專利名稱：：基于還原異α酸蛋白激酶調節(jié)的癌癥治療的制作方法
技術領域：
：0021本發(fā)明主要涉及對蛋白激酶調節(jié)敏感的癌癥進行治療或抑制所需要的方法和混合物。具體地講，本發(fā)明涉及多種方法和混合物，它們通常利用從酒花或植物類家族成員金伶^t羼或它的混合物中分離出的化合物或衍生物。
發(fā)明內容信號轉導受體一般分為三類。第一類受體是滲入質膜并具有某些內在酶活性的受體。這類受體的典型代表包括酪氨酸激酶(例如PDGF、胰島素、EGF和FGF受體)、酪氨酸磷酸酶(例如T細胞和巨噬細胞的CD45[集束行列式-45]蛋白質)、鳥苷酸環(huán)化酶(例如鈉尿肽受體)和絲氨酸/蘇氨酸激酶(例如活化素和TGF-P受體)。具有內在酪氨酸激酶活性的受體自身可發(fā)生磷酸化作用，還可磷酸化其它底物。具有內在酪氨酸激酶活性的許多受體通過磷酸化作用與其它的信號級聯(lián)中的蛋白質發(fā)生相互作用。這些其它的蛋白質包括氨基酸序列域，它與首次在c-Src原癌基因中發(fā)現(xiàn)的域同源。這些域稱為SH2域。009SH2域中的蛋白質與RTK或受體相關酪氨酸激酶相互作用會使該蛋白質酪氨酸磷酸化。由此引起的磷酸化會(積極地或消極地)改變活性。SH2中具有內在酶活性的若干蛋白質包括磷脂酶C-y(PLC-力、原癌基因c-Ras相關的GTP酶激活蛋白(rasGAP)、磷脂酰環(huán)己六醇-3-激酶(PI-3K)、蛋白酪氨酸磷酸酶-1C(PTP1C)以及其它蛋白酪氨酸激酶(PTK)Src家族成員。。。在B細胞中，可以通過接頭蛋白(例如BCAP、CD19或Gabl)的磷化作用激活BCR刺激的PI3K，該激活產生用于PI3K調節(jié)亞基P85的結合位點。由許多IgG受體傳遞的信號需要Syk和PI3K的參與活動，并需要募集它們的集群受體點。在中性粒細胞和單核細胞中，有人建議將PI3K與FcgRIIA上磷酸化的免疫受體酪氨酸活化基序序列直接結合，作為受體的PI3K募集機理。而最近一篇文章報道了Syk和PI3K之間的分子直接相互作用[MoonKD，等乂，Syk蛋白質酪氨酸激酶和磷脂肌醇3激酶間直接相互作用的分子基礎J.Biol.Chem.280,No.2,IssueofJanuary14,pp.1543-1551，(2005)]。大量研究表明COX-2活性抑制劑可減少PGE2的生成，并能有效緩解慢性關節(jié)炎(例如RA)患者的疼痛。既然COX-1禾BCOX-2參與組織(胃腸和心血管系統(tǒng))的重要修復工作，COX抑制酶活性制劑的副作用就更令人擔憂。所以，必須設計一個安全的、長期的治療方法以緩解患者的疼痛。既然通過Syk、PI3K、p38、ERK1/2和NF-kB依賴性通路，COX-2和iNOS合成信號誘導劑，那么這些通路抑制劑會對自身免疫疾病尤其對RA患者關節(jié)發(fā)炎和變形病癥產生療效。在RAW264.7老鼠巨噬細胞炎癥模型內抑制PGE2生成的篩選過程中，發(fā)現(xiàn)酒花衍生物p異a酸(RIAA)。在本發(fā)明中，我們對RIAA能否直接抑制COX酶活性和/或它能否抑制COX-2和iNOS的誘導作用進行研究。我們發(fā)現(xiàn)RIAA并不直接抑制COX酶活性，而是抑制NF-kB驅動的酶誘導，這引導我們對RIAA是否是一種激酶抑制劑進行研究。我們發(fā)現(xiàn)RIAA同時抑制Syk和PI3K，這使我們可測定針對各種自身免疫性疾病患者進行的試點研究的療效。。越來越多的證據證實GSK-3在調節(jié)骨骼肌葡萄糖轉運活動中存在副作用。例如，使用選擇性GSK-3抑制劑，針對抗胰島素的嚙齒類動物進行的急性治療，可提高全身胰島素敏感度，并可增強作用在肌肉葡萄糖轉運上的胰島素效應。使用特定GSK-3抑制劑，針對抗胰島素、前期糖尿病肥胖的Zucker大鼠進行的慢性治療，可提高口服耐藥量和全身胰島素敏感度，改善血脂異常并增強骨骼肌中IRS-1依賴性胰島素信號傳導。這些結果有力地證明在肌肉中選擇性使用GSK-3可對肥胖相關的胰島素抵抗進行有效干預治療。圖5描繪了塞來昔布(圖A)和MgRIAA(圖B)對RAW264.7細胞中分析得到的LPS誘導的COX-2介導的PGE2生成的直接酶抑制作用。PGE2的測量單位用pg/ml表示。誤差帶表示標準偏差(n=8)。圖11示意性描繪了相對于溶劑對照，利用.會合Jt處樣品糾909提取物或作為陽性對照的吲哚美辛和曲格列酮處理3T3-L1脂肪細胞的非極性脂肪含量。誤差帶表示95%的置信區(qū)間(單尾)。圖15是代表性條形圖，描述了利用卩引哚美辛或i^^t厲樣品H4909提取物誘發(fā)TNFa處理過的成熟性3T3-L1細胞的脂聯(lián)素分泌。圖中給出的數值是相對于溶劑對照的百分比；誤差帶表示95%的置信區(qū)間。*與僅用TNFa處理的結果有著顯著性差異(p<0.05)。。所以，這顯示Aktl在確定尺寸大小方面發(fā)揮重要作用，而Akt2參與胰島素信號傳導。對下面表3給出的86個選擇性激酶，THIAA制劑分別在濃度大約為1、10、25和50ug/ml時，對激酶抑制(報告中以抑制百分比表示)測得的劑量反應。同樣根據下面表4給出的實施例1中的方案，金合歡屬制劑在濃度大約為1、5和25|ig/ml對230個以上的選擇性蛋白激酶測得的劑量反應。異cx-酸(IAA)、六氫異oi-酸、p酸和黃腐粉制劑在濃度大約為10、25和50(ig/ml時針對86個選擇性激酶分別測得的劑量反應結果分別顯示在以下表5-8中。表2AmgRho對所選蛋白激酶的劑量反應效應(以抑制百分比表示％)<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>表2BmgRho對所選蛋白激酶的劑量反應效應(以抑制百分比表示％)<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>EphBl15317719653ErbB41241257556Fer85412412Fes11213411657FGFRl109110110111FGFRl(V561M)971069192FGFR2126115587FGFR3112943916FGFR4122938358Fgr12112011047Flt41261198531IKKa139140140102JNKlcd71118118107JNK2a2949798101JNK3121785844KDR106107104126Lck9710512588LKB1145144140140MAPK299109112102Pim-l1031004444Pim陽21031098322PKA(b)10477320PKA1041019025PKBfi1171022733PKBa1031014950PKBy1071099933PKCp卯909387PKC肌9910710364PKCa110111112102PKCy86957762PKCS97938487PKCs76888890PKC;93100107103PKCri8299103卯PKC993958690PKQ779093134PRAK99812133PrKX92763238Ron1201109742Ros1051059493Rskl101874831Rsk2腦854014SGK981037977SGK21171104518Syk99935517TBK11011008256Tie210911510032TrkA10765301534<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>CKl(y)77323PAK21037916CKlyl517-4PAK34353CK1丫23151PAK4999158CKly349160PAK56962CK1S60156PAK677221CK2157162128PAR-lBa70208CK2ct2958351PASK13611426cKit(D816H)2772PDGFRB59199cKit(D816V)1119141PDGFRa(腦2V)60115cKit946824PDGFRa10010651cKit(V560G)4950PDGFRa(V561D)59117cKit(V654A)3083PDK1975716CLK333166PhKy2676216c-RAF105畫87Pim-l4492CSK74191Pim-2821710cSRC99120PKA(b)104527DAPK1907212PKA998516DAPK275314PKBB619-IDCAMKL210710677PKBa98678DDR2849145PKBy86505DMPK105106116PKCn908144DRAK1924011PKCBI108112磨DYRK2835525PKCJ3II714730eEF-2K1039759PKCa753432EGFR76266PKC724727EGFR(L858R)99401PKCS1059463EGFR(L861Q)90491PKCe1089059EGFR(T7卯M)93297PKCC34102EGFR(T7卯M,L858R)74304PKCt!1079984EphAl106439PKC9883121EphA294826PKCi666963EphA3948350PKD2106雨81EphA455126PKG1B31165EphA51002810PKGla41187EphA7103806Plk3114106115EphA81138419PRAK181835EphBl116638PRK292358EphB2302PrKX491416EphB3109351PTK5999588EphB430113Pyk2卯459ErbB46180Ret23-l-2FAK106782RIPK21039564Fer10613428ROCK-I959054Fes1437443ROCK-II1006639FGFR1125263ROCK-II915939FGFR1(V561M)92502Ron3224FGFR273-2-5Ros954035FGFR32131Rse3514036FGFR43075Rskl4594Fgr78187Rskl7585FItl41121Rsk26043Flt3(D835Y)6515-lRsk378317Flt376163Rsk4712512Flt41232SAPK2a99106106Fms947319SAPK2a(T106M)11010680Fyn2351SAPK2b9910077GRK5969181SAPK31087940GRK611711794SAPK41038657GSK3B1354SGK89342GSK3a521SGK210236Hck8729-2SGK31039634HIPK111011262SIK115285HIPK2927124Snk939661HIPK31069256SRPK156146IGF陽1R14812241SRPK237154IKKB3063STK3310094641IKKa12086USyk223IR121123129TAK110510186IRAKI988549TA02976425IRAK41179547TBK137512IRR917028Tie297677Itk12111448TrkA2042JAK2836923TrkB2200JAK32471TSSK189105JNKlal11811075TSSK297292JNK2a299106102VRK2988867JNK352233WNK2967521KDR906018WNK31109838Lck929325Yes63333LIMK110810453ZAP-70571910LKB112612298ZIPK1048128表5IAA對所選蛋白激酶的劑量反應效應(以抑制百分比表示％)激酶1ug/ml5ug/ml25ug/ml50ug/mlAbl(T3151)1041198456ALK492110113AMPK1221218649Aurora-A1031066120Bmx901251084337<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>MSKl991036661MSK295904445MSSKl90785252p70S6K94988458PAK391662111PAK510110810659PAK698109106102PhKy210310910266Pim-l1041067746Pim-21011088860PKA(b)1041158612PKA11010299106PKBJ31041105776PKBa981039172PKBy10310810476PKcmi10310310259PKCa1061048946PRAK99913818PrKX94929158Ron11711311340Ros1011088475Rskl961017248Rsk2951017636SGK10211010096SGK29912810560Syk8592537TBK11001058286Tie210112411340TrkA1121392420TrkB971119059TSSK29911210975ZIPK1021029573表6朋IAA對所選蛋白激酶的劑量反應效應(以抑制百分比表示％)激酶1ug/ral5ug/ml25ug/ml50Abl(T3151)1131098438ALK4123121108AMPK13313013787Aurora-A1111076427Bmx10310210644BTK110105676139CaMKI14815114056CDKl/cyclinB1181159885CDK2/cyclinA1091128260CDK2/cyclinE83847088CDK3/cydinE11511910885CDK5/p25101946951CDK5/p351101037368CD認cyclinD311912411783CDK9/cyclinTl106966640CHK1127124140144CHK211911711082CKl(y)102102100CKlyl1051036830CKly299994549CKly3104982822CK151101158956cKit(D816H)1161099168CSK100簡109112cSRC10511410337DAPK194673727DAPK272584647DRAK111011910369EphA210612711568EphA81331098974EphBl154162200164ErbB41411228514Fer90621320Fes13712611181FGFR2116120717Fgr12212711891Flt41351168858Fyn1041198281GSK3B138845110GSK3a89825818Hck93997377HIPK210310510098HIPK311712111829IGF-1R138173207159IKKJ51231169879IR1299510581IRAKI142140152120JAK31041036190Lyn1151135680MAPK1100885567MAPKAP-K2104997129MAPKAP