本發(fā)明屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種布氏乳桿菌微生物菌株及其在發(fā)酵同步合成和轉(zhuǎn)化合成高值有機(jī)酸中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

有機(jī)酸在化工、材料、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和食品等許多領(lǐng)域有重要應(yīng)用。利用微生物發(fā)酵或微生物轉(zhuǎn)化合成有機(jī)酸，具有制備條件溫和、環(huán)境友好和合成路徑較簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，是生物化工領(lǐng)域的重要方向。

乳酸和苯乳酸都是十分重要的高值有機(jī)酸。乳酸作為一種帶羥基的羧酸，具有廣泛的用途，如在臨床用于消毒劑、手術(shù)縫合線(xiàn)、藥物制劑，在食品領(lǐng)域作為保鮮劑、調(diào)味劑，日用品領(lǐng)域作為化妝品的滋潤(rùn)劑、護(hù)發(fā)劑、保濕劑，農(nóng)業(yè)領(lǐng)域作為緩釋劑、地膜、飼料添加劑，化工和材料領(lǐng)域作為重要的單體等。苯乳酸不僅是新型廣譜抗菌劑，而且是合成高分子材料的重要單體，也是合成抗血小板凝聚和心肌梗塞藥物的前體，在諸多工業(yè)領(lǐng)域有重要的應(yīng)用前景。

化學(xué)法合成乳酸和苯乳酸過(guò)程中，存在一些局限性，如使用高毒溶劑、環(huán)境污染及產(chǎn)物中溶劑殘留等。微生物法合成乳酸和苯乳酸，可以克服化學(xué)合成法的局限性，是近幾年研究發(fā)展的新途徑。

但是，通過(guò)微生物發(fā)酵合或轉(zhuǎn)化合成這些高值有機(jī)酸，常常存在菌株的安全性、高效性、轉(zhuǎn)化產(chǎn)率低、產(chǎn)物濃度低等難題。因此，需要探索既安全又具有很好發(fā)酵合成或轉(zhuǎn)化合成能力的新菌株。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題，本發(fā)明目的是提供一株布氏乳桿菌株，該菌株既有很好的生物安全性，又有很好的乳酸和苯乳酸同步發(fā)酵合成能力和苯乳酸轉(zhuǎn)化合成能力。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，所采取如下的技術(shù)方案：

（1）一種布氏乳桿菌株，其特征在于，所述菌株命名為布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）GBS3，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC No. M 2016215。保藏時(shí)間：2016年4月21日；保藏地址：湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，郵編430072。

進(jìn)一步，所述的布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）GBS3為革蘭氏陽(yáng)性桿菌，0.8微米×1.5~2.0微米；成鏈生長(zhǎng)、無(wú)芽孢、不運(yùn)動(dòng)、兼性厭氧、過(guò)氧化氫酶陰性、化能異養(yǎng)。

更進(jìn)一步，所述的布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）GBS3菌株16S rDNA序列如SEQ ID NO ：1所示。

（2）一種布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）GBS3在發(fā)酵合成乳酸和苯乳酸中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，該應(yīng)用以所述的布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）GBS3菌株為出發(fā)菌株，在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，得到含有乳酸和苯乳酸的發(fā)酵液。

進(jìn)一步，所述的液體培養(yǎng)基組成為：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，檸檬酸氫二胺2 g，無(wú)水乙酸鈉5 g，硫酸錳0.25 g，硫酸鎂0.58 g，磷酸氫二鉀2 g，酵母膏5 g，牛肉膏10 g，吐溫80 1 g，去離子水1 L，pH值自然。

進(jìn)一步，所述的發(fā)酵條件為：溫度25~35℃，發(fā)酵時(shí)間24~72 h，靜置發(fā)酵。

更進(jìn)一步，所述的含有乳酸和苯乳酸的發(fā)酵液中，乳酸的終濃度為0.5~1.8 g/L，苯乳酸終濃度為1~13 mg/L。

（3）一種布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）GBS3在微生物轉(zhuǎn)化制備苯乳酸中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，該應(yīng)用以所述的布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）GBS3菌株為出發(fā)菌株發(fā)酵所得的菌體為全細(xì)胞生物催化劑，以苯丙酮酸和葡萄糖溶液為關(guān)鍵底物，在進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，得到含苯乳酸的轉(zhuǎn)化液。

進(jìn)一步，所述的微生物轉(zhuǎn)化條件為：葡萄糖14 g/L，苯丙酮酸15 g/L，溶劑為100 mM pH 8的磷酸鹽緩沖液，布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）GBS3菌株菌體濃度100 g/L，轉(zhuǎn)化溫度35℃，轉(zhuǎn)化時(shí)間4 h，攪拌速度70 rpm。

更進(jìn)一步，所述的含苯乳酸的轉(zhuǎn)化液中，苯乳酸的終濃度可達(dá)12 g/L。

通過(guò)采用上述技術(shù)，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

（1）本發(fā)明提供的菌株分離自傳統(tǒng)泡菜，生物安全性很好，發(fā)酵周期短，能夠同步發(fā)酵合成乳酸和苯乳酸。

（2）本發(fā)明提供的布氏乳桿菌，可以作為全細(xì)胞生物催化劑，能夠?qū)⒈奖岣咝мD(zhuǎn)化為苯乳酸，轉(zhuǎn)化迅速，轉(zhuǎn)化液中苯乳酸的濃度可達(dá)12 g/L，放大容易，具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。

