本發(fā)明涉及微生物領域，具體涉及一種微生物組合物及其對煙草的促生作用。
技術背景：
煙草作為我國重要的經(jīng)濟作物之一，截止2010年，煙草種植面積為135萬公頃，占耕地總播種面積的0.86％。我國煙草種種區(qū)域廣泛，而就主要煙草栽培分布區(qū)而言，煙葉生產(chǎn)地集中在云南、貴州、四川、重慶、湖南等地的經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)，烤煙給農(nóng)民帶來的經(jīng)濟收益遠大于其它作物，因此，煙葉成為煙草種植區(qū)重要的經(jīng)濟作物，煙葉生產(chǎn)成為這些種植地區(qū)的支柱種植產(chǎn)業(yè)和農(nóng)民的支柱收益方式，對這些地區(qū)的經(jīng)濟增長具有舉足輕重的作用。據(jù)統(tǒng)計，僅2015年上半年，煙草行業(yè)實現(xiàn)工商稅利6242.4億元，上繳財政總額4850.6億元，預計全年上繳財政將超1萬億元。可見煙草對國家財政收入和國民經(jīng)濟的促進作用的貢獻大，其獨特的重要地位不容忽視。
由于煙草重要的經(jīng)濟價值，為了增加煙草產(chǎn)量，大量以促進煙草生長為目的的肥料被應用，其中絕大多數(shù)是化學肥料。然而多數(shù)化學肥料的施用對環(huán)境不友好，容易造成二次污染，因此生物肥料由于其良好的環(huán)境友好性越來越多的受到青睞，其中微生物類肥料更因為具有培養(yǎng)時間短、培養(yǎng)條件容易控制等優(yōu)勢成為關注的重點，其在促進煙草生長方面應用前景也越來越好。
吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid,IAA)是一種植物激素，分泌IAA的植物根際促生菌能合成植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)或是利用有機酸等代謝產(chǎn)物溶解難溶的礦 物供植物利用，從而促進植物的生長和發(fā)育。由于產(chǎn)IAA是促生菌具有促生能力的指標性特征之一，產(chǎn)IAA能力的大小能反應促生菌促生能力的大小，因此促生菌株促生能力可以通過檢測IAA含量表現(xiàn)。本發(fā)明所涉及促生菌的分離篩選和復合微生物組合的構建都通過檢測IAA含量進行。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明目的包括：
提供一種微生物組合物，該微生物組合物的用途；
提供一種能促進煙草生長的微生物組合物的制作方法；
提供一種能促進煙草生長的微生物組合物的施用方法等。
本發(fā)明公開了一株從土壤分離得到的芽孢桿菌(Bacilus tequilensis)，該菌株已于2016年8月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC No.12839，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。該菌株在本發(fā)明實驗中簡稱為YBT-003-B-5。
本發(fā)明公開了一株從土壤分離得到的陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)；該菌株已于2016年8月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC No.12840，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。該菌株在本發(fā)明實驗中簡稱為L2-001-B-16。
本發(fā)明公開了一株從土壤分離得到的變棲克雷伯氏菌(Klebsiela varicola)；該菌株已于2016年8月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC No.12845，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。該菌株在本發(fā)明實驗中簡稱為MT-002-B-12。
本發(fā)明公開了一株從土壤分離得到的腸桿菌屬(Enterobacter xiangfangensis)；該菌株已于2016年8月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC No.12846，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。該菌株在本發(fā)明實驗中簡稱為FY-001-B-9。
