本發(fā)明屬于卷煙煙葉醇化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株用于降解煙葉中果膠的芽孢桿菌屬SMXP-58菌株及其在煙葉醇化中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

煙草是我國的重要經(jīng)濟(jì)作物之一。實(shí)際制備卷煙產(chǎn)品時(shí)，未經(jīng)陳化的煙葉含有較多大分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、果膠、纖維素、淀粉和高級脂肪酸等，其在燃燒過程中，會產(chǎn)生令人不舒服的氣味，因而不宜直接吸食，需要經(jīng)過一定時(shí)間的醇化處理后才能用于生產(chǎn)應(yīng)用。

煙葉結(jié)構(gòu)中，以α-1，4糖苷鍵聚合形成的聚半乳糖醛酸為基本結(jié)構(gòu)的果膠，和纖維素一樣是重要的細(xì)胞壁成分，也是煙草中的重要成分。已有研究表明，若果膠類物質(zhì)含量過高，會造成煙草燃燒不完全，產(chǎn)生甲醇，甲醇進(jìn)一步氧化成甲醛、甲酸等，對煙草吸食及安全性產(chǎn)生不利影響，而且對卷煙品質(zhì)有很大的影響。因此，果膠含量已成為評價(jià)煙草及煙草制品品質(zhì)的重要指標(biāo)，降低煙草中果膠含量對提高煙草品質(zhì)有重要意義。

為合理降低煙葉中果膠及其他物質(zhì)含量，通常做法是將新鮮收獲的煙葉置于特定倉庫中進(jìn)行長期存放，利用環(huán)境及煙葉自身的變化促使煙葉中蛋白質(zhì)、果膠等大分子物質(zhì)降解，從而改善煙葉品質(zhì)，這一過程稱為煙葉的醇化。由于煙葉醇化周期通常較長，一般在2~3年甚至更長，對于實(shí)際煙支生產(chǎn)往往具有較大影響，因而極有必要適當(dāng)縮短或者改進(jìn)這一煙葉醇化操作過程。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在對現(xiàn)有煙葉醇化操作過程中的煙葉表面及煙葉內(nèi)部所含微生物篩選基礎(chǔ)上，本發(fā)明目的在于提供一株能夠較好降解煙葉中果膠物質(zhì)的芽孢桿菌屬SMXP-58菌株，從而能夠促進(jìn)煙葉陳化，加快煙葉醇化過程。

本申請所采取的詳細(xì)技術(shù)方案如下。

一株用于降解煙葉中果膠的SMXP-58菌株，該菌株屬芽孢桿菌屬（Bacillus），最初是由2013年三門峽產(chǎn)的復(fù)烤煙葉中分離而來，其保藏名稱為：枯草芽孢桿菌 SMXP-58，分類學(xué)名稱為Bacillus subtilis SMXP-58，現(xiàn)保藏于武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），保藏編號為CCTCC NO：M 2016083。

利用所述用于降解煙葉中果膠的SMXP-58菌株所制備的菌劑，通過如下步驟制備而成：

（1）活化菌種，將SMXP-58菌株置于LB平板上，37℃條件下培養(yǎng)1~2d；

（2）制備種子液，刮取步驟（1）中所培養(yǎng)的菌體，接種于液體LB培養(yǎng)基中，30℃、150 rpm條件于搖床過夜培養(yǎng)；

（3）擴(kuò)大培養(yǎng)，將步驟（2）中種子液按1%的體積比轉(zhuǎn)接液體LB培養(yǎng)基，30℃、150 rpm條件于培養(yǎng)至OD₆₀₀=2.0左右；

（4）制備菌劑，將步驟（3）中發(fā)酵液3600 rpm離心10min，棄上清夜，然后加入無菌水進(jìn)行充分懸浮，調(diào)整活菌數(shù)為（9~10）×10⁷個(gè)/mL左右后，即為用于降解煙葉中果膠的菌劑。

所述利用SMXP-58菌株所制備的菌劑在降解煙葉果膠中的應(yīng)用，按煙葉質(zhì)量的1~3%比例用無菌水稀釋后，均勻噴灑于煙葉表面，25~30℃、50~70%濕度條件下，發(fā)酵處理60~84h，發(fā)酵完成后，再將煙葉加熱處理（例如80℃條件下保溫10~20min），使細(xì)菌及其產(chǎn)生的果膠酶失活。

上述用無菌水稀釋菌劑時(shí)，無菌水體積用量一般為菌劑用量的10倍，其主要用途在于使菌體較為均勻的分不到煙葉表面。

本發(fā)明中以煙葉中含量較高的果膠為作用目標(biāo)，通過特定菌株篩選，以及特定劑量使用，在較短時(shí)間內(nèi)較好地降低了煙葉中的果膠含量。初步測定結(jié)果表明，煙葉中果膠的降解率可達(dá)50%以上，表現(xiàn)出較好地降低煙葉中果膠含量的技術(shù)效果。