-K31111099977MINK107102114123MSK1105101586940<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表7B酸對所選蛋白激酶的劑量反應效應(以抑制百分比表示％)<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>MSSKl95826167p70S6K89956944PAK3103401611PAK5103998144PAK6103988283PhKy21081037940Pim-l104975721Pim-21031016873PKA(b)120104513PKA10310510228PKBIi1141085652PKBa98958058PKBy10510410152PKCIiII10710510049PKCa1081049854PRAK105812411PrKX93866829Ron1081199844Ros1071038098Rskl103996917Rsk29896568SGK10911198100SGK2123113840Syk92816216TBK11101038078Tie211010010679TrkA97665318TrkB1051008611TSSK211210910362ZIPK1051108537表8黃腐粉對所選蛋白激酶的劑量反應效應(以抑制百分比表示％)激酶1ug/ml5ug/ml25ug/ml50ug/mlAbl(T3151)126115164ALK41161007149AMPK1221139081Aurora國A832738Bmx10897220BTK10957220CaMKI1428334CDKl/cyclinB118103461843CDK2/cyclinA10796576CDK2/cyclinE8286189CDK3/cyclinE101100378CDK5/p2597972487CDK5/p351031024144CDK6/cyclinD311079237CDK9/cyclinTl1101074531CHK1121126142149CHK22532CKl(y)9163379CKlyl101795026CKly292483012CK1丫398512215CK1S75321612cKit(D816H)944514CSK11311393100cSRC92502721DAPK1113854920DAPK2105884526DRAK11334019-5EphA212411312152EphA8103922919EphBl92122175161ErbB4132855227Fer5520101Fes13110610226FGFR211689364Fgr10136100Flt47410114Fyn104664218GSK31i12099253GSK3a1028111-4Hck8535170HIPK2110987537HIPK31061029059IGF-1R107113129139IKKB1451186144IR12010897103IRAKI1291048136JAK310484175Lyn974042MAPK191641917MAPKAP-K2999568MAPKAP-K310099177MINK421057MSK111492319MSK212661819MSSK147117544<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>00146THIAA對許多檢測激酶活性抑制呈現(xiàn)劑量依賴性關系，在濃度為1、5、25禾口50嗎/ml時對激酶FGFR2的抑制百分比分別為7%、16%、77%和91%。在濃度為1、5、25和50pg/ml時對激酶FGFR3(0%、6%、61%和84%)和TrkA(24%、45%、93%和94%)觀測到類似的結果。參見表3。，這里以引用的方式并入本文。實驗須在三個不同的時間段重復進行三次。每種劑量的抑制率均采用三組獨立實驗后取平均值的方法獲得，并可用以計算已報道的半數抑制濃度。/^^J^^fZZi/z^V^^^7必邏一RAW264.7細胞(TIB-71)，從美國組織細胞培養(yǎng)收集中心(Manassas,VA)購得，并按例4中所述進行傳代培養(yǎng)。在溫度為37°C，C02濃度5%的培育條件下培育一整夜后，將培養(yǎng)基吸出并代之以200^不加FBS或青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液。用LPS剌激RAW264.7細胞，并過夜培養(yǎng)以誘導COX-2的表達。施加LPS-刺激18小時后，將測試材料加入到培養(yǎng)基中。60分鐘后再加入鈣離子載體A23187。將測試材料溶解在二甲亞砜中以制成250倍稀釋的原液。先向1ml畫EM培養(yǎng)液中加入4|al這種250倍稀釋后的測試材料制劑，隨后向細胞板上的八個孔中針對測試材料所需的不同劑量添加20(^1的這種溶液。30分鐘后，抽取培養(yǎng)基上清液作為樣品并進行PGE2測定。半數抑制濃度是根據例4中描述的兩組獨立實驗所得的四個濃度中的最小值進行計算的。00165]#/定一本實驗采用商業(yè)化的非放射性流程對PGE2進行定量分析(CaymenChemical,AnnArbor,MI)，實驗完全按照例4中所述生產商的推薦流程進行，未進行任何更改。以及該實驗室關于A549細胞系歷史數據3.2pg/ml(95%置信區(qū)間=0.55-0.19)相一致。當向受LPS刺激的RAW264.7細胞中加入以下COX-2誘導物時，RIAA和IAA對PGE2只產生與劑量相關的普通抑制作用。測試材料濃度增加1000倍時，所觀察到的RIAA和IAA的抑制率僅分別增加14%和10%。劑量反應曲線斜率的變緩導致RIAA(36mg/ml)和IAA(>1000mg/ml)的IC50值(表10)均在mg/ml范圍內。實驗中觀察到的對以上三個對數單位劑量反應的極小變化，表明在此細胞基活性分析中所觀察到的酒花衍生物PEG2抑制影響，可能只是對細胞的一個次要影響，而不是對COX-2的酶活性的直接抑制作用。圖4A和圖4B分別描述了RIAA和IAA(白色柱)以及本例(灰色柱)的劑量反應數據。加樣順序造成的影響非常明顯，該結果支持了RIAA和IAA不是C0X-2酶直接抑制劑的推斷?？磥?1)在所有經過沐//抑制PGE2生物合成能力評估測試的天然產品中，酒花材料具有最高的抗炎活性；(2)基于RIAA和IAA對C0X-2誘導的抑制形式，可知它們似乎并不是C0X-2酶的直接抑制劑；(3)RIAA和IAA對C0X-2的選擇性似乎是基于對C0X-2表達的抑制，而非C0X-2的酶抑制。該選擇性不同于塞來昔布，塞來昔布的選擇性是基于酶的分化抑制。表10施加LPS刺激過夜后加入測試材料時，RIAA和IAA在RAW264.7細胞中的半數抑制濃度。<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>用LPS刺激RAW264.7細胞，并過夜培養(yǎng)以誘導COX-2的表達。施加LPS-刺激18小時后，將試驗材料加入到培養(yǎng)基中，60分鐘后再加入鈣離子載體A23187。30分鐘后，抽取培養(yǎng)基上清液作為樣品并進行PGE2測定。半數抑制濃度是根據例4中描述兩組獨立實驗中分別在四個濃度下重復測定八次所得的最小值進行計算的。實施例6酒花化合物及其衍生物并不是A549肺上皮細胞中環(huán)氧化酶的直接抑制劑。