專利名稱：含經(jīng)修飾后的樹突狀細(xì)胞的疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及攜帶EB病毒潛伏膜蛋白2編碼基因的重組腺病毒、經(jīng)所述重組腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)或修飾的抗原提呈細(xì)胞，以及含有所述經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)或修飾后的抗原提呈細(xì)胞的疫苗組合物。更具體地說，本發(fā)明涉及經(jīng)所述重組腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)或修飾的樹突狀細(xì)胞，以及含有所述經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)或修飾的樹突狀細(xì)胞的疫苗組合物。
背景技術(shù)：
Epstein-Barr(EB)病毒(EBV)是皰疹病毒科γ亞科中唯一能引起人類感染的病毒。在發(fā)展中國(guó)家，大多數(shù)EB病毒的初次感染發(fā)生在患者幼兒時(shí)期，而且沒有明顯的臨床癥狀，一旦感染將終身攜帶病毒；在成人期，EB病毒原發(fā)感染可引起傳染性單核細(xì)胞增多癥(IM)。EB病毒在B細(xì)胞內(nèi)潛伏，但通常在鼻咽部及腮腺上皮細(xì)胞內(nèi)增殖，并通過唾液進(jìn)行傳播。大多數(shù)被EB病毒感染的患者處于隱性感染狀態(tài)。在EB病毒隱性感染的B淋巴細(xì)胞中能夠發(fā)現(xiàn)病毒基因組編碼的6種核蛋白(EBNA1、2、3A、3B、3C和LP)、三種膜蛋白(LMP1、2A、2B)和兩種小的非聚腺苷?；腞NA(EBER1和EBER2)。這些病毒產(chǎn)物的作用主要是維持病毒感染處于隱性感染狀態(tài)，并且促使原來處于靜止?fàn)顟B(tài)的B淋巴細(xì)胞持續(xù)增生。EB病毒的隱性感染與許多人類腫瘤密切相關(guān)，如Burkitt’s淋巴瘤(BL)、鼻咽癌(NPC)、何杰金氏病(HD)以及各種免疫抑制病人和移植病人的淋巴細(xì)胞增生紊亂引起的淋巴瘤(PTLD)等。
鼻咽癌(NPC)是中國(guó)南方一些省(自治區(qū))的常見惡性腫瘤之一，有些地區(qū)發(fā)病率可高達(dá)10～50/10萬，病死率也很高。目前放射治療是鼻咽癌治療的基本方法。鼻咽癌尤其是中晚期鼻咽癌治療失敗的原因大多是局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。鼻咽癌治療后遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率約22～36％。NPC起源于上皮，屬于鱗狀上皮癌。癌組織中病毒以潛伏方式存在，并且僅表達(dá)EBNA1、LMP1和LMP2三種蛋白質(zhì)。
EB病毒潛伏膜蛋白2(以下簡(jiǎn)稱LMP2)是第8個(gè)被確定的EB病毒潛伏膜蛋白，有研究(Rooney，C.M.，Smith，C.A.，The Lancet，1995.3459-13.)表明，在大多數(shù)NPC患者的病理活檢組織中，在病變的各時(shí)期均有LMP2的表達(dá)，其中在未分化或低分化的NPC組織中的表達(dá)率100％，其mRNA不僅見于原發(fā)癌組織，在轉(zhuǎn)移灶中也存在，因此LMP2提供了一個(gè)預(yù)防和治療NPC的良好靶位。EB病毒LMP2的cDNA全序列參見文獻(xiàn)Jeffery Sample，DavidLiebowitz，Elliott Kieff.Journal of Virology，F(xiàn)eb.1989，p.933-937。
樹突狀細(xì)胞(DC)在體內(nèi)分布廣泛，膜表面高表達(dá)共刺激分子、粘附分子及主要組織相容性復(fù)合物分子，是體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，也是唯一能激活初始型T細(xì)胞的APC，被稱為天然“免疫佐劑”，在抗感染、抗腫瘤、移植排斥等過程中發(fā)揮重要作用。在許多動(dòng)物模型及體外試驗(yàn)中[1]，DC為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗可以引發(fā)有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。自從1995年首次報(bào)道了DC腫瘤疫苗在惡性黑色素瘤病人的臨床試驗(yàn)后[2]，許多研究小組對(duì)多種癌癥設(shè)計(jì)并進(jìn)行了廣泛的臨床試驗(yàn)。截至2001年，在英文雜志文章以及會(huì)議文摘中出現(xiàn)的DC疫苗的報(bào)道數(shù)量已經(jīng)超過了1000個(gè)[3]，這些腫瘤疫苗應(yīng)用的范圍超過了20種腫瘤。在DC腫瘤疫苗發(fā)展短短的數(shù)年中，這種革新性的免疫治療策略已經(jīng)進(jìn)行了非常廣泛的臨床試驗(yàn)。它的臨床試驗(yàn)結(jié)果的一個(gè)顯著特征就是其安全性，除了發(fā)燒、局部反應(yīng)等，極少有副反應(yīng)，而且沒有見到嚴(yán)重威脅生命的副反應(yīng)。
因此，為了進(jìn)一步研究LMP2激發(fā)特異性CTL的能力，本發(fā)明人試圖使用EBV-LMP2作為EBV相關(guān)腫瘤基因治療的目的基因，并利用pAdEasy系統(tǒng)構(gòu)建EBV-LMP2重組腺病毒。同時(shí)，選擇DC作為抗原提呈細(xì)胞，用EBV-LMP2重組腺病毒修飾DC后將其作為抗腫瘤疫苗。在檢測(cè)了該疫苗在體外誘導(dǎo)LMP2特異性CTL的能力，以及這種體外活化的CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用后，我們嘗試在NPC病人體內(nèi)進(jìn)行初步臨床試驗(yàn)。結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明人制備的基于EBV-LMP2重組腺病毒的疫苗，在治療EBV相關(guān)腫瘤特別是鼻咽癌中表現(xiàn)有良好的使用效果，具有很大的臨床應(yīng)用前景。
