本發(fā)明涉及一種新菌種及其在環(huán)境工程領(lǐng)域的應(yīng)用，具體涉及一株硝酸鹽還原菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

氮是一種重要的營(yíng)養(yǎng)元素，是植物體內(nèi)氨基酸及蛋白質(zhì)的組成部分，也是植物進(jìn)行光合作用起決定作用的葉綠素的組成部分，對(duì)作物生長(zhǎng)起著非常重要的作用。因此，增施氮肥作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的主要增產(chǎn)因子已為越來(lái)越多的人們理解與承認(rèn)。施用氮肥可以獲得明顯的增產(chǎn)效果，但農(nóng)田中過(guò)量的氮素通過(guò)氨揮發(fā)、硝化\反硝化等方式從土壤中損失，造成湖泊、河流等水體的富營(yíng)養(yǎng)化程度加劇。其中硝態(tài)氮因具有易于流失的特性，成為肥料氮土壤中淋溶損失的主要形態(tài)。研究表明，土壤中硝態(tài)氮過(guò)高，作物吸收中硝酸鹽含量高，因此，硝酸鹽的含量也直接影響作物品質(zhì)。

一般認(rèn)為，土壤中氮素發(fā)生淋溶損失必須具備兩個(gè)條件；一是土壤中具有以移動(dòng)性的氮素累積，主要為硝態(tài)氮；二是水分的流動(dòng)。因此在水分管理充分的條件下，控制土壤硝態(tài)氮的含量成為控制氮素淋溶損失的主要因素。目前，控制土壤氮素?fù)p失的方式主要是在土壤中添加硝化抑制劑，抑制土壤中硝化作用，從而減少硝態(tài)氮含量。但硝化抑制劑均為化學(xué)物質(zhì)，容易造成二次污染。

硝酸鹽還原菌是指能夠還原硝酸鹽的微生物，其還原主要途徑有兩個(gè)：一是某些微生物能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氧化二氮、一氧化氮及氮?dú)?，從而增加土壤氮素?fù)p失；二是將易淋溶的硝酸鹽還原為較穩(wěn)定的氨態(tài)氮，可以降低土壤氮素?fù)p失。因此，控制土壤中硝酸鹽還原菌的種類及數(shù)量，可以控制土壤中氮素的轉(zhuǎn)化途徑，從而達(dá)到降低土壤氮素?fù)p失的目的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了彌補(bǔ)現(xiàn)有微生物資源的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一株硝酸鹽還原菌及其應(yīng)用。

本發(fā)明的硝酸鹽還原菌Nitratireductor lacus GSS14從山西運(yùn)城鹽湖底泥中進(jìn)行分離、純化所得，菌株為革蘭氏陰性菌，卵圓形，桿狀，具雙生鞭毛，菌體大小為0.6-0.8×1.0-2.0μm。在瓊脂固體培養(yǎng)基平板上好氧培養(yǎng)3d后，菌落圓形，奶白色，中央突起，邊緣半透明，菌落直徑為2-3mm。生長(zhǎng)溫度為10-45℃，在鹽濃度范圍為0-12％條件下均能生長(zhǎng)與增殖。發(fā) 明人于2016年8月25日將該硝酸鹽還原菌送至位于廣州市先烈中路100號(hào)大院59號(hào)樓5樓的廣東省微生物菌種保藏中心保藏，保藏中心于2016年8月25日收到該微生物，保藏中心給予本發(fā)明耐鹽硝酸鹽還原菌的分類命名為Nitratireductor lacus，保藏號(hào)為GDMCC No：60065。

本發(fā)明所述Nitratireductor lacus GSS14能夠?qū)⑼寥乐邢跛猁}還原為氨態(tài)氮，減少土壤中可移動(dòng)的氮素含量，進(jìn)而減少土壤氮流失及作物氮含量，具有節(jié)省肥料、提高作物質(zhì)量等多重功效。Nitratireductor lacus GSS14菌株可應(yīng)用于控制土壤氮轉(zhuǎn)化途徑，達(dá)到減少土壤硝態(tài)氮含量，并達(dá)到土壤固氮的效果。

附圖說(shuō)明

圖1為硝酸鹽還原菌Nitratireductor lacus GSS14在5000倍下的掃描電鏡照片。

圖2為硝酸鹽還原菌Nitratireductor lacus GSS14的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：芽孢桿菌Nitratireductor lacus GSS14的培養(yǎng)、分離、篩選及鑒定