本發(fā)明微生物組合物由上述4株細菌組成：芽孢桿菌(Bacillus tequilensis)CGMCC 12839、陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)CGMCC 12840、變棲克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)CGMCC 12845和腸桿菌屬(Enterobacter xiangfangensis)CGMCC 12846。該4株菌從土壤中分離篩選所得，具有一定促進煙草生長的能力。
如，本發(fā)明提供了一種微生物組合物的具體實施方式，由CGMCC 12839、CGMCC 12840、CGMCC 12845和CGMCC 12846四種細菌組成；
所述CGMCC 12839、CGMCC 12840、CGMCC 12845和CGMCC 12846的活菌數(shù)的比例為(1～5):(1～5):(1～5):(1～5)；
優(yōu)選的，活菌數(shù)的比例為1:1:1:1。
本發(fā)明還提供了上述微生物組合物改善農(nóng)藝性狀和調(diào)節(jié)土壤微生物比例的用途；以及上述微生物組合物作為生物肥料的用途，如促進煙草生長、改善煙草植株農(nóng)藝性狀、提高煙草產(chǎn)量和提高上等煙出產(chǎn)量的用途；所述煙草植株農(nóng)藝性狀，包括煙草的株高、莖圍、最大葉長、最大葉寬和有效葉數(shù)等。
本發(fā)明的另一種實施方式是，提供一種復合液體發(fā)酵液；由上述微生物組合物和任選的培養(yǎng)液制備而成；
優(yōu)選的，所述復合菌劑為液體制劑，其中輔料可以為水等。
進一步優(yōu)選的，所述液體發(fā)酵物的活菌數(shù)為1.0×108～1.0×109個/ml。
對于上述微生物、微生物組合物的培養(yǎng)方法，可以將四種細菌在培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)后，按比例復合而成；也可以將四種微生物按比例復合后，同時在培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到；所述培養(yǎng)液為LB培養(yǎng)液，由重量比為2:1:2的胰蛋白胨、酵母提取物和氯化鈉組成，該培養(yǎng)液的PH值為7～8；優(yōu)選的，該培養(yǎng)液由胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g組成，pH值為7.4；
上述微生物、微生物組合物的培養(yǎng)方法，也可以參照本領域常規(guī)方法進行培養(yǎng)。
有益效果
本發(fā)明微生物組合物具有以下有益效果：
1、本發(fā)明通過協(xié)同構建將此4株菌構建成具有促進煙草生長效果優(yōu)于單株菌的組合物。本發(fā)明組合物對煙草農(nóng)藝性狀株高、莖圍、最大葉長、最大葉寬和有效葉數(shù)都有顯著或極顯著的改善作用；
2、能改善植株根際土壤中的微生物區(qū)系，極顯著提高細菌、真菌和放線菌數(shù)量，調(diào)整土壤中的各類微生物比例；
3、能較對照提高煙草產(chǎn)量15.5％，提高上等煙比例6.4％。
微生物材料保藏
2016年8月15日，芽孢桿菌(Bacillus tequilensis)CGMCC 12839保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。
2016年8月15日，陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)CGMCC 12840保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。
2016年8月15日，變棲克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)CGMCC 12845保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。
2016年8月15日，腸桿菌屬(Enterobacter xiangfangensis)CGMCC 12846保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。
具體實施方式
實施例一、最優(yōu)微生物組合物的篩選獲得
1.1IAA的測定方法
從土壤中分離篩選獲得5株細菌有較強產(chǎn)IAA的能力，這5株菌是：1.YBT-003-B-5；2.YB-001-B-8；3.FY-001-B-9；4.MT-002-B-12；5.L2-001-B-16。對5株菌進行復合構建。
⑴標準曲線的制作
