專利名稱：用于鼻內(nèi)傳遞的裂解有包膜病毒制品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的疫苗制劑，制備這樣的疫苗的方法和這樣的疫苗在預(yù)防或者治療疾病中的用途。本發(fā)明尤其涉及包含裂解有包膜病毒(split enveloped virus)制品的疫苗。
有包膜病毒是一種其中病毒核心由含有病毒蛋白的富含脂質(zhì)的外殼(outer coat)圍繞的病毒。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗制劑的裂解有包膜病毒來(lái)源于呼吸道合胞病毒。被有包膜病毒感染的危險(xiǎn)通過(guò)參照RSV說(shuō)明。
人呼吸道合胞病毒(RSV)為副粘病毒科的成員并引起下呼吸道疾病，特別是在幼兒和嬰兒中。最新報(bào)道提示RSV也是成人，特別是老年人的重要病原體。
RSV為具有15222個(gè)核苷酸的非-節(jié)段、負(fù)鏈核糖核酸(RNA)基因組的有包膜病毒，其編碼11個(gè)信使RNA，每種編碼單一的多肽。11種蛋白中有三種為跨膜表面蛋白G(附著)、F(融合)和SH蛋白。一種蛋白是病毒體基質(zhì)蛋白(M)，三種蛋白是核衣殼的成分(N、P和L)，兩種蛋白是非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1和NS2)。存在兩個(gè)另外的蛋白M2-1和M2-2。存在RSV的兩個(gè)抗原性不同的亞組，稱為亞組A和B。已經(jīng)測(cè)定得自這些亞組的毒株的特征性質(zhì)，其主要差別在于G蛋白上，而F蛋白保守。
呼吸道合胞病毒(RSV)以季節(jié)性爆發(fā)的方式發(fā)生，在溫帶氣候的冬天和在亞熱帶氣候(warmer climate)的雨季期間達(dá)到高峰。
RSV為兒童的嚴(yán)重的下呼吸道疾病的主要病因。據(jù)估計(jì)，40-50％患有支氣管炎的住院兒童和25％患有肺炎的住院兒童是因?yàn)镽SV感染的直接結(jié)果而住院。主要的RSV感染通常發(fā)生在一歲以下的嬰幼兒；95％的兩歲兒童具有感染后的血清學(xué)證據(jù)，100％的成年群體更是如此。
在嬰兒和幼兒中，從上呼吸道至下呼吸道的感染進(jìn)程中大約40％的病例和臨床表現(xiàn)屬于支氣管炎或肺炎。2-6個(gè)月齡的兒童處于發(fā)生RSV感染(主要是呼吸衰竭)的嚴(yán)重表現(xiàn)的最高危險(xiǎn)中；然而，患有潛在的心臟病或肺病的任何年齡的兒童、早產(chǎn)兒和免疫力受損的嬰兒還處于嚴(yán)重并發(fā)癥等的危險(xiǎn)中。
癥狀再感染發(fā)生在一生中并且變得日益明顯的是RSV也是重要的成人病原體，尤其是老年人。
RSV感染在成人中的診斷數(shù)字幾乎肯定是低估的，部分是由于它被認(rèn)為是兒童的感染。結(jié)果，未尋找成人體內(nèi)的病毒的證據(jù)以解釋呼吸道疾病。另外，在得自個(gè)體的鼻分泌物中難以鑒定RSV，因?yàn)閷?duì)大多數(shù)成人而言，這些個(gè)體對(duì)病毒具有某種程度的部分免疫力。當(dāng)RSV感染時(shí)，年輕人到中年人一般發(fā)展為持續(xù)的感冒樣綜合征。老年個(gè)體可以發(fā)展為長(zhǎng)期的呼吸綜合征，后者實(shí)質(zhì)上不能與具有上呼吸道癥狀(可伴隨有下呼吸道受累，包括肺炎)的流感區(qū)別。住院的老年群體具有特別的意義，因?yàn)樗麄儼ù罅康木奂谝黄鸬囊赘袀€(gè)體。感染通過(guò)這樣的群體的傳播難以控制，他們中的許多人具有多種醫(yī)學(xué)問(wèn)題，這些問(wèn)題可以促使他們易患更加嚴(yán)重的疾病。另外，評(píng)價(jià)作為成人和社區(qū)健康老年人住院原因的RSV感染的影響的最近研究報(bào)告進(jìn)一步指出在這些群體中的嚴(yán)重下呼吸道疾病中RSV感染的重要作用。RSV已被鑒定為引起導(dǎo)致成人住院的嚴(yán)重下呼吸道疾病的四種最常見病原體之一。也已證實(shí)在老年人中，嚴(yán)重的RSV感染不局限于護(hù)理室或爆發(fā)的情況。當(dāng)然，RSV感染是在居住于社區(qū)的老年患者中嚴(yán)重疾病的可以預(yù)測(cè)的病因。與甲型流感的住院相似，與RSV感染相關(guān)的那些人與實(shí)際的發(fā)病率有關(guān)，如由延長(zhǎng)的留院觀察、特別護(hù)理住院率和高的換氣(ventilatory)支持率證明的那樣。
這些研究指出對(duì)能夠預(yù)防RSV感染在特別是嬰兒、成人及社區(qū)健康和住院老年人兩者的中的嚴(yán)重并發(fā)癥的有效疫苗的醫(yī)學(xué)和經(jīng)濟(jì)需求。
類似的危險(xiǎn)由其它的有包膜病毒引起，因此，還存在對(duì)有效防止由這類病毒引起的感染和疾病的需求。
本發(fā)明提供一種裂解有包膜病毒制品在生產(chǎn)用于鼻內(nèi)傳遞的疫苗制劑中的應(yīng)用，所述裂解有包膜病毒制品不是裂解流感病毒制品。
優(yōu)選所述制劑包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。
本發(fā)明的疫苗制劑源于能夠被裂解的有包膜病毒。有包膜病毒可以衍生自廣泛來(lái)源，包括來(lái)自人或動(dòng)物源的病毒。當(dāng)病毒屬于非人來(lái)源，例如牛來(lái)源時(shí)，病毒優(yōu)選為重組病毒。
本發(fā)明的疫苗制劑優(yōu)選在釋藥(delivery)后能夠刺激針對(duì)有包膜病毒的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
在本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)中，所述病毒包括所有以下舉例說(shuō)明的有包膜病毒(不包括任何流感病毒)，但不限于此1)副粘病毒屬如呼吸道合胞病毒(A和B)、副流感病毒(如PIV-3)、肺炎后病毒(metapneumovirus)、麻疹病毒、腮腺炎病毒；2)皰疹病毒如愛潑斯坦-巴爾病毒、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒；3)黃病毒如登革熱病毒、黃熱病病毒、蜱傳腦炎病毒、日本腦炎病毒；4)披蓋病毒如風(fēng)疹病毒、東方型、西方型和委內(nèi)瑞拉型馬腦炎病毒；5)逆轉(zhuǎn)錄病毒如人免疫缺陷病毒。
本發(fā)明的疫苗制劑任選包括一種以上的裂解病毒制品。
本發(fā)明的疫苗制劑任選包含抗原或來(lái)自與所述裂解制品組合的病原體的抗原，以提供對(duì)抗疾病的另外的保護(hù)。合適的抗原(它不需要來(lái)自裂解制品)包括例如得自任何以上列出的病毒和引起呼吸道疾病的病原體，例如肺炎鏈球菌的抗原。