潘應一A549(人肺上皮)細胞購自美國組織細胞培養(yǎng)收集中心(Manassas,VA),并根據供應商提供的使用說明進行傳代培養(yǎng)。將這些細胞在37°C,5%C02的培養(yǎng)環(huán)境中進行常規(guī)培養(yǎng)，所用培養(yǎng)液RPMI1640含10%FBS、50單位青霉素/ml、50pg鏈霉素/ml、5mM丙酮酸鈉和5mML-谷氨酸鹽。實驗當天，收集以指數生長的細胞，并用不含血清的RPMI1640培養(yǎng)液沖洗。進行，未作任何修改，該流程也稱WHMA-COX-2方案。簡而言之，在植入A549細胞24小時后，加入白細胞介素-lfi(10ng/ml)以誘導C0X-2的表達。24小時后，用不含血清的RPMI1640培養(yǎng)液出沖洗細胞。隨后，將溶于二甲亞砜和不含血清的RPMI中的測試材料加入孔中以獲得25、5.0、0.5和0.05pg/ml的最終濃度。每個濃度重復兩次。向對照孔中加入與測試孔中液體等體積的二甲亞砜。60分鐘后，將A23187(50)uM)加入孔中以釋放花生四烯酸。30分鐘后從孔中取出25pl培養(yǎng)基進行PGE2測定。001761用肉眼評估細胞的存活率，結果所有被測試的化合物在其最高濃度下均未觀察到明顯毒性。培養(yǎng)基上清液中PGE2測定及報道如前面實施例4所述，PGE2合成半數抑制濃度(IC50)的計算如前面實施例4所述。00177^"菜一在所有已測試的劑量下，該試驗方案未能得到任何酒花提取物或衍生物的半數有效濃度。由于該方案要求對C0X-2的表達刺激應在加入測試化合物之前進行，我們相信測試材料未能抑制PGE2合成的原因是它們的作用機理是抑制COX-2同工酶的表達，而不是直接活化。既然一些直接抑制作用是通過WHMA-C0X-2方案觀察到的，該流程似乎不適合對酒花或酒花衍生物的抗炎特性進行評估。實施例7酒花衍生物抑制塵螨過敏原對A549肺上皮細胞中PGE2生物合成的活化001781眾^^"^—本實施例中所用的酒花及酒花衍生物如實施例1所述，(1)a酒花(1%a酸，AA);(2)香型酒花0E(10%P酸和2%異構a酸)；(3)異構酒花(異構a酸，IAA);(4)P酸溶液(P酸BA);(5)金牌六氫異構酒花(六氫異構a酸，HHIAA);(6)還原異構酒花(還原異構a酸，RIAA);(7)四氫異構酒花(四氫異構a酸，THIAA)。其它所有化學品均從實施例4所述的供應商處購得。測試材料的最終濃度為10pg/ml，塵螨過敏原應在測試材料加入60分鐘后加入。^^、過^^"分靡一務^:、艚是美國室內的塵螨。教4、麟在室溫及75%濕度條件下詞育，所用詞料是PurinaLaboratoryChow(RalstonPurina,Co,St.Louis,M0)和弗萊希曼氏顆粒狀干酵母(StandardBrands,Inc.NewYork,NY)以1:1的比例進行配制的。當活螨蟲從培養(yǎng)基中遷出時，將其從培養(yǎng)瓶中吸出冷凍殺死，然后制成干粉并在0%濕度條件下貯存。在室溫下用水萃取螨塵的過敏原成分。將500mg螨粉加入到裝有5ml水(1:10w/v)的15ml的圓錐形離心管(VWR，Rochester,NY)中，振搖1分鐘并在室溫中靜置過夜。次日，將水相用540.2)nm—次性注射式過濾器(Nalgene，Rochester,NY)過濾。濾液稱為螨塵過敏原，用于在A549肺上皮細胞中對PGE2生物合成進行誘導測試。^度伊遂'一在緩沖液E中配制細胞提取物(50mMHEPES，pH7.0;150mM氯化鈉；1%tritonX-100;1mM原釩酸鈉；抑肽酶5ng/ml;抑肽素A1叫/ml;亮肽素5|^g/ml;苯甲基黃酰氟1mM)。簡而言之，用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)潤洗細胞2次后加入緩沖液E。將細胞刮入一個干凈的試管中，接著以每分鐘14，000轉的轉速在4°C條件下離心作用10分鐘，并將上清液取出作為全部的細胞提取液。用細胞提取物(50網)在預制的4%-20%三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽標準凝膠(Bio-Rad公司，赫拉克勒斯，美國加州)中做電泳，直至染色泳移前沿到達膠底部有5誦處為止。使用Bio-Rad公司(赫拉克勒斯，美國加州)的半干系統(tǒng)將蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上。然后用5%的干奶粉在室溫下對膜進行1小時的沖洗和封閉。用第一抗體在室溫下培育1小時后，再用第二抗體在室溫培育1小時。通過將等體積的魯米諾/增強劑溶液和穩(wěn)定的過氧化物溶液在室溫下培育5分鐘的方法，使用PierceBiotechnology公司(羅克福德，美國伊利諾斯州)的SuperSignalWestFemto最大敏感性基質便可進行化學發(fā)光。用冷卻的CCDKodak(羅徹斯特，美國紐約州)IS1000成像系統(tǒng)拍攝免疫印記的圖像。使用Kodak軟件運行密度儀。用免疫印記檢測法對C0X-2和iN0S蛋白表達的百分比進行評估。用LPS刺激20小時后觀察COX-2的表達。同對照溶劑DMS0相比，可觀察到使用MgRIAA時COX-2蛋白的表達下降了55%(圖6)。NF-kB的特異性抑制劑小白菊內酯，會抑制22.5%的蛋白表達，而PI3-激酶抑制劑會使C0X-2表達降低約47%(圖6)。此外，用MgRIAA施加20小時的LPS刺激后，能觀察到iNOS的蛋白表達下降了73%(圖7)。實施例10NF-kB的核轉位與DNA結合AF-"5-力yV力##合一核提取物的準備基本上根據Dignam等人的描述進行[NuclAcidsRes11:1475-1489,(1983)]。簡單來講，先將細胞用冷PBS液潤洗兩次，然后加入緩沖液A(10mM冊PES，pH7.0;1.5mMMgCl2;10mMKC1;0.1%NP-40;抑肽酶5嗎/ml:胃酶抑素A1嗎/ml;亮肽酶素5嗎/ml;氟化磺酰甲苯1mM)并進行15分鐘的冰浴。然后將細胞刮入一個干凈的試管中，并循環(huán)冷凍與解凍三次。在4°C下10000xg加速度下離心5min所得上清液層即為細胞質的組分。將剩余物重新懸浮在緩沖液C(20mMHEPES，pH7.0;1.5mMKC1;420mMKC1;25%甘油；0.2MEDTA;抑肽酶5|ug/ml;胃酶抑素Al嗎/nil;亮肽酶素5ng/ml;氟化磺酰甲苯lmM)中，并進行15分鐘的冰浴。在4°C下10000xg加速度下離心5min后收集上層核提取物組分。細胞核提取物的NF-kBDNA結合分析使用ActiveMotif公司(卡爾斯巴德，美國加州)的TransAMNF-icB試劑盒并按照生產商的使用說明來完成。如圖8所示，TransAM測試盒檢測96孔細胞板上結合到共有序列上的NF-kB的p50亞基。然后測定蛋白質濃度(Bio-Radassay公司)并重復分析10核蛋白提取物。重復進行核提取物(10蛋白質)的分析并將結果以圖9所示的圖形表現(xiàn)出來。LPS(1pg/ml)的刺激會使NF-kB基因結合率增加兩倍。用LY294002(—種PI3激酶抑制劑)進行處理會導致NF-kB結合率降低，這和以往文獻的報道相符。小白菊內酯也能導致NF-kB結合率顯著降低，這點和我們的預期是一致的。使用MgRIAA時也能觀察到NF-KB的結合率大幅降低。以劑量反應的方式也能觀察到這一影響。NF-kB結合力的降低可能導致包括COX-2、iNOS以及TNFci在內的目標基因翻譯活性降低。