配置濃度為0、10、20、30、40、50、60ug/mL的IAA標準溶液，并與Salkowski比色液(50mL 35％HClO4+1mL 0.5M FeCl3)1:1(v/v)混合，室溫避光放置30min，然后分別測定各濃度在530nm下的吸光度(以蒸餾水與Salkowski比色液的1:1混合溶液為空白對照)。最后以IAA濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制IAA標準曲線，并計算回歸方程。
⑵菌液中IAA濃度的測定
活化初篩所得菌株，接種于LB液體培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24h后取出，4000r/min離心15min，然后各取上清液4mL與等體積的Salkowski比色液混合。室溫下避光放置30min，測定其在530nm下的吸光度(以未接菌的LB液體培養(yǎng)基與等體積Salkowski比色液的混合溶液為對照)。通過IAA濃度與吸光度的標準關系曲線計算相應的IAA濃度。
1.2構建促生組合物
將5株初步篩選的促生菌株進行單個菌株、兩兩組合、3個組合、4個組合以及5個菌株全部接入，共有31個組合，菌株組合的命名方式見表1-1所示；各組合的名稱如表1-2所示。組合內(nèi)菌株均從試管中挑取一環(huán)接入同一個裝有無菌LB培養(yǎng)液的三角瓶中，30℃、180r/min發(fā)酵培養(yǎng)24h，利用IAA測定方法檢測并計算各個組合產(chǎn)IAA的量，以不接菌的LB培養(yǎng)液為對照，每個組合重復3次。
表1-1菌株編號、菌株組合的名稱
表1-2各組合產(chǎn)IAA能力
IAA含量單位:μg/mL
注：A,B,C指在1％水平上具有差異，下同。
構建的31個菌系產(chǎn)IAA能力測定結果如表1-2所示，從表中可以看出，單個菌株中的菌株L2-001-B-16產(chǎn)IAA的量明顯高于其它幾個單菌株；兩兩組合菌株中菌株MT-001-B-12和菌株L2-001-B-16形成的組合單IAA的量高于其它的兩兩組合；三個組合中，菌株YBT-003-B-5、菌株FY-001-B-9和菌株MT-002-B-12的組合優(yōu)于其它組合；″1345″在所有組合中產(chǎn)IAA的能力最強，能產(chǎn)生IAA的濃度為51.27μg/mL，極顯著優(yōu)于其它組合(P<0.01)，與產(chǎn)量其次的單個菌株L2-001-B-16每毫升產(chǎn)生的IAA的量高出8.28μg。由此我們確定組合″1345″中的4株菌組成的促生菌系是最優(yōu)組合。
實施例二.以下為田間試驗例
1.微生物組合物發(fā)酵液制作方法
按照實施例一中，組合″1345″中的4株菌，配置復合菌系。將4株菌各接種一環(huán)于裝有250ml LB培養(yǎng)液的500ml三角瓶中，于搖床中30℃、180r/min發(fā)酵培養(yǎng)48h，既成種子液。利用發(fā)酵罐對種子液進行放大培養(yǎng)，發(fā)酵 條件是發(fā)酵時間為36h，通氣量0.5V/V.M，轉(zhuǎn)速250r/h，溫度30℃，既成組合物系發(fā)酵液。
2.試驗方法：
2.1處理設置：
對照:不施菌液
處理:復合微生物組合物發(fā)酵液
2.2施用方法
施用時采取灌根的方法，將發(fā)酵好的菌液濃度調(diào)至108cfu/mL，每株5mL原液，為了灌根均勻，將其用水稀釋至100mL。每個重復3行，每行30株，每個處理3個重復。分別在移栽期施用1次，團棵期施用1次，第二次施用后15d，共施用3次。
2.3農(nóng)藝指標調(diào)查
⑴試驗方法
對所檢測的農(nóng)藝指標每個處理的各個重復隨機取樣5株來測定，調(diào)查結果通過SPSS13.0軟件進行單因素方差分析。調(diào)查內(nèi)容包括株高、鮮重、最大葉長、最大葉寬、莖圍、節(jié)距和有效葉數(shù)，各指標檢測方法如下：
株高指的是自地表莖基處至莖部頂端高度，在打頂后莖頂端生長定型時測量；
鮮重指植株采集后去除上面泥土等雜質(zhì)，立刻測出包括它完整的根、莖、葉的重量；
最大葉長指的是長度自蓮葉連接處至葉尖的直線長度；
最大葉寬指的以葉面最寬處的長度。
莖圍指第一青果期在煙株高約1/3處測得的莖的圓周長度；
節(jié)距指的是第一青果期在株高1/3處測量上下5個葉位，每個葉位測量2個節(jié)距(共測量10個節(jié)距)的平均長度；
有效葉數(shù)指所采收的實際有效葉片數(shù)。
⑵試驗結果
表2各處理農(nóng)藝性狀調(diào)查結果