通過(guò)用具有破壞濃度的裂解劑，裂解或者分裂整個(gè)病毒，包括感染性的(野生型或減毒型)或非感染性的(例如滅活的)病毒，進(jìn)行病毒的裂解，所述裂解劑通常為(但不是必須為)表面活性劑。待裂解的病毒也可以是嵌合重組病毒，具有得自一種以上不同病毒的免疫原性元件。破壞導(dǎo)致所有的病毒蛋白完全或者部分溶解，而這種溶解改變病毒的完整性。
通過(guò)使所述病毒與本發(fā)明的裂解劑接觸，以完全破壞病毒的包膜，可以合適地得到裂解病毒。其它的病毒蛋白優(yōu)選為完全或者部分溶解的。裂解后完整性的喪失使得病毒成為非感染性的，其可以通過(guò)合適的體外滴定分析法評(píng)價(jià)。一旦破碎，病毒包膜蛋白通常不再與整個(gè)完整的病毒體結(jié)合。其它的病毒蛋白優(yōu)選被完全或者部分地溶解，因此與裂解后的整個(gè)完整的病毒體不結(jié)合，或者僅僅部分結(jié)合。
如在此描述的，在蔗糖墊層(cushion)實(shí)驗(yàn)中，用蛋白質(zhì)印跡(Westem Blot)分析和電子顯微鏡目測(cè)觀察，裂解劑對(duì)病毒包膜和病毒蛋白的作用可以伴隨有裂解的病毒和病毒蛋白的遷移。
本發(fā)明裂解疫苗的制備可以另外包括除去裂解劑和某些或者大部分病毒脂質(zhì)物質(zhì)的步驟。裂解有包膜病毒的制備方法還可以包括多種不同的過(guò)濾和/或其它的分離步驟，例如超速離心、超濾、區(qū)帶離心和層析的多種組合步驟，任選滅活步驟，例如用甲醛或者β-丙醇酸內(nèi)酯或UV處理，后者可以在裂解前或者裂解后進(jìn)行。裂解過(guò)程可以作為分批工藝、連續(xù)工藝或者半連續(xù)工藝進(jìn)行。
本發(fā)明的裂解疫苗通常包含膜碎片和膜包膜蛋白以及非膜蛋白，例如在明顯的整個(gè)病毒體不存在下的病毒基質(zhì)蛋白和核蛋白。本發(fā)明的裂解疫苗通常包含大多數(shù)或者所有的病毒結(jié)構(gòu)蛋白，盡管當(dāng)它們?cè)谡麄€(gè)病毒中出現(xiàn)時(shí)不必為相同的比例。優(yōu)選的裂解病毒制品包括至少一半的病毒結(jié)構(gòu)蛋白，優(yōu)選包括所有的這樣的蛋白。另一方面，亞單位疫苗必須由一種或者幾種高純化病毒蛋白組成。例如，亞單位疫苗可包含純化病毒表面蛋白，已知后者在接種疫苗后起激發(fā)所需的病毒中和抗體的作用。
在本發(fā)明中，可以使用多種裂解劑例如非離子型和離子型表面活性劑以及多種其它的試劑。在本發(fā)明的內(nèi)容中有用的裂解劑的實(shí)例包括1.膽汁酸及其衍生物。膽汁酸包括膽酸、脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸、石膽酸、熊去氧膽酸、豬脫氧膽酸和衍生物，像前述的膽酸的糖-、?；?、酰胺基丙基-1-丙磺基-、酰胺基丙基-2-羥基-1-丙磺基衍生物或者N，N-雙(3D葡糖酸酰胺基丙基)脫氧膽酰胺(deoxycholamide)。具體的實(shí)例為脫氧膽酸鈉-NaDOC。
2.非離子型表面活性劑例如octoxynols(TritonTM系列)、聚氧乙烯醚例如聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯(Tween 80TM)，及通式(I)的聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯(I)HO(CH2CH2O)n-A-R其中n為1-50，A為鍵或-C(O)-，R為C1-50烷基或苯基C1-50烷基，及它們中的兩個(gè)或者更多個(gè)的組合。具體的實(shí)例為Tween80TM、TritonX-100TM和laureth9；3.烷基糖苷或烷硫基糖苷，其中烷基鏈介于C6-C18之間，一般介于C8-C14之間，糖部分為任何戊糖或己糖或其具有不同的鍵的組合，像1-＞6、1-＞5、1-＞4、1-＞3、1-2。烷基鏈可以是飽和、不飽和和/或分支的；4.以上3的衍生物，其中一個(gè)或更多個(gè)羥基，優(yōu)選6-位羥基被修飾，像酯、乙氧基化物、硫酸酯、醚、碳酸酯、磺基琥珀酸酯、羥乙磺酸酯、乙醚羧酸酯、季銨化合物；5.酰基糖，其中酰基鏈介于C6-C18之間，一般介于C8-C12之間，糖部分為任何戊糖或己糖或其具有不同的鍵的組合，像1-＞6、1-＞5、1-＞4、1-＞3、1-2。?；溈梢允秋柡偷摹⒉伙柡偷暮?或分支的；6.結(jié)構(gòu)R-N，N-(R1，R2)-3-氨基-1-丙磺酸酯的磺基甜菜堿，其中R為介于C6-C18之間，一般介于C8-C16之間的任何烷基鏈或芳基烷基鏈。烷基鏈R可以是飽和的、不飽和的和/或分支的。R1和R2烷基鏈介于C1-C4之間，一般為C1；7.結(jié)構(gòu)R-N，N-(R1，R2)-甘氨酸的甜菜堿，其中R為介于C6-C18之間，一般介于C8-C16之間的任何烷基鏈。烷基鏈可以是飽和的、不飽和的和/或分支的。R1和R2為介于C1-C4之間的烷基鏈，一般為C1；8.結(jié)構(gòu)R-(-O-CH2-CH2-)n-OH的聚氧乙烯烷基醚，其中R為介于C6-C20之間，一般介于C8-C14之間的任何烷基鏈。烷基鏈可以是飽和的、不飽和的和/或分支的。n介于5-30之間，一般介于8-25之間；9.結(jié)構(gòu)R-(N-R1)-葡糖酰胺的N，N-二烷基-葡糖酰胺(glucamide)，其中R為介于C6-C18之間，一般介于C8-C12之間的任何烷基鏈。烷基鏈可以是飽和的、不飽和的和/或分支的或者環(huán)狀的。R1和R2為介于C1-C6之間的烷基鏈，一般為C1?？梢杂梦焯腔蛘呒禾切揎椞遣糠?；10.Hecameg(6-O-(N-庚基-氨基甲?；?-甲基-α-D-吡喃型葡萄糖苷)；11.結(jié)構(gòu)R-C6H4-O-(-CH2-CH2-)n-OH的烷基苯氧基聚乙氧基乙醇，其中R為介于C6-C18之間的任何烷基鏈，一般為C8的烷基鏈。烷基鏈可以是飽和的、不飽和的和/或分支的(n＞＝3)；12.結(jié)構(gòu)R，-N+(-R1，-R2，-R3)的季銨化合物，其中R為介于C6-C20之間的任何烷基鏈，一般為C20的烷基鏈。烷基鏈可以是飽和的、不飽和的和/或分支的。R1、R2和R3為介于C1-C4之間的烷基鏈，一般為C1。
13.SarcosylN-月桂基肌氨酸鈉鹽；14.CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)或塞他弗倫(Cetavlon)。
最優(yōu)選為NaDoc和Sarcosyl。在室溫下適宜把裂解劑與待裂解的病毒一起溫育，例如過(guò)夜，以進(jìn)行裂解。合適的話，可以采用裂解劑的組合。
