硝酸鹽同化細(xì)菌及其在修復(fù)設(shè)施次生鹽漬化土壤中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種土壤修復(fù)【技術(shù)領(lǐng)域】的硝酸鹽同化細(xì)菌及其在修復(fù)設(shè)施次生鹽漬化土壤中的應(yīng)用，通過(guò)硝酸鹽同化細(xì)菌NCT-2以土壤中硝態(tài)氮作為氮源，并將其同化為其它形態(tài)的無(wú)機(jī)氮或細(xì)胞組分，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)硝態(tài)氮的降解轉(zhuǎn)化、降低土壤中硝態(tài)氮含量并對(duì)土壤進(jìn)行修復(fù)。該硝酸鹽同化細(xì)菌NCT-2為巨大芽孢桿菌(Bacillus?megaterium)，該硝酸鹽同化細(xì)菌NCT-2保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC?No.4698。本發(fā)明對(duì)環(huán)境中硝態(tài)氮有很強(qiáng)的同化轉(zhuǎn)化能力，對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)；此外，還具有溶磷能力。因此該菌在修復(fù)設(shè)施栽培次生鹽漬化土壤和制備微生物肥料上有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】硝酸鹽同化細(xì)菌及其在修復(fù)設(shè)施次生鹽漬化土壤中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及的是一種土壤修復(fù)【技術(shù)領(lǐng)域】的方法，具體是一種高效硝酸鹽同化細(xì)菌及其在修復(fù)設(shè)施次生鹽潰化土壤中的應(yīng)用 。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著設(shè)施農(nóng)業(yè)的發(fā)展，栽培面積不斷擴(kuò)大，氮素化肥使用量大幅度上升，大大超過(guò)植物的需求量。由于土壤中硝酸鹽未能被植物及時(shí)吸收轉(zhuǎn)化，造成大量鹽分在植物體和土壤中積累，從而造成設(shè)施栽培土壤次生鹽潰化。
[0003]若管理不當(dāng)，玻璃溫室2-3年土壤即出現(xiàn)鹽分障礙；塑料大棚3-5年即出現(xiàn)不同程度的鹽潰化障礙。過(guò)高的鹽分會(huì)抑制作物的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致蔬菜生長(zhǎng)矮小，發(fā)育遲緩，嚴(yán)重時(shí)枯萎死亡；根毛生長(zhǎng)分化能力差，植株抗病能力下降，引起生理病害，造成作物產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降；此外，還會(huì)造成肥料浪費(fèi)，多余的化肥通過(guò)農(nóng)田地表徑流和農(nóng)田滲漏導(dǎo)致農(nóng)業(yè)面源污染。
[0004]研究表明，設(shè)施栽培次生鹽潰化土壤中除HCO3 —外，Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl —、SO42 一、NO3—均有不同程度的積累。研究表明，次生鹽潰化土壤的陽(yáng)離子組成中，Na+已不是主要離子，陽(yáng)離子以Ca2+為主，其含量約占陽(yáng)離子總量的60%以上，Mg2+含量在15%-20%之間；陰離子以N03—和S042 —為主，N03—含量約為陰離子總量的56%-76%。NO3 —可在植物體內(nèi)累積，最終通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，過(guò)量的NO3 —在體內(nèi)易被還原成為NO2 —，NO2 —可使細(xì)胞組織缺氧，嚴(yán)重時(shí)使人窒息死亡。因此治理設(shè)施栽培中過(guò)量的硝態(tài)氮已成為設(shè)施農(nóng)業(yè)一項(xiàng)重要且刻不容緩的工作。目前針對(duì)我國(guó)設(shè)施栽培大棚鹽潰化，采取了一些治理措施，如灌水洗鹽，土壤改良劑法和半腐熟有機(jī)肥法等方法。雖然這些方法有不少優(yōu)點(diǎn)，但也存在很大的不足:灌水洗鹽會(huì)把硝態(tài)氮淋洗到地下，不僅造成土壤氮素的損失，而且還污染地下水；土壤改良劑法成本比較高，易產(chǎn)生二次污染；半腐熟有機(jī)肥法存在肥效慢，使用不便等缺點(diǎn)。
[0005]與傳統(tǒng)治理次生鹽潰化方法相比，生物法尤其是微生物法有許多突出優(yōu)點(diǎn)，比如繁殖快，適應(yīng)力強(qiáng)；不產(chǎn)生二次污染，不給周圍環(huán)境增加負(fù)擔(dān)；成本低，見(jiàn)效快，操作方便，易管理等。微生物法處理次生鹽潰化土壤中硝態(tài)氮的關(guān)鍵便是篩選出具有高效硝態(tài)氮同化能力的菌株。隨著我國(guó)設(shè)施栽培的發(fā)展和土壤次生鹽潰化問(wèn)題的日益突出，利用微生物處理土壤中積累的硝態(tài)氮具有著廣闊的應(yīng)用前景。