為了進(jìn)一步觀察DC負(fù)載腫瘤抗原特別是LMP2在激發(fā)抗腫瘤免疫中的積極效果，判斷使用基于EBV-LMP2的重組腺病毒疫苗在體內(nèi)外激活淋巴細(xì)胞以殺傷腫瘤靶細(xì)胞的可行性，本發(fā)明人試圖使用重組腺病毒EBV-LMP2修飾的DC，制成可用于治療EBV相關(guān)腫瘤特別是鼻咽癌的預(yù)防及治療性疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明成功構(gòu)建了一種復(fù)制缺陷型重組腺病毒，該病毒攜帶有編碼EB病毒潛伏膜蛋白2(EBV-LMP2)的DNA序列。本發(fā)明還提供了經(jīng)所述重組腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)或修飾后的抗原提呈細(xì)胞。具體而言，本發(fā)明還提供了經(jīng)所述重組腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)或修飾后的樹突狀細(xì)胞。本發(fā)明還提供了制備經(jīng)所述重組腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)或修飾后的抗原提呈細(xì)胞例如樹突狀細(xì)胞的方法。本發(fā)明還提供了含有所述經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)或修飾后的抗原提呈細(xì)胞的疫苗組合物。本發(fā)明還提供了制備所述含有經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)或修飾后抗原提呈細(xì)胞的疫苗組合物的方法。另外，本發(fā)明還提供了被所述經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)或修飾后的抗原提呈細(xì)胞活化了的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，以及使用活化的CTL進(jìn)行過繼性治療的方法。
Epstein-Barr(EB)病毒(EBV)與許多人類的腫瘤相關(guān)，其中的潛伏膜蛋白2(LMP2)是一種可以很好地引發(fā)CTL反應(yīng)的抗原，這就為基于CTL的腫瘤治療提供了一個(gè)重要的潛在靶位。因此，可以利用LMP2作為體內(nèi)誘導(dǎo)EB病毒特異性CTL、預(yù)防和治療NPC的良好靶抗原。由于腺病毒具有宿主范圍廣泛，可感染分裂期細(xì)胞，也可感染靜止或終末分化細(xì)胞，能夠誘發(fā)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫等優(yōu)點(diǎn)。因此，我們使用LMP2編碼基因作為目的基因，構(gòu)建攜帶EB病毒的LMP2編碼基因的重組腺病毒。
本發(fā)明的發(fā)明人成功構(gòu)建了一種復(fù)制缺陷型的重組腺病毒，該病毒攜帶有外源基因，所述外源基因編碼的蛋白質(zhì)是一種能夠很好地引發(fā)CTL反應(yīng)的抗原。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述外源基因?yàn)镋B病毒潛伏膜蛋白2的編碼基因(EBV-LMP2)，這種攜帶有EB病毒潛伏膜蛋白2編碼基因的復(fù)制缺陷型重組腺病毒簡(jiǎn)稱為Ad-LMP2或EBV-LMP2重組腺病毒。所述的Ad-LMP2的病毒滴度不小于1×109pfu/ml，并可在體內(nèi)誘導(dǎo)EB病毒潛伏膜蛋白2特異性抗體生成反應(yīng)和細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞反應(yīng)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該重組腺病毒的滴度為2-5×109pfu/ml。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述Ad-LMP2是利用pAdEasy系統(tǒng)構(gòu)建的。
簡(jiǎn)而言之，為了得到本發(fā)明所述的Ad-LMP2，我們首先由攜帶LMP 2的DNA編碼序列的已知質(zhì)粒(例如，Psg5-LMP2)中得到LMP 2的全長(zhǎng)度cDNA序列，并將其定向克隆到腺病毒穿梭質(zhì)粒(例如，pShuttle-CMV)中。然后使用所得到的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒與已知的腺病毒骨架質(zhì)粒(例如，pAdEasy-1)一起共轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞(例如，大腸桿菌BJ5183)，并借助宿主細(xì)胞的重組酶使兩質(zhì)粒間發(fā)生同源重組。然后基于質(zhì)粒同源重組后獲得的抗生素抗性(例如卡那霉素抗性)篩選陽(yáng)性菌株，并由之得到所需的重組腺病毒質(zhì)粒。最后，再借助質(zhì)脂體將重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)已知的腺病毒包裝細(xì)胞(例如，293細(xì)胞)中，并在由所述的包裝細(xì)胞提供的E1蛋白的反向作用下包裝病毒，以進(jìn)一步擴(kuò)增病毒。
對(duì)病毒進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增后，結(jié)果證實(shí)病毒DNA中含有了目的基因EBV-LMP2的特異性片段。同時(shí)，反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)證明了外源基因在真核細(xì)胞中得以轉(zhuǎn)錄，間接免疫熒光試驗(yàn)和Western印跡試驗(yàn)的結(jié)果也表明LMP2蛋白在細(xì)胞中得到表達(dá)。
另一方面，本發(fā)明提供了經(jīng)攜帶外源基因的復(fù)制缺陷型重組腺病毒修飾后的抗原提呈細(xì)胞。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了經(jīng)本發(fā)明所述Ad-LMP2修飾后的抗原提呈細(xì)胞。
本發(fā)明中所述的抗原提呈細(xì)胞可以是任一種抗原提呈細(xì)胞，包括但不限于，單核/巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和朗罕細(xì)胞。
