本發(fā)明涉及對產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(enterotoxigenicescherichiacoli，etec)具有特異性殺死能力的新型噬菌體、包含其的組合物、以及使用所述新型噬菌體或所述組合物預(yù)防或治療動(dòng)物的傳染病的方法。
背景技術(shù)：
：：大腸桿菌(escherichiacoli，下文中稱為e.coli)是腸桿菌科埃希氏菌屬的革蘭氏陰性短桿菌，并且是存在于各種動(dòng)物(包括哺乳動(dòng)物)的腸道中的正常菌群之一。已知大腸桿菌的大多數(shù)菌株是非致病性的，并且可以引起機(jī)會性感染，但一些高致病性菌株在包括人的動(dòng)物體內(nèi)引起各種腸道疾病和敗血癥等。大腸桿菌可以被分為產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(etec)、腸致病性大腸桿菌(enteropathogenice.coli,epec)、腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagice.coli,ehec)、腸集聚性大腸桿菌(enteroaggregativee.coli,eaec)、腸侵襲性大腸桿菌(enteroinvasivee.coli,eiec)、產(chǎn)壞死性毒素大腸桿菌(necrotoxigenice.coli，ntec)等，并且具體來說，已知產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌在豬中引起大腸桿菌傳染病。目前，隨著在養(yǎng)豬業(yè)中大規(guī)模群養(yǎng)的趨勢，豬大腸桿菌病已經(jīng)成為養(yǎng)豬場中最常見且困擾的疾病。最近，在韓國豬大腸桿菌病的發(fā)生也一直增長，由于腹瀉而造成小豬的生長遲緩和死亡，這給養(yǎng)豬場造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。盡管在過去已經(jīng)給豬施加多種抗生素用于預(yù)防和治療這種豬大腸桿菌病，但抗生素的濫用或使用不當(dāng)會在豬中引發(fā)抗生素耐受性或者會引起抗生素殘留在豬體內(nèi)，因此目前在世界范圍內(nèi)對抗生素的施用具有很多限制。此外，噬菌體是指感染特定細(xì)菌并抑制和阻礙所感染的細(xì)菌的生長的細(xì)菌特異性病毒。由于噬菌體具有比抗生素更強(qiáng)的宿主特異性而且最近出現(xiàn)對抗生素有抗性的細(xì)菌的問題日益嚴(yán)重，噬菌體的應(yīng)用已經(jīng)引起高度重視。在許多國家已經(jīng)積極進(jìn)行了對噬菌體的研究，并且除了噬菌體的專利申請外，欲從美國食品藥品監(jiān)督管理局(foodanddrugadministration，fda)獲得對使用噬菌體的組合物的批準(zhǔn)的舉動(dòng)也呈增加的趨勢。然而，用于預(yù)防和/或治療由產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌引起的傳染病(該傳染病在包括養(yǎng)豬業(yè)在內(nèi)的畜產(chǎn)業(yè)中正成為非常重要的問題)的噬菌體相關(guān)技術(shù)仍然不足，因而需要開發(fā)這樣的噬菌體及其相關(guān)技術(shù)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：技術(shù)問題作為旨在解決對抗生素有抗性的細(xì)菌的出現(xiàn)和肉類中抗生素殘留等問題以及有效地預(yù)防和治療由大腸桿菌引起的傳染病而進(jìn)行反復(fù)研究的結(jié)果，本發(fā)明人從自然界分離出一種對產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌具有特異性殺死能力的新型噬菌體φcj28(kccm11466p)。此外，本發(fā)明人鑒定了該新型噬菌體的形態(tài)特征、生物化學(xué)性質(zhì)和遺傳性質(zhì)，證實(shí)了該噬菌體具有優(yōu)異的耐酸性、耐熱性，從而開發(fā)了使用該噬菌體的抗生素、消毒劑、飼料添加劑以及其他組合物，并進(jìn)一步開發(fā)了用于預(yù)防或治療由大腸桿菌引起的傳染病的組合物以及使用其來預(yù)防或治療疾病的方法。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供對產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌具有特異性殺死能力的新型噬菌體φcj28(kccm11466p)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于預(yù)防和/或治療由產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌引起的傳染病的組合物，該組合物包含噬菌體φcj28(kccm11466p)作為有效成分。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供包含噬菌體φcj28(kccm11466p)作為有效成分的抗生素、飼料添加劑、飲用水添加劑、飼料、飲用水、消毒劑或洗滌劑。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供使用噬菌體φcj28(kccm11466p)或包含噬菌體φcj28(kccm11466p)作為有效成分的組合物來預(yù)防和/或治療非人類動(dòng)物的由產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌引起的傳染病的方法。技術(shù)方案本發(fā)明的一個(gè)方面提供對產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌具有特異性殺死能力的新型噬菌體φcj28(kccm11466p)。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供用于預(yù)防或治療由產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌引起的傳染病的組合物，該組合物包含噬菌體φcj28(kccm11466p)作為有效成分。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供包含噬菌體φcj28(kccm11466p)作為有效成分的抗生素、飼料添加劑、飲用水添加劑、飼料、飲用水、消毒劑或洗滌劑。