本發(fā)明涉及了一種菌制備方法及其應用，尤其是涉及了一種高抗逆益生菌的制備方法及其應用。

背景技術：

益生菌，英文probiotics一詞由希臘語“for live”派生而來，譯為“為了生命”，是含有生理活性的活菌，當被機體經(jīng)過口服或其他給藥方式攝入適當?shù)臄?shù)量后，能夠定植于宿主并改善宿主微生態(tài)平衡，從而發(fā)揮有益作用。近年來的研究表明，人體內的細菌多達1000多種，特別是胃腸道內的細菌最為豐富，占全身微生態(tài)菌總數(shù)80％左右，是人體細胞的10倍，被譽為人類的“第二基因組”。這些細菌有助于人體消化食物，產(chǎn)生維生素以預防食物中細菌所誘發(fā)的疾病，同時刺激免疫系統(tǒng)。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)腸道微生物在許多慢性疾病和癥狀中，如炎癥、肥胖、糖尿病、還有癌癥等也起了關鍵作用。微生物的數(shù)量和基因數(shù)量驚人，強烈影響人類的健康。這些發(fā)現(xiàn)為益生菌產(chǎn)品在食品、保健品、醫(yī)藥、養(yǎng)殖、環(huán)境、衛(wèi)生用品等領域的應用帶來了巨大的推動力。目前，益生菌被廣泛用于酸奶、乳酸菌飲料、益生菌粉劑、動物飼料、環(huán)境治理等產(chǎn)品中，形成了相對完整和成熟的益生菌行業(yè)。

益生菌的生產(chǎn)主要采用固體發(fā)酵和大罐液體深層發(fā)酵法。固體發(fā)酵法是把益生菌接種到固體培養(yǎng)基上進行發(fā)酵培養(yǎng)，中國發(fā)明專利(公開號：CN 104830711 A)發(fā)明了圓盤發(fā)酵裝置固體發(fā)酵解淀粉芽孢桿菌，發(fā)酵時間通常為48h～72h。雖然生產(chǎn)工藝簡單，投資少，但同時又易受雜菌污染，產(chǎn)品質量不穩(wěn)定，發(fā)酵時間較長的缺點。大罐液體深層發(fā)酵法是采用現(xiàn)代發(fā)酵技術，將益生菌接種到生物反應器中進行通風培養(yǎng)，具有容易控制菌體含量，產(chǎn)品質量穩(wěn)定的特點。中國發(fā)明專利(公開號：CN 105018408 A)在培養(yǎng)基中添加蘆丁提高鼠李糖菌乳桿菌的發(fā)酵速度和益生菌的活菌數(shù)，益生菌發(fā)酵生長24h得到的益生菌發(fā)酵液的最大活菌數(shù)可達到約10⁹CFU/mL。但此類方法對技術水平要求較高，相對固體發(fā)酵投資高。

當前工業(yè)生產(chǎn)的益生菌產(chǎn)品主要為粉劑和水劑兩種。相比較而言，粉劑在運輸、使用和貯存過程中，其菌的存活更易保持。粉劑制備過程中的干燥方法對益生菌活性有直接的影響。芽孢類益生菌對溫度的耐受力較高，通常采用噴霧干燥或烘干等方法；不耐熱的乳酸桿菌等，一般采用真空冷凍干燥或常溫干燥法。盡管如此，現(xiàn)有益生菌的生產(chǎn)技術對菌活仍有較大的負面影響。此外，由于益生菌是一類敏感的微生物，在常溫下無法保存太久，所制備的益生菌產(chǎn)品在后續(xù)的應用和貨架期中難以維持高活性，所以一般含有活性益生菌的產(chǎn)品必須冷藏。目前市場上常見的乳酸菌制品一般要求2-10℃冷藏保存，且保質期一周為宜，保存條件不當很容易使益生菌失活。而如果產(chǎn)品加工需要高溫環(huán)節(jié)時，益生菌更是難以存活。因此，活的益生菌在餅干、面包、糕點等各種中西式食品中的應用十分困難，在室溫加工和保存的產(chǎn)品中也受到限制。

此外，由于益生菌的耐受性較差，活菌進入消化道后難以耐受低pH的胃酸、膽汁酸等的作用，故到達腸道的活菌數(shù)量有限，在改善腸道微生態(tài)方面療效受限。同時，現(xiàn)代醫(yī)療過程中廣泛使用的抗生素以及抗生素濫用，使許多人腸道致病菌獲得耐藥性，同時也造成體內益生菌數(shù)量的大幅減少，使腸道菌群失衡，引發(fā)多種疾病的發(fā)生。因此，只有足夠數(shù)量的活菌耐受環(huán)境的不利影響并到達腸道，才能真正發(fā)揮益生菌的作用。