樹突狀細(xì)胞(DC)在體內(nèi)分布廣泛，膜表面高表達(dá)共刺激分子、粘附分子及主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子，是體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞(APC)，也是唯一能激活初始型T細(xì)胞、誘發(fā)初次免疫應(yīng)答的APC，在抗感染、抗腫瘤、移植排斥等過程中發(fā)揮重要作用。可以使用各種形式的抗原對(duì)DC進(jìn)行修飾，然后再將經(jīng)過修飾的DC回輸動(dòng)物模型或人體內(nèi)，或者在體外激活CTL并用于過繼性治療，結(jié)果取得了良好的抗腫瘤治療效果(Fong，L.，Engleman.E.G.2000，Annu.Rev.Immunol.18245-73)。因此，在本發(fā)明中，所述的抗原提呈細(xì)胞優(yōu)選為樹突狀細(xì)胞。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種一種修飾后的樹突狀細(xì)胞，該樹突狀細(xì)胞經(jīng)攜帶外源基因的復(fù)制缺陷型重組腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后，表達(dá)有該外源基因編碼的蛋白抗原，其中所述外源基因?yàn)镋B病毒潛伏膜蛋白2的編碼基因。
本申請(qǐng)中所述的“經(jīng)修飾(后)的”抗原提呈細(xì)胞(樹突狀細(xì)胞)是指用本發(fā)明所述攜帶外源基因的復(fù)制缺陷型重組腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后，并且表達(dá)有該外源基因編碼蛋白抗原的抗原提呈細(xì)胞(樹突狀細(xì)胞)。
另一方面，本發(fā)明提供了一種制備經(jīng)本發(fā)明所述Ad-LMP2修飾的樹突狀細(xì)胞的方法，該方法包括(1)將編碼EB病毒LMP2的DNA序列克隆到適當(dāng)?shù)南俨《敬┧筚|(zhì)粒(例如，pShuttle-CMV)中，得到攜帶LMP2之DNA編碼序列的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒；(2)用步驟1的重組穿梭質(zhì)粒和腺病毒骨架質(zhì)粒(例如，pAdEasy-1)共轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞(例如，大腸桿菌BJ5183)；(3)在適當(dāng)條件下使步驟2的重組穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒進(jìn)行同源重組的，得到攜帶LMP2之DNA編碼序列的重組腺病毒質(zhì)粒；(4)將步驟3的重組腺病毒質(zhì)粒導(dǎo)入適當(dāng)?shù)南俨《景b細(xì)胞(例如，293細(xì)胞)，得到所需的重組腺病毒；(5)用如上得到重組腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)(自體)樹突狀細(xì)胞。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，其中所述的腺病毒穿梭質(zhì)粒是質(zhì)粒pShuttle-CMV。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，其中所述的腺病毒骨架質(zhì)粒是質(zhì)粒pAdEasy-1。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，其中所述的宿主細(xì)胞是大腸桿菌BJ 5183。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，其中所述的腺病毒包裝細(xì)胞是293細(xì)胞。
試驗(yàn)證明經(jīng)本發(fā)明所述Ad-LMP2修飾后的DC能在體外較強(qiáng)地激發(fā)出針對(duì)LMP2的特異性CTL反應(yīng)。
在探討上述修飾后DC應(yīng)用的過程中，我們首先使用小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，模擬人體DC疫苗的模式，進(jìn)行了初步試驗(yàn)。用本發(fā)明所述Ad-LMP2轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞。經(jīng)間接免疫熒光證實(shí)LMP2蛋白的表達(dá)后，用被轉(zhuǎn)導(dǎo)后的脾淋巴細(xì)胞皮下接種免疫小鼠，并以乳酸脫氫酶(LDH)法檢測(cè)特異性CTL的殺傷作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這種免疫方法可以有效地誘發(fā)小鼠針對(duì)LMP2的特異性細(xì)胞免疫，在效靶比為50∶1、20∶1、10∶1時(shí)，殺傷率分別為32.9％、17.9％、4.6％；而用對(duì)照組的小鼠則沒有引起相應(yīng)的免疫反應(yīng)，對(duì)應(yīng)的殺傷率分別為3.2％、0％、0％(參見圖1)。
為了研究經(jīng)Ad-LMP2修飾后的DC是否能在體外活化CTL，我們選擇3名志愿者進(jìn)行了體外試驗(yàn)。首先體外培養(yǎng)DC并誘導(dǎo)其成熟，用Ad-LMP2轉(zhuǎn)導(dǎo)并證實(shí)LMP2表達(dá)后，用于體外活化自體淋巴細(xì)胞(例如，自體外周血單核細(xì)胞)作為效應(yīng)細(xì)胞，用被攜帶有LMP2的病毒(例如，MVA-LMP2病毒)感染致敏后的自體淋巴細(xì)胞(例如，T淋巴細(xì)胞)作為靶細(xì)胞，LDH法檢測(cè)體外活化CTL對(duì)自體致敏淋巴細(xì)胞的殺傷活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，體外活化的CTL可以有效地殺傷自體致敏的靶細(xì)胞。在兩個(gè)志愿者中，當(dāng)效靶比為20∶1時(shí)殺傷率達(dá)到了60.1％和52.5％；而Ad5對(duì)照組則沒有表現(xiàn)出相應(yīng)的殺傷活性，對(duì)應(yīng)的殺傷率分別為9.3％和20.2％(參見圖2)。