，人們還可對試劑的胰島素增敏和甘油三酸脂沉降能力進行研究。。噻唑烷二酮類，如曲格列酮和吡格列酮這類藥物，已經顯示出在脂肪細胞中能選擇性刺激脂肪生成活性，從而得到更大的脂肪分解胰島素抑制或將脂肪酸釋放到血漿中[Yamauchi,T.，J.Kamon，等乂，雜合過氧化物酶體增殖激活受體Y(PPARy)缺乏和PPARy激動劑提高胰島素抵抗性的機制JBiolChem276(44):41245-54，(2001);0akes，N.D.，P.G.Thalen,等乂，噻唑烷二酮類藥物增加血漿-脂肪組織FFA交換容量并增強胰島素介導游離脂肪酸體系控制的有效性，Diabetes50(5):1158-65，(2001)]。該行為使其他組織可利用的游離脂肪酸更少[Yang,W.60S.,W.J.Lee，^X.體重減輕會增加脂源型抗炎性蛋白質、脂聯(lián)素的血漿水平。JClinEndocrinolMetab86(8):3815-9，(2001)]。因此，肌肉和肝臟中游離脂肪酸的胰島素減感效應將由于噻唑垸二酮處理的結果而減弱。這些錄^/結果己在臨床上得到證實[Boden,G.不飽和脂肪酸在胰島素抵抗和非胰島素依賴型糖尿病發(fā)病機理中的作用。Diabetes46(1):3-10，(1997);St咖voll,M.與H.U.HaringGlitazones:臨床效果與分子機制.AnnMed34(3):217-24,(2002)]。。用PBS(磷酸鹽緩沖液，Mediated!)潤洗單層細胞，然后用10%甲醛固定10min。將三份0.6%油紅0/異丙醇原液與兩份水混合得到油紅0工作液，并將己固定的細胞在其中染色1小時，然后水洗一次去除過量的染料。用異丙醇從細胞中提取出染色油滴，并使用光譜光度測量技術在540nm波長下對其進行定量分析(MEL312eBIO-KINETICSREADER,Bio-TekInstruments公司，文奴斯基，美國佛蒙特州)。實驗材料和作為陽性對照的吲哚美辛以及曲格列酮的實驗結果，以540nm下溶劑的相對吸光度表示。。簡而言之，第6日，將細胞在含有0.5%牛血清白蛋白(BSA)無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)三個小時，接著利用1胰島素/ml加溶劑或1嗎胰島素/ml加測試材料進行處理。將曲格列酮溶解在二甲基亞砜中以獲得5、2.5、1.25和0.625pg/ml的濃度。.會洽^t富提取物測試濃度為50、25、12.5和6.25pg/ml。24小時后，對培養(yǎng)基上清液取樣以進行脂聯(lián)素測定。利用測試材料對細胞進行分化和處理的完整流程概述于圖12中。以確定表觀米氏常數和最大速度。利用自變量v/[S]替換{相對脂聯(lián)素分泌/[濃度]},而利用應變量(v)替換{相對脂聯(lián)素分泌}，生成一個y=mx+b的關系式。利用Y截距方法估算相對溶劑對照的脂聯(lián)素分泌最大值，而利用斜率的負值計算測試材料必要的半最大值處的脂聯(lián)素分泌濃度。錄菜一在抗胰島素3T3-Ll細胞中，利用2.5嗎/ml的濃度，相對溶劑對照2.44倍的最大刺激，作為陽性對照的曲格列酮所有測試濃度增加了脂聯(lián)素分泌(圖13)。50和25pg/ml濃度的會^Jt厲增加了脂聯(lián)素分泌，分別為溶劑對照的1.76倍和1.70倍。雖然#_^^^的兩個濃度均不等于利用曲格列酮測定的脂聯(lián)素分泌最大值，但是它們可與濃度為1.25和0.625pg/ml曲格列酮作用相當。碧—菜一TNFa較大(p<0.05)降低了脂聯(lián)素分泌，相對于溶劑對照而言，在濃度在10和2ng/ml情況下成熟3T3-L1細胞的降低比分別為65%和29%，而濃度在0.5ng/ml時對脂聯(lián)素分泌并沒有顯著影響(圖15)。TNFa濃度為10和2ng/ml時，在所有的測試劑量上與僅施加TNFa相比，吲哚美辛的加入提高了(p<0.05)脂聯(lián)素分泌，但并不能將脂聯(lián)素分泌恢復到溶劑對照的水平上。TNF(i濃度為10ng/ml時，加入.會會^t^進行處理與吲哚美辛相比，對脂聯(lián)素分泌產生一個類似的、很微弱的增加。在逐漸增加的四種劑量上，會會Jt^和d引哚美辛之間對脂聯(lián)素分泌的差值分別為14、20、32和41%。既然」會合^t羼和吲哚美辛劑量間的倍數是相同的，這些結果表明在上述生理濃度TNFa存在的情況下，在重新恢復3T3-Ll細胞脂聯(lián)素分泌水平方面，吲哚美辛與金會^t虜中的活性物質相比具有更高的效力。m/[脂聯(lián)素]F。，*來自TNFa溶劑反應的顯著增加(p〈0.Q5)。一使用5/8"金屬鉆頭在標準功率下對大片i合^t^乂Z茶心材樣品貼669(每片重量在5-10克之間)進行低速鉆孔。然后將刨花收集到研缽中，在液氮冷凍下研磨至細粉狀。然后將粉末通過一個250微米的篩網進行篩分以得到大約10g的自由流動精細粉末。表14用于3T3-L1脂聯(lián)素分析的-會^^^17L芬提取物樣品描述<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>1胃液組成為2.90gNaCl、7.0ml濃縮HC1水溶液、3.2g胃蛋白酶(800-2500活性單位/mg)，并加入1000ml水進行稀釋。最終pH為1.2。對于本提取操作，胃液-心材懸浮液要在40°C下保溫一小時，隨后在"^"^^^移除胃液。然后將剩余殘留物溶解在甲醇中，通過0.45微米聚四氟乙烯注射式過濾器進行過濾并在真空中濃縮。002411將粉末分配到六個琥珀色玻璃定量瓶中(150mg/瓶)，然后在40°C下用2ml表14中所列溶劑提取大約IO小時。提取結束后，將心材/溶劑懸浮液進行離心分離(轉速5800xg下離心IO分鐘)。隨后將離心分離所得上清液部分通過0.45微米聚四氟乙烯注射式過濾器過濾到各自的琥珀色玻璃瓶中。每個樣品都要在真空中進行濃縮。如表7所示，二甲亞砜從」會^^tl7L茶植物心材中提取的原料最多，而三氯甲烷提取的量最少。所有提取物樣品均在50、25、12.5和6.25(ag/ml濃度下進行測試。漠逸y—這些實驗中用到的是實施例11中所述的3T3-L1小鼠成纖維細胞模型。實驗所用的標準化學藥品如實施例11和13所述。將3T3-L1脂肪細胞用濃度為10ng/ml的TNFa按實施例13所述方法進行處理。如實施例13詳述在第6天取出培養(yǎng)基上清液并對脂聯(lián)素進行分析。一金^^t^7L茶樣品#5669根據以下流程進行提取將堿性異丙醇溶液，(含有1.5NNaOH的1%(體積比)異丙醇溶液，)加入到裝有約50mg干燥金會^t^乂L芬心材粉末#5669的50ml試管中。然后將樣品簡單混合處理，超聲降解30分鐘，再離心分離一個小時使剩余固體材料成粒。隨后將上清液用0.45微米濾紙進行過濾。實驗中用到的堿性異丙醇pH為8.0，收集液的pH為7.0。將過濾后的清液部分在^^3^^進行干燥后得到白色固體。該樣品稱為干燥堿性提取物。，m/[脂聯(lián)素]T,對照"值>1.11與TNFa對照(p<0.05)存在顯著性差異。實施例18通過金洽Jt^樣品水提取物的二甲亞砜可溶部分誘導TNFa-處理的3T3-L1脂肪細胞內白細胞介素-6分泌的減少。。人們已經在包括細菌和病毒感染、外傷、自身免疫性疾病、惡性腫瘤以及代謝綜合征等若干病理狀態(tài)中觀察到這種血清濃度水平的提高[Arner，P.II型糖尿病中的胰島素抵抗——脂肪素的作用。CurrMolMed.;5(3):333-9,(May2005)]。sm/[脂聯(lián)素]T,付IL-6指數=[IL-6測試-IL-6對照]/[IL-6醫(yī)。