為了提高益生菌的活性，有專利提出對益生菌進行保護，采用一層、兩層甚至三層壁材包埋益生菌。如中國發(fā)明專利(公告號：CN 104543611 A)以蛋白與還原性低聚糖美拉德產(chǎn)物作為微膠囊壁材，將濃縮益生菌液作為芯材，采用內源乳化凝膠法和噴霧干燥兩種方法制作益生菌微膠囊；中國發(fā)明專利(公告號：CN 104644612 A)利用聚丙烯酸鈉接枝海藻酸鈉包埋益生菌微膠囊，減少胃液環(huán)境對益生菌的不良影響，提高到達腸道的有效活菌數(shù)量；中國發(fā)明專利(公告號：CN104004670 B)采用海藻糖包埋酵母，制備耐高溫微膠囊酵母益生菌。中國發(fā)明專利(公告號：CN101323850 B)采用大豆分離蛋白、微孔淀粉和海藻酸鈉分別作為瑞士乳桿菌的一、二、三層壁材，提高了瑞士乳桿菌冷凍干燥后的存活率。中國發(fā)明專利(公告號：CN105105104 A)采用內部油層、第一外層(海藻酸及其鹽類)和第二外層(天然多糖及陽離子型高分子)包埋益生菌，制備耐熱益生菌組合物。這類方法過程繁瑣、附加成本高，在實際生產(chǎn)中應用很少，且包埋的益生菌活性仍然有限，不能滿足實際工業(yè)加工和常溫貨架長期儲存的需求，并耐受環(huán)境不利因素的影響。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的缺點，提供了一種高抗逆益生菌的制備方法及其應用。該方法是在培養(yǎng)基中加入多孔材料，添加促進益生菌生長繁殖的促生長因子，接種益生菌并培養(yǎng)，得到高抗逆的聚集態(tài)益生菌。所制備的益生菌具有優(yōu)異的耐熱性、耐酸堿性和耐藥性，穩(wěn)定性高，經(jīng)過食品、飲料、保健品、醫(yī)藥、飼料、衛(wèi)生用品、日化用品等產(chǎn)品不可避免的熱加工和機械加工，益生菌仍具有高存活率；經(jīng)過消化系統(tǒng)里胃酸、膽汁及藥物等組分的洗禮，益生菌仍具有高存活率。

本發(fā)明采用的技術方案如下：

一、一種高抗逆益生菌的制備方法：

在培養(yǎng)基中先放置多孔材料，再接種益生菌并進行培養(yǎng)，制備獲得高抗逆的益生菌。

所述培養(yǎng)為厭氧培養(yǎng)，所接種的益生菌為厭氧或兼性厭氧的微生物。

厭氧培養(yǎng)是在30-42℃下培養(yǎng)12-36h。

培養(yǎng)結束后，所述益生菌聚集到多孔材料的表面或者內部或者表面和內部，得到聚集態(tài)的益生菌。

培養(yǎng)結束后，所制備得到的益生菌產(chǎn)品具有超強抗逆性和長期存儲穩(wěn)定性。

所述的培養(yǎng)基為液態(tài)或者半固態(tài)，所述的多孔材料為固態(tài)。

所述的培養(yǎng)基為YPD(酵母菌)、雙歧桿菌培養(yǎng)基(青春雙歧桿菌、動物雙歧桿菌、乳雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌)、MRS培養(yǎng)基(嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、瑞氏乳桿菌、約氏乳桿菌、植物乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、唾液乳桿菌、副干酪乳桿菌、乳酸乳球菌乳酸亞種、乳酸乳球菌雙乙酰亞種、格氏乳桿菌、片球菌屬、腸球菌屬、魏斯氏菌屬、蜜蜂球屬、卷曲乳桿菌)、SIIM0012培養(yǎng)基(發(fā)酵乳桿菌、鼠李糖乳桿菌)、M17培養(yǎng)基(嗜熱鏈球菌)、乳酸菌培養(yǎng)基(乳酸乳球菌乳脂亞種)、腸膜明串珠菌培養(yǎng)基(腸膜明串珠菌腸膜亞種)、丙酸細菌培養(yǎng)基(丙酸桿菌屬)、5°Bé麥芽汁瓊脂(德巴利酵母屬、假絲酵母屬、球擬酵母屬)、血瓊脂培養(yǎng)基(擬桿菌屬、梭桿菌屬)、番茄汁培養(yǎng)基(酒球菌屬)、PDA馬鈴薯、葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(青霉屬)、SICC0070丁酸菌培養(yǎng)基(梭菌屬)、TSA胰蛋白胨大豆瓊脂(氣球菌屬)、肉湯培養(yǎng)基(芽孢桿菌屬)、LB培養(yǎng)基(微球菌屬)等。