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供預(yù)防或治療由產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌引起的傳染病的方法，其包括如下步驟：向非人類動(dòng)物給藥上述噬菌體φcj28(kccm11466p)或包含該噬菌體φcj28(kccm11466p)作為有效成分的組合物。有益效果根據(jù)本發(fā)明的噬菌體φcj28(kccm11466p)具有特異性殺死產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的效果。而且，根據(jù)本發(fā)明的噬菌體φcj28(kccm11466p)具有優(yōu)異的耐酸性和耐熱性，并因此不僅能夠被用作在各種范圍的溫度和ph下預(yù)防或治療由產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌引起的傳染病的物質(zhì)，而且能夠以包含噬菌體φcj28(kccm11466p)作為有效成分的抗生素、飼料添加劑、飲用水添加劑、飼料、飲用水、消毒劑、洗滌劑等使用。而且，本發(fā)明提供噬菌體φcj28(kccm11466p)或包含噬菌體φcj28(kccm11466p)作為有效成分的抗生素，并且具有如下效果：與現(xiàn)有的抗生素相比，對產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的特異性非常高，從而能夠僅殺死特定致病細(xì)菌而不殺死有益細(xì)菌；并且不引發(fā)耐藥性，這使得與現(xiàn)有的抗生素相比產(chǎn)品市場壽命延長。而且，本發(fā)明具有通過向非人類動(dòng)物給藥該噬菌體φcj28(kccm11466p)或包含該噬菌體φcj28(kccm11466p)作為有效成分的組合物來預(yù)防或治療由產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌引起的傳染病的效果。附圖說明圖1是新型噬菌體φcj28(kccm11466p)(在下文中被稱為“φcj28”)的電子顯微鏡圖。圖2示出了新型噬菌體φcj28的脈沖場凝膠電泳(pulsedfieldgelelectrophoresis，pfge)結(jié)果。圖3示出了新型噬菌體φcj28的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis,sds-page)結(jié)果。圖4是示出新型噬菌體φcj28的耐酸性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖。圖5是示出新型噬菌體φcj28在60℃下的耐熱性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖。具體實(shí)施方式在下文中，更詳細(xì)地描述本發(fā)明。在本文中將省略對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說顯而易見的細(xì)節(jié)描述。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式提供對產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(etec)具有特異性殺死能力的新型噬菌體φcj28(kccm11466p)(在下文中被稱為“φcj28”)。產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌是革蘭氏陰性桿菌并且是分解乳糖和果糖以產(chǎn)生酸和氣體的需氧或兼性厭氧細(xì)菌。產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌在普通培養(yǎng)基上也生長良好，并且能夠在約7℃至48℃的溫度下生長，其中最佳生長溫度可以為約35℃至37℃。而且，產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌可以在4.5至9.0的ph范圍下生長。由于產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌產(chǎn)生與由霍亂弧菌(vibriocholera)產(chǎn)生的毒素相似的毒素，因此若感染產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌，則表現(xiàn)出與感染霍亂弧菌的情況相似的癥狀。所產(chǎn)生的毒素能夠大致分類為熱不穩(wěn)定腸毒素(heat-labileenterotoxin,lt)和熱穩(wěn)定腸毒素(heat-stableenterotoxin,st)。熱不穩(wěn)定腸毒素在約60℃下加熱約10分鐘時(shí)失去其活性，而熱穩(wěn)定腸毒素在約100℃下加熱約30分鐘時(shí)也不失去其活性。產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌在小腸的上部增殖，并且當(dāng)產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的濃度達(dá)到每單位體積(1ml)腸液內(nèi)存在約107菌落形成單位(cfu)至約108cfu時(shí)，產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌可引起包括大腸桿菌病在內(nèi)的大腸桿菌傳染病。噬菌體是感染特定細(xì)菌并抑制和阻礙該細(xì)菌生長的細(xì)菌特異性病毒，并且是包含單鏈或雙鏈脫氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)作為遺傳物質(zhì)的病毒。具體而言，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式的噬菌體φcj28具有選擇性地感染產(chǎn)腸毒素性致病大腸桿菌的種屬特異性，并且是具有帶有正二十面體頭部(icosahedralcapsid)且觀察到可收縮性尾部的結(jié)構(gòu)的、在形態(tài)學(xué)上屬于肌病毒科(myoviridae)的噬菌體(參見圖1)。對噬菌體φcj28的核苷酸序列與其他噬菌體的解碼的核苷酸序列之間的同源性進(jìn)行比較，并且結(jié)果示于表1中。