本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種植物乳桿菌菌株(lactobacillusplantarumsubsp.plantarumjjz21)。

背景技術(shù)：

茶葉籽油是以茶葉樹(camelliasinensis)的種子為原料生產(chǎn)的食用油，因其富含多種生物活性成分而被譽(yù)為東方橄欖油。目前有正式報(bào)道的茶葉籽油生產(chǎn)方法主要有冷壓榨法、熱壓榨法、水酶法、一般溶劑浸出法及二氧化碳超臨界萃取法，這些茶葉籽油生產(chǎn)工藝均存在一些難以克服的問(wèn)題。為尋求解決問(wèn)題的途經(jīng)，姜金仲不久前報(bào)道了一種茶葉籽油生產(chǎn)新工藝——茶葉籽油生物發(fā)酵生產(chǎn)工藝，該工藝的核心是通過(guò)生物發(fā)酵將茶葉籽水漿分為上、中、下三層，然后取出上層加熱生產(chǎn)茶葉籽油。該工藝具有生產(chǎn)成本低、產(chǎn)量高、油品質(zhì)高、茶葉籽油風(fēng)味濃等優(yōu)點(diǎn)。

既然生物發(fā)酵分層屬于發(fā)酵范疇，其發(fā)生過(guò)程必然需要快速有效的發(fā)酵微生物。然而，茶葉籽水漿中含有大量的茶皂素，茶皂素對(duì)于大多數(shù)微生物具有抑制作用，因此，大多數(shù)微生物很難在茶葉籽水漿中繁殖生長(zhǎng)，因此，找到一種在茶葉籽水漿中快速繁殖生長(zhǎng)的微生物較為困難，目前還沒(méi)有涉及茶葉籽中微生物存在的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本申請(qǐng)?jiān)诮?jīng)過(guò)大量、反復(fù)的發(fā)酵、提純、鑒定試驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)了一種可用于茶葉籽水漿發(fā)酵，而且還能生產(chǎn)植物油、茶皂素等產(chǎn)品的植物乳桿菌。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明首先提供一種植物乳桿菌，即植物乳桿菌jjz21(l.plantarumsubsp.plantarumjjz21)，于2016年9月9日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，保藏號(hào)為cctccm2016471，保藏地址為：湖北省武漢市武昌區(qū)八一路珞珈山。茶葉籽油可以通過(guò)發(fā)酵的方法獲得，因此，在進(jìn)行茶葉籽油生產(chǎn)過(guò)程中必然存在發(fā)酵微生物。然而由于茶葉籽水漿中含有大量的不利于大多數(shù)微生物生長(zhǎng)的茶皂素成分，導(dǎo)致茶葉籽中的微生物難以生存，因此，在茶葉籽水漿中找到一種可以快速繁殖生長(zhǎng)的微生物較為困難。

本申請(qǐng)的發(fā)明人基于大量反復(fù)的發(fā)酵試驗(yàn)，以期得到從發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)微生物，最后在發(fā)明人不懈的努力下，獲得了微生物群落，經(jīng)發(fā)明人對(duì)微生物進(jìn)行提純、鑒定試驗(yàn)后，反復(fù)確認(rèn)，才得以獲得本發(fā)明的植物乳桿菌jjz21(l.plantarumsubsp.plantarumjjz21)。