調(diào)查每個處理3個重復各5株煙株的農(nóng)藝性狀，并進行方差分析。由表2可知，在6個被調(diào)查的農(nóng)藝性狀項目中，與對照相比，處理的株高、莖圍、最大葉長、最大葉寬和有效葉數(shù)有極顯著或顯著的提高效果。處充分驗證了處理的組合物發(fā)酵液對煙草的促生效果。
2.4土壤微生物區(qū)系分析
每次施用發(fā)酵液前采集植株根際土，檢測其中細菌、真菌和放線菌的種類。方法如下：
⑴培養(yǎng)基：
牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，NaCl 5.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1000mL，pH 6.8～7.2。
高氏一號：KNO3 1.0g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，可溶性淀粉20.0g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，pH 7.2～7.4。
PDA培養(yǎng)基：土豆200.0g，葡萄糖20.0g，瓊脂18.0g，蒸餾水1000mL，pH自然。
⑵倒平板
將121℃滅菌30min后的培養(yǎng)基放入無菌操作臺，待其冷卻至50℃～60℃時倒入培養(yǎng)皿中。每皿20mL，冷卻凝固備用。
⑶系列稀釋
稱取土壤樣品10.00g，加入帶玻璃珠(15個左右)的100mL無菌水中(250mL錐形瓶)，在旋轉(zhuǎn)式搖床上180r/min充分震蕩30min即成母液菌懸液(10-1梯度)。從10-1稀釋液中移取1mL液體加入9mL水中作為10-2稀釋液，再從10-2稀釋液中移取1mL液體加入9mL水中，作為10-3稀釋液…每次吸取懸液，注意把懸液震蕩均勻，反復吹吸3次再取樣。
⑷涂布分離
吸取100μL稀釋液接到培養(yǎng)基上，用無菌玻璃棒同時涂布，將稀釋液均勻地涂開。同一個土壤樣品做4個連續(xù)梯度，每個梯度3個重復，從低濃度到高 濃度進行涂布。細菌培養(yǎng)選取10-4、10-5、10-6、10-7，放線菌和真菌選取濃度10-2、10-3、10-4、10-5。
⑸培養(yǎng)觀察
將涂布后的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板、高氏一號培養(yǎng)基平板和PDA培養(yǎng)基平板放于30℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，細菌培養(yǎng)28～36h，放線菌培養(yǎng)4～5d，真菌培養(yǎng)3～5d后取出觀察生長情況。
⑹菌落計數(shù)
細菌和放線菌以出現(xiàn)20～300個菌落數(shù)的稀釋度的平板為計數(shù)標準，真菌以出現(xiàn)10～150個菌落數(shù)的稀釋度的平板為計數(shù)標準，分別統(tǒng)計活菌數(shù)目。當只有一個稀釋度的平均菌落數(shù)在20～300個之間時，則以該平均菌落數(shù)計算。若有兩個稀釋度，其平均菌落數(shù)均在20～300個之間時，應按兩者菌落總數(shù)之比值決定。若其比值小于等于2應計算兩者的平均數(shù)；若大于2則以稀釋度小的菌落平均數(shù)計算。
式中：
nm—質(zhì)量有效活菌數(shù)，單位：個/g；
—菌落平均數(shù)，單位：個；
k—稀釋倍數(shù)；
v1—基礎液體積，單位：mL；
v2—菌懸液加入量，單位：mL；
m0—樣品量，單位：g。
⑺試驗結果
如表3，根據(jù)3次對土壤微生物區(qū)系的分析結果可知，在整個試驗階段，對照的細菌、真菌和放線菌數(shù)量均在同一個級別，第1次土樣中處理和對照各微生物數(shù)量之間差異不顯著，說明整個試驗地中的微生物分布較為均勻。第2次和第3次的樣品中處理則因為施用菌液，細菌、真菌和放線菌數(shù)量的變化都較大，較對照均達到極顯著差異(P<0.01)。從結果可知，處理中的微生物在根際的定殖能力好，繁殖能力強，也促進了根際相關微生物數(shù)量的增加。
表3不同處理對煙草根際土壤中微生物區(qū)系的影響
微生物數(shù)量單位：個/g
2.5產(chǎn)量、上等煙統(tǒng)計
煙葉屬于持續(xù)采收，每次采收的煙葉由專業(yè)的煙草分級工按照各個重復的各個級別分別累計計重，并根據(jù)國家發(fā)改委、煙草專賣局關于煙草等級的劃分標準，對其進行分級。
表4各處理各等級煙的分別產(chǎn)量和總產(chǎn)量
單位：KG
本次田間小區(qū)試驗地所采收的煙葉被分為6個級別，分別為4個中等級別X3F、B3F、X2F、C4F，2個上等級別B2F和C3F，處理相對對照上等煙提高比例6.4％，產(chǎn)量提高15.50％，上等煙重量和產(chǎn)量較對照都形成極顯著性差異。