噬菌體φcj28示出在ph3.0至ph5.0下穩(wěn)定的耐酸性，而不會失去活性(圖4)，并且在耐熱性方面，當(dāng)暴露于60℃下30分鐘時(shí)，噬菌體φcj28顯示出約1個(gè)對數(shù)(1log)或更少的活性下降，并且當(dāng)在相同溫度下暴露60分鐘或更長的情況下，噬菌體φcj28顯示出約3個(gè)對數(shù)(3log)或更多的活性下降(圖5)。噬菌體φcj28的dna堿基序列展示于序列表的序列號1中。所述噬菌體φcj28是由本發(fā)明人分離出的一種新型噬菌體，并且在2013年10月25日保藏于韓國微生物保藏中心(koreanculturecenterofmicroorganisms，kccm)(首爾市西大門區(qū)弘濟(jì)1洞361-221)，保藏號為kccm11466p。本發(fā)明的另一種實(shí)施方式提供用于預(yù)防或治療由產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌引起的傳染病的組合物，其包含噬菌體φcj28作為有效成分。由于噬菌體φcj28展現(xiàn)出能夠特異性殺死產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的抗菌活性，噬菌體φcj28能夠被用于預(yù)防或治療由感染產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌而引起的疾病。待被用噬菌體φcj28預(yù)防或治療的由產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌引起的傳染病的例子包括但不限于大腸桿菌病(colibacillosis)、特別是豬大腸桿菌病(colibacillosisinpigs)。本文中，術(shù)語“大腸桿菌病”指的是由于動(dòng)物體內(nèi)感染致病性大腸桿菌而發(fā)生的疾病，并且其癥狀包括敗血癥、腹瀉(新生期腹瀉和斷奶后腹瀉)、毒血癥(水腫和腦脊髓血管病)等。其中，敗血癥是具有極高死亡率的急性全身感染，其主要發(fā)生在出生后兩到三天內(nèi)的新生期。腹瀉是經(jīng)常在一周至兩周齡內(nèi)的哺乳期間發(fā)生以及在斷奶后立即發(fā)生的腸道感染癥狀，其是死亡或發(fā)育障礙的一個(gè)原因。毒血癥主要發(fā)生在8周至12周齡的仔豬斷奶后，并且經(jīng)?？稍诔霈F(xiàn)水腫和神經(jīng)癥狀后引起猝死。本文中，術(shù)語“預(yù)防”指的是通過給動(dòng)物施用噬菌體φcj28和/或包含噬菌體φcj28作為有效成分的組合物抑制相應(yīng)疾病或者延緩相應(yīng)疾病發(fā)生的所有措施。本文中，術(shù)語“治療”指的是通過給動(dòng)物施用噬菌體φcj28和/或包含噬菌體φcj28作為有效成分的組合物改善或減輕已感染的相應(yīng)疾病的癥狀的所有措施。根據(jù)該實(shí)施方式的用于預(yù)防或治療由產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌引起的傳染病的組合物可以包含5×102pfu/ml至5×1012pfu/ml、具體而言1×106pfu/ml至1×1010pfu/ml的噬菌體φcj28。根據(jù)該實(shí)施方式的用于預(yù)防或治療由產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌引起的傳染病的組合物還可以包含藥學(xué)上可接受的載體，并且可以與載體一起配制以提供食品、藥物、用于飼料的添加劑或用于飲用水的添加劑等。本文中，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”指的是不刺激生物體并且不抑制給藥化合物的生物活性和性質(zhì)的載體或稀釋劑。適用于該實(shí)施方式的載體的類型不受特別限制，并且可以使用本領(lǐng)域中常用的任何藥學(xué)上可接受的載體。載體的例子可以包括但不限于，鹽水、無菌水、林格氏溶液、緩沖鹽水、白蛋白注射液、葡萄糖溶液、麥芽糖糊精溶液、甘油和乙醇。這些載體可以單獨(dú)使用或兩種以上混合使用。此外，根據(jù)需要，可以向根據(jù)本發(fā)明的組合物中添加其他常見添加劑，例如抗氧化劑、緩沖溶液和/或抑菌劑，并且還可以向根據(jù)本發(fā)明的組合物中添加稀釋劑、分散劑、表面活性劑、粘合劑和/或潤滑劑，來配制可注射制劑(例如水溶液、懸浮液和乳液)、丸劑、膠囊、顆?；蚱瑒?。根據(jù)該實(shí)施方式的用于預(yù)防或治療由產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌引起的傳染病的組合物的給藥方法不受特別限制，并且可以使用本領(lǐng)域中常用的任何方法。給藥方法的非限制性示例可以包括口服給藥或腸胃外給藥。用于口服給藥的劑型的非限制性示例可以為錠劑(troches)、糖錠(lozenges)、片劑、水溶性懸浮液、油性懸浮液、配制粉末、顆粒、乳液、硬膠囊、軟膠囊、糖漿或酏劑等。為了將根據(jù)該實(shí)施方式的組合物配制成諸如片劑或膠囊的劑型，還可以包含粘合劑，例如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、支鏈淀粉、纖維素和明膠；賦形劑，例如磷酸二鈣；崩解劑，例如玉米淀粉和甘薯淀粉；潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酰富馬酸鈉和聚乙二醇蠟；等等，并且對于膠囊劑型來說，除了上述物質(zhì)外，還可以進(jìn)一步包含液體載體(例如脂肪油)等。腸胃外給藥該實(shí)施方式的組合物的方法可以使用例如靜脈內(nèi)給藥、腹腔內(nèi)給藥、肌內(nèi)給藥、皮下給藥或局部給藥等，此外，可以使用將所述組合物涂覆或噴射到疾病部位的方法，但不限于此。為了配制腸胃外給藥劑型，例如可以將該實(shí)施方式的組合物配制成用于注射的劑型，例如皮下注射、靜脈注射和肌肉注射；栓劑；或者用于噴霧的劑型，例如氣霧劑，從而允許通過呼吸器吸入，但不限于此。為了配制用于注射的劑型，可以將該實(shí)施方式的組合物與穩(wěn)定劑或緩沖劑在水中混合，以制備溶液或懸浮液，該溶液或懸浮液被配制成用于單位施用的劑型，例如安瓿或小瓶。當(dāng)組合物被配制成用于噴霧的劑型(諸如氣霧劑)時(shí)，組合物可以與推進(jìn)劑等一起與添加劑配制，以使分散于水中的濃縮物或者潤濕粉末分散于其中。除了配制組合物的方法、給藥方法、給藥時(shí)間和/或給藥途徑外，根據(jù)不同的因素，例如作為給藥對象的動(dòng)物的年齡、體重和性別、疾病癥狀的程度、所攝入的食物、排泄速率等，改變根據(jù)該實(shí)施方式的用于預(yù)防或治療由產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌引起的傳染病的組合物的適當(dāng)?shù)耐扛?