總體而言，本發(fā)明通過特定菌株的篩選，設(shè)計(jì)了較為簡便的菌劑處理煙葉的技術(shù)方案，使得本發(fā)明具有：工藝流程較為簡便，煙葉處理成本較低，且處理周期較短，可明顯降低煙葉中的果膠含量并改善煙葉品質(zhì)等技術(shù)優(yōu)點(diǎn)，因而在卷煙制造技術(shù)領(lǐng)域具有較好地推廣應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為SMXP-58菌株在油鏡下的形態(tài)圖；

圖2為基于SMXP-58菌株 16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本申請做進(jìn)一步解釋說明，在介紹具體實(shí)施例前就下述實(shí)施例中涉及部分物料、實(shí)驗(yàn)設(shè)備等情況簡要介紹如下。

煙草物料：煙草醇化評吸時(shí)所采用煙草原料為2015年河南平頂山產(chǎn)復(fù)烤煙葉，由河南中煙有限責(zé)任公司提供。

實(shí)施例1

本實(shí)施例僅就SMXP-58菌株的篩選及鑒定過程簡要介紹如下。

SMXP-58菌株，最初是由2013年三門峽產(chǎn)的復(fù)烤煙葉中分離獲得。其菌落在NA培養(yǎng)平板上圓形或不規(guī)則，呈乳白色，沒有光澤，菌落表面平整或出現(xiàn)不規(guī)則褶皺凸起，表面粗糙不光滑，菌落不透明。油鏡下形態(tài)如圖1所示，可觀察到細(xì)菌分布均勻，為桿狀，很少呈鏈狀，大小為(0.7~0.9)×(1.6 ~2)μm。

采用16S rDNA基因片段為通用引物，對該菌株進(jìn)行PCR以及克隆測序，可獲得1416bp序列，進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，顯示菌株SMXP-58與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的同源性高達(dá)99%，即，與枯草芽孢桿菌的親緣關(guān)系最近（如圖2所示）。

最終，鑒定認(rèn)為SMXP-58菌株屬芽孢桿菌屬（Bacillus），其分類學(xué)名稱為Bacillus subtilis SMXP-58，現(xiàn)保藏于武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），保藏編號為CCTCC NO：M 2016083。

實(shí)施例2

為將實(shí)施例1中篩選所得SMXP-58菌株用于降解煙葉中果膠，需首先將該菌株制備成易于使用的菌劑，具體制備過程如下。

（1）活化菌種：將SMXP-58菌株置于LB平板上，37℃條件下于生化氣候箱中培養(yǎng)1~2d；

（2）制備種子液：在超凈工作臺中刮取步驟（1）中所培養(yǎng)的菌體，接種于含有5mL液體LB培養(yǎng)基的18×180的試管中，30℃、150 rpm條件于搖床過夜培養(yǎng)；

（3）擴(kuò)大培養(yǎng)：將步驟（2）中種子液按1 mL菌懸液/100 ml LB培養(yǎng)基（1%的體積比）轉(zhuǎn)接于含100mL液體LB培養(yǎng)基的滅菌的250mL錐形瓶中，30℃、150 rpm條件于培養(yǎng)至OD₆₀₀=2.0左右；

（4）制備菌劑：將步驟（3）中菌液3600 rpm離心10min，棄上清夜，然后加入無菌水充分懸浮，調(diào)整活菌數(shù)為9.6×10⁷個(gè)/mL左右后，即為用于降解煙葉中果膠的菌劑。

實(shí)施例3

利用實(shí)施例2中所制備菌劑處理煙葉時(shí)，具體步驟為：

處理煙葉時(shí)，用噴霧器將上述菌劑均勻噴灑于煙葉表面，然后調(diào)整煙葉水分含量為25%；最后置于30℃恒溫恒濕箱（噴灑菌劑后的煙葉放入密封袋中，然后置于恒溫恒濕箱中黑暗條件下發(fā)酵，故其濕度不受恒溫恒濕箱中濕度的影響）中，發(fā)酵處理60~84h；發(fā)酵結(jié)束后，80℃處理20min，使細(xì)菌及其產(chǎn)生的果膠酶失活。

為確定菌劑與煙葉物料間的較佳使用比例，發(fā)明人進(jìn)一步進(jìn)行了正交實(shí)驗(yàn)篩選，相關(guān)實(shí)驗(yàn)過程簡要介紹如下。

