體pCDNA3. 1 (-) 16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67，得到3. 7kb的融合基因 16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67。對該融合基因進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明， 16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列5所 示。
融合基因16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67中均去除了 HPV16mE6、 HPV18mE6和HPV58mE6的E6終止密碼子和HPV16mE7、 HPV18mE7和HPV58mE7的E7 起始密碼子，而保留了E6起始密碼子和E7終止密碼子。以上操作均按常規(guī)分子生 物學(xué)操作規(guī)程及Takara MutanBEST Kit (Takara公司)說明進(jìn)行。
將重組表達(dá)載體pCDNA3. 1 (-) 16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67經(jīng)順el和KI雙酶切后插入穿梭質(zhì)粒pShuttle2 (購自BD公司)的順el和#"1酶切位點(diǎn)間， 得到重組表達(dá)載體pShuttle-16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67。將重組表達(dá)載體 pShuttle2-16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67用PI-Sce I和I-Ceu I雙酶切(New
England Lab公司)，酶切體系如下試劑體積
PI-Sce 1(1 un帥l)2pl
I-Ceu I (5 units/pl)0，
重組表達(dá)載體pShuttle-16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67(500ng/nl)2^1
10xDouble Digest Buffer3^1
醇BSA3^1
dH205pl
總體積30pl
將酶切體系混勻后置37。C水浴中精確酶切3h，回收并純化酶切產(chǎn)物。將回收 的酶切產(chǎn)物用Takara ligation Mixture連入Adeno-X表達(dá)系統(tǒng)(購自BD公司)中的 Adeno-X病毒DNA中，置PCR儀中16。C連接過夜。將連接產(chǎn)物用Swa I酶切消化(Swa I酶切位點(diǎn)位于PI-SceI與I-CeuI之間)，以去除未能與Adeno-X病毒DNA連接的 基因片段。再次回收酶切產(chǎn)物，將融合基因16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67 與Adeno-X病毒DNA正確連接的重組腺病毒載體命名為Adeno-X-HPV16, 18, 58mE67。
用重組腺病毒載體Adeno-X-HPV16, 18， 58mE67轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a， A即抗性平 板挑選陽性克隆，分別以表l中的P3和P4、 P7和P8、 P11和P12為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。提取重組腺病毒載體Adeno-X-HPV16， 18， 58mE67的DNA，將所得的重組質(zhì)粒 命名為pAdeno-X-HPV16， 18， 58mE67。對重組質(zhì)粒pAdeno-X-HPV16,18, 58mE67進(jìn)行 PCR擴(kuò)增、酶切鑒定，將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送上海博亞測序。Pacl酶切 pAdeno-X-HPV16, 18， 58mE67用于轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。
實(shí)施例4、重組缺陷性腺病毒rAd-HPV16， 18， 58mE67的制備與滴度的測定
一、重組缺陷性腺病毒rAd-HPV16， 18， 58mE67的制備
用線性化后的重組質(zhì)粒pAdeno-X-HPV16， 18， 58mE67轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn) 染后的細(xì)胞至細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病態(tài)效應(yīng)(cytopathic effect, CPE)。轉(zhuǎn)染8天后，細(xì)胞 的具體形態(tài)如圖3所示。其中，A為轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pAdeno-X-HPV16, 18， 58mE67的 HEK293細(xì)胞的形態(tài)，B為正常HEK293細(xì)胞的形態(tài)。重組腺病毒rAd-HPV16， 18， 58mE67的制備按照Adeno-X Expression System User Manual進(jìn)行，具體過程如下
(1) 用PBS洗滌上述出現(xiàn)明顯病態(tài)效應(yīng)的HEK293細(xì)胞2次，直接將HEK293細(xì) 胞吹打下來(不用胰酶)，1，500rpm室溫下離心5min; 500|_il PBS重懸細(xì)胞；
(2) -20。C和37"C水浴反復(fù)凍融細(xì)胞3次，每次融化后短時(shí)間混勻細(xì)胞懸液；
(3) 12000rpm室溫離心10min，收集含病毒的上清，加入10%甘油，過濾除菌后 作為重組病毒原液置-70'C凍存?zhèn)溆茫?br> (4) 培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，待細(xì)胞鋪滿瓶底50-70%時(shí)，加入步驟(3)制備的病毒原 液250ul，繼續(xù)培養(yǎng)；
(5) 觀察細(xì)胞的病態(tài)效應(yīng)，待50%以上的細(xì)胞從培養(yǎng)板底浮起時(shí)，重復(fù)上述 (1)-(3)步驟制備重組腺病毒rAd-HPV16，18，58mE67， -20。C存放，以備測定病毒滴
度或進(jìn)一步制備高滴度病毒用。
二、 重組腺病毒rAd-HPV16, 18， 58mE67的滴度測定
因HEK293細(xì)胞能表達(dá)腺病毒活化的早期蛋白El和E3，重組質(zhì)粒 pAdeno-X-HPV16， 18， 58mE67能夠在HEK293細(xì)胞中進(jìn)行包裝并釋放到培養(yǎng)基中，用 超高速離心機(jī)回收上述步驟一制備的重組腺病毒rAd-HPV16， 18， 58mE67，然后用腺 病毒滴定試劑盒測定重組腺病毒的滴度。
三、 熒光顯微鏡觀察
重組質(zhì)粒pAdeno-X-HPV16, 18mE67-EGFP (其構(gòu)建過程同 pAdeno-X-HPV16, 18， 58mE67，用EGFP取代重組質(zhì)粒pAdeno-X-HPV16， 18， 58mE67中 的HPV58mE67基因)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48h后開始，定時(shí)觀察HEK293細(xì)胞表達(dá)綠色 熒光的情況，估算HPV58mE67的表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果表明HPV58mE67在HEK293細(xì)胞中 能表達(dá)。
四、 Western blot檢測
用上述步驟二純化的感染復(fù)數(shù)(MOI)為5: l的重組腺病毒 rAd-HPV16， 18， 58mE67感染COS-7細(xì)胞， 一天后收集細(xì)胞，RIPA裂解細(xì)胞提取蛋白， 分別以小鼠抗人HPV16，18E6單抗(購自Chemicon公司)、HPV16E7單抗(購自 Neomarker公司)、HPV18E7單抗(購自GeneTex公司)和HPV58單抗(購自Santa Cruz 公司)為一抗，Western blot檢測HPV16mE67、 HPV18mE67和HPV58mE67的表達(dá)。