、噴射或給藥量。而且，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地確定和指定對所預(yù)期的治療有效的給藥量。本發(fā)明的另一實(shí)施方式提供包含噬菌體φcj28作為有效成分的抗生素。本文中，術(shù)語“抗生素”指的是以藥物形式施用于包括人的動(dòng)物并具有殺滅細(xì)菌的功效的制劑，而且其被用作防腐劑、殺菌劑和抑菌劑的總稱。該實(shí)施方式的包含噬菌體φcj28作為有效成分的抗生素所具有的效果是：與現(xiàn)有抗生素相比，該抗生素相對于產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的特異性非常高，并因此僅殺死特定的致病細(xì)菌，但不殺死有益細(xì)菌；并且該抗生素不引發(fā)耐藥性，這使得與現(xiàn)有抗生素相比產(chǎn)品市場壽命延長。本發(fā)明的另一實(shí)施方式提供飼料添加劑或飲用水添加劑，其包含噬菌體φcj28作為有效成分。飼料添加劑或飲用水添加劑可以通過如下來使用：使用噬菌體φcj28或包含其的組合物分別制備飼料添加劑或飲用水添加劑，并將飼料或飲用水與添加劑混合，或者在制備飼料或飲用水的過程中直接添加噬菌體φcj28或包含其的組合物。以根據(jù)該實(shí)施方式的飼料添加劑或飲用水添加劑的形式使用的噬菌體φcj28或包含噬菌體φcj28作為有效成分的組合物可以是液體形式或干燥形式，例如干燥粉末形式。例如，基于飼料添加劑的重量，根據(jù)本發(fā)明的噬菌體φcj28可以以粉末形式、以0.05重量％(wt％)至10wt％、具體地0.1wt％至2wt％的組分比混合。用于干燥根據(jù)該實(shí)施方式的飼料添加劑或飲用水添加劑以得到干燥粉末的方法不受特別限制，并且可以采用本領(lǐng)域中常用的任何方法。干燥方法的例子可以包括通風(fēng)干燥、自然干燥、噴霧干燥和冷凍干燥，但不限于此。這些方法可以單獨(dú)使用或者兩種以上組合使用。根據(jù)該實(shí)施方式的飼料添加劑或飲用水添加劑還可以包含其他非致病性微生物。微生物可以選自由如下組成的組：枯草桿菌，例如能夠產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶和/或糖基轉(zhuǎn)移酶的枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)；乳酸菌，例如在厭氧條件(例如牛的胃)下具有生理活性和有機(jī)物分解能力的乳桿菌(lactobacillussp.)；絲狀菌，例如米曲霉(aspergillusoryzae)，其具有增加家畜的體重、增加牛奶產(chǎn)量以及增加飼料的消化吸收率的效果；以及酵母，例如釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)，但不限于此。這些微生物可以單獨(dú)使用或兩種以上組合使用。根據(jù)需要，根據(jù)該實(shí)施方式的包含噬菌體φcj28作為有效成分的飼料添加劑或飲用水添加劑可以進(jìn)一步包含其他添加劑?？捎玫奶砑觿┑姆窍拗菩允纠梢詾闉榱朔乐癸暳匣蝻嬘盟|(zhì)量下降而添加的粘合劑、乳化劑、防腐劑等；為了增加飼料或飲用水的效用所添加的氨基酸、維生素、酶、益生菌、調(diào)味劑、非蛋白含氮化合物、硅酸鹽、緩沖劑、著色劑、萃取劑或寡糖等；除此之外還可以包括飼料混合劑等。這些添加劑可以單獨(dú)使用或兩種以上組合使用?；?00重量份的飼料，根據(jù)本發(fā)明的飼料添加劑可以以0.05重量份至10重量份、具體地0.1重量份至2重量份的量存在?；?00重量份的飲用水，根據(jù)本發(fā)明的飲用水添加劑可以以0.0001重量份至0.01重量份、具體地0.001重量份至0.005重量份的量存在。在這些范圍內(nèi)，添加劑允許噬菌體φcj28對抗產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的活性被充分顯示出。本發(fā)明的另一實(shí)施方式提供通過向飼料或飲用水添加包含噬菌體φcj28作為有效成分的飼料添加劑或飲用水添加劑或者向飼料或飲用水中直接添加噬菌體φcj28制備得到的飼料或飲用水。在該實(shí)施方式中使用的飼料不受特別限制，并且可以使用本領(lǐng)域中常用的任何飼料。飼料的非限制性示例可以為植物性飼料，如谷物、根菜、食品加工副產(chǎn)物、藻類、纖維、醫(yī)藥副產(chǎn)物、油脂、淀粉、粕類或谷物的副產(chǎn)物等；和動(dòng)物性飼料，如蛋白質(zhì)、無機(jī)物、油脂、礦物質(zhì)、油脂、單細(xì)胞蛋白和動(dòng)物性浮游生物或食品。這些飼料可以單獨(dú)或兩種以上組合使用。在該實(shí)施方式中使用的飲用水不受特別限制，并且可以使用本領(lǐng)域中常用的任何飲用水。本發(fā)明的另一實(shí)施方式提供包含噬菌體φcj28作為有效成分的消毒劑或洗滌劑。消毒劑或洗滌劑的劑型不受特別限制，并且可以使用本領(lǐng)域中常用的任何劑型。為了去除產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌，可以將消毒劑噴灑于動(dòng)物的活動(dòng)區(qū)域、屠宰場，死亡區(qū)域、烹飪場所和烹飪設(shè)備等，但不限于此。洗滌劑可以被用于洗滌暴露于或可能暴露于產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的動(dòng)物的皮膚表面或身體各部位等，但不限于此。本發(fā)明的另一實(shí)施方式提供使用噬菌體φcj28或包含噬菌體φcj28作為有效成分的組合物預(yù)防或治療由產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌引起的傳染病的方法。具體而言，該實(shí)施方式的預(yù)防方法或治療方法包括向感染產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌或具有感染產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的危險(xiǎn)的非人類對象給藥藥學(xué)有效量的噬菌體φcj28或包含噬菌體φcj28作為有效成分的組合物的步驟。