所述培養(yǎng)基中，多孔材料上接種的益生菌菌液量為0.1％-30％(v/v)。0.1％-30％(v/v)指的是益生菌菌液加入的體積量為加入后整個培養(yǎng)基體積的0.1％-30％。

益生菌菌液中的菌液的濃度是10⁸-10⁹CFU/mL。

所述的多孔材料的平均孔徑大小為0.1納米-500微米，孔隙率為10％-99.9％(v/v)?？紫堵手傅氖嵌嗫撞牧现械目紫墩颊麄€材料體積的百分比。

所述的多孔材料為凝膠材料、氣凝膠材料、泡沫材料、纖維材料、微孔材料、介孔材料或者大孔材料等。

所述的微孔材料的平均孔徑小于2nm，介孔材料的平均孔徑為2-50nm，大孔材料的平均孔徑大于50nm。

所述的多孔材料為天然多糖類、天然蛋白類或合成高分子的均聚物或者共聚物。

天然多糖類如甲殼素、殼聚糖、纖維素、木質素、葡聚糖、瓊脂糖、低聚果糖、大豆低聚糖、魔芋葡甘聚糖、低聚異麥芽糖、低聚木糖、低聚麥芽糖、淀粉、糊精、菊粉、海藻酸及其鹽、右旋糖酐、透明質酸、海藻多糖、褐藻多糖、螺旋藻多糖、地衣多糖、香菇多糖、靈芝多糖、銀耳多糖、果膠、瓜爾膠、黃原膠、角叉菜膠等來源于植物、動物、海藻和微生物的多糖及其衍生物。

天然蛋白類如大豆蛋白、綠豆蛋白、小麥蛋白、玉米蛋白、谷蛋白、蠶絲蛋白、蜘蛛絲蛋白、膠原蛋白、乳清蛋白、明膠、酪蛋白酸鈉、纖維蛋白、角蛋白等來源于植物、動物和微生物的蛋白及其衍生物。

合成高分子的均聚物和共聚物如聚氨基酸、聚乙二醇、聚乳酸、聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物、聚乙烯基吡咯烷酮、聚己酸內酯、聚β羥基丁酸酯、聚β羥基戊酸等。

所述的多孔材料為以上所述材料的一種或多種，但又不局限于以上材料。

所述的培養(yǎng)基中含有促進益生菌生長繁殖的促生長因子。

含有促進益生菌生長繁殖的促生長因子如乳清發(fā)酵液、膠原蛋白發(fā)酵液、馬鈴薯發(fā)酵液、菌菇類發(fā)酵液或提取物、豆乳、番茄汁、胡蘿卜汁、玉米汁、冬蟲夏草提取物、靈芝提取物、鐵皮石斛提取物、當歸提取物、銀杏葉提取物、麥芽提取物、參類提取物、黃芪提取物、羅漢果提取物、菊粉、酵母葡聚糖、低聚木糖、維生素、氨基酸、多巴胺、植酸、黃腐酸、腐殖酸、鎂鹽、鋅鹽、錳鹽、鈣鹽、鐵鹽、鈷鹽、硒鹽等的一種或多種。

所用的益生菌為雙歧桿菌屬、青春雙歧桿菌、動物雙歧桿菌、乳雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌、乳桿菌屬、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、卷曲乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種(保加利亞乳桿菌)、德氏乳桿菌亞種、發(fā)酵乳桿菌、格氏乳桿菌、瑞士乳桿菌、約氏乳桿菌、副干酪乳桿菌、植物乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、唾液乳桿菌、鏈球菌屬、嗜熱鏈球菌、乳球菌屬、乳酸乳球菌乳酸亞種、乳酸乳球菌乳脂亞種、乳酸乳球菌雙乙酰亞種、腸膜明串珠菌腸膜亞種、丙酸桿菌屬、酵母屬、德巴利酵母數(shù)、假絲酵母屬、球擬酵母屬、擬桿菌屬、梭桿菌屬、酒球菌屬、消化鏈球菌屬、青霉屬、鏈球屬、梭菌屬、氣球菌屬、片球菌屬、芽孢桿菌屬、蜜蜂球菌屬、腸球菌屬、微球菌屬、魏斯氏菌屬等的一種或多種，但又不局限于以上菌種。