裂解疫苗制品優(yōu)選包含至少一種表面活性劑，后者可以具體為非離子型表面活性劑。一種或者更多種非離子型表面活性劑可為來(lái)自裂解過(guò)程的殘留物，和/或加入至裂解后的病毒中。確信裂解抗原材料在非離子型表面活性劑存在下是穩(wěn)定的，盡管應(yīng)理解本發(fā)明并不一定就取決于這樣的情況。合適的穩(wěn)定的非離子型表面活性劑包括octoxynols(TritonTM系列)、聚氧乙烯醚例如聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯(Tween 80TM)，及通式(I)的聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯(I)HO(CH2CH2O)n-A-R其中n為1-50，A為鍵或-C(O)-，R為C1-50烷基或苯基C1-50烷基，及它們中的兩個(gè)或者更多個(gè)的組合。
得自Triton系列的優(yōu)選非離子型表面活性劑包括Triton X-100(叔辛基苯氧基多乙氧基乙醇)、Triton X-165、Triton X-205、Triton X-305或Triton X-405 Triton N-101。Triton X-100為特別優(yōu)選。
優(yōu)選的非離子型表面活性劑還包括但不限于以上的通式(I)的聚氧乙烯醚，具體為聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-9-硬脂基醚、聚氧乙烯-8-硬脂基醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。聚氧乙烯醚最優(yōu)選為聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth9)。在CAS登記號(hào)中公開了聚氧乙烯月桂基醚的另外的術(shù)語(yǔ)或名稱。聚氧乙烯-9-月桂基醚的CAS登記號(hào)為9002-92-0。在默克索引(第12版，登記號(hào)7717，Merck & Co.Inc.，Whitehouse Station，N.J.USA；ISBN 0911910-12-3)中描述了聚氧乙烯醚例如聚氧乙烯月桂基醚。通過(guò)使環(huán)氧乙烷與十二烷醇反應(yīng)可形成laureth9，且具有平均9個(gè)環(huán)氧乙烷單位。
存在于最后疫苗制劑中的穩(wěn)定的表面活性劑的終濃度介于0.001-20％，更優(yōu)選為0.01-10％，最優(yōu)選最多可達(dá)約2％(w/v)。當(dāng)一種或者更多種表面活性劑存在時(shí)，這些表面活性劑通常以每種最多可達(dá)約2％的濃度存在于最后的制劑中，通常每種至多約1％的濃度，一般每種最多可達(dá)約0.6％的濃度，更通常以最多可達(dá)約0.2或0.1％的痕量存在。表面活性劑的任何混合物可以存在于本發(fā)明的疫苗制劑中。
通過(guò)在血清或者在無(wú)血清過(guò)程中于合適的細(xì)胞底物上復(fù)制，可以制備有包膜病毒。組織培養(yǎng)生長(zhǎng)病毒可以在例如人細(xì)胞例如MRC-5、WI-38、HEp-2或猿猴細(xì)胞例如AGMK、Vero、LLc-Mk2、LLc-Mk2、FRhL、FRhL-2或牛細(xì)胞例如MDBK、或犬細(xì)胞例如MDCK，或原代細(xì)胞例如雞胚成纖維細(xì)胞、或任何其它的適合產(chǎn)生用于疫苗目的的病毒的細(xì)胞類型，包括衍生自以上提及的細(xì)胞系的克隆中產(chǎn)生。
裂解疫苗制品適合與藥學(xué)上可接受的賦形劑組合。所使用的藥學(xué)上可接受的賦形劑可以是疫苗制品領(lǐng)域中的那些常規(guī)賦形劑。在任何給定的疫苗制劑中所采用的賦形劑應(yīng)兩者相互適配且與組合物的必需成分適配以便不相互作用，如果有任何相互作用的話，它將削弱各成分與活性劑的性能。所有的賦形劑當(dāng)然必須是無(wú)毒的并具有足夠的純度以使它們適于人體使用。賦形劑的合適實(shí)例為本領(lǐng)域熟知的。
疫苗制劑也可以優(yōu)選包括佐劑，后者可以為載體和/或免疫刺激劑。佐劑可以為得自裂解過(guò)程的殘留物，和/或加入到裂解后的病毒中。用于本發(fā)明疫苗的合適的佐劑為本領(lǐng)域熟知的。
因此，本發(fā)明另一方面提供一種與佐劑組合裂解有包膜病毒疫苗制品在生產(chǎn)用于鼻內(nèi)傳遞的疫苗制劑中的應(yīng)用，所述裂解有包膜病毒制品不是裂解流感病毒制品。優(yōu)選所述制品包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。
本發(fā)明的疫苗制劑可以通過(guò)鼻內(nèi)途徑給予所述疫苗，以用于保護(hù)或治療易感或者患有疾病的哺乳動(dòng)物。本發(fā)明延伸到這樣的治療和保護(hù)的方法。
除了避開對(duì)引起疼痛的注射的需要和因“打針恐懼”的對(duì)患者順應(yīng)性的負(fù)面影響以外，粘膜接種例如通過(guò)鼻內(nèi)方法是吸引人的，因?yàn)樵趧?dòng)物中已顯示，粘膜給予抗原對(duì)在粘膜表面誘導(dǎo)保護(hù)性應(yīng)答具有良好的效力，粘膜表面是許多病原體進(jìn)入的途徑。另外，提示粘膜接種，例如鼻內(nèi)接種，不僅可以在鼻粘膜內(nèi)而且在遠(yuǎn)端粘膜部位例如生殖粘膜誘導(dǎo)粘膜免疫性。盡管在本領(lǐng)域進(jìn)行了大量的研究，用于鼻內(nèi)傳遞的安全有效的疫苗(它們適宜在人中使用)仍有待于確認(rèn)。
本發(fā)明的鼻內(nèi)給藥可以以滴劑、噴霧劑，或干燥粉末形式進(jìn)行。霧化或者氣溶膠化疫苗制劑也形成本發(fā)明的部分。
任何合適的佐劑可以用于本發(fā)明中，并且以任何合適的形式使用，例如溶液、非-泡狀溶液、懸浮液或粉末。優(yōu)選的佐劑包括那些在WO 99/52549中舉例說(shuō)明的那些物質(zhì)，其整個(gè)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。優(yōu)選的佐劑包括但不限于Tween 80TM、Triton X-100TM和laureth9及它們的組合。
非離子型表面活性劑可以與免疫刺激劑有利地結(jié)合，例如脂質(zhì)A的無(wú)毒衍生物，包括那些在US 4,912,094和GB 2,220,211中描述的那些，包括一磷脂酰脂質(zhì)A和二磷脂酰脂質(zhì)A，例如3-de-O-?；涣柞；|(zhì)A(3D-MPL)和3-de-O-酰化二磷脂酰脂質(zhì)A的無(wú)毒衍生物。優(yōu)選的組合為L(zhǎng)aureth-9與3D-MPL的組合。如果合適，以上免疫刺激劑也可以用于不含有非離子型表面活性劑的制劑。
3D-MPL的優(yōu)選形式為直徑小于0.2μm的小粒徑的乳劑形式，其制備方法公開于WO 94/21292中。包含一磷?；|(zhì)A和表面活性劑的水性制劑描述于WO 9843670A2中。