煙葉樣品：取抽取煙梗后的煙葉，分割成片狀，然后均勻分成多份，每份100 g。

菌劑用量、發(fā)酵時(shí)間、施水量：分別以發(fā)酵時(shí)間、施用菌劑量、添加水量（無菌水）為影響因素，進(jìn)了3因素水平設(shè)計(jì)（水平因素表（L9(3)3）），具體設(shè)計(jì)如下：

注：A為發(fā)酵時(shí)間；B為施用菌液量；C為添加水量。

依據(jù)上述3因素水平設(shè)計(jì)，進(jìn)行了三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

表中Ck為對照，不施加菌劑，不施加水。

煙葉處理完成后，對煙葉中的果膠含量采用咔唑硫酸分光光度測定法進(jìn)行測定。測定時(shí)首先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后依據(jù)測定結(jié)果換算獲得果膠含量變化情況，具體步驟為：

（一）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

（1）準(zhǔn)確稱取分析純半乳糖醛酸（G.A.）0.0500g，用蒸餾水溶解后定容于50mL容量瓶中(濃度1000mg/L)，

（2）于6個(gè)50mL容最瓶中分別吸取此液0、1、2、3、4、5mL，稀釋至刻度(濃度0~100mg/L)。

（3）分別吸取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液1mL于6支試管(20mm×150mm)中，然后各加人濃硫酸6mL，用自來水邊加邊冷卻至室溫，

（4）然后各加人0.30mL、0.15%(1.500g/L)咔唑無水乙醇溶液，搖勻；

（5）在室溫下暗處放置1.5h，在540nm波長下用1cm比色皿，以試劑空白（G.A.濃度為0的稀釋液）作參比，測定吸光度(A)，繪制A一C標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（二）樣品測定

（1）準(zhǔn)確稱取0.040g煙葉樣品粉末于50mL燒杯中，

（2）加入10mL、0.5mol/L硫酸、15mL水，攪勻，在75℃水浴中水解15min，冷卻至室溫后定容于50mL容量瓶中，

（3）然后，準(zhǔn)確移取5.00mL該液于另一50 mL容量瓶，稀釋至刻度，吸取10倍稀釋液1mL于6支試管(20mm×150mm)中，然后各加人濃硫酸6mL，用自來水邊加邊冷卻至室溫，

（4）然后各加入0.30mL、0.15%(1.500g/L)咔唑無水乙醇溶液，搖勻；

（5）在室溫下暗處放置1.5h，在540nm波長下用1cm比色皿，以試劑空白（G.A.濃度為0的稀釋液）作參比，測定吸光度(A)，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度。

（三）計(jì)算

計(jì)算公式為，G.A.%=[C×50/(5×50)]÷[W×10⁶]×100%，

式中：C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的所測果膠液中G.A.的濃度(mg/L)，W為煙葉樣品粉末質(zhì)量(g)；根據(jù)不同煙葉樣品中G.A.的含量不同，可換算出相應(yīng)煙葉中果膠的含量。并進(jìn)一步進(jìn)行極差分析，結(jié)果如下表：

。

結(jié)論：由于在一定范圍內(nèi)，煙葉果膠含量越低越好，而k₁＜k₃＜k₂，因此選擇A₁為因素A（A代表時(shí)間）的優(yōu)水平，同理B、C（分別代表菌劑量、水量）的優(yōu)水平分別為B₁、C₂，所以最優(yōu)水平組合為A₁B₁C₂，即時(shí)間為60 h、菌劑量為1 mL、水量為20 mL；比較R值可知RB>RC>RA，菌劑量對整個(gè)作用條件的影響最大，其次是水量，而時(shí)間的影響最小。

由于最優(yōu)化組合并不在9組正交處理方案中，因此對優(yōu)化處理方案進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如下表：

。

綜上所述，當(dāng)菌劑在發(fā)酵時(shí)間為60 h、施用菌劑量為1 mL、施用水水量為20 mL條件下（此時(shí)，菌體數(shù)量為9.6×10⁷）施用于發(fā)酵期時(shí)，煙葉中的果膠降解率可達(dá)52.9%。因而本發(fā)明在降低煙葉中果膠含量，從而提升煙葉品質(zhì)方面具有較好地應(yīng)用前景。

總體而言，本申請中篩選獲得的SMXP-58菌株，其來源于煙葉中原有菌株，當(dāng)利用其所制備菌劑處理煙葉時(shí)，在確保對于煙葉中果膠降解同時(shí)，不具有明顯的副作用，可較為有效的促進(jìn)煙草中大分子物質(zhì)降解形成各類有利于提高煙草品質(zhì)的小分子物質(zhì)，進(jìn)而達(dá)到降低卷煙煙氣中的有害成分，改善煙葉的內(nèi)在品質(zhì)的目的。