-IL-6對照〗*這與TNFa對照有顯著差異(p<0.05)。漠—在這些實驗中，采用實施例U中所述的3T3-L1小鼠成纖維細胞模型。所用的標準化學藥品以及統(tǒng)計程序如實施例11和12所述。IL-6如實施例18所述進行分析。76樣品#4909會以劑量相關的方式增加脂聯(lián)素分泌(表18)。在僉會^t^乂L芬濃度僅為6.25Hg/ml時，通過減少IL-6分泌顯示出其抗炎作用，曲格列酮在濃度為5.00和1.25^g/ml時具有促炎性，在另外兩個濃度下未觀察到任何效果。使用曲格列酮時，抵抗素分泌以劑量依賴的方式增加；然而，-會^^^^乂乙芬以同樣的劑量依賴方式降低抵抗素的表達。w;/[脂聯(lián)素]a島素對照卞卞IL-6指數=[IL-6測試]/[IL-6胰島素對照]卞忖抵抗素指數=[Resistin測試]/[Resistin胰島素對照j*指數值表示平均值±95%置信區(qū)間，它是根據方差分析的剩余均方計算而來。大于或小于胰島素對照±95%置信區(qū)間的數值與p<0.05時存在顯著差異。實施例20使用源自酒花的植物化學成分增加脂肪細胞中的脂肪生成。。替換{相對脂聯(lián)素分泌/[濃度]}，而利用應變量{v}替換{相對脂聯(lián)素分泌}，生成一個y=im+b的關系式。利用Y截距方法估算相對溶劑對照的80脂聯(lián)素分泌最大值，而利用斜率的負值計算測試材料必要的半最大值處的脂聯(lián)素分泌濃度。002691君菜一在抗胰島素3T3-U細胞中，陽性對照曲格列酮在濃度為2.5pg/ml時能最多能將脂聯(lián)素分泌提高到溶劑對照的2.44倍(圖19)。相對于溶劑對照，所有測試的酒花植物化學成分均證實對脂聯(lián)素分泌有增強作用，其中異a酸能顯著生成比曲格列酮更高的脂聯(lián)素分泌(為對照的2.97倍)。實驗中觀察到測試的四個試劑中，異a酸、p異a酸、六氫異a酸和四氫異a酸可產生最大脂聯(lián)素分泌的最大劑量為5pg/ml。對于黃腐酚、酒花殘留物和六氫類蛇麻酮，脂聯(lián)素分泌增加的最大值分別在其濃度為1.25、25和12.5)ag/ml時觀察到。黃腐酚、p異a酸和酒花殘留物的最大相對脂聯(lián)素表達與曲格列酮相當，而六氫異a酸、六氫類蛇麻酮和四氫異a酸的最大相對脂聯(lián)素表達則比曲格列酮低而比對照高。表20分別從v截距和Hofstee點斜率估算最大脂聯(lián)素分泌量及半數最高脂聯(lián)素分泌所需的測試材料濃度。最大脂聯(lián)素分泌[i]半數最高分泌量時測試材料的濃度[Hg/ml]<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>[1]根據四種測試濃度的Hofstee點線性回歸分析估算[2]忽略一個異常數據，使用其它三個濃度估計劑量反應測試/[脂聯(lián)素]膀島素對照忖IL-6指數^[IL-6測試]/[IL-6胰島素對照J*指數值是平均值±95%置信區(qū)間，它是根據方差分析的剩余均方計算而來。對脂聯(lián)素或脂聯(lián)素/IL-6來說，數值<0.7或>1.3與胰島素對照有顯著差異；而對IL-6來說，數值<0.77或>1.23與胰島素對照有顯著差異。弁與胰島素對照pO.05有顯著差異。模至y—在這些實驗中，采用實施例11和13中所述的3T3-L1小鼠成纖維細胞模型?；旌显谒袆┝肯戮@示協(xié)同作用，而金合歡屬RIAA[10:1]在10和5.0(ig/ml濃度下顯示協(xié)同租用，并在其它任何測試濃度下均未發(fā)生拮抗。金合歡屬IAA[10:1]混合物在兩個中等濃度下也呈現(xiàn)協(xié)同作用，并且未發(fā)生拮抗。而金合歡屬IAA[5:1]在濃度為50pg/ml時具有協(xié)同作用，在濃度為5.0pg/ml時發(fā)生拮抗。00284類似地，所有混合物在一個或多個測試濃度下對增加脂聯(lián)素分泌均顯示協(xié)同作用(表23)。金合歡屬IAA[10:1]混合在所有劑量下均顯示協(xié)同作用，而金合歡屬RIAA[5:1]和金合歡屬RIAA[10:1]在三種劑量下顯示協(xié)同作用，而在一種濃度下發(fā)生拮抗。金合歡屬IAA[5:1]混合在濃度為1.0pg/ml時具有協(xié)同作用，在濃度高于10pg/ml時發(fā)生拮抗。表22抗胰島素3T3-1模型中金會^t^乂乙芬和酒花衍生物誘發(fā)的脂肪生成反應的觀測值和預期值。脂肪生成指數卞測試材料濃度[pg/ml觀測值預期值結果金合歡屬/RIAA[5:1]1501,050.98協(xié)同作用87<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>卞脂肪生成指數-[OD〗測試/[OD]廳)對照。O95%置信區(qū)間上限是1.03，最小顯著性差值=0.03。2)95%置信區(qū)間上限是1.03，最小顯著性差異=0.03。3)95%置信區(qū)間上限是1.07,最小顯著性差值=0.07。4)95%置信區(qū)間上限是1.02,最小顯著性差值=0.02。表23TNFa/3T3-1模型中1會-^#乂乙芬和酒花衍生物誘發(fā)的脂聯(lián)素分泌觀測值和預期值。<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>金合歡屬/RIAAno:"2501,291.11協(xié)同作用101.070.95協(xié)同作用5.00.941.06拮抗作用1.01.030.94協(xié)同作用金合歡屬/IAA[IO:I]2501.280.82協(xié)同作用101.121.07協(xié)同作用5.01.110.99協(xié)同作用1.01.301.05協(xié)同作用t脂聯(lián)素指數=[脂聯(lián)素]纖/[脂聯(lián)素]，。對照，1)95%置信區(qū)間上限是1.07，最小顯著性差值=0.07。2)95%置信區(qū)間上限是1.03，最小顯著性差異=0.03。會合^^f乂Zz芬和酒花衍生物p異a酸或異ct酸的混合顯示具有協(xié)同作用，只有極少的混合會在提高脂肪細胞中的脂質成分并增加脂肪細胞中脂聯(lián)素的分泌上顯示拮抗作用。實施例25酒花衍生物在脂多糖/3T3-Ll脂肪細胞模型中的抗炎活性。100286一在這些試驗中，采用實施例11和13中所述的3T3-L1小鼠脂肪細胞模型。IL-6指數卞抑制百分比％二甲亞砜對照一0.09*91*LPS對照±95%置信區(qū)間一1.00±0.300吲哚美辛5.000.47*53*曲格列酮10.00.31*69*吡格列酮5.000.37*63*p異a酸1.250.63*37*異a酸1.250.61*39*阿司匹林25.00.61*39*水楊酸50.00.52*48*布洛芬0.6250.46*54+塞來昔布2.500.39*61*將測試材料與100ng/ml的LPS—起加入到D53T3-L1脂肪細胞中。隔日，對培養(yǎng)基上清液取樣進行IL-6測定。所有數值均如下所示對LPS對照取指數。表中所示的濃度代表能提供IL-6分泌最大抑制的劑量，那些小于0.70的數值顯著(p<0.05)低于LPS對照。卞IL-6指數=[IL-6測試-IL-6x]/[IL-6LPS-IL-6對照]*這與LPS對照有顯著差異(p0.05)。表25酒花衍生物和選用的非甾體抗炎藥物對LPS/3T3-L1脂肪細胞中脂聯(lián)素分泌的最大刺激。