專利名稱：一種管道化雞冠提取玻璃酸鈉(透明質(zhì)酸鈉)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及從動(dòng)物組織中(雞冠)提取玻璃酸鈉 (透明質(zhì)酸鈉)的制備方法。
背景技術(shù)：
玻璃酸鈉(透明質(zhì)酸鈉)是存在于雞冠和動(dòng)物結(jié)締組織中的一種高分子多糖體， 它是從動(dòng)物結(jié)締組織中萃取精制獲得的，具有良好的保水性和潤(rùn)滑性的玻璃酸或玻璃酸鈉 (透明質(zhì)酸鈉)。目前已廣泛用作化妝品的主要原料和眼科手術(shù)用的粘彈劑、骨關(guān)節(jié)腔的潤(rùn) 滑劑，以及婦科、外科手術(shù)中的防粘連劑。為了達(dá)到適用于上述各領(lǐng)域的目的，就需要制取 高純度的玻璃酸鈉(透明質(zhì)酸鈉)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種管道化雞冠提取玻璃酸鈉(透明質(zhì)酸鈉)的制備方法，包括以下 步驟1)雞冠中病毒滅活的處理雞冠中病毒在68 98°C滅活，滅活時(shí)間為1 4小時(shí)。2)雞冠中脂肪的處理將絞碎肉雞冠置于反應(yīng)罐中，加純化水浸泡，去除上層油脂。病毒滅活期間不斷去 除上層油脂。3)酶解木瓜酶酶解溫度控制在48 68°C，pH = 5 7，緩慢攪拌，加木瓜酶每公斤雞冠 200 440萬單位，12 18小時(shí)，期間不斷去除上層油脂。胰酶酶解加氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7 9，溫度35 50°C，加胰酶粉每公斤雞 冠0.75 1.6萬單位。酶解2 6小時(shí)，酶解期間，控制pH為7 9。4)鹵代烷吡啶鹽的純化兩次添加鹵代烷吡啶鹽進(jìn)行提純，將兩次提純物分別用鹽溶液進(jìn)行復(fù)溶。5)乙醇沉淀將上述提取物的復(fù)溶液用乙醇沉淀收取，進(jìn)行兩次乙醇沉淀。將兩次提純物分別 用不同鹽濃度進(jìn)行復(fù)溶。6)預(yù)過濾及除菌過濾乙醇提取物進(jìn)行活性炭吸附去內(nèi)毒素和色素等雜質(zhì)預(yù)過濾，再進(jìn)行0.22U微孔濾 器除菌過濾，除菌液脫水，真空干燥制得玻璃酸鈉(透明質(zhì)酸鈉)。本發(fā)明從動(dòng)物組織中提取的玻璃酸鈉(透明質(zhì)酸鈉)制成的產(chǎn)品，用于人體時(shí)具 有更好的生物相容性，但是在另一方面，它們應(yīng)用到人體則會(huì)增加病毒傳播和免疫原性等 方面的安全風(fēng)險(xiǎn)。因此，本發(fā)明的目的在于管道化雞冠提取玻璃酸鈉(透明質(zhì)酸鈉)的制造 過程中，增加病毒滅活的處理，將動(dòng)物組織中可能存在的病毒滅活，提高產(chǎn)品的安全性。主要工藝參數(shù)為純蒸汽加熱68-98°C滅活，滅活時(shí)間為1 4小時(shí)。本發(fā)明中對(duì)動(dòng)物組織中存在的脂肪通過物理加熱的方法去除，避免了傳統(tǒng)工藝中 采用化學(xué)溶劑如丙酮去脂。提高產(chǎn)品生產(chǎn)的安全性，減少對(duì)環(huán)境的污染。主要工藝為將絞 碎雞冠置于反應(yīng)罐中，加純化水浸泡，去除上層油脂。病毒滅活期間不斷去除上層油脂。本發(fā)明中的組織消化，采用木瓜酶和胰酶進(jìn)行酶消化。對(duì)雞冠組織中蛋白質(zhì)去除 更徹底。主要工藝參數(shù)為木瓜酶酶解溫度控制在48 68°C，pH = 5 7，緩慢攪拌，加木瓜酶每公斤雞冠 200 440萬單位，12 18小時(shí)，期間不斷去除上層油脂。