Western blot檢測結(jié)果如圖4所示。其中，泳道1、 3、 5和7表示未轉(zhuǎn)染腺病毒的C0S-7細(xì)胞的Western blot檢測結(jié)果；泳道2、 4、 6和8分別表示轉(zhuǎn)染重組腺 病毒rAd-HPV16， 18， 58mE67的C0S-7細(xì)胞用不同抗體檢測的Western blot檢測結(jié)果。 結(jié)果表明HPV16mE67和HPV18raE67有較高的表達(dá)，但HPV58mE67的表達(dá)量較 HPV16mE67和HPV18mE67的表達(dá)量少，可能存在表達(dá)的極性問題。
實(shí)施例5、 S0CS1 shRNA的設(shè)計(jì)和重組表達(dá)載體RNAi-SOCSl-pShuttle和 RNAi-mS0CS1-pShuttle的構(gòu)建
S0CS1 shRNA的設(shè)計(jì)登錄上海吉瑪生物公司網(wǎng)站進(jìn)行，S0CS1 shRNA的一條鏈 為sh腿-S0CS1(F):
5 ， - m 7to:tacctgagttccttccccttcaagagaggggaaggmctcaggtagtttttt 6" -3'(自
5'末端第6位至第58位是序列表中序列9) ; S0CS1 shRNA的互補(bǔ)鏈為 shRNA-S0CS1(R):5' -W7TCAAAAAACTACCTGAGTTCCTTCCCCTCTCTTGAAGGGGAAGGAACTC AGGTAGf-3，(自5，末端第6位至第58位是序列表中序列10) ; mS0CSl shRNA 的一條鏈為shRNA-mS0CSl(F):
5 ， - W 7TaCTATCTAAGTTACTACCCCTTCAAGAGAGGGGTAGTAACTTAGATAGTTTTTTT 3 ，， mS0CSl shRNA的互補(bǔ)鏈為shRNA-mS0CSl (R):
5， -^7T6AAAAAAACTATCTMGTTACTACCCCTCTCTTGMGGGGTAGTAACTTAGATAGTg -3，， 中間畫線部分為環(huán)序列，TTTTTT為轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，再在每條鏈兩端引入I和fco/ / 的粘性末端。
將合成的shRNA-S0CSl和shRNA-mS0CSl的正義鏈和反義鏈分別退火成為雙鏈 DNA， 20pl復(fù)性反應(yīng)體系為正義鏈lpl、反義鏈lpl、 20XSSC (sigma公司， Cat.S6639) l|il，水17pl。反應(yīng)條件為95。C加熱2min， 72°C 2min， 34°C 2min。 室溫下冷卻lh，分別稀釋至終濃度為40ng/pl。上述shRNA-S0CS1編碼的雙鏈RNA 的正義鏈為5， -CUACCUGAGUUCCUUCCCC-3，(序列表中序列11)，反義鏈為5，-GGGGAAGGAACUCAGGUAG-3，(序列表中序列12)。
將上述稀釋后的雙鏈DNA (shRNA-S0CSl和shRNA-mS0CSl)分別與經(jīng)限制性內(nèi)切 酶5朋z^I和fcoy 7酶切的載體RNAi-Ready pSIREN-Shuttle (購自BD公司)用T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，Amp抗性平板篩選陽 性克隆，搖菌，提質(zhì)粒，^s/z^I和ibo/ 7雙酶切及測序鑒定，將獲得的序列及插入 位置均正確的含有抑制基因表達(dá)的小干擾RNA編碼基因的重組RNAi載體分別命名為 RNAi-S0CSl-pShuttle和RNAi-mS0CS1-pShuttle。
19實(shí)施例6、重組腺病毒rAd-RNAi-S0CSl和rAd-RNAi-mSOCSl的構(gòu)建 一、重組腺病毒rAd-RNAi-SOCSl和rAd-RNAi-mSOCSl的構(gòu)建 將重組表達(dá)載體RNAi-SOCSl-pShuttle和RNAi-mSOCSl-pShuttle分別用PI-Sce I和I-Ceu I (購自BD Clontech公司)進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，用Takara ligation Mixture分別連入Adeno-X表達(dá)系統(tǒng)(購自BD Clontech公司)中的Adeno-X病毒 DNA中，置PCR儀中16r連接過夜。將連接產(chǎn)物用Swal酶切消化(Swal酶切位點(diǎn) 位于PI-SceI與I-CeuI之間)，以去除未能與Adeno-X病毒DNA連接的基因片段。 再次回收酶切產(chǎn)物，將shRNA-SOCSl與Adeno-X病毒DNA正確連接的重組腺病毒載 體命名為Adeno-X-RNAi-SOCSl ，將shRNA-mS0CSl與Adeno-X病毒DNA正確連接的 重組腺病毒載體命名為Adeno-X-RNAi-mSOCSl 。
用重組腺病毒載體Adeno-X-RNAi-SOCSl和Adeno-X-RNAi-mSOCSl分別轉(zhuǎn)化大腸 桿菌DH5ct， A即抗性平板挑選陽性克隆。分別提取重組腺病毒載體 Adeno-X-RNAi-SOCSl和Adeno-X-RNAi-mSOCSl的DNA，將所得的重組質(zhì)粒分別命名為 pAdeno-X-RNAi-SOCS1和pAdeno-X-RNAi-mSOCS 1 。對重組質(zhì)粒pAdeno-X-RNAi-SOCS1 和pAdeno-X-RNAi-mSOCSl進(jìn)行PCR擴(kuò)增、酶切鑒定，將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送 上海博亞測序。Pac I酶切pAdeno-X-RNAi-SOCSl和pAdeno-X-RNAi-mSOCSl用于轉(zhuǎn)染 服K293細(xì)胞。
用線性化后的重組質(zhì)粒pAdeno-X-RNAi-SOCSl和pAdeno-X-RNAi-mSOCSl分別轉(zhuǎn) 染HEK293細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞至細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病態(tài)效應(yīng)(cytopathic effect, CPE)。
重組腺病毒rAd-RNAi-SOCSl和rAd-RNAi-mSOCSl的制備按照Adeno-X Expression System User Manual進(jìn)行，具體過程如下
(1) 用PBS洗滌上述出現(xiàn)明顯病態(tài)效應(yīng)的HEK293細(xì)胞2次，直接將HEK293細(xì) 胞吹打下來(不用胰酶)，1,500rpm室溫下離心5min; 500^1 PBS重懸細(xì)胞；
(2) -2(TC和37'C水浴反復(fù)凍融細(xì)胞3次，每次融化后短時(shí)間混勻細(xì)胞懸液；
(3) 12000rpm室溫離心10min，收集含病毒的上清，加入10%甘油，過濾除菌后 作為重組病毒原液置-7(TC凍存?zhèn)溆茫?br> (4) 培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，待細(xì)胞鋪滿瓶底50-70%時(shí)，加入步驟(3)制備的病毒原 液250ul，繼續(xù)培養(yǎng)；
(5) 觀察細(xì)胞的病態(tài)效應(yīng)，待50%以上的細(xì)胞從培養(yǎng)板底浮起時(shí)，重復(fù)上述(1)-(3)步驟制備重組腺病毒rAd-RNAi-S0CS1和rAd-RNAi-mS0CSl， -2(TC存放，以
備測定病毒滴度或進(jìn)一步制備高滴度病毒用。
二、重組腺病毒rAd-RNAi-S0CS1和rAd-RNAi-mSOCSl的滴度測定 用超高速離心機(jī)回收上述步驟一制備的重組腺病毒rAd-RNAi-SOCSl和
rAd-RNAi-mSOCSl，然后用腺病毒滴定試劑盒測定重組腺病毒的滴度。結(jié)果表明，