[0006]經(jīng)過(guò)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，中國(guó)專利文獻(xiàn)號(hào)CN103203356，
【公開(kāi)日】2013_07_17，公開(kāi)了一種“次生鹽潰化土壤微生物菌劑及其制備、用途”，該技術(shù)涉及所述次生鹽潰化土壤微生物菌劑由巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)NCT-2CGMCC N0.4698和載體組成，所述載體為稻麥稻桿和葡萄糖。制備時(shí)，每升巨大芽孢桿菌菌液中加入0.5~0.6kg稻麥稻桿，0.3~0.4kg的葡萄糖，混合均勻，即得所述次生鹽潰化土壤微生物菌劑；每毫升所述巨大芽孢桿菌液的含菌量為2.0X IO8~2.32X IO8個(gè)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明測(cè)定了 NCT-2對(duì)設(shè)施次生鹽潰化土壤修復(fù)前后土壤全氮的含量從而證實(shí)了 NCT-2是一株硝態(tài)氮同化菌；本發(fā)明還證實(shí)NCT-2對(duì)發(fā)酵液中硝態(tài)氮的快速降解轉(zhuǎn)化和對(duì)次生鹽潰化大棚的良好修復(fù)效果；此外，本發(fā)明還證實(shí)NCT-2具有溶磷能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種硝酸鹽同化細(xì)菌及其在修復(fù)設(shè)施次生鹽潰化土壤中的應(yīng)用，對(duì)環(huán)境中硝態(tài)氮有很強(qiáng)的同化轉(zhuǎn)化能力，對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)；此外，還具有溶磷能力。因此該菌在修復(fù)設(shè)施栽培次生鹽潰化土壤和制備微生物肥料上有廣闊的應(yīng)用前景。[0008]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0009]本發(fā)明涉及一種硝酸鹽同化細(xì)菌NCT-2的量產(chǎn)方法，包括:菌種保藏、菌種活化和菌種擴(kuò)大培養(yǎng)，其中:
[0010]菌種保藏:采用-80°c低溫冷凍保藏，將硝酸鹽同化細(xì)菌NCT-2處于冷凍狀態(tài)，以降低其代謝作用以達(dá)到保藏目的。
[0011]菌種活化:將冷凍保藏下的硝酸鹽同化細(xì)菌NCT-2放入馬鈴薯培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，直至獲得數(shù)量足夠、活力旺盛的培養(yǎng)物(0D_為1.5-2.0)。
[0012]菌種擴(kuò)大培養(yǎng):將活化后的培養(yǎng)物接種到馬鈴薯培養(yǎng)基中，于28°C、150rpm搖床環(huán)境下培養(yǎng)兩天。
[0013]所述的硝酸鹽同化細(xì)菌NCT-2為巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium),現(xiàn)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)微生物研究所。保存日期為2011年3月21日，保藏編號(hào)為CGMCCN0.4698。
[0014]所述的硝酸鹽同化細(xì)菌NCT-2的穩(wěn)定單菌落通過(guò)從土壤中采集樣品，經(jīng)過(guò)多次馴化后，再在固體培養(yǎng)基接種并培養(yǎng)獲得。
[0015]所述的土壤取自上海市崇明島設(shè)施栽培12-15年的大棚。
[0016]所述的多次是指:每次馴化周期為7天，馴化后以10%接種量重新接入液體培養(yǎng)基中，反復(fù)馴化4次。
[0017]所述的馴化是指:將土壤樣品接種于液體培養(yǎng)基中，于25°C、120rpm條件下培養(yǎng)7天。
[0018]所述的培養(yǎng)基為無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基。
[0019]所述的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基的組分及含量為:葡萄糖15g/L，KC11.0g/L,MgSO4.7H200.5g/L, CaCl20.0Olg/L, FeSO4.7H200.lg/L, KH2PO40.5g/L,余量為超純水，pH 為
6.8_7.2 ο
[0020]所述的接種為:取100 μ L馴化的菌懸液涂布于無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基中，于25°C恒溫恒濕培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2d，待菌落長(zhǎng)出，挑取菌落于無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上劃線，直至獲得單菌落；再將獲得的單菌落，在以硝態(tài)氮為唯一氮源的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上連續(xù)傳代6次，直至獲得形態(tài)穩(wěn)定的純培養(yǎng)。