具體實(shí)施方式

為了更好的說(shuō)明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實(shí)施例1

本發(fā)明從傳統(tǒng)泡菜中進(jìn)行菌株分離篩選。取一定量泡菜汁液，于無(wú)菌水中進(jìn)行稀釋?zhuān)诤刑妓徕}的固體培養(yǎng)基（組成：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，檸檬酸氫二胺2 g，無(wú)水乙酸鈉5 g，硫酸錳0.25 g，硫酸鎂0.58 g，磷酸氫二鉀2 g，酵母膏5 g，牛肉膏10 g，吐溫80 1 g，瓊脂20 g，碳酸鈣30 g，去離子水1 L，pH值自然）上進(jìn)行初篩，溫度30℃，靜置培養(yǎng)24~72 h。

選取過(guò)氧化氫陰性的單一菌落，接種于液體培養(yǎng)基（組成：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，檸檬酸氫二胺2 g，無(wú)水乙酸鈉5 g，硫酸錳0.25 g，硫酸鎂0.58 g，磷酸氫二鉀2 g，酵母膏5 g，牛肉膏10 g，吐溫80 1 g，去離子水1 L，pH值自然），30℃靜置培養(yǎng)24 h；復(fù)篩多次，得到一株乳桿菌株GBS3。

經(jīng)檢測(cè)，菌株GBS3的生理生化特征為：革蘭氏陽(yáng)性桿菌，0.8微米×1.5~2.0微米；成鏈生長(zhǎng)、無(wú)芽孢、不運(yùn)動(dòng)、兼性厭氧、過(guò)氧化氫酶陰性、化能異養(yǎng)。

結(jié)合菌株生理生化特征及16S rDNA序列，與GreenGenes16S rRNA 基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，將菌株GBS3鑒定為布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri），命名為布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）GBS3，已于2016年4月21日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為：CCTCC No. M 2016215。

實(shí)施例2

以本發(fā)明所述的布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）GBS3菌株為出發(fā)菌株，于1 L液體培養(yǎng)基（組成：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，檸檬酸氫二胺2 g，無(wú)水乙酸鈉5 g，硫酸錳0.25 g，硫酸鎂0.58 g，磷酸氫二鉀2 g，酵母膏5 g，牛肉膏10 g，吐溫80 1 g，去離子水1 L，pH值自然）中進(jìn)行靜置發(fā)酵，溫度控制在25~35℃，發(fā)酵24小時(shí)，得到含有乳酸和苯乳酸的發(fā)酵液；用高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè)分析，所得發(fā)酵液中的乳酸濃度為0.5 g/L，苯乳酸終濃度為1 mg/L。

實(shí)施例3

以本發(fā)明所述的布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）GBS3菌株為出發(fā)菌株，于1 L液體培養(yǎng)基（組成同實(shí)施例2）中進(jìn)行靜置發(fā)酵，溫度控制在25~35℃，發(fā)酵72小時(shí)，得到含乳酸和苯乳酸的發(fā)酵液；用高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè)分析，所得發(fā)酵液中的乳酸濃度1.8 g/L，苯乳酸終濃度13 mg/L。

實(shí)施例4

以本發(fā)明所述的布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）GBS3菌株為出發(fā)菌株，于1.5 L液體培養(yǎng)基（組成同實(shí)施例2）中進(jìn)行靜置發(fā)酵，溫度控制在25~35℃，發(fā)酵72小時(shí)，取其中離心所得的2 g菌體，作為全細(xì)胞催化劑，取20 mL含0.28 g葡萄糖和0.30 g苯丙酮酸的溶液（100 mM pH 8磷酸鹽緩沖液）為底物，轉(zhuǎn)化4小時(shí)，溫度35℃，攪拌速度70 rpm，得到轉(zhuǎn)化液；用高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè)分析，所得轉(zhuǎn)化液中苯乳酸濃度12 g/L。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江工業(yè)大學(xué)

<120> 一種布氏乳桿菌及其應(yīng)用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 949

<212> DNA

<213> 菌株GBS3

<400> 1

ggaacgtggc ggggtgctat actgcaagtc gaacgcgtct ccgttgatga ttttaggtgc 60

ttgcacttga aagatttaac attgagacga gtggcgaact ggtgagtaac acgtgggtaa 120

cctgcccttg aagtagggga taacacttgg aaacaggtgc taataccgta taacaaccaa 180

aaccacctgg ttttggttta aaagacggct tcggctgtca ctttaggatg gacccgcggc 240

gtattagctt gttggtaagg taacggccta ccaaggcgat gatacgtagc cgacctgaga 300

gggtaatcgg ccacattggg actgagacac ggcccaaact cctacgggag gcagcagtag 360

ggaatcttcc acaatggacg aaagtctgat ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaagggtt 420

tcggctcgta aaactctgtt gttggagaag aacaggtgtc agagtaactg ttgacatctt 480

gacggtatcc aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 540

gtggcaagcg ttgtccggat ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtt ttttaggtct 600

gatgtgaaag ccttcggctt aaccggagaa gtgcatcgga aaccgggaga cttgagtgca 660

gaagaggaca gtggaactcc atgtgtagcg gtgaaatgcg tagatatatg gaagaacacc 720

agtggcgaag gcggctgtct ggtctgtaac tgacgctgag gctcgaaagc atgggtagcg 780

aacaggatta gataccctgg tagtccatgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttggaggg 840

tttccgccct tcagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacgaccgc 900

aaggttgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggaac 949