特別是，所述植物乳桿菌是通過(guò)茶葉籽的水漿發(fā)酵獲得。

具體的，所述通過(guò)茶葉籽的水漿發(fā)酵獲得包括以下步驟：

將茶葉籽仁與水混合，進(jìn)行打漿處理，過(guò)濾后，得到茶葉籽仁漿液；

將茶葉籽仁漿液在恒溫條件下發(fā)酵，5h后得到發(fā)酵菌液；

蘸取發(fā)酵液進(jìn)行培養(yǎng)、觀察與鑒定，得到植物乳桿菌jjz21。

其中，所述將茶葉籽仁與水混合，進(jìn)行打漿處理，過(guò)濾后，得到茶葉籽仁漿液包括：

向茶葉籽仁中加入充足的水，于20℃條件下浸泡16h，將浸泡過(guò)的茶葉籽清洗后加水進(jìn)行2輪打漿，過(guò)濾得濾液，得到茶葉籽仁漿液。

其中，所述恒溫條件是35℃。

其中，所述蘸取發(fā)酵液進(jìn)行培養(yǎng)、觀察與鑒定，得到植物乳桿菌jjz21包括：

使用接菌環(huán)蘸取發(fā)酵液中的中層液體并于mrs平板上涂布培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃，長(zhǎng)出菌落后，挑選獨(dú)立的菌落，用接種針挑取樣本放在載玻片上，用美藍(lán)染色鏡檢，鑒定桿菌特征；重復(fù)上述步驟，直到獲得具有桿菌特征的菌落樣本，然后接種擴(kuò)大繁殖該菌落，再行鑒定繁殖，反復(fù)多次，使最終平板上為同一形態(tài)菌落為止，挑取單菌落接菌于mrs斜面培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)48h，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理學(xué)生化特征鑒定及16srdna、phes基因序列測(cè)定分析、最終鑒定為植物乳桿菌(l.plantarumsubsp.plantarumjjz21)。

尤其是，所述植物乳桿菌具有使油料植物種子的水漿發(fā)酵產(chǎn)生植物油。

其中，所述植物種子可以是茶葉籽、油茶籽、野山茶籽、無(wú)患子、小桐子、黃連木種子、棉籽等。

其中，所述茶葉籽是指用于茶葉生產(chǎn)的、所有茶樹(camelliasinensis)種及品種的種子，油茶籽是指所有人工栽培的、用于食用油生產(chǎn)的油茶樹(camelliaoleifera)種子，野生山茶籽是指野生的、可以用于食用油生產(chǎn)的、油茶屬(camellia)樹種的種子。

優(yōu)選的，所述植物種子是茶葉籽。

優(yōu)選的，所述植物種子為油茶籽。

優(yōu)選的，所述植物種子為野生山茶籽。

特別是，所述植物乳桿菌具有分離茶皂素的作用。

其中，所述植物種子為茶葉籽或油茶籽。

其中，所述茶皂素為茶葉籽皂素或油茶籽皂素。

特別是，本發(fā)明的植物乳桿菌還具有以下特征：

①其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為接種后的1-6h，之后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期。

②其最適合發(fā)酵溫度為30-35℃，能在40℃條件下發(fā)酵植物種子產(chǎn)生植物油，能在35℃條件下發(fā)酵分離茶皂素，適合生長(zhǎng)溫度為25-40℃。

③其最適發(fā)酵ph值為3.8-6.8，適合生長(zhǎng)的ph值范圍是4.5-5.2。

④該菌株最顯著的特點(diǎn)是能在高濃度茶皂素溶液中繁殖生長(zhǎng)，并進(jìn)行乳酸發(fā)酵。

⑤該菌的最適宜保存條件為：mrs斜面培養(yǎng)基，4℃條件下保存，每20天轉(zhuǎn)接一次。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明還提供一種將上述植物乳桿菌用于生產(chǎn)植物油的用途。

其中，將植物乳桿菌用于生產(chǎn)植物油用途是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)的：

將植物種子依次進(jìn)行浸泡、打漿和過(guò)濾處理后，得到濾液；

向?yàn)V液中分別放入茶葉籽酵母及植物乳桿菌菌種；

對(duì)加入混合菌的濾液在恒溫條件下發(fā)酵，得到植物油毛油；

對(duì)毛油簡(jiǎn)單精煉后，得到可食用的植物油。

其中，所述浸泡溫度為35℃，浸泡時(shí)間為12-20h。

其中，所述茶葉籽酵母的接種量為：茶葉籽酵母干粉/濾液：1-5g/l

其中，所述植物乳桿菌的接種量為：菌種在mrs液體培養(yǎng)基中活化3代，按麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)菌濃度為3.0×109cfu/ml后，按發(fā)酵液的2％進(jìn)行接種。

其中，所述恒溫條件為35-40℃。

其中，所述發(fā)酵時(shí)間為12-20h。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明再提供一種將上述的植物乳桿菌用于生產(chǎn)茶皂素的用途。

其中，將植物乳桿菌用于生產(chǎn)植物油用途是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)的：