重組腺病毒rAd-RNAi-SOCSl的滴度為2.8xlOVfu/ml，重組腺病毒rAd-siDNA-mSOCSl
的滴度為2. 5xl07pfu/ml。
實(shí)施例7、 RT-PCR分析DCs細(xì)胞中SOCSl的表達(dá)
將培養(yǎng)的DCs細(xì)胞(Evel-kabler K, Song XT, Aldrich M, Huang XF and Chen SY. SOCS1 restricts dendritic cell's ability to break self tolerance and induce antitumor immunity by regulating aIL-12 production and signaling丄Clin. Invest. 2006; 116: 90-100)簡單地說，小鼠BM用滅菌的PBS沖洗其后肢的骨髓，用0.83%氯化銨除去 紅細(xì)胞，然后用無血清的RPMI-1640洗三次，每次2分鐘，低速離心5分鐘，最后用 含血清的RPMI-1640在12孔板中培養(yǎng)，并且補(bǔ)充重組小鼠GM-CSF (20ng/ml;PeproTech)， IL-4 (20ng/ml;PeproTech)。在培養(yǎng)后的第二天和第四天， 棄去上清，換上含小鼠GM-CSF (20ng/ml;PeproTech)， IL-4 (20ng/ml; PeproTech) 的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。所有培養(yǎng)物均在37。C 5%濕化的0)2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，未貼壁的粒細(xì) 胞在48小時(shí)后除去，補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)基。培養(yǎng)7天后，用FACS檢測超過80%的細(xì)胞 表達(dá)DC-特異性的標(biāo)記。)用PBS洗滌兩次后，分別提取其總RNA，然后將其反轉(zhuǎn)錄 成cDNA并以此cDNA為模板，以S0CS1-F: 5， -CCAGCCCCTGGCGACACT-3'和S0CS1-R: TGCGGCGCGCGGCGCCGCCACG-3 ，為引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。以GADPH作為內(nèi)參， 擴(kuò)增GADPH的引物為GADPH-F: 5， -ATCACTGCCACCCAGAAGAC-3，和GADPH-R: 5' -ATGAGGTCCACCACCCTGTT-3'。同時(shí)用不含反轉(zhuǎn)錄酶的樣品作為對照，以確保RNA 中不含DNA。
以不同感染復(fù)數(shù)(M0I)的重組腺病毒rAd-RNAi-S0CSl和rAd-RNAi-mS0CSl分別 感染培養(yǎng)的DCs細(xì)胞，以檢測不同MOI的重組腺病毒使DCs細(xì)胞中的SOCSl的表達(dá)受到 抑制的情況。結(jié)果如圖7A所示。其中，泳道l為未感染重組腺病毒的DCs細(xì)胞中SOCSl 的表達(dá)，泳道2為感染復(fù)數(shù)(M0I)為100的重組腺病毒rAd-RNAi-mS0CSl感染DCs細(xì) 胞48h后S0CSl的表達(dá)，泳道3為感染復(fù)數(shù)(M0I)為50的重組腺病毒rAd-RNAi-S0CSl 感染DCs細(xì)胞48h后S0CSl的表達(dá)，泳道4為感染復(fù)數(shù)(MOI)為100的重組腺病毒rAd-RNAi-S0CSl感染DCs細(xì)胞48h后S0CSl的表達(dá)。上述各組細(xì)胞中mRNA的相對比例
(參照GADPH)如圖7B所示。結(jié)果表明，當(dāng)M0I為100時(shí)，感染重組腺病毒 rAd-RNAi-SOCSl的DCs細(xì)胞中SOCSl的表達(dá)受抑制現(xiàn)象最明顯，而用不同MOI的重組 腺病毒rAd-RNAi-mSOCSl感染的DCs細(xì)胞中SOCSl的表達(dá)則沒有明顯的變化，表明重 組腺病毒rAd-RNAi-mSOCSl不能抑制DCs細(xì)胞中SOCSl的表達(dá)。
重組腺病毒感染DCs細(xì)胞兩天后，細(xì)胞的形態(tài)如圖5所示。其中，A為未感染病 毒的DCs細(xì)胞，B為感染重組腺病毒rAd-RNAi-mSOCSl的DCs細(xì)胞，C為感染重組腺病 毒rAd-RNAi-SOCSl的DCs細(xì)胞，D為圖A中的一個(gè)細(xì)胞，形態(tài)清楚，具有典型的DCs特 征。結(jié)果表明，由于腺病毒為復(fù)制缺陷型腺病毒，所以用該復(fù)制缺陷型腺病毒制備 的重組腺病毒感染DCs細(xì)胞2天后未出現(xiàn)細(xì)胞病變，可以作為修飾的樹突狀細(xì)胞使 用。
實(shí)施例8、重組腺病毒感染DCs細(xì)胞及DCs細(xì)胞的成熟
將400ul DCs細(xì)胞以lXl()6個(gè)細(xì)胞/孔的量接種在12孔培養(yǎng)板中。將M0I為100的重 組腺病毒rAd-HPV16， 18， 58mE67和rAd-RNAi-S0CSl以l: l的體積比混合后感染上述 DCs細(xì)胞，將M0I為100的重組腺病毒rAd-HPV16, 18， 58mE67和rAd-RNAi-mSOCSl以l: l的體積比混合后感染上述DCs細(xì)胞。感染8-12小時(shí)后，用PBS洗滌細(xì)胞2-3次，然后 在含有粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和白細(xì)胞介素4 (IL-4)的 RPMI-1640完全培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，用100ng/ml的LPS刺激上述細(xì)胞24h后用PBS洗3 次，然后將轉(zhuǎn)入重組腺病毒rAd-HPV16, 18，58mE67和rAd-RNAi-SOCSl的DCs細(xì)胞，轉(zhuǎn) 入重組腺病毒rAd-HPV16， 18， 58mE67和rAd-RNAi-mSOCSl的DCs細(xì)胞分別稀釋成濃度 為lX104個(gè)細(xì)胞/200ul，準(zhǔn)備回輸?shù)叫∈篌w內(nèi)。
實(shí)施例9、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
雌性C57BL/6(H-2b)小鼠，周齡為3-5周，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 在無特殊病原體的籠子里喂養(yǎng)。 一、抑制腫瘤生長
將培養(yǎng)的TC-1細(xì)胞(上?？蠌?qiáng)生物儀器有限公司)用PBS洗3次后，調(diào)整細(xì)胞密 度為lX107ml，每只小鼠皮下接種200ul上述TC-l細(xì)胞，接種12天后，用手能觸摸 到腫瘤，估計(jì)腫瘤的直徑大小為125ram。將已成瘤的小鼠隨機(jī)分成注射未感染重組腺 病毒的DCs細(xì)胞組(g卩PBS組)、注射感染重組腺病毒rAd-HPV16, 18, 58mE67和 rAd-RNAi-SOCSl的DCs細(xì)胞組、注射感染重組腺病毒rAd-HPV16， 18， 58mE67和rAd-RNAi-mSOCSl的DCs細(xì)胞組，每組10只小鼠。PBS組每只小鼠從后腳墊注射O. 2ml 用PBS稀釋的lX104個(gè)成熟的DCs細(xì)胞；注射感染重組腺病毒rAd-HPV16， 18， 58mE67和 rAd-RNAi-SOCSl的DCs細(xì)胞組，每只小鼠從后腳墊注射O. 2ml 1X1(T個(gè)感染了重組腺 病毒rAd-HPV16， 18， 58mE67和rAd-RNAi-SOCSl的成熟的DCs細(xì)胞；注射感染重組腺病 毒rAd-HPV16， 18， 58mE67和rAd-RNAi-mSOCSl的DCs細(xì)胞組，每只小鼠從后腳墊注射 0. 2ml 1Xl()4個(gè)感染了重組腺病毒rAd-HPV16， 18, 58mE67和rAd-RNAi-mSOCSl的成熟的 DCs細(xì)胞。7天后在上述各組小鼠的腹膜內(nèi)注射5昭LPS (Sigma公司)，觀察小鼠的 腫瘤生長情況。