[0021]所述的固體培養(yǎng)基通過(guò)在無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中將加入15-18g/L瓊脂制備得到。
[0022]所述的馬鈴薯培養(yǎng)基通過(guò)以下方式制備得到:稱取去皮馬鈴薯200g，煮沸20min后過(guò)濾得浸汁，加入蔗糖20g，補(bǔ)超純水至體積為IL ;然后調(diào)節(jié)pH為7.0-7.2，最后加熱至121/C環(huán)境下滅菌20min。技術(shù)效果
[0023]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)包括:
[0024]1、本發(fā)明細(xì)菌對(duì)硝態(tài)氮進(jìn)行同化，轉(zhuǎn)化為自身細(xì)胞組分，不會(huì)造成氮素流失，可以用來(lái)處理土壤中硝酸鹽積累，進(jìn)一步提高了氮的利用率，不會(huì)對(duì)自然界氮循環(huán)和環(huán)境造成任何危害；
[0025]2、本發(fā)明細(xì)菌對(duì)發(fā)酵液中硝態(tài)氮5d內(nèi)降解效率高可達(dá)75%以上，轉(zhuǎn)化率高；
[0026]3、本發(fā)明細(xì)菌對(duì)Ν03_Ν含量為IOOmg.kg—1的土壤中硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化率可達(dá)98%以上，且成本低，操作方便，易于產(chǎn)業(yè)化化實(shí)施；
[0027]4、本發(fā)明細(xì)菌對(duì)硝態(tài)氮耐受濃度高，可承受并處理硝態(tài)氮濃度為1600mg.kg—1的土壤；
[0028]5、本發(fā)明細(xì)菌具有解磷能力，可用于制備微生物菌肥。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0029]圖1本發(fā)明中巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)的菌落形態(tài)(a)和菌體形態(tài)(b)圖；
[0030]圖2本發(fā)明中巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium) 16SrDNA序列電泳圖；
[0031]圖3本發(fā)明中巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)最適生長(zhǎng)曲線；
[0032]圖4本發(fā)明中巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)對(duì)發(fā)酵液中硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化效率圖；
[0033]圖5本發(fā)明中巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)菌劑對(duì)模擬次生鹽潰化土壤中硝酸鹽的轉(zhuǎn)化效率圖；
[0034]圖6本發(fā)明中巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)菌劑對(duì)模擬次生鹽潰化土壤中全氮含量影響圖；
[0035]圖7本發(fā)明中巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)菌劑對(duì)輕度次生鹽潰化土壤中硝酸鹽的轉(zhuǎn)化效率圖；
[0036]圖8本發(fā)明中巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)溶磷效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0037]下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
實(shí)施例1
[0038]巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)NCT-2的分離和純化
[0039]土壤樣品取自上海市崇明島設(shè)施栽培12-15年的大棚中，取樣后將樣品充分混合。采用搖瓶富集培養(yǎng)，取土樣IOg接種于IOOmL富集培養(yǎng)基中，于25°C、150rpm條件下培養(yǎng)。每隔7d,以接種量的10%重新接入富集培養(yǎng)基中，反復(fù)馴化4次。
