本發(fā)明涉及透明質(zhì)酸生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種透明質(zhì)酸鈉的生產(chǎn)工藝。

背景技術(shù)：

微生物發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸采用的工藝發(fā)酵周期長，發(fā)酵工藝不能依據(jù)菌種特性進行，導致菌種活性不能被激發(fā)，透明質(zhì)酸產(chǎn)率低，產(chǎn)品質(zhì)量差。發(fā)酵液中含有菌體、蛋白質(zhì)以及核酸等物質(zhì)，提取透明質(zhì)酸不但要求高的提取率和其分子不發(fā)生解聚，而且要求高的產(chǎn)品純度，而從發(fā)酵液中提取透明質(zhì)酸的工藝過程會直接影響著透明質(zhì)酸的產(chǎn)量、質(zhì)量和生產(chǎn)成本。

開發(fā)新的發(fā)酵用菌種，同時，依據(jù)菌種特性改善發(fā)酵工藝和提取工藝來提高透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量和產(chǎn)量，是本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是針對上述存在的缺陷而提供一種透明質(zhì)酸鈉的生產(chǎn)工藝。本發(fā)明篩選出透明質(zhì)酸產(chǎn)率高的菌種，結(jié)合改進的發(fā)酵技術(shù)，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)工藝簡單，原輔料常見易得，生產(chǎn)易于控制，雜質(zhì)含量更低，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)要求，收率高，并且大大降低了生產(chǎn)成本。

本發(fā)明的一種透明質(zhì)酸鈉的生產(chǎn)工藝技術(shù)方案為，包括以下步驟：

（1）馬鏈球菌獸疫亞種（Streptococcus equi subsp. zooepidemicus）DCS005搖瓶種子液培養(yǎng)；

（2）菌種擴大培養(yǎng)；

（3）發(fā)酵，先通入無菌含氧空氣發(fā)酵，再通入氮氣繼續(xù)發(fā)酵；

（4）將發(fā)酵液加水稀釋至發(fā)酵液體積的6-8倍，向稀釋液中加入硅藻土和活性炭，40℃保溫攪拌后板框壓濾，收集濾液；對濾液進行超濾，去除金屬離子和小分子的有色物質(zhì)；

（5）將超濾后的溶液加入 0.6mol/L 的氯化鈉，待完全溶解后加入乙醇，沉淀至終點酒精度數(shù)為60％-65％，充分攪拌，靜置沉淀，取出沉淀物透明質(zhì)酸鈉；將上清液抽濾，然后流加0.3-2倍體積的無水乙醇，離心后收集沉淀 ；

(6) 洗滌脫水干燥 ：將透明質(zhì)酸鈉沉淀物用乙醇洗滌、脫水后真空干燥，即得透明質(zhì)酸鈉成品。

本發(fā)明所用馬鏈球菌獸疫亞種（Streptococcus equi subsp. zooepidemicus）DCS005，目前該馬鏈球菌獸疫亞種在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵編：100101，其保藏編號是：CGMCC No.12782，菌種的拉丁文名稱是Streptococcus equi subsp. zooepidemicus，參據(jù)的微生物（株）：DCS005，保藏日期是2016年7月14日。

步驟（1）、（2）、（3）中的培養(yǎng)液包括按重量百分比的淀粉1%、蔗糖0.5%、牛肉膏0.5%、酵母粉0.5%、磷酸氫二鉀0.02%、氫氧化鈉0.05%，余量為水，pH7.0-7.3。

步驟（1）中，培養(yǎng)條件為：38.5℃培養(yǎng)12-16小時。

步驟（2）中，培養(yǎng)條件為溫度38.5℃、pH7.0-7.3，培養(yǎng)時間為12-16小時，罐壓0.05MPa。

步驟（3）具體為，通入無菌含氧空氣37-40℃發(fā)酵18-32小時后，通入氮氣39-45℃繼續(xù)發(fā)酵，通入氮氣階段同時加入濃度為800g/L的葡萄糖300mL，發(fā)酵液pH每分鐘下降幅度小于0.01時結(jié)束發(fā)酵，檢測發(fā)酵液粘度，將發(fā)酵液壓入沉淀罐中，其中，發(fā)酵罐罐壓0.05MP。