胰酶酶解加氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7 9，溫度35 50°C，加胰酶粉每公斤雞 冠0.75 1.6萬單位。酶解2 6小時(shí)，酶解期間，控制pH為7 9。本發(fā)明中采用兩次CPC沉淀，沉淀完全后，收集沉淀，用NaCl溶液復(fù)溶，加硅藻土 過濾ο本發(fā)明中采用兩次乙醇沉淀90%以上乙醇加至過濾料液中，沉淀完全后，收集沉 淀。0. 4 lmol/L NaCl溶液中復(fù)溶。本發(fā)明中第二次乙醇沉淀的復(fù)溶溶液用活性炭吸附(0. 2% -0. 25% )，50°C以上 吸附不少于1小時(shí)，攪拌吸附后，進(jìn)行除活性炭過濾，收集濾液。以上濾過液，經(jīng)0.22um微 孔濾器過濾，收集濾液。本發(fā)明在攪拌狀態(tài)下加2-2. 5倍量體積左右95%乙醇，充分沉淀后加適量體積的 95%除菌乙醇固化，經(jīng)固化的沉淀物于三合一機(jī)器內(nèi)洗滌、脫水、干燥。即得玻璃酸鈉(透 明質(zhì)酸鈉)。本發(fā)明采用管道化制備，每Ikg雞冠經(jīng)上述方法可制得玻璃酸鈉(透明質(zhì)酸 鈉)5 7g，比非管道生產(chǎn)方法提高2 3倍，單批產(chǎn)量達(dá)4kg以上，比非管道生產(chǎn)方式提高 20倍。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1將絞碎肉雞冠置于反應(yīng)罐中，加純化水浸泡，去除上層油脂。88°C滅活2小時(shí)。病 毒滅活期間不斷去除上層油脂。溫度控制在58°C，PH6.0，緩慢攪拌，加木瓜酶每公斤雞冠 200 440萬單位，16小時(shí)，期間不斷去除上層油脂。加氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8. 0，溫度 450C，加胰酶粉每公斤雞冠0. 75 1. 6萬單位。酶解4小時(shí)，酶解期間，控制pH為8. 0。兩 次添加鹵代烷吡啶鹽進(jìn)行提純，將兩次提純物分別用鹽溶液進(jìn)行復(fù)溶。將上述提取物的復(fù) 溶液用乙醇沉淀收取，進(jìn)行兩次乙醇沉淀。將兩次提純物分別用不同鹽濃度進(jìn)行復(fù)溶。乙醇 提取物進(jìn)行活性炭吸附去內(nèi)毒素和色素等雜質(zhì)預(yù)過濾，再進(jìn)行0. 22u微孔濾器除菌過濾， 除菌液脫水，真空干燥制得玻璃酸鈉(透明質(zhì)酸鈉)。實(shí)施例2將絞碎肉雞冠置于反應(yīng)罐中，加純化水浸泡，去除上層油脂。78°C滅活1.5小時(shí)。 病毒滅活期間不斷去除上層油脂。溫度控制在48°C，PH5.0，緩慢攪拌，加木瓜酶每公斤雞 冠200 440萬單位，12小時(shí)，期間不斷去除上層油脂。加氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7. 0，溫 度50°C，加胰酶粉每公斤雞冠0. 75 1. 6萬單位。酶解3小時(shí)，酶解期間，控制pH為8. 0。兩次添加鹵代烷吡啶鹽進(jìn)行提純，將兩次提純物分別用鹽溶液進(jìn)行復(fù)溶。將上述提取物的 復(fù)溶液用乙醇沉淀收取，進(jìn)行兩次乙醇沉淀。將兩次提純物分別用不同鹽濃度進(jìn)行復(fù)溶。 乙醇提取物進(jìn)行活性炭吸附去內(nèi)毒素和色素等雜質(zhì)預(yù)過濾，再進(jìn)行0. 22u微孔濾器除菌過 濾，除菌液脫水，真空干燥制得玻璃酸鈉(透明質(zhì)酸鈉)。