本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種鼠李糖乳桿菌凍干粉的制備方法。
背景技術(shù)：
：鼠李糖乳桿菌從屬于乳桿菌屬，為革蘭氏陽性兼性厭氧菌，無質(zhì)粒；不能利用乳糖，但可代謝單糖；在厭氧情況下能很好生長，在有CO2存在的情況下也能生長。鼠李糖乳桿菌是人體正常菌群之一，腸道黏著率高，定植能力強(qiáng)，是人類研究最廣泛的益生菌之一，具有平衡和改善胃腸道功能、增強(qiáng)人體自身免疫能力、促進(jìn)雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌生長和作用、預(yù)防和幫助治療腹瀉、預(yù)防呼吸道感染、排出毒素、預(yù)防齲齒、預(yù)防過敏等作用?；谑罄钐侨闂U菌對人體的多種功用，越來越多的企業(yè)利用鼠李糖乳桿菌凍干粉為原料生產(chǎn)生物制品，那么單位產(chǎn)品活菌數(shù)就直接影響產(chǎn)品的功效。因此，在凍干粉生產(chǎn)制備過程中提高活菌數(shù)就尤為重要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種鼠李糖乳桿菌凍干粉的制備方法，達(dá)到了鼠李糖乳桿菌增殖培養(yǎng)、凍干粉活菌數(shù)量大、菌體收率提高、生產(chǎn)成本降低的目的。本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種鼠李糖乳桿菌凍干粉的制備方法，包括如下步驟：1)制備發(fā)酵用的菌種1.1)劃線培養(yǎng)：鼠李糖乳桿菌菌粉用無菌水稀釋后，于MC培養(yǎng)基上分區(qū)劃線，37℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)48～72小時(shí)；1.2)一級純化培養(yǎng)：挑取MC培養(yǎng)基平皿上的單菌落，接種至裝有MRS液體培養(yǎng)基的試管中，密封，37℃培養(yǎng)箱恒溫靜置培養(yǎng)17～24小時(shí)，得一級純化菌懸液；1.3)二級純化培養(yǎng)：按3～5％接種量，將培養(yǎng)好的一級菌懸液接種至裝有MRS液體培養(yǎng)基的三角瓶中，密封，37℃培養(yǎng)箱恒溫靜置培養(yǎng)17～24小時(shí)，得二級純化菌懸液；1.4)菌泥制備與保存：將二級純化菌懸液進(jìn)行離心，12000rpm離心10分鐘得到菌泥，將菌泥溶解于MRS液體培養(yǎng)基與50％甘油溶液組成的混合液中，得菌泥混合液，將菌泥混合液分裝在已滅菌的凍存管中，封口膜密封，凍存于-40～-80℃低溫冰箱內(nèi)，得鼠李糖乳桿菌菌泥凍存管，備用；2)菌種發(fā)酵2.1)凍存菌泥復(fù)蘇：取存于低溫冰箱內(nèi)的鼠李糖乳桿菌菌泥凍存管，立即放入37℃水浴鍋內(nèi)進(jìn)行菌種復(fù)蘇，至凍存管內(nèi)液體全部融化；2.2)菌種一級培養(yǎng)：將復(fù)蘇好的菌泥混合液1～2ml直接接種至裝有基礎(chǔ)培養(yǎng)基的三角瓶中，三角瓶密封，37℃培養(yǎng)箱恒溫靜置培養(yǎng)17～24小時(shí)；2.3)菌種二級培養(yǎng)：按照2～6％接種量，將一級培養(yǎng)結(jié)束的菌懸液接種至裝有基礎(chǔ)培養(yǎng)基的三角瓶中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基裝液體積占三角瓶容積的40％，三角瓶密封，37℃培養(yǎng)箱恒溫靜置培養(yǎng)17～24小時(shí)；2.4)菌種三級培養(yǎng)：按照2～6％接種量，將二級培養(yǎng)結(jié)束的菌懸液接種至裝有基礎(chǔ)培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基裝液體積占發(fā