為了檢測(cè)這種體外活化的CTL能否有效的殺傷腫瘤細(xì)胞，我們進(jìn)行了體外以及小鼠體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)。所使用的靶細(xì)胞是來源于鼻咽癌病人的鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2細(xì)胞。CNE-2細(xì)胞含有并表達(dá)LMP2基因，在體外試驗(yàn)中，我們選擇與CNE-2細(xì)胞有相同HLA-A11類型的健康志愿者。在體外試驗(yàn)中，首先按照上述方法于體外活化特異性CTL，然后按適當(dāng)比例將CTL細(xì)胞加入到預(yù)先接種的CNE-2細(xì)胞培養(yǎng)物中，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后采用MTT法檢測(cè)CNE-2細(xì)胞的增殖。結(jié)果顯示，與用不攜帶EBV-LMP2的腺病毒修飾的DC(對(duì)照組)相比，本發(fā)明的LMP2重組腺病毒修飾的DC體外活化的CTL可以在體外有效抑制CNE-2腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。當(dāng)效靶比例為20∶1時(shí)，抑制率達(dá)到48.3％，而對(duì)照組是15.4％。在小鼠(Nod-Scid小鼠)活體試驗(yàn)中，首先按照上述方法在體外活化CTL，然后用CTL與CNE-2細(xì)胞的混合物(10∶1)皮下接種小鼠，然后觀察小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)狀況。5周后處死小鼠，取腫瘤組織稱重并進(jìn)行免疫組化分析。結(jié)果顯示，與未修飾的DC相比，本發(fā)明的LMP2重組腺病毒修飾的DC體外活化的CTL可以明顯延緩CNE-2細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的成瘤作用，并且有效的抑制腫瘤的生長(zhǎng)，在效靶比是10∶1時(shí)，抑制率達(dá)到46.35％(參見圖3)。
試驗(yàn)證明經(jīng)Ad-LMP2修飾后的DC活化的CTL可有效地抑制或殺滅NPC腫瘤細(xì)胞。用經(jīng)Ad-LMP2修飾后的DC接種小鼠后，可檢測(cè)(免疫熒光法)到動(dòng)物體內(nèi)特異性抗體的生成，并且可檢測(cè)(LDH方法)到動(dòng)物的特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)。
因此，本發(fā)明的另一方面提供了被本發(fā)明所述修飾后的抗原提呈細(xì)胞活化了的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，以及使用該活化的CTL進(jìn)行過繼性治療的方法，其中該方法包括向受試者施用免疫有效量的活化CTL。
為了檢測(cè)經(jīng)Ad-LMP2修飾后的DC能否在NPC病人體內(nèi)誘導(dǎo)特異性CTL反應(yīng)，我們?cè)谏鲜鲶w外及動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，初步嘗試了所述經(jīng)Ad-LMP2修飾后的DC細(xì)胞疫苗臨床應(yīng)用的可行性。臨床試驗(yàn)中共選擇了9例NPC病人自愿者作為研究對(duì)象。這些病例均為放射治療半年以上的、血清學(xué)檢測(cè)EBV-IgA/VCA升高的非角化性NPC病人。常規(guī)體外培養(yǎng)自體DC，然后用Ad-LMP2感染并將細(xì)胞誘導(dǎo)成熟。以200拉達(dá)劑量的Co60照射后，用如上得到的細(xì)胞皮內(nèi)免疫病人(間隔兩周共免疫3次，2×106個(gè)細(xì)胞/次)。分別于第一次免疫前以及最后一次免疫后4周采血，使用乳酸脫氫酶法(LDH)檢測(cè)病人體內(nèi)LMP2特異性CTL水平，以及IgA/VCA抗體滴度。結(jié)果顯示，9例NPC病人均能夠完成全部免疫過程，未見明顯副反應(yīng)。采用LDH法檢測(cè)CTL顯示，有5例NPC病人體內(nèi)LMP2特異性CTL水平顯著上升，在效靶比為50∶1時(shí)，5個(gè)病人體內(nèi)的特異性殺傷率分別從28.90％上升至54.77％，30.00％上升至51.01％，42.60％上升至67.45％，22.00％上升至32.10％，10.90％上升至35.60％(參見圖5)。同時(shí)，有7例NPC病人體內(nèi)IgA/VCA抗體滴度下降(參見圖7)。
試驗(yàn)證明經(jīng)Ad-LMP2修飾后的自體DC可以在NPC病人體內(nèi)誘發(fā)針對(duì)LMP2的特異性CTL反應(yīng)。
總之，我們的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果清楚地表明，本發(fā)明的經(jīng)Ad-LMP2修飾的DC可以在體內(nèi)和體外激發(fā)針對(duì)LMP2的特異性CTL，而且這些活化的CTL還可以有效地殺傷NPC腫瘤細(xì)胞。
因此，本發(fā)明所述經(jīng)過轉(zhuǎn)導(dǎo)或修飾的樹突狀細(xì)胞還可用于治療用途，用于治療EBV相關(guān)腫瘤，特別是鼻咽癌。
另一方面，本發(fā)明提供了經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)或修飾后的抗原提呈細(xì)胞在制備治療和預(yù)防EBV相關(guān)腫瘤的疫苗和藥物中的用途。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述抗原提呈細(xì)胞為DC細(xì)胞。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，其中所述的EBV相關(guān)腫瘤是鼻咽癌。
另一方面，本發(fā)明提供了一種疫苗組合物，其中含有經(jīng)Ad-LMP2修飾的抗原提呈細(xì)胞和藥物學(xué)上可接受的佐劑、載體和/或賦形劑。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述抗原提呈細(xì)胞為DC細(xì)胞。可按照制藥工業(yè)中已知的方法(如參見Remington’s Pharmaceutical Science.15thed.，Mack Publishing Company，1980)將如上限定的被攜帶LMP2編碼序列的重組腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)或修飾的樹突狀細(xì)胞與一種或多種藥物學(xué)上可接受的佐劑、載體、賦形劑或稀釋劑按適當(dāng)?shù)谋壤旌?，并按已知方法除菌后制備本發(fā)明的疫苗組合物。
根據(jù)給藥途徑的不同，可將本發(fā)明的疫苗組合物配制成適于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、體腔內(nèi)、組織內(nèi)、皮內(nèi)或皮下給藥的可注射的溶液劑或分散劑。
