一種快速制備樹突狀細胞的改良方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術領域，具體地說是一種快速制備樹突狀細胞的改良方法。一種快速制備樹突狀細胞的改良方法，其特征在于：具體改良方法步驟如下：取患者自體血，分離出紅細胞、單個核淋巴細胞、血漿；調整單個核淋巴細胞的濃度；將調整好濃度的單個核淋巴細胞加入6孔板中，貼壁過夜；次日，留下未成熟的樹突狀細胞；在6孔板的每個孔內加入DC?1培養(yǎng)基，培養(yǎng)48小時；再在6孔板內加入DC?2培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時；獲得成熟樹突狀細胞；檢測成熟樹突狀細胞的數(shù)量、細胞活力和細胞表型及功能。同現(xiàn)有技術相比，用自然貼壁的方法獲取DC，誘導時間短，成本低，無毒副作用，DC細胞的活力大于90%，純度可達80~90%，有相同的效果，更適合推廣臨床使用。
【專利說明】
一種快速制備樹突狀細胞的改良方法
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及生物技術領域，具體地說是一種快速制備樹突狀細胞的改良方法。
【背景技術】
[0002]DC名為樹突狀細胞，它是機體重要的免疫細胞，在免疫細胞治療中有著廣泛的應用前景，在特異的腫瘤抗原刺激下，成熟的樹突狀細胞能表達多種細胞因子和趨化因子，如:MHC Π分子HLA-DR，共刺激分子⑶80、⑶83、⑶86等多種細胞因子，有效誘導抗原特異性和非特異性免疫應答反應，增強機體免疫功能。但DC在人外周血中比例很低，因此提高擴增倍數(shù)，增加成熟的樹突狀細胞數(shù)，對治療效果有著關鍵的作用。
[0003]為了更好發(fā)展我國生物治療技術，研發(fā)適合臨床應用的細胞治療方法很有必要。本發(fā)明的目的就是克服現(xiàn)有技術的不足，優(yōu)化DC制備技術，提供一種改良的DC制備方法，本發(fā)明成本低，方法簡便，純度高，治療效果好。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明為克服現(xiàn)有技術的不足，為了更好發(fā)展我國生物治療技術，研發(fā)適合臨床應用的細胞治療方法很有必要。提供一種快速制備樹突狀細胞的改良方法，成本低，方法簡便，純度高，治療效果好。
[0005]為實現(xiàn)上述目的，設計一種快速制備樹突狀細胞的改良方法，其特征在于:具體改良方法步驟如下:
(1)取患者自體血20毫升，用淋巴細胞分離液分離出紅細胞、單個核淋巴細胞、血漿；
(2)用無血清培養(yǎng)基調整單個核淋巴細胞，濃度為IxlOVml;
(3)將調整好濃度的單個核淋巴細胞以3ml/孔的體積加入6孔板中，貼壁過夜，時間為16小時；
(4)次日，吸棄6孔板內的上層未貼壁的細胞，在每孔的下層留下未成熟的樹突狀細胞；
(5)在6孔板的每個孔內加入DC-1培養(yǎng)基，體積為2.82ml/孔，置于二氧化碳濃度為5%，溫度為37° C，培養(yǎng)48小時；
(6)再在6孔板內加入DC-2培養(yǎng)基，體積為180ul/孔，繼續(xù)培養(yǎng)24小時；
(7)獲得成熟樹突狀細胞；
(8)檢測成熟樹突狀細胞的數(shù)量、細胞活力和細胞表型及功能。
[0006]所述的淋巴細胞分離液為國藥集團化學試劑有限公司生產。
[0007]所述的DC-1培養(yǎng)基為在Gibco無血清培養(yǎng)基中加入1000 U/mL派普泰克公司生產的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子和1000 U/mL派普泰克公司生產的白細胞介素4。
[0008]所述的DC-2培養(yǎng)基含有1000 U/mL派普泰克公司生產的腫瘤壞死因子、10000 U/mL派普泰克公司生產的白細胞介素1、1000 U/mL派普泰克公司生產的干擾素r、I微摩爾/升西格瑪奧德里奇公司生產的前列腺素E2、500ng/mL的CD40L、2.5ug/mL的R848、TLR7/8配體。
[0009]所述的CD40L為腫瘤壞死因子相關激活蛋白。
[0010]所述的R848是TLR7/8的激動劑，加入后可以刺激TLR7/8活化；因為TLR稱為Toll樣受體，所以R848稱為配體，就如鑰匙和鎖的一對一關系。
[0011]本發(fā)明同現(xiàn)有技術相比，用自然貼壁的方法獲取DC，誘導時間短，成本低，無毒副作用，DC細胞的活力大于90%，純度可達80?90%，有相同的效果，更適合推廣臨床使用。
[0012]本發(fā)明細胞制備方法簡便，成本低，細胞成熟度高，特異性殺傷力強的特點，更適合臨床細胞生物治療使用。
【附圖說明】