待配制到本發(fā)明組合物中的細(xì)菌脂多糖衍生佐劑可以從細(xì)菌來(lái)源純化和加工，或者它們可以是合成的。例如，在Ribi等1986(Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins，PlenumPubl.Corp.，NY，第407-40149頁(yè))中描述了純化一磷?；|(zhì)A，而在GB 2220211和US 4912094中描述了來(lái)源于沙門氏菌(Salmonella sp.)的3-O-去?；涣柞；蚨字Ｖ|(zhì)A(3D-MPL)。其它純化的和合成的脂多糖已有描述(Hilgers等，1986，Int.Arch.Allergy.Immunol.，79(4)392-6；Hilgers等，1987，Immunology，60(1)141-6；及EP 0 549074 B1)。特別優(yōu)選的細(xì)菌脂多糖佐劑為3D-MPL。
因此，可以用于本發(fā)明的LPS衍生物為那些在結(jié)構(gòu)上與LPS或MPL或3D-MPL類似的免疫刺激劑。在本發(fā)明的另一方面，LPS衍生物可以是酰化單糖，它為MPL上述結(jié)構(gòu)的亞部分。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，佐劑為ADP-核糖基化毒素或其突變體。這樣的毒素的實(shí)例為得自大腸桿菌的Heat Labile Toxin(熱不穩(wěn)定毒素)(LT)及其突變體例如LTR192G，以及這些毒素的片段例如結(jié)合神經(jīng)節(jié)苷脂的成分(LTB)。
進(jìn)一步優(yōu)選的佐劑包括皂草苷如QS21。
一種增強(qiáng)的系統(tǒng)包括無(wú)毒脂質(zhì)A衍生物和皂草苷衍生物的組合，特別是如WO 94/00153中公開的QS21和3D-MPL的組合，或如WO 96/33739所公開的其中QS21被膽固醇猝滅的反應(yīng)原性較小的組合物。
本發(fā)明疫苗的鼻內(nèi)給藥的優(yōu)選裝置為噴霧裝置。合適的鼻噴霧裝置可從Becton Dickinson，Pfeiffer GmBH和Valois經(jīng)市售獲得。
鼻內(nèi)使用的優(yōu)選噴霧裝置不依它們對(duì)使用者施加的壓力的性能而定。壓力閾控制(threshold)裝置是特別有用的，因?yàn)閮H當(dāng)達(dá)到壓力閾值時(shí)，液體才會(huì)自噴嘴釋放。這些裝置更易于獲得具有常規(guī)液滴大小的噴霧。適于本發(fā)明使用的壓力閾控制(threshold)裝置是本領(lǐng)域已知的，并且例如在WO 91/13281和EP 311 863 B中有描述。這樣的裝置目前可以從Pfeiffer GmBH得到，并且也在Bommer R.Advancesin Nasal drug delivery Technology，Pharmaceutical Technology Europe1999年9月，第26-33頁(yè)中有描述。
優(yōu)選的鼻內(nèi)裝置產(chǎn)生1-500μm范圍內(nèi)的液滴(采用水作為液體測(cè)量)。10μm以下的液滴存在吸入的危險(xiǎn)，因此。要求10μm以下的液滴不多于約5％。
雙劑量傳遞是用于本發(fā)明疫苗的鼻內(nèi)傳遞系統(tǒng)的另外的優(yōu)選特征。雙劑量裝置含有單一疫苗劑量的兩個(gè)亞劑量，每個(gè)鼻孔給予一個(gè)亞劑量。
本發(fā)明也提供一種包含本發(fā)明的裂解疫苗制劑的鼻內(nèi)傳遞裝置。
本發(fā)明另一個(gè)方面提供一個(gè)藥用試劑盒，它包含一個(gè)如在此描述的鼻內(nèi)給藥裝置，或者包含一個(gè)鼻內(nèi)給藥裝置和一個(gè)分開的用于該裝置的疫苗制劑。
本發(fā)明的這個(gè)方面不一定限制于液體制劑的噴霧傳遞。本發(fā)明的疫苗可以其它的形式，例如粉末給藥。
本發(fā)明的疫苗制劑可以用于預(yù)防和治療兩種目的。因此，本發(fā)明提供治療易感或者患有感染性疾病的哺乳動(dòng)物的方法。本發(fā)明的另一方面提供在此描述的用于醫(yī)藥的疫苗。在New Trends andDevelopments in Vaccines，Voller等編輯，University Park Press，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978中全面描述了疫苗制劑。
疫苗可以以任何合適的給藥方案?jìng)鬟f，例如一次劑量或者兩次劑量方案。疫苗可用于首次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的和已接觸過(guò)抗原的群體，即血清陰性和血清陽(yáng)性的個(gè)體。
優(yōu)選所述制劑包括佐劑和/或給予通過(guò)接觸于病毒已接觸過(guò)抗原的個(gè)體。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)疫苗制劑的方法，該方法包括以下步驟(a)裂解有包膜病毒；(b)任選使裂解有包膜病毒制品與穩(wěn)定劑混合；和(c)任選使裂解有包膜病毒制品與佐劑(其中佐劑也可以是載體和/或免疫刺激劑)混合。
所述方法合適地包括步驟(a)和(b)、(a)和(c)，或(a)、(b)和(c)。穩(wěn)定劑適合包括至少一種選自包括聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯(TWEEN 80TM)、叔辛基苯氧基多乙氧基乙醇(TRITON X100TM)、聚氧乙烯-9-月桂基醚在內(nèi)的表面活性劑。
以該方法生產(chǎn)的疫苗可以任選與合適的載體混合。
本發(fā)明也延伸到如在此所述的裂解有包膜病毒的方法，包括用合適的裂解劑處理病毒。
本發(fā)明通過(guò)以下(但不限于)圖和實(shí)施例說(shuō)明，其中

圖1說(shuō)明裂解RSVA與抗F抗體的蛋白質(zhì)印跡；圖2說(shuō)明裂解RSVA與抗M2抗體的蛋白質(zhì)印跡；圖3說(shuō)明裂解RSVA與抗G抗體的蛋白質(zhì)印跡；圖4說(shuō)明裂解RSVA與抗N抗體的蛋白質(zhì)印跡；圖5說(shuō)明通過(guò)EM觀察的RSV/A病毒原料；圖6說(shuō)明通過(guò)EM觀察用NaDOC裂解的RSV/A病毒；圖7說(shuō)明通過(guò)EM觀察的PIV3病毒原料；圖8說(shuō)明通過(guò)EM觀察用NaDOC裂解的pIV3病毒；圖9說(shuō)明通過(guò)EM觀察的HSV2病毒原料；圖10說(shuō)明通過(guò)EM觀察用Sarcosyl裂解的HSV2病毒；圖11說(shuō)明用裂解RSV經(jīng)肌內(nèi)或鼻內(nèi)途徑免疫已接觸過(guò)抗原的小鼠的抗FG抗體(ELISA)滴度(Post II)；圖12說(shuō)明用裂解RSV經(jīng)肌內(nèi)或鼻內(nèi)途徑免疫已接觸過(guò)抗原的小鼠的抗RSV/A中和抗體滴度(Post II)；圖13說(shuō)明用裂解RSV經(jīng)肌內(nèi)或鼻內(nèi)途徑免疫已接觸過(guò)抗原的小鼠的抗FG IgG同種型反應(yīng)(Post II)；圖14說(shuō)明用裂解RSV經(jīng)肌內(nèi)或鼻內(nèi)途徑免疫已接觸過(guò)抗原的小鼠的抗FG抗體(ELISA)滴度(Post I)；圖15說(shuō)明用裂解RSV經(jīng)鼻內(nèi)途徑免疫未接觸過(guò)抗原的小鼠的抗FG抗體(ELISA)滴度；圖16說(shuō)明用裂解RSV經(jīng)鼻內(nèi)途徑免疫未接觸過(guò)抗原的小鼠的抗RSV/A中和抗體滴度。