為了制備適于胃腸道外途徑給藥的可注射溶液劑，例如可以使用無菌蒸餾水、注射用水、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、以及含有乙醇、多元醇(如乙二醇、丙二醇及液態(tài)聚乙二醇等)的溶劑或分散介質(zhì)作為載體或稀釋劑。在任何情況下，所述的可注射制劑均應(yīng)是無菌和可流動(dòng)并適于通過注射器注射給藥的。另外，在生產(chǎn)、運(yùn)輸和儲(chǔ)存條件下，所述的制劑還必須是穩(wěn)定的，并能夠?qū)辜?xì)菌和真菌等微生物的污染。
也可使用制藥工業(yè)中已知的方法和輔助成份，將本發(fā)明的疫苗組合物制成脂質(zhì)體包裹劑。
另一方面，本發(fā)明提供了所述疫苗組合物在制備用于預(yù)防和治療EB病毒相關(guān)腫瘤，特別是鼻咽癌的疫苗或藥物中的應(yīng)用。
初步的臨床試驗(yàn)顯示，本發(fā)明的DC疫苗可以作為一種有效的治療性疫苗，用于治療包括NPC在內(nèi)的EBV相關(guān)腫瘤。
本發(fā)明所涉及的核酸序列和用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的其他核酸，包括RNA、cDNA、基因組DNA、載體均可從各種來源中分離得到并可經(jīng)受遺傳操作、擴(kuò)增，和/或被重組表達(dá)。另外，也可以使用已知的化學(xué)合成技術(shù)體外合成這些核酸(例如參見Adams，J.Am.Chem.Soc.105661，1983；Belousov，Nucleic Acids Res.253440-3444，1997；Blommers，Biochemistry337886-7896，1994；Narang，Meth.Enzymol.6890，1997)。
核酸操作技術(shù)，例如亞克隆、探針標(biāo)記、測(cè)序、雜交等在科學(xué)文獻(xiàn)和專利文獻(xiàn)都已有充分描述(如參見Sambrook，ed.Molecular CloningA Laboratory Manul(2nd.ed.)，Vols.1-3，ColdSpring Harbor Laboratory(1998)；Current Protocols In Molrcular Biology，Ausubel，ed.John wiley&Sons，Inc.New York(1997))。
可以使用許多已知的方法完成核酸、載體、多肽和蛋白質(zhì)等的定性和定量分析，例如這些方法包括分光光度法、放射顯影法、電泳、高效液相層析(HPLC)、免疫沉淀、免疫擴(kuò)散、免疫電泳、放射免疫、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、免疫熒光試驗(yàn)、Southern分析、Northern分析、點(diǎn)印跡分析、凝膠電泳(SDS-PAGE)、RT-PCR、定量PCR、其他核酸或信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)等。
本發(fā)明是在由本發(fā)明人此前完成的記載于申請(qǐng)?zhí)枮?3128743.3的專利申請(qǐng)中的發(fā)明的基礎(chǔ)上完成的。上述專利申請(qǐng)以及本申請(qǐng)中引用的其他文獻(xiàn)，其內(nèi)容在此全文引入作為參考。
本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明所述的經(jīng)Ad-LMP2修飾的樹突狀細(xì)胞(DC)能夠激發(fā)顯著的細(xì)胞免疫，并且能有效地抑制EBV病毒相關(guān)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。含有經(jīng)Ad-LMP2修飾的DC的疫苗可用于預(yù)防和治療EBV相關(guān)腫瘤，而且對(duì)鼻咽癌特別有效。
2.由于本發(fā)明可以采用患者自體的DC，這樣能夠最大限度地減少外源物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)，克服了傳統(tǒng)疫苗可能帶來的污染和副作用。
3.本發(fā)明中的DC疫苗同時(shí)還可以適用于HLA基因亞型相同的人群。
本發(fā)明的各個(gè)方面參考下列附圖及實(shí)施例提供的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可得到更好的理解。


圖1圖示的是經(jīng)Ad-LMP2修飾的小鼠脾淋巴細(xì)胞在致敏動(dòng)物體內(nèi)誘發(fā)的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。
圖2圖示的是被本發(fā)明所述Ad-LMP2修飾的DC體外活化的CTL對(duì)CNE-2腫瘤細(xì)胞的體外抑制和殺傷活性。
圖3圖示的是被本發(fā)明所述Ad-LMP2修飾的DC體外活化的CTL對(duì)體外培養(yǎng)的CNE-2腫瘤細(xì)胞的成長(zhǎng)抑制作用。
圖4圖示的是含Ad-LMP2修飾的DC細(xì)胞疫苗對(duì)荷瘤活體動(dòng)物(小鼠)的平均腫瘤體積的影響。
圖5圖示的是患者接受本發(fā)明的細(xì)胞疫苗前后的CTL殺傷率(效靶比50∶1)的比較。
圖6圖示的是患者接受本發(fā)明的細(xì)胞疫苗前后的CTL水平的比較。
圖7圖示的是患者接受本發(fā)明的細(xì)胞疫苗前后的IgA/VCA抗體水平的比較。
除另有說明外，本申請(qǐng)中的所有科技術(shù)語(yǔ)的都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。盡管與本申請(qǐng)中描述類似或等同的方法及材料都可用于實(shí)施或檢驗(yàn)本發(fā)明，但是下文仍還是對(duì)合適的方法和材料進(jìn)行了描述。本申請(qǐng)中引用的全部出版物、專利申請(qǐng)、專利及其他參考文獻(xiàn)其全部?jī)?nèi)容在此引入作為參考。如有抵觸，包括定義，以本申請(qǐng)為準(zhǔn)。