)酵罐容積的60％，開啟發(fā)酵罐攪拌槳，轉(zhuǎn)速為100rpm，通氣量為0，37℃恒溫培養(yǎng)8～15小時(shí)；2.5)菌種四級發(fā)酵：按照2～6％接種量，將三級培養(yǎng)結(jié)束的菌懸液接種至裝有優(yōu)化培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，優(yōu)化培養(yǎng)基裝液體積占發(fā)酵罐容積的60％，開啟發(fā)酵罐攪拌槳，轉(zhuǎn)速為100rpm，通氣量為0，37℃恒溫培養(yǎng)，在發(fā)酵開始3小時(shí)后，通過流加食品級NaOH溶液來維持菌液的恒pH為5.50～6.00，培養(yǎng)周期8～15小時(shí)，直至監(jiān)測到菌液OD600值停止增長，立即停止發(fā)酵；3)凍干粉的制備3.1)發(fā)酵液離心：發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵罐罐體溫度調(diào)低，當(dāng)罐內(nèi)發(fā)酵液溫度低于20℃時(shí)，準(zhǔn)備利用離心設(shè)備進(jìn)行離心，離心結(jié)束后，收集離心設(shè)備轉(zhuǎn)鼓內(nèi)的菌泥；3.2)冷凍干燥：菌泥收集完畢后，按照菌泥：凍干保護(hù)劑＝1:1～2的體積比，向菌泥中添加凍干保護(hù)劑，并攪拌、混合均勻，分裝到冷凍干燥機(jī)托盤，然后將冷凍干燥機(jī)托盤放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行菌粉的凍干，保持真空度0～1.0Pa，持續(xù)凍干57～72小時(shí)；3.3)收集凍干粉，按質(zhì)量要求進(jìn)行粉碎后包裝。所述的制備方法，步驟1.4)所述MRS液體培養(yǎng)基與50％甘油溶液的體積比為1:1，MRS液體培養(yǎng)基與50％甘油溶液組成的混合液與離心前菌懸液的體積比為1:10。所述的制備方法，步驟2)中基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備，配方：酵母蛋白胨6.0～10.0g/L、葡萄糖19.0～25.0g/L、酵母浸出物2.0～4.0g/L、乙酸鈉4.5～6.0g/L、硫酸鎂0.4～0.6g/L、吐溫800.5～0.75g/L、低聚異麥芽糖1.0～2.5g/L、磷酸二氫鉀1.5～3.0g/L、余量為無菌水，pH值6.20～6.80；按照配方比例稱量、加熱溶解，如果培養(yǎng)基的pH值低于6.20，則用1mol/L食品級NaOH溶液調(diào)培養(yǎng)基pH值至6.20～6.80，115℃下滅菌30min。所述的制備方法，步驟2)中優(yōu)化培養(yǎng)基的制備，配方：酵母蛋白胨11.0～15.0g/L、葡萄糖25.0～30.0g/L、酵母浸出物6.0～8.0g/L、乙酸鈉2.0～3.0g/L、硫酸鎂0.10～0.15g/L、吐溫800.5～0.75g/L、低聚異麥芽糖1.0～2.5g/L、磷酸二氫鉀1.5～3.0g/L、余量為無菌水，pH值6.20～6.80；按照配方比例稱量、加熱溶解，如果培養(yǎng)基的pH值低于6.20，則用1mol/L食品級NaOH溶液調(diào)培養(yǎng)基pH值至6.20～6.80，115℃下滅菌30min。所述的制備方法，步驟3.1)所述離心設(shè)備采用管式離心機(jī)，離心前對轉(zhuǎn)鼓進(jìn)行蒸汽滅菌30min，轉(zhuǎn)速為10000～15000rpm。所述的制備方法，步驟3.2)中凍干保護(hù)劑配方為：脫脂奶粉60.0～80.0g/L、麥芽糊精30.0～45.0g/L、海藻糖100.0～300.0g/L、吐溫800.5～0.75g/L、甘油8.0～15.0g/L、谷氨酸鈉0.8～1.0g/L、余量為無菌水，pH值為6.80～7.50。