將植物種子依次進(jìn)行浸泡、打漿和過(guò)濾處理后，得到濾液；

沉淀所述濾液，然后放入茶葉籽酵母，進(jìn)行第一發(fā)酵處理，得到上層漂浮物；

向所述上層漂浮物中加入植物乳桿菌進(jìn)行第二發(fā)酵處理，取出下層沉淀進(jìn)行純化處理，得到茶皂素。

其中，所述浸泡溫度為35℃，浸泡時(shí)間為12-20h。

其中，所述沉淀時(shí)間為2.5h。

其中，所述濾液與茶葉籽酵母的比例為：茶葉籽酵母干粉/濾液：1-5g/l。

其中，所述植物乳桿菌的接種量為：菌種在mrs液體培養(yǎng)基中活化3代，按麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)菌濃度為3.0×109cfu/ml后，按發(fā)酵液的2％進(jìn)行接種。

其中，所述第一發(fā)酵處理溫度為35℃，發(fā)酵時(shí)間為5h。

其中，所述第二發(fā)酵處理溫度為25℃，發(fā)酵時(shí)間為72h。

使用本發(fā)明的植物乳桿菌生產(chǎn)茶皂素，其產(chǎn)率達(dá)1.6％以上，純度達(dá)90％以上。

本發(fā)明所述的打漿處理均為兩輪打漿處理，其打漿處理方法采用現(xiàn)有的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。有益效果：

1、本發(fā)明提供植物乳桿菌可以使植物種子的漿液發(fā)酵產(chǎn)生植物油，其出油率達(dá)到16-20％(茶葉籽油)，相較于傳統(tǒng)的植物油(茶葉籽油)生產(chǎn)方法，使用本發(fā)明的植物乳桿菌可以提高出油效率、降低出油成本、適用于大規(guī)模的生產(chǎn)。

2、本發(fā)明提供的植物乳桿菌可以分離茶葉籽或油茶籽中的茶皂素，分離工藝具有低溫特點(diǎn)，分離的茶皂素最大限度地保留了天然活性，純度達(dá)90％以上，相對(duì)于現(xiàn)有的提取方法，利用本發(fā)明的植物乳桿菌，得到的茶皂素使用價(jià)值更高，拓展了茶皂素的高檔用途。

附圖說(shuō)明

圖1為植物乳桿菌jjz21菌落形態(tài)；

圖2為植物乳桿菌jjz21個(gè)體特征及出芽情況；

圖3為以16srdna序列為基礎(chǔ)的植物乳桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹；

圖4為以phes基因序列為基礎(chǔ)的植物乳桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹。

菌種保存

本發(fā)明菌種命名為植物乳桿菌jjz21，其拉丁文名稱為：lactobacillusplantarumsubsp.plantarumjjz21，于2016年9月9日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，保藏號(hào)為cctccm2016471，保藏地址為：湖北省武漢市武昌區(qū)八一路珞珈山。

具體實(shí)施方式

為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

在下面的描述中闡述了很多具體的細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明，但是，本發(fā)明還可以采用其他不同于在此描述的其他方式來(lái)實(shí)施，因此，本發(fā)明并不限于下面公開(kāi)的具體實(shí)施例的限制。

實(shí)施例1：菌株的篩選和保藏

本發(fā)明的植物乳桿菌jjz21(或l.plantarumsubsp.plantarumjjz21)是從貴州省貴陽(yáng)市烏當(dāng)區(qū)高新路115號(hào)貴州師范學(xué)院“貴州特色生物資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”自制茶葉籽水漿發(fā)酵液中分離篩選獲得，具體分離鑒定步驟如下：

1、菌株的獲得

稱取茶葉籽仁100g，加充足的水于25℃條件下浸泡16h，將浸泡好的茶葉籽清洗后加水進(jìn)行2輪打漿、過(guò)濾得濾液(即茶葉籽水漿)，把濾液置于35℃恒溫發(fā)酵，5h以后，使用接菌環(huán)蘸取發(fā)酵液并于mrs平板上涂布培養(yǎng)(25℃)，長(zhǎng)出菌落后，挑選獨(dú)立的菌落，用接種針挑取樣本放在載玻片上，用美藍(lán)染色，觀察是否是桿菌，如果是桿菌；接種擴(kuò)大繁殖該菌落，再行鑒定繁殖，反復(fù)4次，使最終平板上為同一形態(tài)菌落為止。挑取單菌落接菌于mrs斜面培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)48h，以備保藏和鑒定使用。

2、菌株的形態(tài)觀察

如圖1和圖2所示的本發(fā)明的植物乳桿菌jjz21：菌落呈圓形，白色，凸起，表面光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊。植物乳桿菌jjz21菌株25℃培養(yǎng)48h的個(gè)體形態(tài)如附圖2：菌體呈桿狀，大小0.5-0.7μm×0.8-1.7μm，單個(gè)或成對(duì)排列，革蘭氏陽(yáng)性。