[0013]圖1為本發(fā)明制備樹突狀細胞與同型對照和磁珠分選的樹突狀細胞培養(yǎng)法的MHCII類分子及共刺激分子表達水平圖。
【具體實施方式】
[0014]下面根據附圖對本發(fā)明做進一步的說明。
[0015]如圖1所示，其中左側一列為同型對照圖，左側第二列為磁珠分選的DC細胞培養(yǎng)法的MHC II類分子及共刺激分子表達水平圖，其余四列為非磁珠分選的DC細胞培養(yǎng)法的MHCII類分子及共刺激分子表達水平圖，兩種DC細胞制備方式相比，本發(fā)明制備的DC細胞具有較好的完全成熟表型。
[0016]DC-1培養(yǎng)基為:Gibco無血清培養(yǎng)基加入1000 U/mL派普泰克公司生產的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子和1000 U/mL派普泰克公司生產的白細胞介素4。
[0017]DC-2培養(yǎng)基為:1000 U/mL派普泰克公司生產的腫瘤壞死因子、10000 U/mL派普泰克公司生產的白細胞介素1、1000 U/mL派普泰克公司生產的干擾素r、l微摩爾/升西格瑪奧德里奇公司生產的前列腺素E2、500ng/mL的CD40L、2.5ug/mL的R848、TLR7/8配體。
[0018]⑶40L為腫瘤壞死因子相關激活蛋白。
[0019]R848是TLR7/8的激動劑，加入后可以刺激TLR7/8活化。
[0020]具體改良方法步驟如下:
(1)取患者自體血20毫升，用淋巴細胞分離液分離出紅細胞、單個核淋巴細胞、血漿；
(2)用無血清培養(yǎng)基調整單個核淋巴細胞，濃度為Ix1Vml;
(3)將調整好濃度的單個核淋巴細胞以3ml/孔的體積加入6孔板中，貼壁過夜，時間為16小時；
(4)次日，吸棄6孔板內的上層未貼壁的細胞，在每孔的下層留下未成熟的樹突狀細胞；
(5)在6孔板的每個孔內加入DC-1培養(yǎng)基，體積為2.82ml/孔，置于二氧化碳濃度為5%，溫度為37° C，培養(yǎng)48小時；
(6)再在6孔板內加入DC-2培養(yǎng)基，體積為180ul/孔，繼續(xù)培養(yǎng)24小時；
(7)獲得成熟樹突狀細胞；
(8)檢測成熟樹突狀細胞的數(shù)量、細胞活力和細胞表型及功能。
【主權項】
1.一種快速制備樹突狀細胞的改良方法，其特征在于:具體改良方法步驟如下: (1)取患者自體血20毫升，用淋巴細胞分離液分離出紅細胞、單個核淋巴細胞、血漿； (2)用無血清培養(yǎng)基調整單個核淋巴細胞，濃度為Ix1Vml; (3)將調整好濃度的單個核淋巴細胞以3ml/孔的體積加入6孔板中，貼壁過夜，時間為16小時； (4)次日，吸棄6孔板內的上層未貼壁的細胞，在每孔的下層留下未成熟的樹突狀細胞； (5)在6孔板的每個孔內加入DC-1培養(yǎng)基，體積為2.82ml/孔，置于二氧化碳濃度為5%，溫度為37° C，培養(yǎng)48小時； (6 )再在6孔板內加入DC-2培養(yǎng)基，體積為180ul/孔，繼續(xù)培養(yǎng)24小時； (7)獲得成熟樹突狀細胞； (8)檢測成熟樹突狀細胞的數(shù)量、細胞活力和細胞表型及功能。2.根據權利要求1所述的一種快速制備樹突狀細胞的改良方法，其特征在于:所述的淋巴細胞分離液為國藥集團化學試劑有限公司生產。3.根據權利要求1所述的一種快速制備樹突狀細胞的改良方法，其特征在于:所述的DC-1培養(yǎng)基為在Gibco無血清培養(yǎng)基中加入1000 U/mL派普泰克公司生產的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子和1000 U/mL派普泰克公司生產的白細胞介素4。4.根據權利要求1所述的一種快速制備樹突狀細胞的改良方法，其特征在于:所述的DC-2培養(yǎng)基含有1000 U/mL派普泰克公司生產的腫瘤壞死因子、10000 U/mL派普泰克公司生產的白細胞介素1、1000 U/mL派普泰克公司生產的干擾素r、l微摩爾/升西格瑪奧德里奇公司生產的前列腺素E2、500ng/mL的CD40L、2.5ug/mL的R848、TLR7/8配體。5.根據權利要求4所述的一種快速制備樹突狀細胞的改良方法，其特征在于:所述的CD40L為腫瘤壞死因子相關激活蛋白。6.根據權利要求4所述的一種快速制備樹突狀細胞的改良方法，其特征在于:所述的R848是TLR7/8的激動劑，加入后可以刺激TLR7/8活化。
【文檔編號】C12N5/0784GK105861438SQ201610334107
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月19日
【發(fā)明人】鄭秀娟, 儲以微
【申請人】上海君微生物科技有限公司