1.1菌株的培養(yǎng)、分離

本發(fā)明的芽孢桿菌N.lacus GSS14是通過(guò)對(duì)山西運(yùn)城鹽湖底泥富集培養(yǎng)進(jìn)行分離純化得到的。

具體分離純化方法包括以下步驟：

(1)取5.0g山西運(yùn)城鹽湖底泥接種于pH值為7.2的富集分離培養(yǎng)基中，30℃、200rpm/min震蕩培養(yǎng)；當(dāng)培養(yǎng)3d后，以10％的接種量將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至另一新鮮的富集分離培養(yǎng)基，30℃、200rpm/min震蕩培養(yǎng)。

(2)富集培養(yǎng)四代后，將第四代的培養(yǎng)液采用稀釋平板法稀釋到10^-5-10^-6，將稀釋后的培養(yǎng)液0.1mL均勻涂布于瓊脂固體培養(yǎng)基上，置于30℃培養(yǎng)48h，挑取單菌落進(jìn)行分離與純化。

所述富集分離培養(yǎng)基為2216E培養(yǎng)基，培養(yǎng)基組分為：酵母粉1.0g，蛋白胨5.0g，檸檬酸鐵0.1g，NaCl 19.45g，MgCl₂ 5.98g，Na₂SO₄ 3.24g，CaCl₂ 1.8g，KCl 0.55g，Na₂CO₃0.16g，BrCl₂ 0.08g，SeCl₂ 0.034g，H₃BO₃ 0.022g，Na₂SiO₃ 0.004g，NaF 0.0024g，NH₄NO₃0.0016g，Na₂HPO₄ 0.008g，水1000mL，pH 7.2。所述固體瓊脂培養(yǎng)基是在上述富集分離培養(yǎng)基中加入瓊脂粉20g。

1.2菌體形態(tài)特性

采用常規(guī)的細(xì)菌電子顯微鏡觀察，該菌株為革蘭氏陰性菌，棒狀，兼性厭氧，菌菌體大小為0.6-0.8×1.0-2.0μm。生長(zhǎng)溫度為10-45℃，在鹽濃度范圍為0-12％條件下能生長(zhǎng)與增殖。

1.3菌落形態(tài)特性

在2216E固體培養(yǎng)基平板上好氧培養(yǎng)3d后，菌落圓形，奶白色，中央突起，邊緣半透明，菌落直徑為2-3mm。

1.4生理生化特征

對(duì)菌株N.lacus GSS14進(jìn)行生理生化特征的鑒定，其結(jié)果見(jiàn)表1。

表1.菌株生理生化鑒定結(jié)果

(表中：+表示為陽(yáng)性，W表示為弱陽(yáng)性，-表示為陰性)

由鑒定結(jié)果(表1)可知：菌株N.lacus GSS14兼性厭氧，能在12％NaCl的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，而最適NaCl為6％；生長(zhǎng)溫度為10-50℃，最適生長(zhǎng)溫度為37℃；pH值為6.5-7.0，最適pH為7.5；接觸酶陽(yáng)性，氧化酶陽(yáng)性；具有脲酶及七葉靈水解活性。菌株N.lacus GSS14能夠利用D-葡萄糖、D-甘露醇、麥芽糖、蘋果酸作為唯一碳源；G+C含量為61％。

1.5分子生物學(xué)特征

采用SDS-蛋白酶K，氯仿-異戊醇(體積比24：1)抽提，0.6體積異丙醇沉淀的方法提取細(xì)菌總DNA。采用16S rRNA通用引物F27和R1492R擴(kuò)增細(xì)菌的16S rRNA，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果見(jiàn)SEQ ID NO.KX531008。將得到的堿基序列在GenBank等國(guó)際核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)進(jìn)行同源序列搜索(Blast search)，找出該菌株與數(shù)據(jù)庫(kù)中同源性最高的模式菌株或保藏于ATCC或DSM等國(guó)際菌種保藏中心的菌株。N.lacus GSS14的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果見(jiàn)圖2。

根據(jù)比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該菌株與芽孢桿菌N.kimnyeongensis KY 101^T的16S rRNA序列具較高同源性，相似度為98.2％；分子雜交結(jié)果顯示，該菌株與N.kimnyeongensis KY 101^T DNA-DNA相關(guān)性為52％。