實(shí)施例1 裂解病毒的生成通過(guò)加入裂解劑例如表面活性劑，將來(lái)源于各個(gè)病毒科的有包膜病毒裂解。通過(guò)SDS-PAGE分析目測(cè)裂解病毒在蔗糖梯度或緩沖墊層中的遷移特性以及通過(guò)采用電子顯微鏡評(píng)價(jià)直接檢測(cè)裂解病毒產(chǎn)物，可以評(píng)價(jià)裂解。
在這個(gè)實(shí)施例中描述的裂解病毒包括多個(gè)有包膜病毒科的代表。例如，副粘病毒科(呼吸道合胞病毒A和B、副流感病毒-3、腮腺炎病毒和麻疹病毒)的成員、披蓋病毒科(風(fēng)疹病毒)和皰疹病毒科(愛潑斯坦-巴爾病毒、巨細(xì)胞病毒或單純皰疹病毒)的成員被評(píng)價(jià)。
通過(guò)加入裂解劑，例如在對(duì)無(wú)細(xì)胞病毒制品的助溶濃度下的表面活性劑，可以實(shí)現(xiàn)破壞病毒顆粒(裂解)的作用。具體地說(shuō)，膽汁酸和烷基糖苷被用作表面活性劑。單獨(dú)或者以多種組合加入表面活性劑，并溫育使該過(guò)程進(jìn)行至完成。
采用蔗糖梯度或緩沖墊層離心，初步進(jìn)行有效裂解的評(píng)價(jià)。簡(jiǎn)而言之，將表面活性劑處理和未處理的樣品上樣至蔗糖梯度/緩沖墊層，并且在SDS-PAGE凝膠上分析各部分。在可溶性部分中所有類型的病毒體蛋白質(zhì)的遷移指明有效的裂解。通過(guò)電子顯微鏡，進(jìn)一步分析經(jīng)蔗糖-SDS-PAGE分析被認(rèn)為有效裂解的樣品。采用標(biāo)準(zhǔn)負(fù)染色技術(shù)對(duì)樣品目測(cè)。
以下具體裂解實(shí)驗(yàn)在RSV、HSV和PIV上進(jìn)行。1.1 細(xì)胞培養(yǎng)條件將人野生型RSV/A/Long和PIV-3在VERO細(xì)胞中以固定無(wú)血清方法復(fù)制。感染前，使VERO細(xì)胞生長(zhǎng)4天至匯合。病毒產(chǎn)生條件適用于每種病毒在35℃下，MOI 0.03，對(duì)RSV/A 4天；MOI 0.001，對(duì)HSV23天和MOI 0.01、在37℃下，對(duì)PIV-35天。在收獲當(dāng)天，于裂解后收獲細(xì)胞液體，加入穩(wěn)定劑并立即在-70℃下貯存。1.2 病毒純化通過(guò)以1000×g離心10分鐘澄清后，經(jīng)PEG 6000沉淀上清液，使病毒顆粒沉淀。使沉淀重懸浮于Tris 50mM-NaCl 50mM-MgSO42mM(pH7.5)緩沖液中，隨后通過(guò)benzonase處理。在500kD AGT膜上，對(duì)5體積的磷酸鹽緩沖鹽水超濾該溶液，然后對(duì)5體積的磷酸鹽緩沖液(pH7.5)滲濾。
如由EM證實(shí)的那樣，產(chǎn)生完整的病毒顆粒并且如在此描述的那樣在蔗糖緩沖墊層上離心。測(cè)定蛋白濃度。1.3 病毒裂解通過(guò)向無(wú)細(xì)胞病毒制劑中加入裂解劑，可裂解病毒顆粒。
為有效，必須在其臨界膠束濃度cmc以上采用去污劑。它們的cmc值以以上的終濃度使用所有的去污劑。研究D/P比率(去污劑/蛋白比率)。D/P比率≥25時(shí)成功獲得裂解，此為優(yōu)選的。
在2％濃度下，采用以下去污劑以裂解病毒顆粒；脫氧膽酸鈉、Sarkosyl、Plantacare和Laureth9。
裂解后，對(duì)制劑緩沖液(PO4 10mM/NaCl 150mM pH7.5)透析溶液以除去過(guò)量的去污劑。
通過(guò)舉例的方式，概述對(duì)RSV的裂解過(guò)程如下RSV-A病毒純化流程圖收獲澄清液在3500 RPM(1000×g)+4℃下，于Beckman JA10轉(zhuǎn)子上離心10分鐘。
→澄清上清液↓10％PEG 6000沉淀于4℃下，緩慢攪拌1小時(shí)30分鐘以3500 RPM(1000×g)離心約20分鐘沉淀重懸浮于Tris 50mM-NaCl 50mM-MgSO42mM(pH7.5)緩沖液中。
↓Benzonase處理在125單位/ml下攪拌下溫育最少4小時(shí)↓超濾AGT-VAGE4A-500Kd-420cm25體積對(duì)PO4(Na)10mM-NaCl 150mM(pH7.5)隨后5體積的PO4(Na)20mM(pH7.5)↓裂解緩慢攪拌下于室溫加入去污劑≤2％最終-溫育O/N↓澄清在Sartopure 300(GF2-深度濾膜1.2μm)上死端式過(guò)濾(Dead-end filtration)↓超濾清除去污劑-濃縮5體積PO4(Na)20mM(pH7.5)然后5體積PO4(Na)10mM/NaCl 150mM(pH7.5)↓裂解體積1.4 裂解病毒特性通過(guò)30％蔗糖緩沖墊層(在TL 100 Beckman轉(zhuǎn)子上，在50,000rpm下1小時(shí))上超速離心，測(cè)定起始病毒的完整性和裂解質(zhì)量。通過(guò)特異性蛋白質(zhì)印跡測(cè)定分析各部分；對(duì)這些部分中的一些部分進(jìn)行電子顯微鏡和感染性效價(jià)分析。1.4.1 超速離心用30％蔗糖溶液(450μl)填充離心管一半后，將待分析的樣品(450μl)溫和且小心填充到該蔗糖緩沖墊層上，然后在Beckman TL100轉(zhuǎn)子中，以50,000rpm于+4℃離心1小時(shí)。離心后，試管排出3個(gè)部分。上相(300μl)稱為“上清液”。中間相(300μl)為樣品與蔗糖緩沖墊層之間的界面相；在此稱之為“中間層(middle)”。當(dāng)在完整病毒上離心時(shí)，下相(300μl)為具有重懸浮沉淀物的底部溶液，稱之為“沉淀物”。
進(jìn)一步分析這3個(gè)部分。1.4.2 蛋白質(zhì)印跡分析這個(gè)分析可檢測(cè)待檢查的病毒(沉淀部分陽(yáng)性)的完整性和待測(cè)定的裂解物(合適地，上清液部分對(duì)所有或大多數(shù)的結(jié)構(gòu)蛋白例如包膜蛋白陽(yáng)性)的功效。
特異性抗體用于特異性病毒蛋白的特征鑒定。
分析對(duì)RSV-A非-裂解和裂解部分的抗F蛋白(表面蛋白)、抗G蛋白(表面蛋白)、抗N蛋白(核衣殼)和抗M蛋白(基質(zhì))的含量。