所述的制備方法，所述凍干保護(hù)劑的制備方法為：按配方比例準(zhǔn)確稱取脫脂奶粉，取配方中部分無菌水用于完全溶解脫脂奶粉，于115℃下滅菌30min，得溶液A；其他組分按照配方比例稱量、混合，用配方中剩余部分的無菌水溶解，于115℃下滅菌30min，得溶液B；滅菌結(jié)束放置至室溫后，在無菌間內(nèi)將溶液A和溶液B混合均勻得pH值為6.80～7.50的凍干保護(hù)劑，將制備好的凍干保護(hù)劑冷藏于-4℃冰箱內(nèi)備用。所述的制備方法，若凍干保護(hù)劑的pH值低于6.80，則用1mol/L食品級NaOH溶液調(diào)pH值至6.80～7.50。所述的制備方法，步驟3.2)中采用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行菌粉凍干時(shí)，冷凍干燥機(jī)的溫度和凍干時(shí)間按區(qū)段設(shè)置，具體為，第1區(qū)段：凍干時(shí)長3h，溫度設(shè)定為-25℃；第2區(qū)段：凍干時(shí)長40～55h，溫度設(shè)定為-25℃；第3區(qū)段：凍干時(shí)長4h，溫度設(shè)定為-10℃；第4區(qū)段：凍干時(shí)長4h，溫度設(shè)定為10℃；第5區(qū)段：凍干時(shí)長2h，溫度設(shè)定25℃；第6區(qū)段：凍干時(shí)長4h，溫度設(shè)定為30℃。本發(fā)明具有以下有益效果：1、本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌的增殖培養(yǎng)、富集高活菌數(shù)的菌體用于生產(chǎn)作為食品添加劑的凍干粉的目的，針對鼠李糖乳桿菌純化培養(yǎng)和菌種發(fā)酵分別采用了不同的更適于菌體不同生長階段的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和優(yōu)化培養(yǎng)基，培養(yǎng)基采用的組分原料均為食品級，并在培養(yǎng)基中添加了促生長因子低聚異麥芽糖。2、采用離心菌泥凍存菌種進(jìn)行發(fā)酵，通過流加食品級NaOH溶液來控制發(fā)酵過程中pH恒定，采取分級擴(kuò)大培養(yǎng)方式促使菌體數(shù)量快速增加，在短時(shí)間里得到大量的菌體，并且菌種穩(wěn)定，變異、退化少。3、采用管式離心機(jī)分離收集鼠李糖乳桿菌菌泥，菌泥收率可達(dá)到1.5％以上，并且管式離心機(jī)的轉(zhuǎn)鼓可用蒸汽滅菌，有效地防止了在離心過程中染菌。4、利用冷凍干燥技術(shù)生產(chǎn)活菌制劑有許多突出的優(yōu)點(diǎn)：①由于在低溫下干燥，微生物不會(huì)失去生物活性；②在低溫干燥過程中，微生物的生長和酶的作用幾乎無法進(jìn)行，能最好地保持被凍干物質(zhì)的原來性狀；③干燥后體積、形狀基本不變；④被凍干制品呈海綿狀，不干縮，因而溶解時(shí)與水接觸面大，能迅速恢復(fù)原來的性狀；⑤能除去物質(zhì)中95％-99％的水分，延長制品的保存期。⑥采用溫度梯度降低和回升，減小對菌體的損傷。5、為避免在冷凍干燥過程造成菌細(xì)胞膜的損傷，加入凍干保護(hù)劑，在凍干保護(hù)劑中脫脂奶粉主要在細(xì)胞表面起保護(hù)層作用；甘油和谷氨酸鈉能滲透到細(xì)胞內(nèi)部，可改善凍干過程中冰晶生成的速度和膜的滲透性；海藻糖在冷凍干燥過程中形成一種玻璃態(tài)，在玻璃態(tài)下黏度極高，因而分子擴(kuò)散系數(shù)很低，使大分子物質(zhì)運(yùn)動(dòng)受阻，細(xì)胞壁的通透性降低，從而起到保護(hù)作用；麥芽糊精有利于提高在冷凍干燥后的菌體成活率以及儲(chǔ)存過程中的菌體成活率，同時(shí)還能提高菌粉的速溶性；吐溫80作為表面活性劑可防止蛋白質(zhì)變性，冷凍時(shí)冰-水界面的形成可引起蛋白質(zhì)表面誘導(dǎo)變性，表面活性劑可使蛋白質(zhì)溶液表面張力下降，減少冰-水界面蛋白質(zhì)吸收和聚集的驅(qū)動(dòng)力。