每周免疫上述各組小鼠一次，連續(xù)免疫2周，每兩天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長 和寬并統(tǒng)計(jì)小鼠的存活率，腫瘤體積的大小按照寬2X長/2計(jì)算。當(dāng)腫瘤大小達(dá)到 2500mm3時(shí)，斷頸處死小鼠。小鼠的存活率結(jié)果如圖7所示。結(jié)果表明PBS組小鼠 在18-24天內(nèi)腫瘤大小達(dá)到2500mm、注射感染重組腺病毒rAd-HPV16， 18， 58mE67和 rAd-RNAi-mSOCSl的DCs細(xì)胞組的小鼠，在52-64天內(nèi)腫瘤大小達(dá)到2500mm、注射感 染重組腺病毒rAd-HPV16， 18， 58mE67和rAd-RNAi-S0CSl的DCs細(xì)胞組的小鼠腫瘤未 見明顯生長，從第一次免疫起22天內(nèi)，60%的小鼠觸摸不到腫瘤。以上結(jié)果說明， 注射感染重組腺病毒rAd-HPV16, 18， 58mE67和rAd-RNAi-S0CSl的DCs細(xì)胞組的小鼠 腫瘤生長明顯被抑制。
二、 CTL反應(yīng)
將上述步驟一的成瘤小鼠隨機(jī)分成PBS組、注射感染重組腺病毒 rAd-HPV16,18, 58mE67和rAd-RNAi-S0CS1的DCs細(xì)胞組、注射感染重組腺病毒 rAd-HPV16， 18， 58mE67和rAd-RNAi-mSOCSl的DCs細(xì)胞組，每組10只小鼠，每周免 疫上述各組小鼠一次，連續(xù)免疫2周，各組的免疫原和免疫劑量均同步驟一。當(dāng)腫 瘤大小達(dá)到2500mm3時(shí)，斷頸處死小鼠并取其脾細(xì)胞作CTL反應(yīng)。具體的實(shí)驗(yàn)過程 如下
將各組小鼠脾的單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)在RPMI1640 (GIBCO/BRL)中，補(bǔ)充10%FCS、 2mM L-谷氨酰胺、lmM丙酮酸鈉(GIBCO/BRL)、 50MM 2-巰基乙醇和50l^g/ml的硫酸 慶大霉素(GIBCO/BRL)。用1 pg/ml合成多肽E7.49-57 (上海生工生物工程技術(shù)服務(wù) 有限公司)分別刺激上述各組小鼠脾的單細(xì)胞7天，7天后分析各組細(xì)胞的裂解活 性。以激活的脾細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，以TC-1細(xì)胞作為靶細(xì)胞，將上述效應(yīng)細(xì)胞和 靶細(xì)胞按照100:1、 33:1和11:1的體積比混合并接種到96孔板中，混合細(xì)胞在37°C條件下5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)，然后用離心機(jī)((Beckman Coulter Canada, Mississauga, ON)以200xg離心5min。從每個(gè)孔收集lOOul培養(yǎng)上清，用試劑盒檢 測乳酸脫氫酶(LDH)的活性。為了檢測自發(fā)的LDH活性，設(shè)培養(yǎng)孔中只有靶細(xì)胞 沒有效應(yīng)細(xì)胞作為對照，檢測最大釋放的乳酸脫氫酶(LDH)的活性。培養(yǎng)孔中加 Triton X-100 (1%質(zhì)量百分含量)表示最大釋放活性。乳酸脫氫酶活性的計(jì)算公式為 (LDHtest—LDHspont)/(LDH total _LDHspont)] x 100 (Shan, B.E., J.S. Hao, Q.X.. Li, and M.Tagawa. Antitumor Activity and Immune Enhancement of Murine Interleukin-23 Expressed in Murine Colon Carcinoma Cells Ce/Mar <fe My/ecw/ar /mmt/wo/ogy. 2006; 3(1), 47-52)。公式中LDH^、 LDHs,和LDH艦分別代表試驗(yàn)孔、自發(fā)釋放孔和 最大釋放孔。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，具體結(jié)果如圖8所示。注射感染重組腺病毒 rAd-HPV16, 18, 58mE67和rAd-RNAi-S0CSl的DCs細(xì)胞組、注射感染重組腺病毒 rAd-HPV16, 18， 58mE67和rAd-RNAi-mS0CSl的DCs細(xì)胞組效應(yīng)細(xì)胞對耙細(xì)胞的裂解 率分別達(dá)81%和67%，而PBS組不到30。/。。結(jié)果表明，注射感染重組腺病毒 rAd-HPV16, 18， 58raE67和rAd-RNAi-S0CS1的DCs細(xì)胞組能產(chǎn)生強(qiáng)烈的CTL反應(yīng)。
由于IL-12受到S0CS1的調(diào)控，因此IL-12被稱作是NK細(xì)胞刺激因子或細(xì)胞毒淋 巴細(xì)胞成熟因子，是介導(dǎo)先天免疫及細(xì)胞免疫的重要細(xì)胞因子，具有強(qiáng)大的抗腫瘤 及抗轉(zhuǎn)移活性。目前，IL-12用于腫瘤和傳染性疾病治療的II期臨床試驗(yàn)。IL-12在 體外對于腫瘤細(xì)胞并沒有直接的作用，但能激活T細(xì)胞及NK細(xì)胞，剌激CD4+T細(xì)胞向 Thl表型分化，Thl細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子可激活CTL和巨噬細(xì)胞。IL-12是血管形成的 強(qiáng)力抑制劑，通過誘導(dǎo)IFN-Y分泌以及產(chǎn)生IP10而抑制血管形成，進(jìn)而抑制體內(nèi)腫 瘤生長。用IL-12檢測試劑盒(購自eBioscience公司)檢測上述各組小鼠血清中IL-12 的p40亞單位，結(jié)果如圖10所示。結(jié)果表明，注射感染重組腺病毒 rAd-HPV16， 18， 58mE67和rAd-RNAi-S0CSl的DCs細(xì)胞組小鼠血清中IL-12的濃度最高， 與其他組相比具有顯著性差異(p<0.05)。
三、ELISPOT分析抗原特異的T細(xì)胞
用ELISP0T試劑盒(購自eBioscience公司)檢測從被免疫的小鼠脾中收集的激活 的抗原特異的細(xì)胞毒T細(xì)胞。具體實(shí)驗(yàn)過程如下
用純化的抗小鼠IFN-Y抗體(購自eBioscience公司)包被96孔硝酸纖維板， 4"C孵育過夜，然后用RMPI-1640完全培養(yǎng)基封閉。加入100iU含l(f個(gè)上述步驟 二獲得的各組小鼠脾細(xì)胞到96孔板中，細(xì)胞作系列稀釋(10倍稀釋)，用lug/ml的E7. 49-57或R187多肽(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)刺激或不刺激上 述各組脾細(xì)胞(RAHYNIVTF對應(yīng)于HPV16E7氨基酸的49-57， Rl87(FLLTRILTI) 對應(yīng)于HbsAgaal83-191)。用PMA(5ng/ral， Sigma公司)作為陽性對照，用R187 或培養(yǎng)基作為陰性對照。培養(yǎng)板在37。C條件下02培養(yǎng)箱中孵育過夜。第二天用 檢測抗體(生物素標(biāo)記的抗小鼠IFN-y抗體)(購自eBioscience公司，試劑盒已 提供)在室溫下孵育2小時(shí)，洗掉沒有結(jié)合的抗體；再加入Streptavidin-服P (購自 eBioscience公司，試劑盒已提供)，室溫下孵育1小時(shí)，洗去沒有結(jié)合的檢測酶復(fù) 合物。培養(yǎng)板用AEC底物染色20分鐘，空氣中干燥過夜，用放大鏡對染色點(diǎn)計(jì)數(shù)， 產(chǎn)IFN-y脾細(xì)胞的染色結(jié)果如圖9A所示(左圖為陰性對照組，右圖為實(shí)驗(yàn)組)， ELISPOT試劑盒分析各組DCs細(xì)胞中IFN-y的表達(dá)結(jié)果如圖9B所示。結(jié)果表明， 注射感染重組腺病毒rAd-HPV16, 18， 58mE67和rAd-RNAi-S0CS1的DCs細(xì)胞組、注 射感染重組腺病毒rAd-HPV16， 18, 58mE67和rAd-RNAi-mSOCSl的DCs細(xì)胞組均能產(chǎn) 生IFN-y的T細(xì)胞。序列表