下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例說明實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體方式，而決不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不違背本發(fā)明的精神和原則的前提下，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行改動(dòng)得到的技術(shù)方案都將落入本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍內(nèi)。
實(shí)施例在本申請(qǐng)中，如無特別說明，本發(fā)明的實(shí)施都使用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的。這些技術(shù)在下列文獻(xiàn)中有詳細(xì)地描述Sambrook等人編著的Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版(1989)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames和S.J.Higgins編著，1984)；Transcription and Translation(B.D.Hames和S.J.Higgins編著，1984)；Immnochemical Methods in Cell And MolecularBiology(Academic Press，London)。
材料和方法本發(fā)明方法中所使用的攜帶LMP2基因的pSG-LMP2質(zhì)粒由美國(guó)哈佛大學(xué)惠贈(zèng)，腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV、腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1、大腸桿菌宿主細(xì)胞BJ 5183以及腺病毒包裝細(xì)胞(293細(xì)胞)均購(gòu)自美國(guó)STRATAGENE公司。
試驗(yàn)中使用的EBV-LMP2非復(fù)制型痘苗病毒安卡拉株(MVA-LMP2)為英國(guó)伯明翰大學(xué)Rickinson教授饋贈(zèng)。
本發(fā)明實(shí)驗(yàn)研究中使用的Tag酶購(gòu)自Takara公司，本試驗(yàn)中使用的內(nèi)切酶如無特別說明均購(gòu)自Takara公司；細(xì)胞因子GM-CSF由華北制藥廠提供；IL-4、TNF-α、IL-2以及LDH檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司；淋巴細(xì)胞分離液和MTT分別購(gòu)自Pharmacia和Sigma公司。
實(shí)施例1經(jīng)Ad-LMP2修飾的樹突狀細(xì)胞(DC)的制備和鑒定本實(shí)施例目的在于制備經(jīng)Ad-LMP2修飾的樹突狀細(xì)胞(DC)A.樹突狀細(xì)胞的分離和培養(yǎng)隨機(jī)選取HLA-A11基因型的自愿者3名。
常規(guī)方法(參見《樹突狀細(xì)胞與腫瘤免疫》，張錦堃等編著)分離和培養(yǎng)具有的樹突狀細(xì)胞。采用淋巴細(xì)胞分離液通過常規(guī)方法分離出外周血單核細(xì)胞(PBMC)，在6孔板中培養(yǎng)2小時(shí)去除非貼壁細(xì)胞。然后加含10％胎牛血清、細(xì)胞因子IL-4(25ng/ml)、GM-CSF(50ng/ml)的RPMI 1640培養(yǎng)液，37℃5％CO2培養(yǎng)7天，中間半換液一次。
B.重組腺病毒Ad-LMP2的構(gòu)建本發(fā)明方法中所使用的含LMP2基因的pSG-LMP2質(zhì)粒由美國(guó)哈佛大學(xué)惠贈(zèng)，腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV、腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1、大腸桿菌宿主細(xì)胞BJ 5183以及腺病毒包裝細(xì)胞(293細(xì)胞)均購(gòu)自美國(guó)STRATAGENE公司。
重組腺病毒Ad-LMP2的構(gòu)建、鑒定及病毒滴度的測(cè)定，均參見本發(fā)明人此前完成的記載于CN1548532A的發(fā)明，該文獻(xiàn)內(nèi)容在此全文引入作為參考。
重組腺病毒Ad-LMP2的鑒定使用序列表中的引物1和2。
C.經(jīng)Ad-LMP2修飾的樹突狀細(xì)胞的制備和鑒定將培養(yǎng)7天的DC細(xì)胞用無血清RPMI 1640收集并重懸于100ul RPMI 1640中，用MOI為500-1000的Ad-LMP2重組腺病毒37℃吸附2小時(shí)，然后，在含細(xì)胞因子(IL-4 25ng/ml、GM-CSF 50ng/ml、TNF-α20ng/ml)的DC培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后離心收集成熟的即為Ad-LMP2修飾的成熟的樹突狀細(xì)胞。使用FITC標(biāo)記的CD80，CD83，CD86抗體，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行DC表面分子檢測(cè)。同時(shí)采用間接免疫熒光方法檢測(cè)LMP2的表達(dá)。
實(shí)施例2Ad-LMP2修飾的小鼠脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生有效的CTL的體內(nèi)試驗(yàn)本實(shí)施例使用由小鼠脾組織制備的含樹突狀細(xì)胞在內(nèi)的淋巴細(xì)胞混合物代替DC進(jìn)行試驗(yàn)，利用。
A.經(jīng)Ad-LMP2修飾的淋巴細(xì)胞的制備常規(guī)方法(參見《樹突狀細(xì)胞與腫瘤免疫》，張錦堃等編著)制備小鼠脾淋巴細(xì)胞。這樣制得的小鼠脾淋巴細(xì)胞是一種混合物，其中含有包括DC細(xì)胞在內(nèi)的所有APC細(xì)胞。
用重組腺病毒Ad-LMP2修飾上述小鼠脾淋巴細(xì)胞(制備方法同實(shí)施例1的部分C)，制備獲得經(jīng)Ad-LMP2轉(zhuǎn)導(dǎo)的淋巴細(xì)胞。
相同方法制備經(jīng)Ad5(腺病毒5型野毒株)修飾的淋巴細(xì)胞用作下列試驗(yàn)的對(duì)照。
B.免疫接種取小鼠10只，分為兩組，每組5只。
用上述經(jīng)Ad-LMP2轉(zhuǎn)導(dǎo)的淋巴細(xì)胞和經(jīng)腺病毒Ad5修飾的淋巴細(xì)胞分別接種上述兩組小鼠，作為試驗(yàn)組和對(duì)照組。在接種后第2和第4周，以相同劑量同樣方法加強(qiáng)免疫兩次；第6周，取脾，分離脾細(xì)胞用于下列CTL水平檢測(cè)試驗(yàn)。