復(fù)配保護(hù)劑體系中每種保護(hù)劑成分在冷凍干燥過程中都發(fā)揮各自的作用，同時(shí)相互間又具有協(xié)同作用。6、凍干保護(hù)劑中的脫脂奶粉采取單獨(dú)滅菌方式，充分保護(hù)其活性成份不被過酸、過堿或高溫破壞，能夠更好的在菌粉凍干過程中發(fā)揮保護(hù)作用，提高凍干活菌率；并且制得的凍干粉的顏色較淺，利于增進(jìn)食欲。7、本發(fā)明技術(shù)制備鼠李糖乳桿菌凍干粉，活菌數(shù)高達(dá)1011CFU/g以上。附圖說明圖1為采用不同配方凍干保護(hù)劑制得凍干粉的存活率對比圖。圖2為鼠李糖乳桿菌凍干粉的制備工藝流程圖。具體實(shí)施方式一種鼠李糖乳桿菌凍干粉的制備方法，如圖2所示，包括如下步驟：1)制備發(fā)酵用菌種1.1)劃線培養(yǎng)：鼠李糖乳桿菌菌粉用無菌水稀釋后，于MC培養(yǎng)基上四區(qū)劃線，劃線結(jié)束后，將MC培養(yǎng)基平皿倒置，37℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)48～72小時(shí)；1.2)一級純化培養(yǎng)：挑取平皿上溶鈣圈較大的單菌落接種至裝有5mlMRS液體培養(yǎng)基的試管中，試管密封，37℃培養(yǎng)箱恒溫靜置培養(yǎng)17～24小時(shí)，得一級純化菌懸液；1.3)二級純化培養(yǎng)：按3～5％接種量，將培養(yǎng)好的一級菌懸液接種至裝有MRS液體培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)基裝液體積占三角瓶容積的40％，三角瓶密封，37℃培養(yǎng)箱恒溫靜置培養(yǎng)17～24小時(shí)，得二級純化菌懸液；1.4)菌泥制備與保存：將二級純化培養(yǎng)得到的二級純化菌懸液進(jìn)行離心，12000rpm離心10分鐘后得到菌泥，將菌泥溶解于MRS液體培養(yǎng)基與50％甘油溶液組成的混合液中，得菌泥混合液；將菌泥混合液分裝在已滅菌的凍存管中，封口膜密封，凍存于-40～-80℃低溫冰箱內(nèi)，得鼠李糖乳桿菌菌泥凍存管，備用；所述MRS液體培養(yǎng)基與50％甘油溶液的體積比為1:1，MRS液體培養(yǎng)基與50％甘油溶液組成的混合液與離心前二級純化菌懸液的體積比為1:10。注：步驟1)操作均必需在無菌操作臺(tái)和無菌間內(nèi)執(zhí)行；2)菌種發(fā)酵2.1)凍存菌泥復(fù)蘇：取存于低溫冰箱內(nèi)的鼠李糖乳桿菌菌泥凍存管，立即放入37℃水浴鍋內(nèi)進(jìn)行菌種復(fù)蘇，30～45s，至凍存管內(nèi)液體全部融化；2.2)菌種一級培養(yǎng)：將復(fù)蘇好的菌泥混合液1～2ml直接接種至裝有10ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，三角瓶密封，37℃培養(yǎng)箱恒溫靜置培養(yǎng)17～24小時(shí)；2.3)菌種二級培養(yǎng)：按照2～6％接種量，將一級培養(yǎng)結(jié)束的菌懸液接種至裝有基礎(chǔ)培養(yǎng)基的三角瓶中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基裝液體積占三角瓶容積的40％，三角瓶密封，37℃培養(yǎng)箱恒溫靜置培養(yǎng)17～24小時(shí)；2.4)菌種三級培養(yǎng)：按照2～6％接種量，將二級培養(yǎng)結(jié)束的菌懸液接種至裝有基礎(chǔ)培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基裝液體積占發(fā)酵罐容積的60％，開啟發(fā)酵罐攪拌槳，轉(zhuǎn)速