每天噬菌體φcj28或包含其的組合物的合適總量可以由醫(yī)生在適當(dāng)?shù)尼t(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)確定，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的。噬菌體φcj28或包括噬菌體φcj28作為有效成分的組合物針對特定動(dòng)物的具體的藥學(xué)有效量可以通過考慮如下內(nèi)容來確定：要實(shí)現(xiàn)的反應(yīng)的種類和程度，相應(yīng)個(gè)體的年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食，噬菌體φcj28或包括其的組合物的給藥時(shí)間和給藥途徑，以及組合物的分泌率，治療時(shí)期等，并且根據(jù)包含同時(shí)使用或者不同時(shí)使用的其他藥物組合物的成分的各種因素和在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中公知的相似因素，來改變上述具體的藥學(xué)有效量。噬菌體φcj28或包含噬菌體φcj28作為有效成分的組合物可以以藥物制劑的形式噴霧式鼻腔給藥至動(dòng)物或者直接添加到動(dòng)物的飼料或飲用水并使動(dòng)物攝食該飼料或飲用水而給藥至動(dòng)物，并且可以以飼料添加劑或飲用水添加劑的形式與飼料或飲用水混合，然后給藥至動(dòng)物。噬菌體φcj28或包含噬菌體φcj28作為有效成分的組合物的給藥途徑和給藥方法不受特別限制，并且可以使用任何給藥途徑和給藥方法，只要該給藥允許噬菌體φcj28或包含其的組合物到達(dá)相應(yīng)的組織即可。即，噬菌體φcj28或包含噬菌體φcj28作為有效成分的組合物可以通過各種口服途徑或非腸道途徑來給藥，該給藥途徑的非限制性示例可以為口服給藥、直腸給藥、局部給藥、靜脈內(nèi)給藥、腹腔內(nèi)給藥、肌內(nèi)給藥、動(dòng)脈內(nèi)給藥、經(jīng)皮給藥、鼻內(nèi)給藥和吸入給藥。下文中，將通過實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而，這些實(shí)施例僅用于示例性地說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。[實(shí)施例1]–感染產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的噬菌體的分離<實(shí)施例1-1>噬菌體篩選和單噬菌體分離將從忠清道洪城郡廣川區(qū)的samhwawonjong(三和原種)公司農(nóng)場區(qū)的豬糞和環(huán)境樣品獲得的50ml樣品在4000rpm的轉(zhuǎn)速下離心分離10分鐘，然后將所獲得的上清液通過0.45μm過濾器過濾，以制備樣品溶液，使用該樣品溶液執(zhí)行頂層瓊脂法(softagaroverlaymethod)。頂層瓊脂法是指使用在頂層瓊脂(使用0.7％瓊脂放置在固體培養(yǎng)基上)上生長的宿主細(xì)胞觀察噬菌體溶菌的方法。具體而言，將150μl的由首爾大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院的獸醫(yī)傳染病實(shí)驗(yàn)室分離的產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(2618)的振蕩培養(yǎng)液(od600＝2)和2ml的10×lb培養(yǎng)基(10g/l的色氨酸；5g/l的酵母提取物；10g/l的nacl)與18ml的經(jīng)過濾的樣品溶液混合，然后在30℃下培養(yǎng)18小時(shí)，并將所獲得的培養(yǎng)液在4000rpm的轉(zhuǎn)速下離心分離10分鐘，并且將所獲得的上清液通過0.45μm過濾器過濾。隨后，將3ml的0.7％(w/v)瓊脂和150μl的產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(2618)的振蕩培養(yǎng)液(od600＝2)的混合液倒在lb平板培養(yǎng)基上并使其固化，向其逐滴添加10μl的樣品溶液，然后在30℃下培養(yǎng)18小時(shí)，從而確認(rèn)形成溶菌斑。由于已知每個(gè)溶菌斑均存在一種噬菌體，發(fā)明人嘗試從所形成的溶菌斑分離單一的噬菌體。具體而言，將溶菌斑添加至400μl的sm(懸浮培養(yǎng)基)溶液(5.8g/l的nacl；2g/l的mgso47h2o；50ml的1m三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(tris-hcl，ph7.5))，并在室溫下放置4小時(shí)，從而獲得噬菌體溶液。隨后，將100μl的噬菌體溶液與5ml的0.7％(w/v)瓊脂和150μl的產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(2618)的振蕩培養(yǎng)液(od600＝2)混合，并使用直徑為150mm的lb平板培養(yǎng)基執(zhí)行頂層瓊脂法，其中進(jìn)行培養(yǎng)直至完全溶菌。培養(yǎng)完成后，向lb平板培養(yǎng)基添加5ml的sm溶液，并在室溫下放置4小時(shí)，從而獲得噬菌體溶液?；厥账鋈芤翰⑻砑?％(v/v)氯仿，并混合10分鐘，然后在4000rpm的轉(zhuǎn)速下離心分離10分鐘，從而獲得上清液，將該上清液通過0.45μm過濾器過濾，從而獲得最終試樣。<實(shí)施例1-2>噬菌體的大規(guī)模培養(yǎng)和純化使用產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(2618)大規(guī)模培養(yǎng)在實(shí)施例1-1中獲得的噬菌體，然后從中純化噬菌體。具體而言，振蕩培養(yǎng)產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(2618)，并以1.0×1010cfu分株，在4000rpm的轉(zhuǎn)速下離心分離10分鐘，然后使其再懸浮于4ml的sm溶液中。在該懸浮液中以1.0×107pfu接種所述噬菌體，滴定所述噬菌體至感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection，moi)＝0.001后，在室溫下放置20分鐘。接著，將其接種在150ml的lb培養(yǎng)基中，并在30℃培養(yǎng)5小時(shí)。培養(yǎng)完成后，添加氯仿最終體積的1％的體積(v/v)，接著攪拌20分鐘，向其中以1μg/ml的最終濃度分別添加作為限制酶的脫氧核糖核酸酶i(dnasei)和核糖核酸酶a(rnasea)，并在30℃下放置30分鐘。