[0040]取100 μ L馴化菌懸液涂布于無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基中，于25°C恒溫恒濕培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2d，待菌落長(zhǎng)出，挑取菌落于無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上劃線，直至獲得單菌落；再將獲得的單菌落，在以硝態(tài)氮為唯一氮源的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上連續(xù)傳代6次，直至獲得形態(tài)穩(wěn)定的純培養(yǎng)。NCT-2菌落形態(tài)和菌體形態(tài)如圖1所示。
[0041]所述的富集培養(yǎng)基采用無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基，無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基成分為葡萄糖15g，KC11.0g, MgSO4.7Η200.5g, CaCl20.0Olg, FeSO4.7Η200.lg, KH2PO40.5g，超純水 lOOOmL，調(diào)節(jié) pH 為 6.8-7.2。
[0042]所述的固體培養(yǎng)基為無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中再加入15-18g/L瓊脂即得。
實(shí)施例2
[0043]巨大芽抱桿菌(Bacillusmegaterium)NCT-2 的鑒定
[0044]通過(guò)對(duì)巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium) 16SrDNAV3區(qū)序列的對(duì)比，結(jié)合該菌株對(duì)Biolog GP2平板95種不同碳源的利用情況,鑒定該菌株為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)。
[0045]命名巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)為NCT-2,于2011年3月21日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC N0.4698。
實(shí)施例3
[0046]巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)NCT-2最適生長(zhǎng)曲線的確定
[0047]經(jīng)測(cè)定，確定該菌最適培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH為7.0，將活化細(xì)菌接種到LB液體培養(yǎng)基，接種量為培養(yǎng)基體積的1.0%，于35°C、150rpm搖床上培養(yǎng)，在培養(yǎng)時(shí)間為1、2、4、6、8、10、12、14、18、22、26、30、34、38小時(shí)，分別測(cè)定菌液OD6tltl值，繪制曲線如圖3所示。
實(shí)施例4
[0048]巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)NCT-2對(duì)發(fā)酵液中硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化能力測(cè)定。
[0049]以10%的接種量將NCT-2菌接入無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)硝態(tài)氮濃度為200mg/kg ο于25°C、120rpm振蕩培養(yǎng)，并分別于第0、1、3、5天，測(cè)定培養(yǎng)基中剩余硝態(tài)氮量。結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)基中硝態(tài)氮濃度不斷降低，在第I天下降速度最快，到第3天逐漸緩慢，到第5天基本達(dá)到平穩(wěn)。該菌在5天內(nèi)對(duì)硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化率可達(dá)78%。
實(shí)施例5
[0050]模擬巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)NCT-2菌劑對(duì)設(shè)施次生鹽潰化土壤修復(fù)效果
[0051]將供試土壤自然風(fēng)干后磨碎過(guò)2mm篩。試驗(yàn)硝態(tài)氮設(shè)A、B、C3個(gè)濃度處理(O、IOOmg.kg—1和200mg.kg—1)，每盆裝0.5kg 土，每個(gè)處理麥桿粉(g.kg—1)和NCT-2菌液(ml.kg—1)添加量分別為0+0 (CK)、15+0 (MF)、15+20 (MF+JY)三組處理，共9個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。硝酸鹽、麥桿粉末和NCT-2菌液均在裝盆時(shí)一次性施入，室溫放置并保持土壤水分在20%左右。第0、3、6、9、12、15天取樣備用。
[0052]所述的麥桿粉用小型粉碎機(jī)粉碎后過(guò)2mm篩后收集備用。