C.含LMP2靶細(xì)胞系的建立用電擊法，將pCDNAIII-LMP2導(dǎo)入p815細(xì)胞系(ATCCNumberTIB-64TM)，得到重組P815-LMP2 G418抗性細(xì)胞。質(zhì)粒pCDNAIII-LMP2是將LMP2基因插入到載體質(zhì)粒pCDNAIII(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)中構(gòu)建而成的。以間接免疫熒光法，檢測(cè)到該重組細(xì)胞中有LMP2表達(dá)。
D.CTL水平的檢測(cè)使用乳酶脫氧酶(LDH)方法(Cytotox96TMNon Radioactive Cytotoxicity Assay，Promega公司)檢測(cè)小鼠的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)水平。用重組痘苗病毒MVA-LMP2吸附后的小鼠淋巴細(xì)胞為刺激細(xì)胞。取本實(shí)施例B部分制備得到的脾組織細(xì)胞，與刺激細(xì)胞以10∶1的比例混合共培養(yǎng)4-6天后，即為效應(yīng)細(xì)胞。采用本實(shí)施例C部分制備的重組P815-LMP2抗性細(xì)胞作為靶細(xì)胞。結(jié)果如表1和圖1所示。從CTL試驗(yàn)結(jié)果可以看出，經(jīng)本發(fā)明所述重組腺病毒Ad-LMP2修飾的小鼠脾淋巴細(xì)胞皮下接種免疫同種小鼠，誘導(dǎo)的CTL的殺傷率明顯高于野生病毒株組。(圖1)。
表1免疫小鼠產(chǎn)生的LMP2特異性CTL平均活性(殺傷率％)

注E∶T＝效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞。
同時(shí)，以間接免疫熒光的方法檢測(cè)免疫小鼠血清中抗LMP2抗體的水平，結(jié)果顯示，LMP2重組腺病毒組小鼠體內(nèi)的抗體水平為10∶1，而野生病毒對(duì)照組未檢測(cè)到相應(yīng)的抗體。
試驗(yàn)表明經(jīng)本發(fā)明所述的重組腺病毒Ad-LMP2修飾的淋巴細(xì)胞能夠在動(dòng)物體內(nèi)激發(fā)顯著的特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)。
實(shí)施例3經(jīng)重組腺病毒Ad-LMP2轉(zhuǎn)導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞(DC)體外激發(fā)特異性CTL及其特異性抗瘤作用A.體外活化的CTL殺傷自體致敏靶細(xì)胞試驗(yàn)采用淋巴細(xì)胞分離液通過常規(guī)方法分離出外周血單核細(xì)胞(PBMC)，用實(shí)施例1中制備的經(jīng)Ad-LMP2重組腺病毒和Ad5野毒株修飾的DC作為刺激細(xì)胞，刺激自體外周血單核細(xì)胞(PBMC)成為效應(yīng)細(xì)胞，以重組MVA-LMP2(AB Rickinson教授惠贈(zèng)，CRC Institutefor Cancer Studies，University of Birmingham，Edgbaston，Birmingham，B 152TT，U.K)感染的自體T細(xì)胞作為靶細(xì)胞，采用乳酸脫氫酶法檢測(cè)CTL殺傷率。
結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，本發(fā)明所述經(jīng)Ad-LMP2重組腺病毒修飾的DC在體外有效地活化CTL，并且隨著效靶比的升高，CTL的殺傷活性逐漸升高(參見表2)。
表2經(jīng)Ad-LMP2修飾的DC體外活化CTL活性(殺傷率％)

B.體外活化CTL對(duì)CNE-2鼻咽癌細(xì)胞的體外抑制試驗(yàn)常規(guī)方法分離淋巴細(xì)胞。
用實(shí)施例1制備的經(jīng)Ad-LMP2修飾的DC和經(jīng)無關(guān)基因重組腺病毒修飾的DC作為刺激細(xì)胞，刺激分離的淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞。
以細(xì)胞膜上表達(dá)LMP2的鼻咽癌細(xì)胞CNE-2(來源于鼻咽癌病人，由本室分離建立的細(xì)胞系，屬HLA-A∏)為靶細(xì)胞，MTT方法測(cè)定殺傷活性。結(jié)果顯示，經(jīng)Ad-LMP2修飾的DC體外活化的CTL可以在體外有效的抑制CNE-2細(xì)胞的生長(zhǎng)。當(dāng)效靶比為20∶1時(shí)，抑制率可以達(dá)到48.34％，而對(duì)照組是15.4％(參見圖2)。
C.體外活化CTL對(duì)體內(nèi)CNE-2腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)用實(shí)施例1制備的經(jīng)Ad-LMP2修飾的DC刺激自體PBMC活化成殺傷細(xì)胞。將殺傷細(xì)胞與CNE-2細(xì)胞(HLA-A11基因型)以10∶1的比例混勻后，皮下免疫nod/scid小鼠，觀察小鼠成瘤情況，并進(jìn)行免疫組化分析。
結(jié)果可見，在效靶比為10∶1時(shí)，陰性對(duì)照組小鼠腫瘤平均重量是2.19g，Ad-LMP2重組病毒組小鼠腫瘤平均重量是1.18g，與陰性對(duì)照組相比抑制率為46.35％。未處理DC活化CTL對(duì)照組小鼠腫瘤平均重量是2.54g，與陰性對(duì)照組相比抑制率為-11.61％。免疫組化的結(jié)果顯示，此三組小鼠的移植瘤均為低分化磷癌(參見表3、圖3和4)。
表3經(jīng)Ad-LMP2修飾的DC對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用

試驗(yàn)表明用本發(fā)明所述的經(jīng)Ad-LMP2修飾的DC能夠在體外有效地活化細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，而活化后的CTL在體內(nèi)外均能夠有效地抑制或殺滅NPC腫瘤細(xì)胞。
實(shí)施例4經(jīng)Ad-LMP2修飾的DC的臨床應(yīng)用試驗(yàn)本實(shí)施例試驗(yàn)選取的9例患者均為組織學(xué)上分型屬于非角化性型的三期鼻咽癌患者。試驗(yàn)前所有患者均接受過半年至一年的放射治療，同時(shí)血清學(xué)檢測(cè)都有EBV-IgA/VCA抗體升高。