本發(fā)明方法在各個菌種的基礎培養(yǎng)基中加入多糖、蛋白和(或)合成高分子多孔材料，同時添加促進益生菌生長繁殖的促生長因子，在二者的協(xié)同作用下，益生菌的生長繁殖速率大幅提升，并且由于益生菌的厭氧或兼性厭氧特性，益生菌聚集到多孔材料的表面或者內部或者表面和內部，得到高抗逆的聚集態(tài)益生菌。

本發(fā)明制備獲得的益生菌一方面在經(jīng)過食品加工后，活菌數(shù)下降不明顯，活菌數(shù)可達到88％以上；一方面在經(jīng)過至少6個月的長期存儲后，活菌數(shù)下降不明顯，活菌數(shù)可達到90％以上；另一方面在經(jīng)過消化系統(tǒng)等應用場景后，到達目標位置(如腸道)的活菌數(shù)下降不明顯，活菌數(shù)可達到92％以上；而在經(jīng)過青霉素的處理后，活菌數(shù)可達80％以上。

二、所述益生菌在制備食品或食品添加劑、保健品等產(chǎn)品中的應用。

食品包括餅干、面包、蛋糕等西式糕點，米糕、饅頭、包子、花卷、月餅、粽子等中式糕點，酸奶、乳制品等奶制品，水、果蔬汁、運動飲料等飲料，巧克力、蜜餞、面粉、面粉制品等；保健品包括粉劑、水劑制品等。

所述產(chǎn)品中的益生菌在通過消化系統(tǒng)等應用場景時，具有高抗逆特性，包括耐熱性、耐酸堿性及耐藥性的能力，存活率高。

本發(fā)明的有益效果是：

根據(jù)本發(fā)明制備的益生菌，大幅提升了益生菌的抗逆性能，提高了益生菌在冷藏、常溫或高溫加工環(huán)境中的存活能力，活菌數(shù)可達到88％以上，使菌體的活性長時間保留，同時提高了益生菌到達腸道等目標位置的活菌率，活菌數(shù)可達到92％以上，大大拓寬了益生菌在食品、保健品、醫(yī)藥、飼料等產(chǎn)品中的應用。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。

下面通過實施例，對本發(fā)明專利進一步的詳細描述，但本發(fā)明并不限于這些。

本發(fā)明的實施例如下：

實施例1：

先在培養(yǎng)基中加入纖維素/殼聚糖凝膠，凝膠孔隙率為90％，平均孔徑大小為500nm。該培養(yǎng)基中各組分重量百分比為MRS 75％，L-半胱氨酸鹽酸鹽1％，維生素C 1％，胡蘿卜汁5％，香菇提取物10％，豆乳8％。雙歧桿菌接種到培養(yǎng)基中，雙歧桿菌從中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心公眾渠道購買獲得，雙歧桿菌采用濃度為10⁹CFU/mL的菌液，接種菌液量為20％。厭氧培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)16h后，得到雙歧桿菌聚集的凝膠顆粒。

該雙歧桿菌抗逆性良好，經(jīng)過200℃高溫處理10min，88％雙歧桿菌保留活性；常溫存放6個月，92％雙歧桿菌保留活性；經(jīng)過國標人工胃液、膽汁和腸液的模擬處理，93％雙歧桿菌保留活性；經(jīng)過0.10mg/mL青霉素的處理后，活菌數(shù)可達80％以上。

實施例2：

先在培養(yǎng)基中加入膠原蛋白/海藻糖多孔膜，多孔膜孔隙率為80％，平均孔徑大小為200nm。該培養(yǎng)基中各組分重量百分比為MRS 80％，蔗糖4％，鎂鹽1％，玉米汁5％，香菇提取物5％，乳清發(fā)酵液5％。再將德氏乳桿菌保加利亞乳桿菌接種到培養(yǎng)基中，德氏乳桿菌保加利亞乳桿菌采用濃度為10⁹CFU/mL的菌液，德氏乳桿菌保加利亞乳桿菌從中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心公眾渠道購買獲得。厭氧培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)12h后，多孔膜表面聚集德氏乳桿菌保加利亞乳桿菌。

