本發(fā)明屬于病原培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于高密度培養(yǎng)副豬嗜血桿菌的方法。
背景技術(shù)：
豬副豬嗜血桿菌病，又稱豬革拉斯氏病( disease)，是由副豬嗜血桿菌引起的以多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征的傳染病，是近年來嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要細菌性傳染病之一。目前，已經(jīng)證實副豬嗜血桿菌在我國絕大多數(shù)豬場存在和流行，主要影響5～8周齡的仔豬，發(fā)病率一般為l0％～15％，嚴(yán)重時死亡率可達50％以上，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。但目前針對副豬嗜血桿菌的培養(yǎng)技術(shù)和方法存在很多問題，比如培養(yǎng)時間長、培養(yǎng)密度低等，均造成培養(yǎng)成本高。這都對該疫苗的研究造成嚴(yán)重影響，因此研制一種副豬嗜血桿菌的高密度培養(yǎng)技術(shù)，具有十分重要的意義。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的發(fā)明目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種高密度發(fā)酵培養(yǎng)副豬嗜血桿菌的方法，從而彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足。
本發(fā)明的高密度發(fā)酵培養(yǎng)副豬嗜血桿菌的方法，是在發(fā)酵罐中對接種了種子液的培養(yǎng)基進行發(fā)酵，其中發(fā)酵溫度為36-37℃，攪拌速度為100r/min、pH值為7.2～7.4、溶解氧(DO)為60％～80％、培養(yǎng)時間為12～14h。
本發(fā)明的液體培養(yǎng)基，其包含有如下的組分：胰蛋白胨、大豆蛋白胨、氯化鈉、磷酸氫二鉀、葡萄糖、酵母粉、牛血清和輔酶Ⅰ，其pH值為7.2～7.4。
其組分濃度為胰蛋白胨18～25.0g/L、大豆蛋白胨3.0～5.0g/L、氯化鈉5.0g/L、磷酸氫二鉀3.0～4.0g/L、葡萄糖2.0～3.0g/L、酵母粉1.0～5.0g/L、滅活牛血清30ml/L～100ml/L、輔酶Ⅰ1.0～30g/L，pH值調(diào)至7.2～7.4。
作為優(yōu)選，其組分濃度為胰蛋白胨22.0g/L、大豆蛋白胨4.0g/L、氯化鈉5.0g/L、磷酸氫二鉀3.0g/L、葡萄糖2.5g/L、酵母粉3.0g/L、滅活牛血清50ml/L、輔酶Ⅰ0.1g/L，pH值調(diào)至7.2～7.4。
上述培養(yǎng)基的制備方法如下：
分別稱取胰蛋白胨，大豆蛋白，氯化鈉，磷酸氫二鉀，葡萄糖，酵母粉，加入去離子水，定容后充分搖勻溶解，調(diào)pH值至7.2～7.4，121℃高壓蒸汽滅菌15min；冷卻后，按無菌要求加入滅活牛血清和過濾除菌的1％NAD輔酶Ⅰ。
本發(fā)明的培養(yǎng)方法通過使用高密度發(fā)酵罐培養(yǎng)技術(shù)，控制培養(yǎng)過程中的攪拌速度、溶氧量pH值和培養(yǎng)時間，利于副豬嗜血桿菌的生長，使活菌數(shù)均不低于109CFU/ml，并將該技術(shù)培養(yǎng)的副豬嗜血桿菌菌液制備滅活疫苗，其安全性和免疫效力均良好。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細的描述。
實施例1按照不同配方制備本發(fā)明培養(yǎng)基
1培養(yǎng)基制備按不同的培養(yǎng)基配方配制6種不同成分的培養(yǎng)基。具體配方見表1。
表1 液體培養(yǎng)基制備方法
實施例2不同配方液體培養(yǎng)基的篩選：