測試材料濃度[Hg/ml]脂聯(lián)素指數卞刺激百分比％二甲亞砜對照一1.24LPS對照±95%置信區(qū)間—1.00吲哚美辛2.501.09*9曲格列酮0.6251.15*15吡格列酮1.251.12*12p異a酸0.6251.17*17異a酸0.6251.20*20阿司匹林1131.02NS水楊酸1730.96NS布洛芬0.6251.22*22塞來昔布5.001.05NS卞脂聯(lián)素指數=[脂聯(lián)素]測試/[脂聯(lián)素]LPS對照91*數值大于1.07表示與LPS對照有顯著差異(p<0.05)。NS二與LPS對照無明顯差異。實施例26在TNFa/3T3-l模型中金^^t^J7^茶或酒花衍生物與姜黃素或黃腐酚混合時的協(xié)同效應。測試/[脂聯(lián)素]TNF。對照1)95%置信區(qū)間從0.961到1.049，最小顯著性差異=0.049。實施例27共軛亞油酸與酒花衍生物p異a酸混合在抗胰島素3T3-L1脂肪細胞模型中對脂肪生成的體外協(xié)同作用。冴/試眾合激i!必邏一實驗中用到的標準化學藥品如實施例11所述。為計算脂肪生成指數，3T3-L1脂肪細胞須在發(fā)生分化前按實施例11中所述進行處理。粉狀CLA購自LipidNutrition(美國伊利諾斯州Channahon)公司，其藥品為同分異構體c9tl1和tl0cl2的1:1混合物。CLA及CLA:RIAA的5:1的混合物在10、5、1.0和1.0pg/ml四個濃度下進行測試。為了計算預期的脂肪生成指數，將RIAA在10、l.O和O.1pg/ml三個濃度下按前述方法進行測試。^"菜—RIAA與CLA混合可協(xié)同增加甘油三酯含量。在所有劑量下均觀測到協(xié)同作用(表27)。1501.261.15協(xié)同作用101.161.06協(xié)同作用5,01.161.10協(xié)同作用1.01.171.06協(xié)同作用卞脂肪生成指數=[OD]測試/[OD]斷。對照。1)95%置信區(qū)間上限是1.05，最小顯著性差異=0.05。實施例28酒花植物化學成分抑制TNFct-處理后的3T3-L1脂肪細胞中NF-kB的活性。003001#^〃一在這些實驗中，采用實施例11中所述的3T3-LI小鼠成纖維細胞模型。900301]邀^^i,^^7必潘一在3T3-L1脂肪細胞分化后將其置于后分化培養(yǎng)基中再培養(yǎng)40天。標準化學藥品、培養(yǎng)基以及酒花化合物RIAA和黃腐酚如實施例13和20所述。在2.5和5.0pg/ml濃度下，對酒花衍生物和陽性對照吡格列酮進行測試。測試材料應在核提取物制備3小時和24小時前的1小時加入，隨后用TNFa進行處理。00302^"^T慮疫級/^^/定一在3T3-L1脂肪細胞分化后將其置于生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)40天。使用ActiveMotif(美國加州卡爾斯巴德鎮(zhèn))公司的TransAMNF-kB試劑盒對核NF-kBp65進行測定，未做任何修改。試劑盒中的Jurkat核提取物源自在含有50ng/mlTPA(佛波醇，12-豆蔻酸，13醋酸鹽)和0.5鈣離子載體A23187的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞，該細胞在收集前在37°C下培養(yǎng)2小時。00303]蛋白質分析一核蛋白使用ActiveMotif熒光蛋白定量試劑盒進行定量分析。測試化學藥品及處理一二甲雙胍購自Sigma公司(美國密蘇里州圣路易斯市)。將測試材料在分化的當天加入二甲亞砜中，之后每2天添加一次，直至成熟期結束(第6/7天)。加入作為陽性對照的曲格列酮使其最終濃度達到4.4Hg/ml。將測試材料二甲雙胍、金合歡屬兒茶樣品#5669以及二者1:1(w/w)混合物在50pg/ml的濃度下進行測試。分化后的3T3-L1細胞用0.2%的油紅0染色，染色后的油滴用異丙醇溶解并在530nm下用分光光度法進行定量分析。結果顯示溶劑對照中完全分化細胞的相對甘油三酯含量。提出。003101—會會^^f乂^芬提取物具有很強的脂肪生成能力，可將3T3-L1細胞中甘油三酯含量提高32%(圖23)，從而獲得1.32的脂肪生成指數。由于脂肪生成指數為0.79，單獨使用二甲雙胍并不能促進脂肪生成。實驗觀測到二甲雙胍/金會^t^乂L芬提取物的混合物的脂肪生成指數為1.35。二甲雙胍/會^^t,乂L芬提取物的脂肪生成指數為98，該值落在期望值95%置信區(qū)間上限的2%以外，因而表明有協(xié)同作用。,對照。1)95%置信區(qū)間上限是1.02，最小顯著性差異=0.02。2)95%置信區(qū)間上限是1.05，最小顯著性差異=0.05。實施例31。-異a酸和二甲雙胍在TNFa/3T3-Ll脂肪細胞中的沐//協(xié)同作用IL-6指數卞抑制百分比％說明二甲亞砜對照一0.16——TNFa對照±95%置信區(qū)間一1.00±0.07*0—曲格列酮1.00.6634—RIAA1.00.7624—二甲雙胍500.7822—二甲雙胍/1RIAA500.6832協(xié)同作用二甲雙胍100.7822二甲雙胍/1嗎RIAA100.8614拮抗作用二甲雙胍5.00.964—二甲雙胍/1嗎RIAA5.00.919無效果二甲雙胍1.00.919二甲雙胍/1ngRIAA1.00.5644協(xié)同作用在指定濃度下將測試材料連同10ng/ml的TNFa加入到D53T3-Ll脂肪細胞中。隔日，對培養(yǎng)基上清液取樣進行IL-6測定。所有值均對TNFa對照取指數。卞IL-6指數=[IL-6溯試-IL-6対照]/[IL-6t^-IL-6對照〗*數值小于0.93顯著(pO.05)低于TNFa對照。實施例32測試化合物對癌癥細胞錄》/增殖的影響^"茲一在RL95-2子宮內膜癌細胞模型(AKT激酶過度表達)、HT-29(組成性表達C0X-2)模型和SW480(組成性表達激活的AKT激酶)腸癌細99胞模型中檢測本發(fā)明的測試化合物對癌細胞增殖的抑制效果。簡而言之，將耙細胞植入96孔組織培養(yǎng)盤中使其不斷生長直至接近匯合。然后如實施例4所述用不同劑量的測試化合物將細胞處理72小時，并用CyQuant(Invitrogen公司，美國加州卡爾斯巴德)商用熒光分析儀測定細胞相對增殖情況。00322]潛菜一用10嗎/ml的MgDHIAA(mgRho)、IAA、THIAA、TH-HHIAA(THIAA和HHIAA的1:1混合物)、Xn(黃腐酚)、LY(LY249002，PI3K抑制劑)、EtOH(乙醇)、alpha(a酸混合物)以及p(p酸混合物)對RL95-2細胞進行72小時處理。對細胞增殖的相對抑制情況如圖24所示，相對于DMSO溶劑對照，黃腐酚的抑制程度要高于50%。圖25和26所示是不同濃度的RIAA和THIAA對HT-29和SW480癌細胞各自的劑量反應結果。RIAA和THIAA對HT-29細胞系的半數抑制濃度分別為31和10^M，對SW480細胞系的半數抑制濃度分別為38pM和3.2nM。實施例33金會^t^yg羅和酒花衍生物對KK-Ay鼠糖尿病模型中的體外降血糖作用。——會^歡虜y^羅樣品#5659如實施例14所述，而所用酒花衍生物p-異a酸、異a酸和黃腐酚如實施例20所述。金合歡屬尼羅、RIAA和IAA每天按100rag/kg進行給藥，而XN按20mg/kg進行給藥。此外，將—會^100右羅和RIAA、IAA、以及XN以5:1和10:1配制混合物并按每天100mg/kg的劑量給藥。