實(shí)施例3將絞碎肉雞冠置于反應(yīng)罐中，加純化水浸泡，去除上層油脂。70°C滅活2小時(shí)。病 毒滅活期間不斷去除上層油脂。溫度控制在68°C，PH7.0，緩慢攪拌，加木瓜酶每公斤雞冠 200 440萬單位，16小時(shí)，期間不斷去除上層油脂。加氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至9. 0，溫度 500C，加胰酶粉每公斤雞冠0. 75 1. 6萬單位。酶解4小時(shí)，酶解期間，控制pH為8. 0。兩 次添加鹵代烷吡啶鹽進(jìn)行提純，將兩次提純物分別用鹽溶液進(jìn)行復(fù)溶。將上述提取物的復(fù) 溶液用乙醇沉淀收取，進(jìn)行兩次乙醇沉淀。將兩次提純物分別用不同鹽濃度進(jìn)行復(fù)溶。乙醇 提取物進(jìn)行活性炭吸附去內(nèi)毒素和色素等雜質(zhì)預(yù)過濾，再進(jìn)行0. 22u微孔濾器除菌過濾， 除菌液脫水，真空干燥制得玻璃酸鈉(透明質(zhì)酸鈉)。病毒滅活的效果驗(yàn)證實(shí)施例4用本發(fā)明方法制得的玻璃酸鈉(透明質(zhì)酸鈉)取至生產(chǎn)過程中88°C加熱處理之 前的中間品，批號(hào)分別為090622、090707、090714的玻璃酸鈉(透明質(zhì)酸鈉)中間品，送中 國(guó)藥品生物制品檢定所委托進(jìn)行玻璃酸鈉(透明質(zhì)酸鈉)病毒滅活效果驗(yàn)證。經(jīng)中國(guó)藥品生物制品檢定所病毒滅活效果驗(yàn)證，結(jié)果如下采用指示病毒1)呼腸孤病毒III型(Reo3)屬呼腸病毒科，為雙股RNA病毒，無囊膜，在 ph2. 2-8. 0穩(wěn)定，對(duì)有機(jī)溶劑有抵抗力，較耐熱。2)偽狂犬病毒(PRV)屬皰疹病毒科，為雙股DNA病毒，有囊膜，對(duì)乙醚、氯仿等脂 溶劑，福爾馬林和紫外線照射等敏感，是皰疹病毒中抵抗力較強(qiáng)的一種。3)水泡性口炎病毒(VSV)屬彈狀病毒科，為單股負(fù)鏈RNA病毒，有囊膜，可見光、 紫外光及脂溶劑能使其滅活，不耐酸。對(duì)理化學(xué)因子的抵抗力與口蹄疫病毒相似。4)猴空泡病毒40 (SV40)屬乳多空病毒科，為雙股DNA病毒，無囊膜，對(duì)酸、熱、乙 醚、甲醛等均有較強(qiáng)的抵抗力。驗(yàn)證結(jié)果1)三批中間品經(jīng)88°C加熱處理后，可滅活呼腸孤病毒III型分別為090622 批彡 5. 625LgTCID50/0. Iml090707 批彡 5. 375LgTCID50/0. Iml090714 批彡 6. 063LgTCID50/0. Iml2)三批中間品經(jīng)88°C加熱處理后，可滅活偽狂犬病毒分別為090622 批彡 5. 375LgTCID50/0. Iml090707 批彡 5. 188LgTCID50/0. Iml090714 批彡 5. 563LgTCID50/0. Iml3)三批中間品經(jīng)88°C加熱處理后，可滅活水泡性口炎病毒分別為090622 批彡 6. 563LgTCID50/0. Iml