A.用經(jīng)Ad-LMP2修飾的DC免疫免疫患者將實(shí)施例1制備的經(jīng)Ad-LMP2修飾的DC用200拉達(dá)的Co60照射，以殺死病毒和細(xì)胞。第0周，將照射后的DC皮內(nèi)免疫患者，然后在第2周和第4周，各加強(qiáng)免疫一次。每次免疫所用的DC的數(shù)量平均是2×106細(xì)胞。所有患者均能夠完成全部治療過程且耐受性良好，患者注射后局部沒有紅腫現(xiàn)象和發(fā)熱等不良副反應(yīng)。
B.細(xì)胞免疫水平和抗體的檢測(cè)(1)LDH法檢測(cè)CTL水平分別于第0和8周采血，用與實(shí)施例2和3相同的LDH法測(cè)定CTL水平。結(jié)果顯示，其中5例患者可見明顯的CTL數(shù)升高。在效靶比為50∶1時(shí)，第1號(hào)、2號(hào)、4號(hào)、7號(hào)和8號(hào)患者的殺傷率(特異性細(xì)胞溶解百分?jǐn)?shù))分別從28.90％上升至54.77％，30.00％上升至51.01％，42.60％上升至67.45％，22.00％上升至32.10％，10.90％上升至35.60％(參見圖5)。
(2)胞內(nèi)IFN-γ染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CTL水平其中4例患者，在采用LDH法檢測(cè)的同時(shí)也使用流式細(xì)胞分析儀，采用胞內(nèi)IFN-γ染色法檢測(cè)了體內(nèi)LMP2特異性CTL水平。結(jié)果可見，其中的第7號(hào)和8號(hào)患者的雙陽(yáng)性細(xì)胞(IFN+CD8+細(xì)胞)數(shù)所占比例分別從0.09％和0.04％上升至0.46％和0.38％(參見圖6)。
(3)采用免疫酶的方法測(cè)定IgA/VCA抗體水平將TPA刺激后的B95.8細(xì)胞涂片，丙酮固定后，細(xì)胞孔用一系列稀釋度的患者血清覆蓋，37℃孵育45分鐘，再分別覆蓋HRP標(biāo)記的羊抗人IgA，(37℃，45分鐘)，底物顯色反應(yīng)，終止后于顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示用經(jīng)Ad-LMP2轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC治療后，其中的7例患者IgA/VCA抗體水平(滴度)下降至1∶10以下，其中的1例患者下降至1∶20，剩余的另1例患者未見變化(參見圖7)。
試驗(yàn)表明本發(fā)明所述的經(jīng)Ad-LMP2修飾的DC能夠在NPC患者體內(nèi)誘導(dǎo)特異性CTL反應(yīng)。
序列表<110>中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所<120>含經(jīng)修飾后的樹突狀細(xì)胞的疫苗組合物<140>
<141>
<160>2<210>1<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。
<400>1GCTGCAGGAA ACAACTCCCA ATATCCA<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。
<400>2AACTGGAGGG CAGATCTAAT GACC
權(quán)利要求
1.一種修飾后的抗原提呈細(xì)胞，該抗原提呈細(xì)胞經(jīng)攜帶外源基因的復(fù)制缺陷型重組腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后，表達(dá)有該外源基因編碼的蛋白抗原。
2.權(quán)利要求1所述修飾后的抗原提呈細(xì)胞，其中所述的外源基因?yàn)镋B病毒潛伏膜蛋白2的編碼基因。
3.權(quán)利要求1或2所述修飾后的抗原提呈細(xì)胞，其中所述的抗原提呈細(xì)胞為樹突狀細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的抗原提呈細(xì)胞，其中所述的攜帶外源基因復(fù)制缺陷型重組腺病毒是利用pAdEasy系統(tǒng)構(gòu)建的。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的抗原提呈細(xì)胞在制備用于在治療和預(yù)防EBV相關(guān)腫瘤的疫苗和藥物中的用途。
6.權(quán)利要求5所述的用途，其中所述的EBV相關(guān)腫瘤是鼻咽癌。
7.一種疫苗組合物，其中含有權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的抗原提呈細(xì)胞和一種或多種藥物學(xué)上可接受的載體、佐劑和/或賦形劑。
8.一種活化的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，該細(xì)胞是用權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的抗原提呈細(xì)胞刺激細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞使其活化得到的。
9.權(quán)利要求8中所述的活化的細(xì)胞毒性T淋巴在制備用于過繼性治療藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及攜帶EB病毒潛伏膜蛋白2編碼基因的重組腺病毒、經(jīng)所述重組腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)或修飾的抗原提呈細(xì)胞，以及含有所述經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)或修飾后的抗原提呈細(xì)胞的疫苗組合物。更具體地說，本發(fā)明涉及經(jīng)所述重組腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)或修飾的樹突狀細(xì)胞，以及含有所述經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)或修飾的樹突狀細(xì)胞的疫苗組合物。
文檔編號(hào)A61K45/00GK1709510SQ20051008421
公開日2005年12月21日 申請(qǐng)日期2005年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月18日
發(fā)明者曾毅, 周玲, 左建民, 王湛, 王 琦 申請(qǐng)人:曾毅