將副豬嗜血桿菌YBH05株(副豬嗜血桿菌已于2011年11月23日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為：CGMCC No.5480)的菌液，分別按5％接種上述6種液體培養(yǎng)基，置37℃，150r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時間均為24小時，于培養(yǎng)不同時間分別取樣進行活菌計數(shù)。不同配方液體培養(yǎng)基的篩選試驗結(jié)果表明，按照配方三、配方四制備的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)效果較好，14～16小時活菌數(shù)均不低于109CCU/ml，配方五和配方六因為培養(yǎng)基中的血清等輔液成分加入量較高，使培養(yǎng)基營養(yǎng)過于豐富，導(dǎo)致YBH05株生長過快，衰亡也較快，且血清等輔液成分加入量高，也增加了生產(chǎn)成本；配方一和配方二培養(yǎng)菌液密度較低。綜合考慮，最終選擇配方三制備的液體培養(yǎng)基來驗證培養(yǎng)效果。
結(jié)果見表2。
表2：6種液體培養(yǎng)基培養(yǎng)不同時間活菌計數(shù)結(jié)果
實施例3：本發(fā)明培養(yǎng)基與胰蛋白胨大豆肉湯液體培養(yǎng)基培養(yǎng)效果比較
將YBH05株凍干種子復(fù)蘇純化后，按3-5％分別接種胰蛋白胨大豆肉湯液體培養(yǎng)基和本發(fā)明的配方三的液體培養(yǎng)基，分別置37℃，150r/min振蕩培養(yǎng)24小時，于培養(yǎng)不同時間分別取樣進行活菌計數(shù)。試驗結(jié)果表明，應(yīng)用本發(fā)明培養(yǎng)基，不同培養(yǎng)時間的活菌量均高于胰蛋白胨大豆肉湯液體培養(yǎng)基。不同培養(yǎng)時間的活菌量結(jié)果見表3。
表3：培養(yǎng)基的選擇試驗結(jié)果
實施例4：發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化
試驗結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)溫度為36-37℃、攪拌速度為100r/min、pH值為7.2～7.4、溶氧(DO)為60％～80％、培養(yǎng)12～14h時，YBH05株的活菌數(shù)最高，結(jié)果詳見表4～表6。
表4 YBH05株在不同攪拌轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)活菌數(shù)測定結(jié)果
表5 YBH05株在不同pH值下攪拌培養(yǎng)活菌數(shù)測定結(jié)果
表6 YBH05株在不同溶氧條件下培養(yǎng)活菌數(shù)測定結(jié)果
實施例5：培養(yǎng)條件驗證
本發(fā)明培養(yǎng)方法的驗證應(yīng)用本發(fā)明培養(yǎng)方法發(fā)酵培養(yǎng)3批YBH05株菌液，分別進行活菌計數(shù)，以驗證培養(yǎng)工藝的可行性。驗證結(jié)果表明，YBH05株的菌液活菌量為2.5～3.0×109CFU/ml，本發(fā)明培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果確實可行。結(jié)果見表7。
表7 本發(fā)明驗證結(jié)果
實施例6：應(yīng)用該發(fā)明的培養(yǎng)方法培養(yǎng)的菌液制備疫苗
應(yīng)用發(fā)酵培養(yǎng)的3批YBH05株菌液，離心后，用生理鹽水稀釋至4.0×109CFU/ml，滅活后，和201佐劑按質(zhì)量比1:1乳化后，制備單價滅活疫苗。進行安全性檢驗，頸部肌肉注射21日齡仔豬4.0ml.頭，觀察14日后，仔豬未出現(xiàn)全身或局部不良反應(yīng)。
將單價滅活疫苗頸部肌肉注射21日齡仔豬，2.0ml/頭，一免后21日加強免疫，免疫后14日，采血檢測5型抗體，并用YBH05株進行腹腔注射攻毒3.0ml/頭(6.0×109CFU)，觀察14日，觀察仔豬的發(fā)病或死亡情況。結(jié)果表明，免疫組抗體5/5均大于等于1:32，對照組均小于1:4；攻毒后免疫組5/5保護，對照組4/5發(fā)病。結(jié)果見表8。
表8：3批疫苗的安全性和效力結(jié)果
該發(fā)明培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)時間短、培養(yǎng)密度大，很適合副豬嗜血桿菌的大規(guī)模培養(yǎng)；用該技術(shù)培養(yǎng)的菌液制備的疫苗，安全性和效力均良好。