090707 批彡 6. 313LgTCID50/0. Iml090714 批彡 6. 750LgTCID50/0. Iml4)三批中間品經(jīng)88°C加熱處理后，可滅活猴空泡病毒40分別為090622 批彡 7. 125LgTCID50/0. Iml090707 批彡 7. 000LgTCID50/0. Iml090714 批彡 7. 250LgTCID50/0. Iml驗(yàn)證結(jié)論上海昊海生物科技有限公司生產(chǎn)的連續(xù)三批玻璃酸鈉(透明質(zhì)酸鈉)(玻璃酸鈉 (透明質(zhì)酸鈉))中間品，加入感染呼腸孤病毒III型、偽狂犬病毒(PRV)、水泡性口炎病毒 (VSV)、猴空泡病毒40等四種指示病毒后，按照其生產(chǎn)工藝，進(jìn)行88°C加熱處理，病毒去除 量均大于41ogs，根據(jù)國(guó)藥監(jiān)注[2002] 160號(hào)文的規(guī)定，88°C加熱處理為有效滅活病毒方法。玻璃酸鈉(透明質(zhì)酸鈉)制品的檢驗(yàn)結(jié)果實(shí)施例5用本發(fā)明方法制得的玻璃酸鈉(透明質(zhì)酸鈉)原料配制成的玻璃酸鈉(透明質(zhì)酸 鈉)注射液質(zhì)量指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果如下經(jīng)山東醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心測(cè)試結(jié)果(檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)YY0308-2004《醫(yī)用透
明質(zhì)酸鈉凝膠》)
權(quán)利要求
1. 一種管道化雞冠提取玻璃酸鈉(透明質(zhì)酸鈉)的制備方法，其特征在于該方法包括 以下步驟1)雞冠中病毒滅活的處理雞冠中病毒在68 98°C滅活，滅活時(shí)間為1 4小時(shí)。2)雞冠中脂肪的處理將絞碎肉雞冠置于反應(yīng)罐中，加純化水浸泡，去除上層油脂。病毒滅活期間不斷去除上 層油脂。3)酶解木瓜酶酶解溫度控制在48 68°C，pH為5 7，緩慢攪拌，加木瓜酶每公斤雞冠 200 440萬單位，12 18小時(shí)，期間不斷去除上層油脂。胰酶酶解加氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH至7 9，溫度35 50°C，加胰酶粉每公斤雞冠 0. 75 1. 6萬單位。酶解2 6小時(shí)，酶解期間，控制pH為7 9。4)鹵代烷吡啶鹽的純化兩次添加鹵代烷吡啶鹽進(jìn)行提純，將兩次提純物分別用鹽溶液進(jìn)行復(fù)溶。5)乙醇沉淀將上述提取物的復(fù)溶液用乙醇沉淀收取，進(jìn)行兩次乙醇沉淀。將兩次提純物分別用不 同鹽濃度進(jìn)行復(fù)溶。6)預(yù)過濾及除菌過濾乙醇提取物進(jìn)行活性炭吸附去內(nèi)毒素和色素等雜質(zhì)預(yù)過濾，再進(jìn)行0. 22u微孔濾器除 菌過濾，除菌液脫水，真空干燥制得玻璃酸鈉(透明質(zhì)酸鈉)。
全文摘要
本發(fā)明公開一種管道化雞冠提取玻璃酸鈉(透明質(zhì)酸鈉)的制備方法，該方法以雞冠為原料，經(jīng)過加熱病毒滅活，加熱去脂，組織消化，季銨鹽分離，乙醇提純、除菌、真空干燥制得無菌玻璃酸鈉(透明質(zhì)酸鈉)。本發(fā)明制得產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，純度高，收率可達(dá)到千分之六以上，成本大幅下降。
文檔編號(hào)C08B37/08GK102134287SQ20101002317
公開日2011年7月27日 申請(qǐng)日期2010年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月22日
發(fā)明者任彩霞, 侯永泰, 吳劍英, 孔淑靜, 張偉群, 梁文峰, 范素俊 申請(qǐng)人:上海昊海生物科技股份有限公司