[0053]所述的NCT-2菌液是將活化的菌株接種到馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，28°C、150rpm搖床培養(yǎng)兩天至菌液0D_約為2.0后 停止發(fā)酵。
[0054]將土壤浸提液適當(dāng)稀釋后用AA3流動(dòng)注射儀測(cè)定土壤中硝態(tài)氮含量變化。如圖5，與對(duì)照相比，MF、MF+JY 土壤中硝態(tài)氮顯著減少。結(jié)果表明當(dāng)添加硝態(tài)氮為IOOmg.kg-1時(shí)，15d內(nèi)MF+JY組硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化率高達(dá)98.4%，比MF組高15.7%，比空白高95%以上；當(dāng)添加硝態(tài)氮為200mg.kg-1時(shí)，15d內(nèi)MF+JY組硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化率為45.5%，比MF組高15.3%，比空白高40%以上。結(jié)果表明，MF+JY組可以更好地降低土壤硝態(tài)氮且硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化菌NCT-2能促進(jìn)土壤中硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化。
[0055]全氮的測(cè)定則是土壤浸提液經(jīng)高氯酸消煮后，適當(dāng)稀釋再進(jìn)行測(cè)定。在不同的硝態(tài)氮添加濃度水平下，CKq、CK、MF和MF+JY 土壤全氮含量無(wú)明顯差異(如圖6)。一般而言，土壤中硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化有以下兩種途徑:1)通過(guò)微生物的固化作用將土壤硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為自身生物有機(jī)氮，再通過(guò)氨化作用轉(zhuǎn)化為氨，最后轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮供植物吸收利用；2)通過(guò)反硝化作用將硝態(tài)氮還原為NO、N2O或N2釋放到大氣中。土壤總氮含量在實(shí)驗(yàn)前后沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明土壤中硝態(tài)氮可能轉(zhuǎn)化為微生物組分而并沒(méi)有發(fā)生反硝化作用。
實(shí)施例6
[0056]巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)NCT-2菌劑對(duì)輕度次生鹽潰化大田土壤修復(fù)效果
[0057]隨機(jī)選取輕度鹽潰化的齊新園藝場(chǎng)內(nèi)的3個(gè)大棚(每個(gè)0.5畝)，每個(gè)大棚設(shè)3壟重復(fù)，每壟設(shè)四個(gè)取樣點(diǎn)。種植作物為華強(qiáng)青梗菜，I號(hào)棚施用NCT-2固體菌劑，2號(hào)棚施用市售生物有機(jī)肥，3號(hào)大棚不施用任何肥料作為空白對(duì)照。
[0058]取原始土樣和小青菜收獲后土樣測(cè)定硝態(tài)氮含量。結(jié)果如圖7所示，NCT-2菌劑處理后土壤中硝態(tài)氮含量降低54.87%，生物有機(jī)肥處理后土壤中硝態(tài)氮降低31.68%，對(duì)照組硝酸鹽含量與原始土樣差異不大。相比于對(duì)照組與生物有機(jī)肥組，NCT-2菌肥可在更大程度上降低硝酸鹽的含量。
[0059]所述的NCT-2固體菌劑是通過(guò)將菌液與麥桿粉以1:1 (V:W)的比例混合，28°C靜置發(fā)酵Id獲得，并保證活菌數(shù)≤2.0X 109cfu/g。
實(shí)施例7
[0060]巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)NCT-2溶磷能力測(cè)試
[0061]將NCT-2菌接種于該磷酸鈣培養(yǎng)基上，4d后觀察平板是否產(chǎn)生透明溶磷圈，觀測(cè)結(jié)果記錄如圖8。經(jīng)測(cè)定，水解圈直徑⑶與菌落直徑⑷平均比值D/d為5.4。一般而言，溶磷能力大小與D/d的值成正比。
[0062]所述的磷酸鈣培養(yǎng)基組分及含量為:葡萄糖10g/L，(NH4)2SO40.5g/L, NaCl0.2g/L，KC10.2g/L, MgSO4.7H200.002g/L, MnSO4.H2O0.002g/L, FeSO4.7H200.5g/L,酵母提取物 5g/L，Ca3 (PO4) 22g/L，瓊脂 18g/L ，其余為超純水，pH 為 7.0。
[0063]結(jié)果表明，NCT-2菌可以溶解 難溶的無(wú)機(jī)鹽。該菌可將土壤中難溶的無(wú)機(jī)磷鹽轉(zhuǎn)化為易被植物吸收的可溶性磷肥。這樣可以減少了化肥的投入，不僅降低了成本，而且避免了大量化肥投入帶來(lái)的土壤板結(jié)和次生鹽潰化，具有巨大的環(huán)境效益。