隨后，分別以1m和10％(w/v)的最終濃度添加氯化鈉和聚乙二醇，并在4℃下放置3小時(shí)，然后在4℃和12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心分離20分鐘，從而獲得沉淀物。使獲得的沉淀物懸浮在5ml的sm溶液中，在室溫下放置20分鐘，然后向其中添加1ml的氯仿并攪拌，在4℃下以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心分離20分鐘，從而獲得上清液。將該上清液通過0.45μm過濾器過濾，然后使用甘油密度梯度法(密度：40％，5％甘油)執(zhí)行超離心分離(35000rpm，1小時(shí)，4℃)，從而純化噬菌體。本發(fā)明人從豬糞收集樣品，并從該樣品分離出對產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌具有特異性殺死能力的噬菌體，將該噬菌體命名為“噬菌體φcj28”并于2013年10月25日保藏于韓國微生物保藏中心(首爾市西大門區(qū)弘濟(jì)1洞361-221)，保藏號為kccm11466p。<實(shí)施例2>φcj28的形態(tài)檢查將實(shí)施例1中所純化的噬菌體φcj28稀釋于0.01％明膠溶液中，然后用2.5％戊二醛溶液固定。將所獲得的噬菌體滴加至涂覆有碳的云母板(大約2.5mm×2.5mm)上，馴化10分鐘，然后用無菌蒸餾水洗滌。將碳膜插入銅網(wǎng)中，用2％乙酸鈾酰染色60秒，干燥，并在透射電子顯微鏡(jem-1011，80kv，放大倍數(shù)為200000)下檢查(圖1)。圖1示出噬菌體φcj28的透射電子顯微鏡照片，其中觀察到噬菌體φcj28在形態(tài)學(xué)上具有正二十面體頭部和可收縮性尾部，由此可知噬菌體φcj28屬于肌病毒科。<實(shí)施例3>φcj28的全基因組dna的尺寸分析從實(shí)施例1中純化的噬菌體φcj28中提取基因組dna。具體而言，向經(jīng)純化的噬菌體φcj28的培養(yǎng)液中，添加20mm乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid，edta)、50μg/ml蛋白酶k和0.5％(w/v)十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecylsulfate，sds)，并在50℃下放置一個(gè)小時(shí)，向其中添加等體積的苯酚(ph8.0)并攪拌，隨后在室溫和12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心分離10分鐘，從而獲得上清液。將上清液與等體積的pc(苯酚:氯仿＝1:1)混合，隨后在室溫和12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心分離10分鐘，從而獲得上清液。將上清液與等體積的氯仿混合，隨后在室溫和12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心分離10分鐘，從而獲得上清液。將上清液與基于總體積的10％(v/v)的3m乙酸鈉混合，隨后添加2倍體積的95％冷乙醇，混合并在-20℃下放置1小時(shí)。在0℃和12000rpm的轉(zhuǎn)速下將所獲得的物質(zhì)離心分離10分鐘，從中去除上清液以獲得沉淀物，將沉淀物溶解于50μl的te緩沖溶液(tris-edta,ph8.0)中。將提取的dna稀釋10倍，然后通過在od260下測量吸光度來確定dna的濃度。接下來，將1μg的dna加載到1％脈沖場凝膠電泳(pulse-fieldgelelectrophoresis，pfge)瓊脂糖凝膠上，并使用伯樂(biorad)公司pfge系統(tǒng)7號程序(尺寸范圍從25kb到100kb；轉(zhuǎn)換時(shí)間斜度(switchtimeramp)從0.4秒到2.0秒，線性；正向電壓，180v；反向電壓，120v)在室溫下進(jìn)行電泳20個(gè)小時(shí)(圖2)。圖2是噬菌體φcj28的基因組dna的電泳照片，并且可以看出，噬菌體φcj28的基因組dna尺寸為98kb以上。在圖2中，m為作為用于尺寸測量的基準(zhǔn)的dna。<實(shí)施例4>φcj28的蛋白質(zhì)圖譜分析將15μl的經(jīng)純化的噬菌體φcj28溶液(1010pfu/ml效價(jià))與3μl的5×sds樣品溶液混合，然后煮沸5分鐘，以進(jìn)行12％sds-page(圖3)。圖3是示出以噬菌體φcj28為對象進(jìn)行的sds-page結(jié)果的電泳照片，并且可以看出主要蛋白質(zhì)具有約67.9kda、約50.8kda和約6kda的尺寸。<實(shí)施例5>φcj28的遺傳特性分析為了確定實(shí)施例1中所純化的噬菌體φcj28的遺傳特性，使用flxtitaniumsequencer(roche公司)作為基因分析儀來分析噬菌體φcj28的dna。在macrogen公司使用gs和denovoassemblersoftware(roche公司)重組基因。使用genemark.hmm,glimmerv3.02和fgenesb軟件執(zhí)行開放讀碼框架(openreadingframe)。使用blastp和interproscan對讀碼框架的名稱進(jìn)行命名。噬菌體φcj28的核苷酸序列顯示出與之前報(bào)道的噬菌體(腸桿菌噬菌體bp7)的核苷酸序列相似性，但可以看出沒發(fā)現(xiàn)其中所有片段100％一致的噬菌體。因此，可以看出，該噬菌體是新分離的噬菌體。下表1示出了噬菌體φcj28的核苷酸序列與現(xiàn)有技術(shù)中之前報(bào)道的噬菌體的解碼的核苷酸序列之間的比較結(jié)果。表1使用基因分析儀分析所制備的噬菌體φcj28的dna的全核苷酸序列結(jié)果與序列號1相同。<實(shí)施例6>φcj28的ph穩(wěn)定性研究為了鑒定噬菌體φcj28是否能夠在低ph(如腸胃內(nèi))下保持穩(wěn)定性，在多種ph(ph2.0、3.0、4.0、5.0)下執(zhí)行穩(wěn)定性研究實(shí)驗(yàn)。為了該實(shí)驗(yàn)，分別以0.2m的濃度制備多種ph溶液(乙酸鈉緩沖溶液(ph4.0和ph5.0)和檸檬酸鈉緩沖溶液(ph2.0和ph3.0))。將180μl的各ph溶液與20μl的具有2.9×109pfu/ml效價(jià)的噬菌體溶液混合，以允許每個(gè)ph溶液具有1m的濃度，然后將所獲得的溶液在室溫下放置2小時(shí)。