為100rpm，通氣量為0，37℃恒溫培養(yǎng)8～15小時(shí)；2.5)菌種四級發(fā)酵：按照2～6％接種量，將三級培養(yǎng)結(jié)束的菌懸液接種至裝有優(yōu)化培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，優(yōu)化培養(yǎng)基裝液體積占發(fā)酵罐容積的60％，開啟發(fā)酵罐攪拌槳，轉(zhuǎn)速為100rpm，通氣量為0，37℃恒溫培養(yǎng)，在發(fā)酵開始3小時(shí)后，通過流加食品級NaOH溶液來維持菌液的恒pH為5.50～6.00，培養(yǎng)周期8～15小時(shí)，直至監(jiān)測到菌液OD600值停止增長，立即停止發(fā)酵；其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方及制備方法：酵母蛋白胨6.0～10.0g/L、葡萄糖19.0～25.0g/L、酵母浸出物2.0～4.0g/L、乙酸鈉4.5～6.0g/L、硫酸鎂0.4～0.6g/L、吐溫800.5～0.75g/L、低聚異麥芽糖1.0～2.5g/L、磷酸二氫鉀1.5～3.0g/L、余量為無菌水，pH值6.20～6.80；按照配方比例稱量、加熱溶解，如果培養(yǎng)基的pH值低于6.20，則用1mol/L食品級NaOH溶液調(diào)培養(yǎng)基pH值至6.20～6.80，115℃下滅菌30min；優(yōu)化培養(yǎng)基配方及制備方法：酵母蛋白胨11.0～15.0g/L、葡萄糖25.0～30.0g/L、酵母浸出物6.0～8.0g/L、乙酸鈉2.0～3.0g/L、硫酸鎂0.10～0.15g/L、吐溫800.5～0.75g/L、低聚異麥芽糖1.0～2.5g/L、磷酸二氫鉀1.5～3.0g/L、余量為無菌水，pH值6.20～6.80；按照配方比例稱量、加熱溶解，如果培養(yǎng)基的pH值低于6.20，則用1mol/L食品級NaOH溶液調(diào)培養(yǎng)基pH值至6.20～6.80，115℃下滅菌30min；注：培養(yǎng)基組分原料均為食品級。3)凍干粉的制備3.1)發(fā)酵液離心：四級發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵罐罐體溫度調(diào)低，當(dāng)罐內(nèi)發(fā)酵液溫度低于20℃時(shí)方可準(zhǔn)備離心，離心設(shè)備采用管式離心機(jī)，離心前對轉(zhuǎn)鼓進(jìn)行蒸汽滅菌30min，轉(zhuǎn)速為10000～15000rpm，離心結(jié)束后，收集轉(zhuǎn)鼓內(nèi)的菌泥；3.2)凍干保護(hù)劑制備：凍干保護(hù)劑配方：脫脂奶粉60.0～80.0g/L、麥芽糊精30.0～45.0g/L、海藻糖100.0～300.0g/L、吐溫800.5～0.75g/L、甘油8.0～15.0g/L、谷氨酸鈉0.8～1.0g/L、余量為無菌水，pH值為6.80～7.50；凍干保護(hù)劑制備方法：按配方比例準(zhǔn)確稱取脫脂奶粉，取配方中2/3體積的無菌水用于完全溶解脫脂奶粉，115℃滅菌30min，得溶液A；其他組分按照配方比例稱量、混合，用配方中剩余1/3體積的無菌水溶解，115℃滅菌30min，得溶液B；分別滅菌結(jié)束放置至室溫后，在無菌間內(nèi)將溶液A和溶液B混合均勻得凍干保護(hù)劑，如果凍干保護(hù)劑的pH值低于6.80，則用1mol/L食品級NaOH溶液調(diào)pH值至6.80～7.50，將制備好的凍干保護(hù)劑冷藏于-4℃冰箱內(nèi)備用；3.3)冷凍干燥：菌泥收集完畢后，按照菌泥：凍干保護(hù)劑＝1:1～2的體積比，向菌泥中添加凍干保護(hù)劑，并攪拌、混合均勻，分裝到凍干機(jī)托盤，然后將凍干機(jī)托盤放入凍干機(jī)內(nèi)進(jìn)行菌粉的凍干，冷凍干燥機(jī)溫度隨時(shí)間按區(qū)段設(shè)置(見表1)，真空度0～1.0Pa，持續(xù)凍干57～72小時(shí)；表1冷凍干燥機(jī)溫度設(shè)置表區(qū)段123456運(yùn)行時(shí)間/h340～554424結(jié)束溫度/℃-25-25-1010253013)收集凍干粉，按質(zhì)量要求進(jìn)行粉碎后包裝。