3、菌株的生理生化特征測(cè)試

測(cè)試參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行，對(duì)植物乳桿菌jjz21菌株的生理生化特征進(jìn)行測(cè)試，測(cè)試結(jié)果如表1所示，根據(jù)表1的檢測(cè)結(jié)果可知，jjz21菌株對(duì)大多數(shù)的芳胺酶及糖苷酶均呈陰性，對(duì)大多數(shù)的d型糖類碳源均呈陽(yáng)性。上述試驗(yàn)由“中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院微生物檢測(cè)中心”完成。

表1：jjz21菌株的生理生化特征

注：生理生化特征表中：(“+”表示陽(yáng)性；“-”表示陰性)。

4、菌株的16srdna及phes基因序列測(cè)定及分析

jjz21菌株的16srdna及phes基因的序列測(cè)定結(jié)果如seqidno.1和seqidno.2所示。jjz21菌株的16srdna序列全長(zhǎng)為1417bp，phes基因序列全長(zhǎng)為410bp。利用blest進(jìn)行序列同源檢索，相似度達(dá)到98％以上的植物乳桿菌(lactobacillus)近緣種有10種如表2所示，其中與l.plantarumsubsp.plantarum的相似度達(dá)到了100％。以16srdna及phes基因序列的同源性為基礎(chǔ)，用mega5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果得到了如圖3及圖4所示的系統(tǒng)發(fā)育樹。圖3所示的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析結(jié)果表明，該系統(tǒng)樹中l(wèi).plantarumsubsp.plan-tarumatcc14917t(acgz01000098)是一個(gè)單獨(dú)的外群種，jjz21菌株與該種單獨(dú)構(gòu)成一個(gè)分支；二者序列的相似性最大，遺傳距離最??；但可靠性只有66％，不足以給出結(jié)論；但圖4的分析結(jié)果表明：jjz21菌株仍然與l.plantarumsubsp.plantarum相似性最大，遺傳距離最小，且可靠性達(dá)到了100％；綜合兩種分析結(jié)果，可以得出結(jié)論：jjz21菌株與l.plantarumsubsp.plantarum的親緣關(guān)系最近。

表2：jjz21菌株的16srdna及phes基因序列與近緣種同源性比較結(jié)果

綜合上述形態(tài)觀察、碳源反應(yīng)、酶學(xué)反應(yīng)、16srdna及phes基因序列比對(duì)、以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建與分析，中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院微生物檢測(cè)中心將jjz21菌株鑒定為：l.plantarumsubsp.plantarum，結(jié)合我們的研究編號(hào)：jjz21菌株，因此將該菌株定義為：l.plantarumsubsp.plantarumjjz21。將植物乳桿菌jjz21(l.plantarumsubsp.plantarumjjz21)于2016年9月9日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，保藏號(hào)為cctccm2016471，保藏地址為：湖北省武漢市武昌區(qū)八一路珞珈山。

實(shí)施例2：植物乳桿菌jjz21應(yīng)用于植物油的生產(chǎn)

稱取油茶籽仁1000g，加充足的水于35℃條件下浸泡16h，將浸泡好的油茶籽仁清洗后加水(茶葉籽：水＝1:3)進(jìn)行2輪打漿、過(guò)濾得濾液，按照一定比例(茶葉籽酵母干粉/濾液：1-5g/l)向?yàn)V液中加入茶葉籽酵母(meyerozymacaribbicajjz11，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，保藏號(hào)為cctccm2016470；中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心及本實(shí)驗(yàn)室可以提供菌種。)及植物乳桿菌jjz21(菌種在mrs液體培養(yǎng)基中活化3代，按麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)菌濃度為3.0×109cfu/ml后，按發(fā)酵液的2％的量進(jìn)行接種)，攪拌均勻，放入容器置于40℃恒溫發(fā)酵16h后，濾液會(huì)出現(xiàn)堅(jiān)實(shí)的白色頂層，撈出白色頂層加熱，即可生產(chǎn)出油茶籽毛油，經(jīng)簡(jiǎn)單精煉后，可得到油茶籽成品油，其中精煉方法可參照現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行，經(jīng)計(jì)算，其產(chǎn)油率達(dá)30％以上。