<160> 12
<210> 1
<211〉 777
<212> DNA 〈213>人工序列
〈400〉 1
atgcaccaaaagagaactgcaatgtttcag gacccacaggagcgacccagaaagttacca60
catttatgcacagagctgcaaacaactata catga/tataatatt6igaatgtgtgtactgc120
aagcaacagttactgcgacgtgaggtatat gactttgcttttcgggatggttgcatagta180
tatagagatgggaatccatatgcagtgtgt gataaatgtttaaagttttattctaaaatt240
agtgagtatag3tstt3ttgttatagtgtg tatggaacaacattagaacagcaa_tacaa_c300
aaaccgttgtgtgatttgttaattaggggt attaactgtcaaaagccactgtgtcctg朋360
ga^a_a_gca_aagacatctggacaaaaagcaa agattccataatataaggggtcggtggacc420
ggtcgatgtatgtcttgttgcagatcatca agaacccgtagagaaacccagctg8agctt480
atgcatggagatacacctacattgcatgaa tatatgttagatttgcaaccagagacaact540
gatggctactgttatgagcaattaaatgac agctcagagg3gga卿tgaaatagatggt600
CC3gCtgg3C犯gcagaaccggacagagcc cattacaatattgtaaccttttgttgcaag660
tgtgactctacgcttcggttgtgcgtacaa agcacacacgtagacattcgtactttggaa720
gscctgttaatgggca_ca_ctaggaattgtg gggcccatctgttctcagaaaccataa777
〈210〉 2
〈211〉 798
〈212〉 腿 〈213〉人工序列
〈400〉 2
26atggcgcgctttgaggatcc aacacggcga ccctacaagc tacctgatctgtgC3Cgg3360
ctgaacacttcactgcaaga catagaaata acctgtgtat attgcaagacagtattggaa120
cttscag3ggtatttgaatt tgcatttaaa gatggatttg tagtgtatagagacagtata180
ccgcatgctgcatgccataa aggtatagat ttctattcta gaattagaga3ttaagatat240
tattcagactctgtgtatgg agacacatta gaaaaactaa ctaacactgggttatacaat300
ttattaataaggtgcctgcg gtgccagaaa ccgttgaatc ca.gcagaaaaacttagacac360
cttaa_tgaa_aaacgacgatt ccacaaaata gctgggcact atagaggccagtgccattcg420
tgctgcaaccgagcacgaca ggagagactc caacgacgca gagaaacacaagtagtcgac480
atgtatggacctaaggcaac attgcaagac attgtattgc atttagagcctcaaaatgaa540
attccggttgaccttctagg tcacgagcaa ttaagcgact cagaggaagaaaacgatgaa600
atagatggagttaatcatca acatttacca gcccgacgag ccgaaccacaacgtcacaca660
atgttgtgtatgtgttgtaa gtgtgaagcc agaattgagc tagtagtagaaagctcagca720
gacgaccttcgagcattcca gcagctgttt ctgagcaccc tgtcctttgtgggtccgtgg780
tgtgcatccc agcagtaa798
<210〉 3
〈211〉 750
<212〉 腿
<213>人工序列
<400> 3
atgttccaggacgcagagga gaaaccacgg acattgcatg atttgtgtcaggcgttggag60
acatctgtgcatga犯tcga attg肌atgc gttgaatgcei gia犯geictttgcsgcgatct120
g鄉(xiāng)t3t3tgactttgtatt tgcagatggc agaatagtgt atagagatggaaatccattt180
gcEigteitgt3aagtgggctt acgattgcta tctaaaataa'gtgagtatag240
tattcgctat9"tggagacac att3gaacaa ac3ctaaaa3 3gtgttta_aatgaaatatt8L300
attagatgtattatttgtca aa_gacca_ttg tgtccacaag a_aaa_a3aaaggcatgtggat360
ggtttcataa tatttcgggt cgttggeicag ggcgctgtgcagtgtgttgg420
agaccccgacgtag8CEi犯c acaagtgg肌ttcatgag3g ga犯c3accc犯cgctaagei480
gaatatattttagatttaca tcctgaacca actgacctat tctgctacggccaattatgt540
g8C3gCtC3gacgaggatga aataggcttg gacgggccag atggacaagcacaaccggcc600
acagctaattactacattgt aacttgttgt tacacttgtg gcaccacggttcgtttgtgt660
caacaaccga cgtacgaacc ctacagcagc tgcttatgggcacatgtacc720attgtgggcc ctagctgtgc acagcaataa
<210> 4
〈211〉 663
〈212> DNA <213>人工序列
〈400〉 4
gatccgcccc tctccctccc ccccccctaa ccggtgtgcg tttgtctata tgttattttc ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc atctggggcc tcggtgcaca tgctttacat gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc acc
<210> 5 〈211〉 3676 〈212> DNA <213〉人工序列
<400〉 5
tctagaatgc eiccaaaagag aactgcaatg ttaccacatt tatgcacaga gctgcaaaca tactgcaagc aacagttact gcgacgtgag atagtatata gagatgggaa tccatatgca aaaattagtg agtatagata ttattgttat
750
cgttactggc cgaagccgcttggaataagg60
caccatattg ccgtcttttggcaatgtg3g120
gagcattcct aggggtctttcccctctcgc180
gaaggaagca gttcctctggaagcttcttg240
caggcagcgg aaccccccacctggcgacag300
agatacacct gc3朋ggcggC3C3aCCCC3360
aagagtcaaa tggctctcctcaagcgtatt420
accccattgt atgggatctgatctggggcc480
gaggttaai犯eiaeicgtctagatgggatctg540
gtgtttagtc gaggttaaaaaaacgtctag600
tttgaaaaac acgatgataatatggccaca660
663