注：2)—3)操作均需在10萬級凈化車間內(nèi)進(jìn)行。實(shí)施例1一種鼠李糖乳桿菌凍干粉的制備方法包括如下步驟：1)發(fā)酵用菌種的制備1.1)劃線培養(yǎng)：鼠李糖乳桿菌菌粉用無菌水稀釋后，于MC培養(yǎng)基上四區(qū)劃線，劃線結(jié)束后，平皿倒置，37℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)60小時(shí)；1.2)一級純化培養(yǎng)：挑取平皿上溶鈣圈較大的單菌落接種至裝有5mlMRS液體培養(yǎng)基的試管中，試管密封，37℃培養(yǎng)箱恒溫靜置培養(yǎng)20小時(shí)；1.3)二級純化培養(yǎng)：按3％接種量，將培養(yǎng)好的一級菌懸液接種至裝有100mlMRS液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，三角瓶密封，37℃培養(yǎng)箱恒溫靜置培養(yǎng)20小時(shí)；1.4)菌泥制備與保存：將二級純化培養(yǎng)得到的100ml菌懸液進(jìn)行離心，12000rpm離心10分鐘后得到菌泥，將菌泥溶解于10ml混合液中(混合液由5mlMRS液體培養(yǎng)基與5ml50％甘油溶液混合均勻配制而成)中，將菌泥混合液分裝在已滅菌的1ml凍存管中，封口膜密封，凍存于-80℃低溫冰箱內(nèi)，備用；注：1.1)—1.4)操作均必需在無菌操作臺(tái)和無菌間內(nèi)執(zhí)行；2)菌種發(fā)酵2.1)凍存菌泥復(fù)蘇：取存于低溫冰箱內(nèi)的鼠李糖乳桿菌菌泥凍存管，立即放入37℃水浴鍋內(nèi)進(jìn)行菌種復(fù)蘇，30～45s，至凍存管內(nèi)液體全部融化；2.2)菌種一級培養(yǎng)：將復(fù)蘇好的1ml菌泥混合液直接接種至裝有10ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，三角瓶密封，37℃培養(yǎng)箱恒溫靜置培養(yǎng)20小時(shí)；2.3)菌種二級培養(yǎng)：按照2％接種量，將一級培養(yǎng)結(jié)束的菌懸液接種至裝有100ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，按此接種4瓶，三角瓶密封，37℃培養(yǎng)箱恒溫靜置培養(yǎng)20小時(shí)；2.4)菌種三級培養(yǎng)：按照2％接種量，將二級培養(yǎng)結(jié)束的菌懸液接種至裝有18L基礎(chǔ)培養(yǎng)基的30L發(fā)酵罐中，開啟發(fā)酵罐攪拌槳，轉(zhuǎn)速為100rpm，通氣量為0，37℃恒溫培養(yǎng)12小時(shí)；2.5)菌種四級發(fā)酵：按照5％接種量，將三級培養(yǎng)結(jié)束的菌懸液接種至裝有300L優(yōu)化培養(yǎng)基的500L發(fā)酵罐中，開啟發(fā)酵罐攪拌槳，轉(zhuǎn)速為100rpm，通氣量為0，37℃恒溫培養(yǎng)，在發(fā)酵開始3小時(shí)后，通過流加食品級NaOH溶液來維持恒定pH為5.60±0.1，培養(yǎng)至11小時(shí)時(shí)，監(jiān)測到菌液OD600值停止增長，立即停止發(fā)酵；其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成及制備：酵母蛋白胨8.0g/L、葡萄糖25.0g/L、酵母浸出物3.0g/L、乙酸鈉6.