對于對照組，通過相同的方法將20μl的具有2.9×109pfu/ml效價(jià)的噬菌體溶液與180μl的sm溶液混合，然后將所獲得的溶液在室溫下放置2小時(shí)。此后，分階段地稀釋這些溶液，并且利用頂層瓊脂法分別將10μl各階段的稀釋液在30℃下培養(yǎng)18小時(shí)，通過是否溶菌來確定效價(jià)(圖4)。圖4示出了噬菌體φcj28的耐酸性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在圖4中，可以看出與對照組相比噬菌體φcj28在ph3.0至ph5.0下沒有失去其活性且保持穩(wěn)定。<實(shí)施例7>噬菌體φcj28的熱穩(wěn)定性研究如果在噬菌體的眾多劑型中，噬菌體被配制成飼料添加劑，在配制過程中可產(chǎn)生熱量，因而為了確定噬菌體的熱穩(wěn)定性進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。具體而言，將200μl的具有2.9×108pfu/ml濃度的噬菌體φcj28溶液在60℃下分別放置0分鐘、30分鐘、60分鐘和120分鐘。此后，將獲得的實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)液分階段地稀釋，并且利用頂層瓊脂法分別將10μl各階段的稀釋液在30℃下培養(yǎng)18小時(shí)，通過是否溶菌來確定效價(jià)(圖5)。圖5示出了噬菌體φcj28的耐熱性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如在圖5中所示，可以看出噬菌體φcj28在60℃下暴露30分鐘時(shí)示出約1個(gè)對數(shù)(1log)以下的活性損失，并且當(dāng)噬菌體φcj28暴露60分鐘或更長時(shí)，活性損失3個(gè)對數(shù)或更多。<實(shí)施例8>針對野生型分離菌株產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的噬菌體φcj28的感染范圍研究除了本實(shí)驗(yàn)中所使用的產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(2618)外，還對99株由首爾大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院、建國大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院和韓國動(dòng)植物檢疫局(kapqa)分離的野生型分離菌株(即產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌)，確認(rèn)噬菌體φcj28是否具有溶菌活性。分離的菌株由37株f-血清型f4型、30株f5型、7株f6型、20株f18型和5株其他菌株組成。具體而言，將150μl的每個(gè)菌株的振蕩培養(yǎng)液(od600＝2)混合，并向其滴加10μl的具有109pfu/ml效價(jià)的噬菌體φcj28溶液，且通過在30℃下進(jìn)行頂層瓊脂法18小時(shí)來培養(yǎng)，觀察是否形成溶菌斑。結(jié)果示于表2中。表2如表2中所示，噬菌體φcj28展現(xiàn)出感染f-血清型f4、f5、f6、f18型的能力，這些是在一般的養(yǎng)豬場中引起豬腹瀉的主要病原性細(xì)菌，因此預(yù)期展現(xiàn)出優(yōu)異的功效。序列目錄freetext(自由文本)在所附的序列表中提供。申請人或代理人檔案號p14-5112國際申請?zhí)栮P(guān)于微生物或其他生物學(xué)物質(zhì)的保藏的說明(pct細(xì)則13之二)pct/ro/134表(1998年7月，2004年1月再版)序列表<110>cj第一制糖株式會社<120>新型噬菌體以及包含其的組合物<130>p14-5112<150>kr10-2014-0042911<151>2014-04-10<160>1<170>patentinversion3.2<210>1<211>171499<212>dna<213>新型噬菌體cj28<400>1aaatacgttgggtccaacccattgaatatgcaaccattatatcactcatttcaataagcg60ttttggctgcttcaaaagtcattacattagaggtttccgctgtttgggtgaatttaccgt120ccatggagtggatataatggtcataatgaatctgggtatcttgctcgtttaaatcaaact180tgacaaagcaacgtttttcctcggacaatccacgaacacggttagtaatagtatcccaat240attcatcgatgtaaataccttcaagagaaaaagcttcatgctcgttaagattagacttga300caatttcaataatatctgaaggcttaagacctgattcaagaagctcttggattttagcca360atttctcagcattgccttgagggtccattttatcaaattttttagcttcttcaaaatgtt420gctcagggcgagcactcacacctttaccaaagtagaaaggttttttgttttcatctacta480aacgatatacctgataaattgtttcttgattgtaagccattttaaatctcctttagttga540taggtctatagtatcatgcctacaggagatgtaaactgattttataaatattaatttaac600aggaggataacatgggcagtattttttaccaaatctggaaattggccgaaaagaaagaca660agaaaatgatgttaggttttcttgcactagatgtattcctttggaatcttctggtagtcc720ctgtagccgctagtcaaggtgtaattttaccagcggttacaatggagcacgtgttaagca780tagttgggttctttagcggaattcctgcctaaatcttggaatattttgaaagtctcattt840ttgccattaaaccttgggctatattagctttcatatatgccagtacatcatttatatcgg900ctttatctttcataaccatatcatttatatctttagaaggccatggggccttgtcccaga960atagaaccctttcgccagcatcaactaatcgttgcatacgcttaattgtgtcaggatggc1020ggggttcattgtccattacccaggcacgagtttctttacatggaactatagccaagtcca1080atgacccaccagtaattgctattgcattcggtacgaataatgaatcgataggaccttcca1140ttacccacaccaactgacgttcgtcaactgtatccattccatatatttttgtagcttggt1200catgagcttttattgtaatatatttttgtggagcgtctttacgtaaggctcgaccctgaa1260aactttcaatttgtttattcttattgaaaattggaataaccaaacgaggctcaggcattt1320ctttagaataggtccctggattgacagagttcaccaatgcaggccattctttagtaaacc1380acagccggttccatttgttttcaggaatgcaacgtaacgtcacatattttataataggat1440ggtccttcggcattctatctaatcgttcacagaaattaagcttttcgatgacaggcatct1500tagctttaattttttcagatatctccaccttaggtgcagcttgtctcccgaacgattgct1560ctttatgtttctcaagaatatattcacgatataaatcaggctcatattcgtatagatact1620tcttaattcctgctgaataatcacagttaaaacagtgcagcataatagagccgtcattgg1680caggataggcccaaaaacgagctttgttctcatctttttgggagtcaccgcatacacgac1740aacggcagtttaatttaaaatcactaccagttacttgtctgaatttaggttggtaattca1800aggcacgtacagcaaattctttatcgacatatgacattatttttccttgggccctaaatt1860aatagagccattatatcattcgttttcggatttttctttacgctttttagatgggatttg1920ttcaggccctttgttgacgaccgcgcctgaggtagttccggaggcaatagcagtaggatt1980accacctgcatcgcctgcgaccatatcttcgttcataacttctttaaaagatttcatagg2040ctcctggccttatttatattacgaaaatagctttatcaccatttgcatcagtgacttcat2100aggtatcttcgtggtaaagtggaataatccaagtcgcaccatcaccagcaataatatgga2160tagcttcttggtcttttgatacgatttcatattcttcgaataattcgaatacagaaatct2220tagagcccgtacacattgcactcatattgttcccttcttttaatcagttggcgatgagcc2280tttttaagtttacgaagctgacgtttagttggccgtgcaacataagcttgagtagttact2340cgtccaaaaacaccgtacttaggtgaaggagaatcgataaagacttcccactgacaagag2400taactatacacggctttagagaattgagttaagacaaacatattaacctcgattcataaa2460agcattaaaaatttggtcatcaattgaataaaccggggcttccagaattttcaacagact2520gtttttgatatacttgctagggatatccatattaacgccatcattcaattcgttgtccgg2580gaggatatctttaaattcgaatccatcaaactcaaccttgtcaggaataccttcagcgaa2640aaaataaaccaattggtgcattgtattgcatgaaaataatttagacctcaccgcaataag2700ttcttgccaatggtttaattctctgttaagaagtttatgagccattgtaattcgatcatc2760actatcaacaagaaaataacccaggtattggtggtcgtcgctccaaaacatcctgtatgc2820ttgtgcatttggatttttacaacgaagctttttaataactaaatttctgttaatcttatt2880cacctgtcacctctttaacgatatttttgttatcgaaattggcatcacaatacaaaacat2940agttatattgcataacaccacctgaagctaattggtctgacacttctttagccatatcag3000ggcggtcacgtttagtgatgttcatgatatcagcataaatctgatgttcaaccgattctt3060ggtctgcagtcatagaccattcacaaaggtctttatccaatccggccgttaccggagccg3120tgccacatgatgctactgtaaggattgctgcgattaataactttttcatttttaactcct3180cgttagttgataggtccatagtatcactaccatagaccgttgtaaactttattttaacga3240atcttctaaataaattttacggaatttacgttttgtctggcgaatctgacgcttagtagg3300cttcacaggaaattcgaagaactctacgtattcttgttcataatcattgtgaccgactga3360aagaactagttcccagttgcttacagtacgttggataaacatattatgcttaccaaaaga3420tttgttccaaaaagaactgggagttggtttcattagtacgatattcatttattcctcgcc3480ttcatgtttatgggcaatttcttcgaattcgttgtcacagtctatacaggttgcattgtc3540ccaagcatcaaataccgcttggtcttcgcggaccgaacaaccacatactacacactcaac3600ttcttccatttagatttcctcaatacgggcatcatgttcataaacttctacgtcgtcgac3660atacgccttaaccaaaatactattgacttcagcgaattgggtagtcacccacacgatatc3720gttttcacgcactgaagcttctttggtagcggtatcgccgttggtgaaatggccgacaaa3780tttta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