硅藻土加入量為發(fā)酵液體積的2%，活性炭加入量為發(fā)酵液體積的2%。

超濾所用超濾膜截留分子量為30,000-50,000，超濾在0.5MPa 以下進行。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明篩選出透明質(zhì)酸產(chǎn)率高的菌種，結(jié)合改進的發(fā)酵技術(shù)，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)工藝簡單，原輔料常見易得，生產(chǎn)易于控制，雜質(zhì)含量更低，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)要求，收率高，并且大大降低了生產(chǎn)成本。能低成本制得高純度的透明質(zhì)酸鈉，透明質(zhì)酸及其鹽純度高達99.6%，葡萄糖醛酸純度在 45％以上，分子量損失率低于 11％，蛋白含量低于 0.04％。

具體實施方式：

為了更好地理解本發(fā)明，下面用具體實例來詳細說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但是本發(fā)明并不局限于此。

實施例１

本發(fā)明所用的馬鏈球菌獸疫亞種（Streptococcus equi subsp. zooepidemicus）DCS005，目前該馬鏈球菌獸疫亞種在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵編：100101，其保藏編號是：CGMCC No.12782，菌種的拉丁文名稱是Streptococcus equi subsp. zooepidemicus，參據(jù)的微生物（株）：DCS005，保藏日期是2016年7月14日。

一種透明質(zhì)酸鈉的生產(chǎn)工藝，包括以下步驟：

（1）馬鏈球菌獸疫亞種（Streptococcus equi subsp. zooepidemicus）DCS005搖瓶種子液培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：38.5℃培養(yǎng)12-16小時；

（2）菌種擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度38.5℃、pH7.0-7.3，培養(yǎng)時間為12-16小時，罐壓0.05MPa；

（3）發(fā)酵，，通入無菌含氧空氣37-40℃發(fā)酵18-32小時后，通入氮氣39-45℃繼續(xù)發(fā)酵，通入氮氣階段同時加入濃度為800g/L的葡萄糖300mL，發(fā)酵液pH每分鐘下降幅度小于0.01時結(jié)束發(fā)酵，檢測發(fā)酵液粘度，將發(fā)酵液壓入沉淀罐中，其中，發(fā)酵罐罐壓0.05MP；

（4）將發(fā)酵液加水稀釋至發(fā)酵液體積的6-8倍，向稀釋液中加入發(fā)酵液體積2%的硅藻土和發(fā)酵液體積2%的活性炭，40℃保溫攪拌后板框壓濾，收集濾液；在0.5MPa 以下用截留分子量為30,000-50,000的超濾膜對濾液進行超濾，去除金屬離子和小分子的有色物質(zhì)；

（5）將超濾后的溶液加入 0.6mol/L 的氯化鈉，待完全溶解后加入乙醇，沉淀至終點酒精度數(shù)為60％-65％，充分攪拌，靜置沉淀，取出沉淀物透明質(zhì)酸鈉；將上清液抽濾，然后流加0.3-2倍體積的無水乙醇，離心后收集沉淀 ；

(6) 洗滌脫水干燥 ：將透明質(zhì)酸鈉沉淀物用乙醇洗滌、脫水后真空干燥，即得透明質(zhì)酸鈉成品。

步驟（1）、（2）、（3）中的培養(yǎng)液包括按重量百分比的淀粉1%、蔗糖0.5%、牛肉膏0.5%、酵母粉0.5%、磷酸氫二鉀0.02%、氫氧化鈉0.05%，余量為水，pH7.0-7.3。

本發(fā)明能低成本制得高純度的透明質(zhì)酸鈉，透明質(zhì)酸及其鹽純度高達99.6%，葡萄糖醛酸純度在 45％以上，分子量損失率低于 11％，蛋白含量低于 0.04％。