對(duì)PIV-3病毒，分析非-裂解和裂解部分的HN蛋白含量(用單克隆抗體)和F、M、HN蛋白含量(用多克隆抗體)。
對(duì)HSV，用抗體分析非-裂解和裂解部分的G蛋白、間層蛋白和衣殼蛋白含量。裂解的標(biāo)準(zhǔn)針對(duì)沉淀部分中的所有四種待測(cè)蛋白的陽(yáng)性蛋白質(zhì)印跡(WB)信號(hào)的存在和裂解前在兩個(gè)其它部分中的信號(hào)的不存在提示在病毒制劑中存在全完整病毒。
當(dāng)包膜破壞時(shí)，裂解被認(rèn)為是有效的，并且在上清液和/或中間部分中檢測(cè)出包膜蛋白。當(dāng)F或G例如在S或M部分中被檢測(cè)到時(shí)，對(duì)RSV，裂解是有效的。優(yōu)選F和G基本上位于S層和/或M層，并且在沉淀中不存在。結(jié)果概述對(duì)RSVA的結(jié)果示于圖1-4中。
在所有的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果中，“Split-O”指裂解前的病毒?！癝”、“M”和“P”分別指樣品在蔗糖緩沖墊層上超速離心后采集的“上清液”、“中間層”和“沉淀物”部分。電泳泳道的編號(hào)從左至右。體積指沉積在SDS-PAGE凝膠上的樣品的量。
圖1說(shuō)明用mAb B4(抗F)探測(cè)的裂解RSVA的蛋白質(zhì)印跡；上圖下圖
圖2說(shuō)明用抗M單克隆探測(cè)的裂解RSVA的蛋白質(zhì)印跡；上圖下圖
圖3說(shuō)明用抗G單克隆探測(cè)的裂解RSVA的蛋白質(zhì)印跡；上圖下圖
圖4說(shuō)明用抗N單克隆探測(cè)的裂解RSVA的蛋白質(zhì)印跡；上圖下圖
裂解F和G蛋白后，在培養(yǎng)基和上清液部分存在信號(hào)而在沉淀部分幾乎沒有任何條帶，這顯示病毒包膜完全破壞。所有部分中的N和M蛋白的信號(hào)存在顯示這些蛋白存在于裂解制劑中。這些結(jié)果提示受試的所有四種去污劑導(dǎo)致RSVA裂解病毒。
在所有的部分中對(duì)全部四種蛋白的信號(hào)的分析，并且特別是對(duì)在培養(yǎng)基和上清液部分裂解后的N和M蛋白的比較的信號(hào)提示，在試驗(yàn)條件下，NaDOC和Sarkosyl不僅導(dǎo)致裂解病毒，而且也能夠使所有的病毒結(jié)構(gòu)破壞，并且溶解結(jié)構(gòu)和非-結(jié)構(gòu)蛋白。
用裂解PIV、HSV和麻疹病毒(其可以用例如2％Nadoc或Sarcosyl成功裂解)得到類似的結(jié)果。
NaDoc和Sarkosyl為所有病毒的優(yōu)選裂解劑。1.5 體外病毒滴定裂解后完整性的喪失可使病毒成為非感染性的。病毒成功的破壞的分析顯示裂解后的病毒滴度喪失106log或以上。1.6 電子顯微鏡(EM)分析采用標(biāo)準(zhǔn)兩步負(fù)染色方法，使用磷鎢酸鈉作為造影劑，進(jìn)行電子顯微鏡分析(Hayat和Miller，1990，Negative Staining，McGraw，ed.Hill)。檢測(cè)柵格以評(píng)價(jià)材料的裂解模式。
非-裂解和NaDoc或Sarkosyl裂解的RSVA、HSV2和PIV3病毒制劑的電子顯微鏡分析支持經(jīng)蛋白質(zhì)印跡分析得到的觀察結(jié)果。為說(shuō)明結(jié)果，顯示RSV、PIV和HSV數(shù)據(jù)。
圖5說(shuō)明通過(guò)電鏡觀察的RSV/A原料。圖6說(shuō)明用NaDOC裂解后的RSV/A。圖7說(shuō)明通過(guò)電鏡觀察的PIV3原料。圖8說(shuō)明用NaDOC裂解后的PIV3。圖9說(shuō)明通過(guò)電鏡觀察的HSV2原料。圖10說(shuō)明用Sarcosyl裂解后的HSV2。
非裂解病毒(全完整病毒)含有相對(duì)保存完好的或者輕微損傷的病毒顆粒和某些無(wú)定形物。NaDoc或Sarkosyl裂解病毒顯示出現(xiàn)不均-分布的無(wú)定形物，這些物質(zhì)以不同的程度聚集。用所有的待測(cè)病毒RSV、PIV和HSV得到類似的數(shù)據(jù)。此外，用RSV或PIV觀察到極少量來(lái)自病毒包膜或者核蛋白源的可鑒別的結(jié)構(gòu)。實(shí)施例2.裂解疫苗在小鼠體內(nèi)的免疫原性裂解RSV和/或PIV制品用作接種小鼠以評(píng)價(jià)這些制劑的免疫原性的免疫原。簡(jiǎn)而言之，用鼻內(nèi)裂解疫苗制品免疫8周齡雌性小鼠。包括未加佐劑的對(duì)照。以數(shù)周間隔給予兩個(gè)劑量。
最后一次給藥兩周后，處死動(dòng)物并收集血液、脾細(xì)胞和/或鼻腔洗液。通過(guò)在病毒-特異性ELISA測(cè)定中試驗(yàn)小鼠血清，評(píng)價(jià)血清中的病毒特異性體液免疫應(yīng)答。另外，采用同種型特異性測(cè)定，測(cè)定抗體反應(yīng)的同種型分布。采用特異性病毒中和試驗(yàn)，評(píng)價(jià)中和抗體在血清中的存在。通過(guò)測(cè)定鼻腔洗液中的中和抗體或者測(cè)定鼻腔洗液中的病毒-特異性IgA，可以評(píng)價(jià)有關(guān)的局部免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)作用。
通過(guò)體外刺激收獲的脾細(xì)胞和測(cè)定細(xì)胞增殖(氚標(biāo)記胸苷攝取)和/或通過(guò)受刺激細(xì)胞的IL-5和IFNγ的分泌，可以評(píng)價(jià)病毒特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)作用。
將特別注意力放在由裂解制品誘導(dǎo)的反應(yīng)的性質(zhì)和大小上，能夠評(píng)價(jià)在實(shí)驗(yàn)中的變量的影響。2.1 裂解RSV制劑當(dāng)通過(guò)鼻內(nèi)(IN)途徑給藥時(shí)，以下系列實(shí)驗(yàn)示例性說(shuō)明裂解病毒例如RSV誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答。為更準(zhǔn)確地反映幼年(pediatric)(首次進(jìn)行試驗(yàn))或老年(已接觸過(guò)抗原的)群體的免疫狀態(tài)，在已接觸過(guò)抗原的或者未接觸過(guò)抗原的動(dòng)物中評(píng)價(jià)免疫原性，并且在兩種群體中證實(shí)免疫原性。IM傳遞用于對(duì)比。