【權(quán)利要求】
1.一種硝酸鹽同化細(xì)菌NCT-2的量產(chǎn)方法，其特征在于，包括:保藏、活化和擴(kuò)大培養(yǎng)，其中: 菌種保藏:采用-80°C低溫冷凍保藏，將硝酸鹽同化細(xì)菌NCT-2處于冷凍狀態(tài)，以降低其代謝作用以達(dá)到保藏目的； 菌種活化:將冷凍保藏下的硝酸鹽同化細(xì)菌NCT-2放入馬鈴薯培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，直至獲得數(shù)量足夠、活力旺盛的培養(yǎng)物(0D_為1.5-2.0)； 菌種擴(kuò)大培養(yǎng):將活化后的培養(yǎng)物接種到馬鈴薯培養(yǎng)基中，于28°C、150rpm搖床環(huán)境下培養(yǎng)兩天； 所述的硝酸鹽同化細(xì)菌NCT-2為巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium),該硝酸鹽同化細(xì)菌NCT-2保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號(hào)為 CGMCC N0.4698。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的硝酸鹽同化細(xì)菌NCT-2的穩(wěn)定單菌落通過(guò)從土壤中采集樣品，經(jīng)過(guò)多次馴化后，再在固體培養(yǎng)基接種并培養(yǎng)獲得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，所述的土壤取自上海市崇明島設(shè)施栽培12-15年的大棚。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，所述的多次是指:每次馴化周期為7天，馴化后以10%接種量重新接入液體培養(yǎng)基中，反復(fù)馴化4次。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，所述的馴化是指:將土壤樣品接種于液體培養(yǎng)基中，于25°C、12 0rpm條件下培養(yǎng)7天。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或4或5所述的方法，其特征是，所述的培養(yǎng)基為無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征是，所述的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基的組分及含量為: 葡萄糖 15g/L, KC11.0g/L, MgSO4.7Η200.5g/L, CaCl20.0Olg/L, FeSO4.7H200.lg/L,KH2PO40.5g/L，余量為超純水，pH 為 8-7.2。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，所述的接種為:取100μ L馴化的菌懸液涂布于無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基中，于25°C恒溫恒濕培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2d,待菌落長(zhǎng)出，挑取菌落于無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上劃線，直至獲得單菌落；再將獲得的單菌落，在以硝態(tài)氮為唯一氮源的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上連續(xù)傳代6次，直至獲得形態(tài)穩(wěn)定的純培養(yǎng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求2或8所述的方法，其特征是，其特征是，所述的固體培養(yǎng)基為無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中再加入15-18g/L瓊脂即得。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的馬鈴薯培養(yǎng)基通過(guò)以下方式制備得到:稱取去皮馬鈴薯200g，煮沸20min后過(guò)濾得浸汁，加入蔗糖20g，補(bǔ)超純水至體積為IL ；然后調(diào)節(jié)pH為7.0-7.2,最后加熱至121°C環(huán)境下滅菌20min。
【文檔編號(hào)】B09C1/10GK103525739SQ201310512371
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年10月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月25日
【發(fā)明者】周培, 馮?，|, 支月娥, 時(shí)唯偉, 衛(wèi)星, 毛亮, 孫玉靜, 羅艷青, 唐冬 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)