結果—在3天的治療期間，對照鼠的非空腹血糖含量升高2.6%，而胰島素含量降低6.7%。羅格列酮、金會^t^y&羅、XN:Acacia[1:5]混合物、XN:Acacia[1:10]混合物、Acacia:RIAA[5:1]混合物、黃腐酚、Acacia:IAA[5:1]混合物、異a酸和p-異a酸均可降低非空腹血糖，而對胰島素無效果。Acacia:RIAA[10:1]混合物和Acacia:IAA[10:1]混合物對血糖和胰島素均無效果(表30)。本實驗使用C57BLKS/Jm+/m+L印rdb(db/db)雄鼠對測試材料降低空腹血糖或胰島素濃度的能力進行分析。這一品系小鼠由于缺乏起作用的瘦素受體而對瘦素產生抗性。血漿胰島素從第10天到第14天這段時間開始升高，血糖從4到8周開始升高。在測試時(9周)動物體重顯著增加50±5g，并呈現(xiàn)胰島肥大的跡象。003301一陽性對照二甲雙胍和羅格列酮連續(xù)三天每天分別按300mg/kg和.Omg/kg的劑量給藥。i會Jt^yg^7樣品#5659、酒花衍生物和它們的混合物如前文所述進行給藥?；旌衔镒钣行?，使血清胰島素水平降低21%，而二甲雙胍只能使胰島素濃度降低17%，噻唑烷二酮類羅格列酮使其降低15%。金合歡屬RIAA[5:1]混合物的反應要高于兩者中的單獨成分，從而可顯示協(xié)同作用。單獨使用j會會^t^^芕不能減少血清葡萄糖或血清胰島素，而RIAA減少血清胰島素的程度與二甲雙胍相近。在剩余測試材料中，金合歡屬IAA[10:1]混合物還可有效降低血清胰島素濃度。00333]在db/db鼠2型糖尿病模型中，由p-異a酸造成的血清胰島素含量快速下降以及由黃腐酚造成的血糖含量下降，表明它們在治療與胰島素不敏感癥和高血糖癥有關的人類疾病方面具有潛在的臨床療效。此外，p-異a酸和金合歡屬兒茶的5:1混合物在db/db鼠糖尿病模型中呈現(xiàn)協(xié)同效應。p-異a酸、黃腐酚和金合歡屬:RIAA[5:1]成分對2個獨立的糖尿病動物模型和3個錄^/模型的陽性反應表明它們可用于降低血糖或提高胰島素敏感性的臨床表現(xiàn)中。表31金會^t^yg羅和酒花衍生物對db/db糖尿病鼠體內非空腹血糖和胰島素的效應。劑量t葡萄糖胰島素測試材料[mg/kg-每天[預治療百分比％][預治療百分比％]對照(臨界值)-103.6(98.4)94.3(84.9)金合歡屬RIAA10099.679.3#1二甲雙胍30067.6#83.3#p-異a酸100102.383.抑金合歡屬IAA100104.384.4#1羅格列酮1.083.0#84.7#XN:金合歡屬[1:10]100101.591.1i^歡虜y^羅樣品100100.491.9#5659金合歡屬RIAA100101.693.51異構ct酸100100.895.8黃腐酚2097.8#101.6XN:金合歡屬[1:5]1100104.1105.6金合歡屬IAA[5:1]1100102.7109.1卞對每組中的5個動物連續(xù)3天每天施加l次劑量。弁顯著低于各自的對照(p<0.05)。實施例35在糖尿病db/db鼠模型中金會歡虜yg羅和酒花衍生物比值的沐A優(yōu)化本實施例證實MgRho和THIAA這兩種酒花化合物在類風濕性關節(jié)炎模型中減少炎癥和關節(jié)炎癥狀的療效，目前己知這種炎癥和癥狀部分由許多蛋白激酶介導。計算空腹胰島素和血糖的HOMA得分。^"茲一將大腸癌細胞系接種在96孔細胞板上，密度為3xl03個細胞/孔，過夜培養(yǎng)以使細胞貼壁生長。在每個濃度下對測試材料重復測定8次。72小時后，利用CyQUANT細胞增殖檢測試劑盒分析細胞中活細胞總數。然后計算相對于二甲亞砜溶劑對照所觀察到的活細胞減少百分數。塞來昔布和RIAA或THIAA混合物的細胞毒性效應的預期值用下列關系式進行估算1/[T]c=X/[T]x+Y/[T]y，式中T=毒性，其代表生長受抑制或被殺死的細胞所占分數，X、Y是測試混合物每種成分的相對分數，且X+Y=l。圖示觀察值是在95%置信區(qū)間內所得8個觀察值的平均數。當估計的百分數下降落于相應觀察分數的95%置信區(qū)間之下時，就表示具有協(xié)同作用。本實驗旨在確定口服劑量后THIAA是否經新陳代謝并可探測。003641方法一前劑量血清提取后，5粒軟膠囊(188mgTHIAA/每粒軟膠囊)以游離酸形式釋放的940mgTHIAA(PRTetra獨立軟膠囊。OGft2210KP-247.LotC42331111)被吸收，緊接著用水果酸奶容器收集。除了脫咖啡因咖啡外，在服下THIAA后四個小時內并沒有其它食物被吸收。每隔45分鐘取一次樣并置入沒有凝塊催化物的血清分離管中。讓樣品在室溫下凝結45分鐘，并在4°C下1800xg加速度下離心10分鐘。然后加入含有0.5%HOAc的0.9ml的MeCN的0.3ml血漿并在-20°C下放置45-90分鐘。此混合物在4°C15000xg加速度下離心10分鐘。離心作用后出現(xiàn)明顯的兩相；從0.6ml的上相中取樣以進行HPLC分析。利用加樣確定回收率，該值大于95%。/#菜一該結果顯示在圖44-46中。圖44顯示攝入940mgTHIAA后在血清中測定的THIAA隨時間的變化情況。圖45顯示攝入THIAA225分鐘后，血清中測定的THIAA各水平相對于測定的體外THIAA水平的情況。圖46顯示通過CYP2C9*1產生的THIAA新陳代謝的變化情況。[00366現(xiàn)在本發(fā)明已充分描述完畢，顯而易見本領域的技術人員在不背離隨附權利要求的精神和范圍內均可對本發(fā)明做出變更和修改。權利要求1.用以治療哺乳動物中對其所需蛋白激酶調節(jié)敏感的癌癥方法，其中所述方法包括使用有效治療劑量的還原異α酸給哺乳動物用藥。2.權利要求1的方法中，還原異a酸選自以下組群中二氫異律草酮、二氫異類律草酮、二氫聚律草酮和p異a酸。3.權利要求1的方法中，進行調節(jié)的蛋白激酶選自以下組群中Aurora-A、DAPK2,、FGFR3、FGFR4、GSK3B、GSK3a、MAPK1、MAPKAP-K2、MSK2、MSSK1、PI3Ke、PI3KS、Rse、Syk以及TrkA。4.權利要求1的方法中，對激酶調節(jié)敏感的癌癥選自以下組群中膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結腸癌、肺癌、淋巴癌、黑素瘤、前列腺癌、和甲狀腺癌。5.哺乳動物中對其所需蛋白激酶調節(jié)敏感的癌癥治療混合物，其中混合物包括有效治療劑量的還原異a酸，這里有效治療劑量調節(jié)與癌癥相關的蛋白激酶。6.權利要求5的混合物中，還原異a酸從以下組群中進行選擇二氫異律草酮、二氫異類律草酮、二氫聚律草酮和p異a酸。7.權利要求5的混合物中，還包括藥用可接受的輔料，其可從以下組群中選擇涂料、等滲和吸收延緩劑劑、粘結劑、粘合劑、潤滑劑、崩解劑、著色齊U、調味劑、甜味劑、吸收劑、去污劑以及乳化劑。8.權利要求5的混合物中，該混合物還包括選自以下組群的一種或多種成分抗氧化劑、維生素、礦物質、蛋白質、脂肪以及碳水化合物。全文摘要本發(fā)明公開了用于癌癥治療的蛋白激酶調節(jié)的化合物和方法。本發(fā)明公開的化合物和方法基于酒花中常見的還原異α酸。文檔編號A61K35/00GK101505770SQ200780030528公開日2009年8月12日申請日期2007年6月20日優(yōu)先權日2006年6月20日發(fā)明者杰弗里·布蘭德,琳達·帕西奧雷蒂,約翰·G·巴比士,維拉·康達,艾米·杰尼·霍爾,艾紐·德賽,馬修·L·特里普申請人:麥特普羅泰歐米克斯有限公司