將同樣的方法、同樣的操作條件應(yīng)用于茶葉籽，同樣可以獲得茶葉籽油，其產(chǎn)油率達(dá)18-20％。

參照油茶籽油國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)gb11765-2003的食用油質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)本發(fā)明獲得的植物油進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表3所示。

表3植物油質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)表3所示的檢測(cè)數(shù)據(jù)可知，本申請(qǐng)的油茶籽油紅色僅為0.2，黃色僅為22，茶葉籽油紅色僅為0.5，黃色僅為20，可見(jiàn)其色澤均小于國(guó)家一級(jí)油的標(biāo)準(zhǔn)(即紅2.0，黃35)；而且利用本發(fā)明的乳桿菌獲得的油茶籽油和茶葉籽油的均無(wú)異味、只有油茶籽或茶葉籽油特有的香味、均為澄清透明狀態(tài)，且水分及揮發(fā)物均小于國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的0.05％、不溶性雜質(zhì)均小于國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的0.05％，酸值均遠(yuǎn)小于國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的1.0mgkoh/g，過(guò)氧化值均遠(yuǎn)小于國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的6.0mol/kg，對(duì)油茶籽油或茶葉籽油進(jìn)行280℃加熱試驗(yàn)，均無(wú)析出物，黃色不變，紅色增加小于0.4，含皂量小于0.03％，煙點(diǎn)大于280℃，無(wú)溶劑殘留?？梢?jiàn)，利用本申請(qǐng)的乳桿菌均可以獲得一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的油茶籽油或茶葉籽油。

實(shí)施例4：植物乳桿菌jjz21用于生產(chǎn)茶皂素。

以茶葉籽皂素為例。稱取茶葉籽仁1000g，加充足的水于30℃條件下浸泡16h，將浸泡好的油茶籽清洗后加水(茶葉籽：水＝1:3)進(jìn)行2輪打漿、過(guò)濾得濾液，濾液沉淀2.5h，去除沉淀，按照一定比例(茶葉籽酵母干粉/濾液：1-5g/l)向?yàn)V液中加入茶葉籽酵母(meyerozymacaribbicajjz11，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，保藏號(hào)為cctccm2016470；中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心及本實(shí)驗(yàn)室可以提供菌種)，攪拌均勻，放入容器置于35℃恒溫發(fā)酵5h后，取出上層漂浮物。然后按照一定比例向發(fā)酵液中加入植物乳桿菌jjz21(菌種在mrs液體培養(yǎng)基中活化3代，按麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)菌濃度為3.0×109cfu/ml后，按發(fā)酵液的2％的量進(jìn)行接種)，攪拌均勻，放入容器置于35℃恒溫發(fā)酵72h后，倒掉上清液，取出下層沉淀，將沉淀溶解在80％的乙醇中，過(guò)濾，濃縮濾液回收乙醇，將濃縮液放入烘箱，60℃烘干，可得到純度為90％以上的茶葉籽皂素，其產(chǎn)率達(dá)1.6％。

將同樣的方法、同樣的操作條件應(yīng)用于油茶籽，同樣可以獲得油茶籽皂素，其產(chǎn)率達(dá)3％。

利用本發(fā)明的植物乳桿菌制備茶皂素的方法獲得的茶皂素是低溫天然的茶皂素，與目前市售茶皂素的最大不同點(diǎn)是其水溶液為淡黃色，而不是市售產(chǎn)品的黑褐色；且發(fā)泡能力及去污能力遠(yuǎn)高于目前市售產(chǎn)品(具體比較如下表)；因此，拓寬了茶葉籽皂素的高檔用途。

表：本專利茶皂素與市售茶皂素對(duì)比

以上所述實(shí)施方式及應(yīng)用領(lǐng)域僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，而并非本發(fā)明可行實(shí)施的窮舉。對(duì)于本領(lǐng)域一般技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明原理和精神的前提下對(duì)其所做出的任何顯而易見(jiàn)的改動(dòng)及應(yīng)用領(lǐng)域的拓廣，都應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為包含在本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)。

<110>貴州師范學(xué)院

<120>一種植物乳桿菌菌株及其應(yīng)用

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<213>植物乳桿菌jjz21（lactobacillusplantarumsubsp.plantarumjjz21）

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<210>2

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<212>dna

<213>植物乳桿菌jjz21（lactobacillusplantarumsubsp.plantarumjjz21）

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