在第一套實(shí)驗(yàn)中，8周齡雌性Balb/c小鼠被用于測(cè)試經(jīng)IM或IN途徑給予裂解RSV制品的免疫原性。通過(guò)以60μl(2×30μl)體積鼻內(nèi)給予3×105噬斑形成單位(pfu)的活RSV病毒，實(shí)現(xiàn)已接觸過(guò)抗原的目的。接觸抗原后三周，用RSV裂解抗原接種動(dòng)物。RSV裂解產(chǎn)物的定量基于RSV F蛋白特異性ELISA，后者可將裂解產(chǎn)物中的F蛋白與重組FG蛋白標(biāo)準(zhǔn)物比較來(lái)定量。以21天的間隔，通過(guò)肌內(nèi)途徑給予2個(gè)劑量RSV裂解抗原(在100μl中含4.2μg F蛋白)使A組小鼠免疫。以21天的間隔，通過(guò)肌內(nèi)途徑給予2次劑量為100μl中含輔以50μg Al(OH)3的4.2μg F蛋白的RSV裂解抗原使組B小鼠免疫。通過(guò)鼻內(nèi)途徑給予60μl含2.7μg F蛋白的第一個(gè)劑量和21天后用在60μl中含4μg F蛋白的第二個(gè)劑量的RSV裂解抗原，使C組小鼠免疫。最后一次給藥后兩周，處死所有的動(dòng)物并評(píng)價(jià)免疫應(yīng)答。
在圖11-16中概述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。用于評(píng)價(jià)免疫應(yīng)答的讀出的第一次免疫為ELISA測(cè)定，該測(cè)定測(cè)量存在于已接種動(dòng)物血清中的總RSVFG-特異性免疫球蛋白(Ig)或者FG-特異性IgG同種型(IgG1和IgG2A)。在這些測(cè)定中，用重組RSV FG抗原包被96孔皿，并且系列稀釋動(dòng)物血清并加樣至包被的孔中。通過(guò)加入生物素化的抗小鼠Ig、IgG1或IgG2A，隨后用過(guò)氧化物酶-綴合的鏈霉抗生物素蛋白擴(kuò)增，可以檢測(cè)已結(jié)合的抗體。加入OPDA底物，隨后用2N H2SO4處理，在490nm下測(cè)量光密度(OD)，顯示已結(jié)合的抗體。采用SoftMax Pro軟件(采用四參數(shù)方程式)自對(duì)照品計(jì)算抗體效價(jià)并以EU/ml表示。
除ELISA測(cè)定以外，也包括中和試驗(yàn)對(duì)由免疫接種誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的性質(zhì)作進(jìn)一步的特征鑒定。對(duì)中和試驗(yàn)，將動(dòng)物血清的兩倍稀釋液與RSV/A病毒(3000pfu)和豚鼠補(bǔ)體在96孔組織培養(yǎng)皿中于37℃溫育1小時(shí)。將Hep-2細(xì)胞(104細(xì)胞/孔)直接加入到每孔中，并于37℃把培養(yǎng)板溫育4天。吸出上清液，并向每孔中加入市售的WST-1溶液。于37℃將該板溫育另外18-24小時(shí)。在450nm下監(jiān)測(cè)OD并通過(guò)線性回歸分析進(jìn)行滴定分析。所報(bào)道的滴度與血清稀釋度相反，后者導(dǎo)致對(duì)未感染細(xì)胞所觀察到的最大OD減少50％。
圖11顯示采用讀出總Ig ELISA所得到的結(jié)果。在已接觸過(guò)抗原的小鼠體內(nèi)，通過(guò)IM(A組、B組)或IN(C組)給予裂解RSV抗原接種2次，誘導(dǎo)有效的抗FG抗體反應(yīng)。
具體地說(shuō)，圖11顯示在已與活RSV接觸過(guò)并經(jīng)肌內(nèi)(IM)或鼻內(nèi)(IN)途徑用裂解RSV免疫的小鼠體內(nèi)的抗FG抗體(ELISA)效價(jià)(第二次接種后)。A組接受2個(gè)劑量，每個(gè)劑量4.2μg裂解RSV IM。B組接受2個(gè)劑量，每個(gè)劑量4.2μg輔以明礬的裂解RSV IM。C組接受2個(gè)劑量，分別為2.7和4.0μg裂解RSV IN。
圖12顯示中和試驗(yàn)結(jié)果。在這些已接觸過(guò)抗原的動(dòng)物中，通過(guò)IM或者IN接種2個(gè)劑量的裂解RSV制品誘導(dǎo)有效的病毒中和抗體反應(yīng)。
具體地說(shuō)，圖12顯示在已接觸活RSV并通過(guò)肌內(nèi)(IM)或鼻內(nèi)(IN)途徑用裂解RSV免疫的小鼠體內(nèi)的抗RSV/A中和抗體效價(jià)(第二次接種后)。A組接受2個(gè)劑量，每個(gè)劑量4.2μg裂解RSV IM。B組接受2個(gè)劑量，每個(gè)劑量4.2μg輔以明礬的裂解RSV IM。C組接受2個(gè)劑量分別為2.7和4.0μg的裂解RSV IN。
圖13顯示同種型分析的結(jié)果。在鼻內(nèi)已接觸過(guò)抗原的動(dòng)物中，與在未接觸過(guò)抗原的小鼠中得到的數(shù)據(jù)相比較(參見下文)，IgG2a∶IgG1的比率增加，提示當(dāng)小鼠已與活病毒接觸過(guò)時(shí)，往往有助于更多的Th1-樣反應(yīng)(即老年群體的自然情況)。
具體地說(shuō)，圖13顯示在已接觸過(guò)活RSV并經(jīng)肌內(nèi)(IM)或鼻內(nèi)(IN)途徑用裂解RSV免疫的小鼠體內(nèi)的抗FG IgG同種型(ELISA)反應(yīng)(第二次接種后)。A組接受2個(gè)劑量，每個(gè)劑量4.2μg裂解RSV IM。B組接受2個(gè)劑量，每個(gè)劑量4.2μg輔以明礬的裂解RSV IM。C組接受2個(gè)劑量，分別為2.7和4.0μg的裂解RSV IN。
圖14證實(shí)即使在單次給予抗原后，也可在已接觸過(guò)抗原的群體中對(duì)用裂解RSV經(jīng)IN接種的應(yīng)答產(chǎn)生強(qiáng)免疫應(yīng)答。因此，在已接觸過(guò)抗原的群體中，裂解RSV為IN接種后誘導(dǎo)高滴度抗體反應(yīng)的有效免疫原。
具體地說(shuō)，圖14顯示在已接觸過(guò)活RSV并經(jīng)肌內(nèi)(IM)或鼻內(nèi)(IN)途徑用裂解RSV免疫的小鼠體內(nèi)的抗FG抗體(ELISA)滴度(首次接種后)。A組接受2個(gè)劑量，每個(gè)劑量4.2μg裂解RSV IM。B組接受2個(gè)劑量，每個(gè)劑量4.2μg輔以明礬的裂解RSV IM。C組接受2個(gè)劑量，分別為2.7和4.0μg的裂解RSV IN。D組僅接觸過(guò)抗原且不接受接種-對(duì)該組報(bào)道的抗體滴度低于檢測(cè)水平并且在已接觸過(guò)抗原后第21天測(cè)量。
在第二個(gè)系列的實(shí)驗(yàn)中，未接觸過(guò)抗原的小鼠被用于證明抗原劑量的作用和對(duì)裂解RSV制品的免疫原性的輔助作用。對(duì)于第一個(gè)劑量，小鼠接受含2.4μg F蛋白(在60μl中傳遞-2×30μl)的裂解RSV抗原。對(duì)于30天后給予的第二個(gè)劑量，小鼠接受含3.5μg F蛋白的裂解RSV抗原。輔以加入5μg大腸桿菌不穩(wěn)定毒素(LT)或聚氧乙烯-9-月桂基醚0.5％(此中稱為“Lanreth9”)或者不加佐劑，給予IN裂解RSV。接受在第1劑量中含2.0μg F蛋白而在第2劑量中含3.5μg F蛋白的全純化RSV病毒的對(duì)照組也經(jīng)鼻內(nèi)途徑免疫。最后一次接種給予兩周后，處死動(dòng)物并評(píng)價(jià)免疫應(yīng)答。