綜上所述，16S rRNA同源序列比對(duì)可以確定本發(fā)明菌株N.lacus GSS14屬于Nitratireductor屬。但由于本發(fā)明菌株N.lacus GSS14具有許多與現(xiàn)有Nitratireductor屬菌顯著不同的表型特征，加上DNA-DNA雜交和分子生物學(xué)分析結(jié)果表明本發(fā)明菌株不屬于Nitratireductor屬的已有任何種。因此，根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)，可以判定本發(fā)明菌株為Nitratireductor屬的一個(gè)新種。命名為Nitratireductor.lacus GSS14，簡(jiǎn)寫為N.lacus GSS14，于2016年8月25日在廣東省微生物菌種保藏中心保藏，編號(hào)為：GDMCC No.60065。

實(shí)施例2：硝酸鹽還原菌N.lacus GSS14的硝酸鹽還原效果

(1)從N.lacus GSS14斜面上挑取菌苔一環(huán)接入裝有LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，37℃、200rpm/min搖床震蕩培養(yǎng)36h，制得的發(fā)酵液即為種子液。

在Giltay基礎(chǔ)培養(yǎng)中分別加入葡萄糖、乙酸鈉、乳酸鈉等不同碳源，調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中C/N比為3:1。將上述培養(yǎng)液分裝入500mL錐形瓶中，每瓶100mL，接種N.lacus GSS14接種液1mL，37℃、200rpm/min搖床中序批式培養(yǎng)，檢測(cè)培養(yǎng)液中硝態(tài)氮氮和氨態(tài)氮的含量。產(chǎn)氨率＝(NH₄-N含量/NO₃-N初濃度)/NO₃-N初濃度×100。

所述2216E液體培養(yǎng)基配方為：酵母粉1.0g，蛋白胨5.0g，檸檬酸鐵0.1g，NaCl 19.45g，MgCl₂ 5.98g，Na₂SO₄ 3.24g，CaCl₂ 1.8g，KCl 0.55g，Na₂CO₃ 0.16g，BrCl₂ 0.08g，SeCl₂ 0.034g，H₃BO₃ 0.022g，Na₂SiO₃ 0.004g，NaF 0.0024g，NH₄NO₃ 0.0016g，Na₂HPO₄0.008g，水1000mL，pH 7.2。

所述Giltay基礎(chǔ)培養(yǎng)液組分為：KNO₃ 1.0g，KH₂PO₄ 1.0g，MgSO₄·7H₂O 1.0g，F(xiàn)eCl₃·2H₂O 0.1g，CaCl₂·6H₂O 0.1g，蒸餾水1L。

結(jié)果表明，培養(yǎng)72h后，培養(yǎng)液中硝態(tài)氮減少68％，氨態(tài)氮增加65％，表明N.lacus GSS14能夠?qū)睉B(tài)氮還原為硝態(tài)氮。

實(shí)施例3：微生物菌劑的制備

(1)搖瓶培養(yǎng)：從N.lacus GSS14斜面上挑取菌苔一環(huán)接入裝有100mL 2216E液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，37℃、200rpm/min搖床震蕩培養(yǎng)24h。所述的述的2216E液體培養(yǎng)基配方為：酵母粉1.0g，蛋白胨5.0g，檸檬酸鐵0.1g，NaCl 19.45g，MgCl₂ 5.98g，Na₂SO₄ 3.24g，CaCl₂ 1.8g，KCl 0.55g，Na₂CO₃ 0.16g，BrCl₂ 0.08g，SeCl₂ 0.034g，H₃BO₃ 0.022g，Na₂SiO₃0.004g，NaF 0.0024g，NH₄NO₃ 0.0016g，Na₂HPO₄ 0.008g，水1000mL，pH 7.2。

(2)種子罐發(fā)酵：將上述培養(yǎng)好的N.lacus GSS14發(fā)酵液接入10L發(fā)酵罐中，37℃、200rpm/min發(fā)酵培養(yǎng)36h；所用發(fā)酵培養(yǎng)基配方為上述液體培養(yǎng)基。

(3)發(fā)酵罐發(fā)酵：將上述培養(yǎng)好的N.lacus GSS14發(fā)酵液接入發(fā)酵罐中，37℃、200rpm/min發(fā)酵培養(yǎng)48h；所用發(fā)酵培養(yǎng)基配方為上述液體培養(yǎng)基。

(4)菌劑制備：將上述發(fā)酵液加入固體輔料中，固體輔料與發(fā)酵液的質(zhì)量比為1.5∶1，攪拌均勻，28℃烘干，粉碎，經(jīng)40目過(guò)篩，包裝裝袋。固體輔料含有活性炭60％，硅藻土40％。制得的脫氮微生物菌劑成品經(jīng)活菌計(jì)數(shù)，總菌數(shù)達(dá)到5億/克以上。