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、吐溫800.5g/L、低聚異麥芽糖1.0g/L、磷酸二氫鉀3.0g/L、余量為無菌水，pH值6.20；按照配方比例稱量、加熱溶解，用1mol/L食品級NaOH溶液調(diào)培養(yǎng)基pH值至6.20，115℃下滅菌30min；優(yōu)化培養(yǎng)基配方：酵母蛋白胨14.0g/L、葡萄糖30.0g/L、酵母浸出物6.0g/L、乙酸鈉3.0g/L、硫酸鎂0.10g/L、吐溫800.5g/L、低聚異麥芽糖2.0g/L、磷酸二氫鉀3.0g/L、余量為無菌水，pH值6.80；按照配方比例稱量、加熱溶解，用1mol/L食品級NaOH溶液調(diào)培養(yǎng)基pH值至6.80，115℃下滅菌30min；注：2.1)—2.5)操作均需在10萬級凈化車間內(nèi)進(jìn)行。3)凍干粉的制備3.1)發(fā)酵液離心：四級發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵罐罐體溫度調(diào)低，當(dāng)罐內(nèi)發(fā)酵液溫度低于20℃時(shí)準(zhǔn)備離心，離心設(shè)備采用管式離心機(jī)，離心前對轉(zhuǎn)鼓進(jìn)行蒸汽滅菌30min，轉(zhuǎn)速為12000rpm，離心結(jié)束后，收集到轉(zhuǎn)鼓內(nèi)的菌泥5.55L，菌泥收率為1.85％；3.2)配制6L凍干保護(hù)劑：稱取脫脂奶粉360.0g，完全溶解于2974L無菌水中，115℃滅菌30min；稱取麥芽糊精210.0g、海藻糖900.0g、吐溫803.0g、甘油60.0g、谷氨酸鈉6.0g，混合后完全溶解于1487L無菌水中，115℃滅菌30min；分別滅菌結(jié)束放置至室溫后，在無菌間內(nèi)將兩溶液混合均勻，然后用1mol/L食品級NaOH溶液調(diào)pH值至7.00，將制得的凍干保護(hù)劑冷藏于-4℃冰箱內(nèi)備用；3.3)冷凍干燥：菌泥收集完畢后，按照菌泥：凍干保護(hù)劑＝1:1的體積比，添加凍干保護(hù)劑，并攪拌、混合均勻，分裝到凍干機(jī)托盤，然后將凍干機(jī)托盤放入凍干機(jī)內(nèi)進(jìn)行菌粉的凍干，冷凍干燥機(jī)溫度設(shè)置見表2，真空度0～1.0Pa，持續(xù)凍干62小時(shí)；表2冷凍干燥機(jī)溫度設(shè)置表區(qū)段123456運(yùn)行時(shí)間/h3454424結(jié)束溫度/℃-25-25-101025303.4)收集凍干粉，檢測活菌數(shù)為5.0×1011CFU/g；3.5)按質(zhì)量要求進(jìn)行粉碎后包裝。注：3.1)—3.5)操作均需在10萬級凈化車間內(nèi)進(jìn)行。實(shí)施例2對比試驗(yàn)凍干保護(hù)劑配方選擇實(shí)驗(yàn)配方A：脫脂奶粉160g/L、麥芽糊精100g/L、海藻糖100g/L、谷氨酸10g/L、抗壞血酸20g/L、甘油20g/L；配方B：乳清粉100g/L、麥芽糊精50g/L、抗壞血酸20g/L、甘油50g/L；配方C：麥芽浸粉150g/L、甘油20g/L、菊糖70g/L；配方D(實(shí)施例1配方)：脫脂奶粉60g/L、麥芽糊精35g/L、海藻糖150g/L、吐溫800.5g/L、甘油10g/L、谷氨酸鈉1g/L，pH值7.00。按照上述A、B、C、D四種配方分別配制凍干保護(hù)劑，在相同的冷凍干燥條件下制得凍干粉A、B、C、D，將凍干粉A、B、C、D放置于-20℃條件下貯存12個(gè)月，通過檢測貯存前后活菌數(shù)計(jì)算其存活率，見圖1。由圖1顯示：采用實(shí)施例1配方的凍干保護(hù)劑制得的鼠李糖乳桿菌凍干粉，-20℃條件下貯存12個(gè)月后，菌體存活率遠(yuǎn)高于其他3種凍干保護(hù)劑。當(dāng)前第1頁1 2 3