如圖15和16所示，在未接觸過(guò)抗原的小鼠中通過(guò)IN制劑誘導(dǎo)抗體反應(yīng)。當(dāng)ELISA讀數(shù)(圖15)提示對(duì)IN接種的反應(yīng)弱于那些通過(guò)IM誘導(dǎo)的反應(yīng)時(shí)，中和讀數(shù)(圖16)提示輔以LT的裂解RSVIN制劑在誘導(dǎo)中和抗體中至少與IM同樣好并且其它的制劑也可以與IM相當(dāng)。因此，在未接觸過(guò)抗原的小鼠中，通過(guò)IN途徑給予的裂解RSV也是具有免疫原性的。
具體地說(shuō)，圖15顯示在未接觸過(guò)抗原的經(jīng)鼻內(nèi)(IN)或肌內(nèi)(IM)途徑用裂解RSV免疫的小鼠體內(nèi)的抗FG抗體(ELISA)滴度(第二次接種后)。A組接受2個(gè)劑量，各為2.4和3.5μg的裂解RSVIN。B組接受2個(gè)劑量，各為2.4和3.5μg輔以Laureth9的裂解RSV IN。C組接受2個(gè)劑量，各為2.4和3.5μg輔以LT的裂解RSV IN。D組接受2個(gè)劑量各為2.0和3.5μg的純化全病毒IN。E組接受2個(gè)劑量各為4.2μg的裂解RSV IM。
圖16顯示在未接觸過(guò)抗原的經(jīng)鼻內(nèi)(IN)或肌內(nèi)(IM)途徑用裂解RSV免疫的小鼠體內(nèi)的抗RSV/A中和抗體滴度(第二次接種后)。A組接受2個(gè)劑量，各為2.4和3.5μg的裂解RSV IN。B組接受2個(gè)劑量，各為2.4和3.5μg輔以Laureth9的裂解RSV IN。C組接受2個(gè)劑量，各為2.4和3.5μg輔以LT的裂解RSV IN。D組接受2個(gè)劑量，各為2.0和3.5μg的純化全病毒IN。E組接受2個(gè)劑量，各為4.2μg的裂解RSV IM。
總之，這些實(shí)驗(yàn)已證實(shí)裂解RSV抗原在首次用于和已接觸過(guò)抗原的群體中是強(qiáng)免疫原性的。另外，這些實(shí)驗(yàn)已顯示通過(guò)鼻內(nèi)途徑可以有效地給予裂解RSV，并且是有免疫原性的。
權(quán)利要求
1.一種裂解有包膜病毒制品在制備用于鼻內(nèi)傳遞的疫苗制劑中的用途，所述裂解有包膜病毒制品不是裂解流感病毒制品。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述裂解有包膜病毒制品或者是單一的呼吸道合胞病毒、副流感病毒、麻疹病毒和單純皰疹病毒或者是它們的混合物。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的用途，其中所述裂解有包膜病毒制品包含病毒膜碎片、病毒膜包膜蛋白、病毒基質(zhì)和核蛋白。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的用途，它還包含一種或者更多種殘留的裂解劑。
5.權(quán)利要求4的用途，其中所述殘留的裂解劑選自laureth9、NaDOC、Sarcosyl基團(tuán)、Tween 80TM和Triton X100TM。
6.權(quán)利要求5的用途，其中所述裂解劑為NaDOC或Sarcosyl。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的用途，它還包含穩(wěn)定劑。
8.權(quán)利要求7的用途，其中所述穩(wěn)定劑為表面活性劑。
9.權(quán)利要求8的用途，其中所述表面活性劑或者是單一的聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯(TWEEN 80TM)、叔辛基苯氧基多乙氧基乙醇(TRITON X100TM)和聚氧乙烯-9-月桂基醚或者是它們的混合物。
10.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)要求的用途，它還包括佐劑。
11.一種生產(chǎn)如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)要求的疫苗制劑的方法，該方法包括以下步驟(a)裂解有包膜病毒；(b)任選使裂解有包膜病毒制品與穩(wěn)定劑混合；和(c)任選使裂解有包膜病毒制品與佐劑(載體和/或免疫刺激劑)混合。
12.一種生產(chǎn)如權(quán)利要求11要求的疫苗制劑的方法，其中所述穩(wěn)定劑為至少一種選自聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯(TWEEN 80TM)、叔辛基苯氧基多乙氧基乙醇(TRITON X100TM)和聚氧乙烯-9-月桂基醚的表面活性劑。
13.一種裂解有包膜病毒疫苗制品在制備用于預(yù)防或治療疾病的鼻內(nèi)疫苗制劑中的用途，所述裂解有包膜病毒制品不是裂解流感病毒制品。
14.一種用于如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)要求的鼻內(nèi)疫苗制劑的傳遞的試劑盒，它包含(a)裂解有包膜病毒制品；和(b)鼻內(nèi)傳遞裝置。
15.一種鼻內(nèi)傳遞裝置，它包含權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的疫苗。
16.一種權(quán)利要求15的裝置，它為一種壓力閾裝置。
17.一種保護(hù)或者治療易感或者患有由有包膜病毒引起的疾病的哺乳動(dòng)物的方法，該方法包括經(jīng)鼻途徑給予權(quán)利要求1-10的疫苗。
18.一種任一前述權(quán)利要求的方法、用途、試劑盒或裝置，其中所述疫苗制劑在血清反應(yīng)陽(yáng)性和血清反應(yīng)陰性的個(gè)體中都有免疫原性。
全文摘要
本發(fā)明特別涉及包含裂解有包膜病毒制品的疫苗制劑，它不是裂解流感病毒制品，所述制劑在制備用于鼻內(nèi)傳遞的疫苗制劑中的用途，制備這樣的制劑的方法和這樣的疫苗在預(yù)防或者治療疾病中的用途。
文檔編號(hào)A61K39/165GK1477971SQ01819807
公開日2004年2月25日 申請(qǐng)日期2001年10月1日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月2日
發(fā)明者B·D·A·科勞, M·德沙姆普斯, B D A 科勞, 襯菲賬 申請(qǐng)人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司