實(shí)施例4：微生物菌劑的制備

(1)搖瓶培養(yǎng)：從N.lacus GSS14斜面上挑取菌苔一環(huán)接入裝有LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，45℃、240rpm/min搖床震蕩培養(yǎng)24h。所述的述的2216E液體培養(yǎng)基配方為：酵母粉1.0g，蛋白胨5.0g，檸檬酸鐵0.1g，NaCl 19.45g，MgCl₂ 5.98g，Na₂SO₄ 3.24g，CaCl₂ 1.8g，KCl 0.55g，Na₂CO₃ 0.16g，BrCl₂ 0.08g，SeCl₂ 0.034g，H₃BO₃ 0.022g，Na₂SiO₃ 0.004g，NaF 0.0024g，NH₄NO₃ 0.0016g，Na₂HPO₄ 0.008g，水1000mL，pH 7.2。

(2)種子罐發(fā)酵：將上述培養(yǎng)好的N.lacus GSS14發(fā)酵液接入10L發(fā)酵罐中，45℃、200rpm/min發(fā)酵培養(yǎng)24h；所用發(fā)酵培養(yǎng)基配方為上述液體培養(yǎng)基。

(3)發(fā)酵罐發(fā)酵：將上述培養(yǎng)好的N.lacus GSS14發(fā)酵液接入發(fā)酵罐中，45℃、200rpm/min發(fā)酵培養(yǎng)48h；所用發(fā)酵培養(yǎng)基配方為上述液體培養(yǎng)基。

(4)菌劑制備：將上述發(fā)酵液加入固體輔料中，固體輔料與發(fā)酵液的質(zhì)量比為2∶1，攪拌均勻，28℃烘干，粉碎，經(jīng)40目過(guò)篩，包裝裝袋。固體輔料含有活性炭40％，硅藻土60％。制得的脫氮微生物菌劑成品經(jīng)活菌計(jì)數(shù)，總菌數(shù)達(dá)到5億/克以上。

實(shí)施例5：微生物菌劑N.lacus GSS14應(yīng)用

試驗(yàn)采用盆栽方式，共設(shè)計(jì)2個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)4個(gè)重復(fù)，完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，共8盆。處理1為施用微生物菌劑N.lacus GSS14，施用量為0.1g/kg，處理2為對(duì)照，即不施用微生物菌劑。肥料與微生物菌劑以基肥方式一次性施入，肥料成分為尿素0.36g/kg、過(guò)磷酸鈣(P₂O₅)0.28g/kg和氯化鉀(K₂O，20％)0.59g/kg。其余栽培及田間管理措施均按常規(guī)措施處理。定期取樣測(cè)定土壤中硝態(tài)氮含量。小白菜成熟后將小白菜整株用自來(lái)水沖洗干凈后再用去離子水沖洗兩遍，晾干稱重后，將植株分為根部和地上部，稱植株地上部位鮮重，并測(cè)定地上部硝酸鹽含量。

結(jié)果表明，隨著時(shí)間的推移，施用N.lacus GSS14微生物制劑后土壤中硝酸鹽含量明顯減少，而小白菜中硝態(tài)氮含量為110.02mg/kg，明顯低于對(duì)照的172.15，說(shuō)明微生物菌劑N.lacus GSS14在減少氮流失的同時(shí)可降低小白菜中硝態(tài)氮含量，從而提高作物品質(zhì)。

表2土壤硝態(tài)氮含量的變化(mg/kg)

實(shí)施例6：微生物菌劑N.lacus GSS14應(yīng)用

在種植作物之前以施用基肥的方式按每公頃50kg的比例施用實(shí)施例4制備的N.lacusGSS14微生物菌劑，其他肥料及栽培措施按常規(guī)處理，以不施微生物菌劑的處理為對(duì)照。施肥后種植小白菜，品種為F-339。每個(gè)處理3個(gè)平行，每個(gè)平行10m²。每隔5d取樣測(cè)定土壤中硝態(tài)氮含量。小白菜成熟后取樣測(cè)定小白菜中硝態(tài)氮含量。結(jié)果表明，隨著時(shí)間的推移，施用N.lacus GSS14微生物制劑后土壤中硝酸鹽含量明顯減少，而小白菜中硝態(tài)氮含量為123.45mg/kg，明顯低于對(duì)照的189.35，說(shuō)明微生物菌劑N.lacus GSS14在減少氮流失的同時(shí)可降低小白菜中硝態(tài)氮含量，從而提高作物品質(zhì)。

表3土壤硝態(tài)氮含量的變化