tttc8Lggacc C3caggagcgeicccagaasg60
actataceitg atataatattagaatgtgtg120
gtatatgact ttgcttttcgggatggttgc180
gtgtgtgata aatgttt肌agttttattct240
agtgtgtatg gaacaacatt300t ac aac aaaccgttgtgtgatttgttaatt8ggggtatt3actgtcaaaagccactgtgt360
cctgaagaaaagcaaagacatCtgg3C犯8aagcaaagattccataatataaggggtcgg420
tggaccggtcgatgtatgtcttgttgcagatcatcaagaacccgtagagaaacccagctg■
aagcttatgcatggagatacacctacattgcatgaatatatgttagatttgcaaccagag540
acaactgatggctactgttatgagcaattaaatgacagctca_gaggaggaagatgaaata600
g3tggtCC3gctggacaagcagaaccggacagagcccattacaatattgtaaccttttgt660
tgcaagtgtgactctacgcttcggttgtgcgtacaaagcacattcgtact720
ttgg肌gacctgtt肌tgggcacactaggaattgtggggcccatctgttctcagaaacca780
taaggatccttacctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaat840
肌ggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatg■
tgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctc960
tcgcc肌sggaatgc犯ggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagctt1020
cttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcg1080
acaggtgcctctgcggccaa犯gCC3CgtgtataagatacacctgcaaeiggCggC3C犯C1140
cccagtgccacgttgtgagttggatagUgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcg1200
tattcaacaaggggctgaaggatgcccaga3ggt3ccccattgtatgggatctgatctgg1260
ggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaa3a3aacgtCt,tggg31320
tctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggtta^a^aaa^cgt1380
ctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaeiacacgatgataatatggc1440
caccgaattcatggcgcgctttgaggatccaacacggcgaccctacaagctacctgatct1500
gtgcacgg犯ctgaacacttcactgcaagacatagaaataacctgtgtatattgcaagac1560
agtattggeieicttacagaggtatttgaatttgcatttaaagatggatttgtagtgtatag1620
agacagtataccgcatgctgcatgccataa3ggt3t8geitttctattctagaattagaga1680
attaagatattattcagactctgtgtatggagacacattagaa^aactaactaacactgg1740
gtt3ta_caa_t11 at t aat aaggtgcctgcggtgccagaaaccgttgaatccagcagaaeia1800
acttag3C3Ccttaatgsaaaacgeicggittccacaaaatagctgggcactatagaggcca1860
gtgccattcgtgctgcaaccg￡lgCa_Cg￡lC3gg,gactccaacgacgcaga_ga￡iacac31920
agtagtcgacatgtatggacctaaggcaacattgcaagacattgtattgcatttagagcc1980
tcaaaatgaaattccggttgaccttctaggtcacgagcaattaagcgactcagagg犯ga2040
aaacgatgaaat卿tggagttaatcatcaacatttaccagcccgacgagccgaaccaca2100
acgtcacacaatgttgtgtatgtgttgtaagtgtgaagccagaattgagctagtagtaga2160
aagctcsgc3gacgaccttcgagc3ttcc3gcagctgtttctgagcaccctgtcctttgt2220
gggtccgtggtgtgcatcccagcagtaaggatccttacctctccctcccccccccct肌c2280
gttactggccgaagccgcttgg犯t犯ggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttcc2340
accatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacg2400
agcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggeiatgcaeiggtctgttgaatgtcgtg2460
肌gg卿C3gttcctctggaagcttcttgacgtctgtagcgaccctttgc2520aggcagcgga accccccacc tggcgacagg tgcctctgcg gccaaaagcc acgtgtataa 2580
gatacacctg caaaggcggc acaaccccag tgccacgttg tgagttggat agttgtggaa 2640
agagtcaaat ggctctcctc aagcgtattc aacaaggggc tgaaggatgc ccagaaggta 2700
ccccattgta tgggatctga tctggggcct cggtgcacat gcttteicatg tgtttagtcg 2760
aggttaaaaa aacgtctaga tgggatctga tctggggcct cggtgcacat gctttacatg 2820
tgtttagtcg aggttaaaaa aacgtctagg ccccccgaac cacggggacg tggttttcct 2880
ttgaaaaaca cgatgataat atggccacac tcgagatgtt ccaggacgca gaggagaaac 2940
cacggacatt gcatgatttg tgtcaggcgt tggagacatc tgtgcatgaa atcgaattga 3000
aatgcgttga atgcaaaaag actttgcagc gatctgaggt atatgacttt gtatttgcag 3060
atggcagaat agtgtataga gatggaaatc catttgcagt atgtaaagtg ggcttacgat 3120
tgctatctaa aataagtgag tatagacatt ataattattc gctatatgga gacacattag 3180
aacaaacact aaaaaagtgt ttaaatgaaa tattaattag atgtattatt tgtcaaagac 3240
cattgtgtcc acaagaaaaa aaaaggcatg tggatttaaa caaaaggttt cataatattt 3300
cgggtcgttg gacagggcgc tgtgcagtgt gttggagacc ccgacgtaga caaacacaag 3360