該德氏乳桿菌保加利亞乳桿菌抗逆性良好，經(jīng)過180℃高溫處理10min，88％德氏乳桿菌保加利亞乳桿菌保留活性；常溫存放6個月，90％德氏乳桿菌保加利亞乳桿菌保留活性；經(jīng)過國標人工胃液、膽汁和腸液的模擬處理，92％德氏乳桿菌保加利亞乳桿菌保留活性；經(jīng)過0.10mg/mL青霉素的處理后，活菌數(shù)可達83％以上。

實施例3：

培養(yǎng)基中加入蠶絲蛋白纖維材料，蠶絲蛋白纖維材料為82％，平均孔徑大小為400μm。該培養(yǎng)基中各組分重量百分比為YPD 85％，麥芽提取物4％，維生素1％，平菇提取物5％，靈芝提取物2％，膠原蛋白發(fā)酵液3％。然后將酵母接種到培養(yǎng)基中，酵母菌采用濃度為10⁸CFU/mL的菌液，酵母菌從中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心公眾渠道購買獲得。厭氧培養(yǎng)，30℃培養(yǎng)24h后，泡沫表面及內部聚集大量酵母。

該酵母菌產(chǎn)品抗逆性良好，經(jīng)過120℃高溫處理10min，93％酵母菌保留活性；常溫存放6個月，96％酵母保留活性；經(jīng)過國標人工胃液、膽汁和腸液的模擬處理，93％酵母菌保留活性；經(jīng)過0.10mg/mL青霉素的處理后，活菌數(shù)可達82％以上。

實施例4：

培養(yǎng)基中加入聚乳酸泡沫材料，聚乳酸泡沫材料孔隙率為95％，平均孔徑大小為50μm。該培養(yǎng)基中各組分重量百分比為M17 78％，馬鈴薯提取物10％，草菇發(fā)酵液5％，當歸提取物5％，番茄汁2％。

再將嗜熱鏈球菌接種到培養(yǎng)基中，嗜熱鏈球菌采用濃度為10⁹CFU/mL的菌液，嗜熱鏈球菌從中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心公眾渠道購買獲得。37℃培養(yǎng)36h后，纖維聚集體表面及內部聚集大量嗜熱鏈球菌。

該嗜熱鏈球菌產(chǎn)品抗逆性良好，經(jīng)過210℃高溫處理10min，95％酵嗜熱鏈球菌保留活性；常溫存放6個月，96％嗜熱鏈球菌保留活性；經(jīng)過國標人工胃液、膽汁和腸液的模擬處理，92％嗜熱鏈球菌保留活性；經(jīng)過0.10mg/mL青霉素的處理后，活菌數(shù)可達85％以上。

實施例5：

培養(yǎng)基中加入纖維素氣凝膠材料，纖維素氣凝膠材料孔隙率為99％，平均孔徑大小為50nm。該培養(yǎng)基中各組分重量百分比為雙歧桿菌培養(yǎng)基30％，MRS培養(yǎng)基30％，YPD培養(yǎng)基20％，菊粉5％，酵母葡聚糖5％，乳清發(fā)酵液5％，番茄汁3％，冬蟲夏草提取物2％。

再將嬰兒雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌和釀酒酵母接種到培養(yǎng)基中，鼠李糖乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和酒酵母分別采用濃度為10⁹CFU/mL、10⁹CFU/mL、10⁸CFU/mL的菌液，嬰兒雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌和釀酒酵母從中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心公眾渠道購買獲得。37℃培養(yǎng)36h后，纖維聚集體表面及內部聚集大量嬰兒雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌和釀酒酵母。

該嬰兒雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌和釀酒酵母的共培產(chǎn)品抗逆性良好，經(jīng)過180℃高溫處理10min，92％的共培菌保留活性；常溫存放6個月，93％共培菌保留活性；經(jīng)過國標人工胃液、膽汁和腸液的模擬處理，92％共培菌保留活性；經(jīng)過0.10mg/mL青霉素的處理后，活菌數(shù)可達83％以上。

由以上實施例可見，本發(fā)明方法制備的益生菌能大幅提升了益生菌的抗逆性能，提高了冷藏、常溫或高溫加工環(huán)境中的存活能力，使菌體的活性長時間保留，同時提高了益生菌到達腸道等目標位置的活菌率，大大拓寬了益生菌的應用，其技術效果顯著突出。