tggaattcat gagaggaaac aacccaacgc taagagaata tattttagett ttacatcctg 3420
aaccaactga cctattctgc tacggccaat tatgtgacag ctcagacgag gatgaaatag 3480
gcttggacgg gccagatgga caagcacaac cggccacagc taattactac attgtaactt 3540
gttgttacac ttgtggcacc acggttcgtt tgtgtatcaa cagtacaaca accgacgtac 3600
gaaccctaca gcagctgctt atgggcacat gtaccattgt gggccctagc tgtgcacagc 兆60
aataaacagc ggccgc 3676
<210〉 6
<211> 258
〈212〉 PRT 〈213〉人工序列
〈400〉 6
Met His Gin Lys
1
Arg Lys Leu Pro 20
lie lie Leu Glu 35
Val Tyr Asp Phe
Arg Thr Ala Met Phe Gin Asp Pro Gin Glu Arg Pro
5 10 15
His Leu Cys Thr Glu Leu Gin Thr Thr lie His Asp
25 30 Cys Val Tyr Cys Lys Gin Gin Leu Leu Arg Arg Glu
40 45 Ala Phe Arg Asp Gly Cys lie Val Tyr Arg Asp Gly
30Asn
65
Ser
Cys
Lys
Ser 145 Met
Arg
50 Pro
Tyr Ala Val Glu Tyr Gin Gin Tyr
Gin
Gin 130 Cys
His
Arg Tyr
85 Asn Lys 100
Pro Leu
Cys
70
Tyr
55 Asp
Lys Cys Leu Cys Tyr Ser Pro Leu Cys
Lys 115
Arg Phe His Cys Arg Ser Gly
Cys Asn
Pro
lie 135 Arg
Glu 120
Arg
Thr
Asp 105 Glu
Gly
Arg
Val
90
Leu
Ser 150
Pro Thr Leu His
Asp Thr 165
Pro Glu Thr Thr Asp Gly Tyr Cys 180
Asp Glu lie
Glu Glu Glu 195 His
Tyr Asp
Ala 210 Arg
Leu
Leu 225
Asp Leu Leu Lys Pro
Tyr Asn
Cys Val
Met Gly 245
lie
Gly 200 Thr
Lys Arg Arg
Lys
75
Tyr
Leu
Gin
Trp
60
Phe Tyr Ser Lys
Gly Thr Thr lie Arg Arg
Thr 140 Thr
His 125 Gly
Glu 170
Glu Gin Leu Asn
Tyr 185
Pro Ala Gly Gin
Phe
Val 215
Gin Ser Thr His 230
Thr Leu Gly lie
Cys
Val
Val 250
Gly Cys
Gly 110 Leu
Leu
95
lie
Asp Arg Cys Gin Leu Lys
Glu 155
Tyr Met Leu Asp
Leu 175 Ser
Lys 220
lie Arg Thr Leu
Asp 235
Gly Pro lie Cys
Ser 255
lie
80
Glu
Asn
Lys
Met
Leu 160 Gin
Ser
Asp 190
Glu Pro Asp
Ala 205
Cys Asp Ser Thr
Glu 240 Gin
〈210〉 7 <211> 265 〈212〉 PRT〈213>人工序列
〈400> 7 Met Ala Arg
1
Leu
Phe Glu Asp Pro Thr Arg 5
Cys Thr
Val Tyr
Phe
Cys
65
Tyr
Lys
50
His
Cys
35
Asp
Glu
20
Lys
Ser Asp Ser
Gly Leu Tyr
Asn Pro
Lys
Ala 145 Met
lie 130 Arg
Ala 115 Ala
Asn 100 Glu
Pro Gin Asn
Glu 180
Leu
Lys Gly lie
Val
85
Leu
Tyr Gly Pro
Lys 165 lie
Asn Thr Ser
Thr Val Leu
Gly Phe Val
Asp
70
Tyr
Val
55
Phe
Lys Leu Arg
Gly His Tyr
Gin Glu Arg
Leu 150 Ala
Arg 135 Gin
Glu
40
Tyr
His 120 Gly
Leu
25
Leu
Tyr Ser
Gly Asp Thr
Leu lie Arg
Cys 105 Leu
Thr Leu Gin
Pro Val Asp
Leu 185
Arg Pro 10
Gin Asp Thr Glu
Arg Asp Ser
Arg lie
75 Leu Glu 90
Leu Arg Asn Glu
Gin Cys His
Arg Arg
Arg Glu 155 Asp lie 170
Leu Gly
Tyr Lys Leu Pro Asp 15
lie Glu lie Thr Cys 30
Val Phe Glu Phe Ala 45
lie Pro His Ala Ala 60
Arg Glu Leu
Lys Leu Thr
Cys Gin Lys 110
Lys Arg Arg
125 Ser Cys Cys 140
Thr Gin Val
Val Leu His
His Glu Gin 190
Asn
95
Pro
Tyr 80 Thr
Leu
Phe His
Asn Arg
Val
Leu 175 Leu
Asp 160 Glu
SerAsp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu lie Asp Gly Val Asn His Gin His
195 200 205
Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gin Arg His Thr Met Leu Cys Met
210 215 220
Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg lie Glu Leu Val Val Glu Ser Ser Ala 225 230 235 240
Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gin Gin Leu Phe Leu Ser Thr Leu Ser Phe
245 250 255
Val Gly Pro Trp Cys Ala Ser Gin Gin 260 265
〈210〉 8
〈211〉 249
〈212〉 PRT <213>人工序列
〈400〉 8
Met Phe Gin Asp Ala Glu Glu Lys Pro Arg Thr Leu His Asp Leu Cys
15 10 15
Gin Ala Leu Glu Thr Ser Val His Glu lie Glu Leu Lys Cys Val Glu
20 25 30
Cys Lys Lys Thr Leu Gin Arg Ser Glu Val Tyr Asp Phe Val Phe Ala
35 40 45
Asp Gly Arg lie Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Phe Ala Val Cys Lys
50 55 60
Val Gly Leu Arg Leu Leu Ser Lys lie Ser Glu Tyr Arg His Tyr Asn 65 70 75 80
Tyr Ser Leu Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Gin Thr Leu Lys Lys Cys Leu 85 90 95Asn Glu lie Leu lie Arg Cys lie lie Cys Gin Arg Pro Leu Cys Pro
100 105 110
Gin Glu Lys Lys Arg His Val Asp Leu Asn Lys Arg Phe His Asn lie
115 120 125
Ser Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Ala Val Cys Trp Arg Pro Arg Arg
130 135 140
Arg Gin Thr Gin Val Glu Phe Met Arg Gly Asn Asn Pro Thr Leu Arg 145 150 155 160
Glu Tyr lie Leu Asp Leu His Pro Glu Pro Thr Asp Leu Phe Cys Tyr
165 170 175
Gly Gin Leu Cys Asp Ser Ser Asp Glu Asp Glu lie Gly Leu Asp Gly
180 185 190
Pro Asp Gly Gin Ala Gin Pro Ala Thr Ala Asn Tyr Tyr lie Val Thr
195 200 205
Cys Cys Tyr Thr Cys Gly Thr Thr Val Arg Leu Cys lie Asn Ser Thr
210 215 220
Thr Thr Asp Val Arg Thr Leu Gin Gin Leu Leu Met Gly Thr Cys Thr 225 230 235 240
lie Val Gly Pro Ser Cys Ala Gin Gin 245
〈210〉 9 〈211> 53 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
<400> 9
ctacctgagt tccttcccct tcaagagagg ggaaggaact caggtagttt ttt 53 <210> 10〈211> 53
〈212> DNA <213>人工序列
<400> 10
aaaaaactac ctgagttcct tcccctctct tgaaggggaa ggaactcagg tag 53
<210〉 11
<211> 19
<212> RNA <213>人工序列
〈400〉 11
CU3CCUg3gU uccuucccc 19
<210〉 12
<211〉 19
〈212〉 RNA 〈213>人工序列
<400〉 12
ggggaaggaa cucaggimg 19
權(quán)利要求
1、表達(dá)如下雙鏈RNA的復(fù)制缺陷型重組腺病毒，所述雙鏈RNA的正義鏈的序列如序列表中序列11所示；所述雙鏈RNA的反義鏈的序列如序列表中序列12所示。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)制缺陷型重組腺病毒，其特征在于所述雙鏈RNA 的編碼shRNA的一條鏈的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列9所示，所述雙鏈RNA 的編碼shRNA的互補(bǔ)鏈的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列IO所示。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的復(fù)制缺陷型重組腺病毒，其特征在于所述復(fù) 制缺陷型重組腺病毒是用Adeno-X表達(dá)系統(tǒng)制備得到的。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的復(fù)制缺陷型重組腺病毒，其特征在于所述復(fù)制缺 陷型重組腺病毒按照如下方法制備1) 將所述雙鏈RNA的編碼DNA插入Adeno-X表達(dá)系統(tǒng)的 RNAi-Ready-pSIREN-shuttle的多克隆位點(diǎn)，得到重組表達(dá)載體 RNAi-SOCSl-pShuttle;2) 用PI-Sce I與I-Ceu I雙酶切所述重組表達(dá)載體RNAi-SOCSl-pShuttle,將得 到的含有所述雙鏈RNA的編碼DNA的酶切片段與Adeno-X表達(dá)系統(tǒng)的Adeno-X病毒 DNA連接，將得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，得到重組腺病毒DNA， 再將該重組腺病毒DNA轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，得到復(fù)制缺陷型重組腺病毒 rAd-RNAi-SOCSl。
5、 一種修飾的樹突狀細(xì)胞，是將復(fù)制缺陷型重組腺病毒rAd-HPV16， 18， 58mE67 和權(quán)利要求1-4中任一所述的復(fù)制缺陷型重組腺病毒感染樹突狀細(xì)胞中得到的；所述重組腺病毒rAd-HPV16, 18， 58mE67是將轉(zhuǎn)錄融合三基因片段插入復(fù)制缺陷 型腺病毒表達(dá)載體得到重組腺病毒載體，再將該重組腺病毒載體導(dǎo)入細(xì)胞中得到重 組腺病毒rAd-HPV16, 18， 58mE67;所述轉(zhuǎn)錄融合三基因片段包括HPV16mE67、 HPV18mE67和HPV58mE67以及連接 三者的短核苷酸片段；所述HPV16mE67編碼的氨基酸序列是序列表中序列6;所述HPV18mE67編碼的氨基酸序列是序列表中序列7;所述HPV58mE67編碼的氨基酸序列是序列表中序列8;所述連接HPV16mE67、 HPV18mE67和HPV58mE67的短核苷酸片段為核糖體內(nèi)部進(jìn)入位點(diǎn)。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的修飾的樹突狀細(xì)胞，其特征在于所述HPV16mE67 的脫氧核糖核苷酸序列為序列表中序列1;所述HPV18mE67的脫氧核糖核苷酸序列 為序列表中序列2;所述HPV58mE67的脫氧核糖核苷酸序列為序列表中序列3;所 述核糖體內(nèi)部進(jìn)入位點(diǎn)的脫氧核糖核苷酸序列是序列表中序列4。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的修飾的樹突狀細(xì)胞，其特征在于所述轉(zhuǎn)錄融合三基 因片段的脫氧核糖核苷酸序列為序列表中序列5。
8、 一種治療人宮頸癌的修飾的樹突狀細(xì)胞疫苗，它的活性成分是權(quán)利要求5-7 中任一所述的修飾的樹突狀細(xì)胞細(xì)胞。
9、 含有權(quán)利要求5-7中任一所述的復(fù)制缺陷型重組腺病毒rAd-HPV16， 18， 58mE67和權(quán)利要求1-4中任一所述的復(fù)制缺陷型重組腺病毒的重組 菌。
10、 權(quán)利要求5-7中任一所述的修飾的樹突狀細(xì)胞或權(quán)利要求9所述的重組菌 在制備預(yù)防和/或治療人宮頸癌疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種治療人宮頸癌的樹突狀細(xì)胞疫苗。本發(fā)明疫苗的活性成分是修飾的樹突狀細(xì)胞；所述修飾的樹突狀細(xì)胞是將復(fù)制缺陷型重組腺病毒rAd-HPV16，18，58mE67和復(fù)制缺陷型重組腺病毒rAd-RNAi-SOCS1轉(zhuǎn)入樹突狀細(xì)胞中得到的。本發(fā)明的樹突狀細(xì)胞疫苗不需要多肽或蛋白質(zhì)的脈沖，避免了在脈沖過程中加入RNA而導(dǎo)致的降解。然后用LPS使樹突狀細(xì)胞成熟并回輸體內(nèi)，對荷瘤的個(gè)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，突破機(jī)體對腫瘤細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞的免疫耐受，在小鼠腫瘤模型的治療性實(shí)驗(yàn)中，具有良好的治療效果。
文檔編號A61K39/00GK101591646SQ20081011301
公開日2009年12月2日 申請日期2008年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月27日
發(fā)明者駿 萬, 師超凡, 張宏玲, 張毅娟, 義 鄭, 黃來強(qiáng) 申請人:清華大學(xué)深圳研究生院