本發(fā)明屬于環(huán)境微生物領(lǐng)域，具體涉及一種嗜熱微生物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
好氧堆肥是利用嗜熱細菌群，分解有機物，同時釋放出熱能，并將有機碳轉(zhuǎn)化為類腐殖質(zhì)的過程。目前，好氧堆肥技術(shù)已成為有機固廢資源化的重要手段。傳統(tǒng)好氧堆肥一般是利用堆肥物料中的土著微生物進行發(fā)酵，其發(fā)酵過程實質(zhì)為嗜熱微生物成為優(yōu)勢菌群的過程。堆肥過程中嗜熱微生物成為優(yōu)勢菌群的過程較長，因此導致發(fā)酵時間長，臭氣污染嚴重且腐熟度低等問題。在堆肥過程初始階段接種微生物菌劑，增加功能微生物數(shù)量，可以提高堆肥效率和產(chǎn)品質(zhì)量。
目前，好氧堆肥采用的微生物接種劑主要是嗜溫好氧菌，其中應(yīng)用最多的是枯草芽孢桿菌(Bacullus subtilis)和地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)；當發(fā)酵溫度超過50℃，菌株活性受到明顯抑制。申請?zhí)枮?01010514582.7的中國專利介紹了一種將銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、植物乳桿菌、短小芽孢桿菌和珊瑚色諾卡氏菌以及將綠色木霉、脫氮副球菌、黃曲霉、黃孢原毛平革菌和圓褐固氮菌制備成兩種堆肥接種劑，用于堆肥發(fā)酵的不同階段。專利號為CN 101486969A、CN101186879A、CN101696391A等中國專利也公布了將多種芽孢桿菌、放線菌、酵母菌、乳酸菌、光合菌、固氮菌、霉菌等組合制備的堆肥復合菌劑。
嗜熱菌是一類生活在高溫環(huán)境中的微生物，廣泛存在于地熱溫泉，海底火山口及人工水熱環(huán)境如熱水管道和高溫好氧堆肥，其細胞和酶蛋白獨特的耐熱性和與之相適應(yīng)的分子結(jié)構(gòu)，使之成為可開發(fā)利用的重要微生物資源。目前，已有部分嗜熱菌用于好氧堆肥的報道。如專利CN 102851247 A公開了一種利用極端嗜熱菌Calditerricola yamamurae UTM801應(yīng)用于有機固廢高溫堆肥的方法。與常規(guī)微生物接種劑相比，好氧堆肥過程中接種嗜熱菌菌劑具有更高的微生物代謝活性和有機物降解速率，在固體有機廢物處理領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景和科學價值。
Anoxybacillus是2000年P(guān)ikuta從芽孢桿菌屬劃分出來的新屬，開始被鑒定為嚴格的嗜熱厭氧菌，2003年被重新鑒定為兼性厭氧菌。專利CN102732465B公開了一種A.pushchinoensis UTM601用于堆肥接種劑的方法。但未見有Anoxybacillus.rupiensis在有機固體廢物堆肥上應(yīng)用的公開報道。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明目的是提供一種嗜熱菌A.rupiensis ZQ2及其在堆肥中的應(yīng)用。
本發(fā)明從高溫期污泥堆肥中，經(jīng)高溫富集、分離純化得到嗜熱菌A.rupiensis ZQ2菌株。該菌株于2016年7月8日保存于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏號：GDMCC No.60056。
所述嗜熱菌A.rupiensis ZQ2的鑒定特征是：
(1)為革蘭氏陽性，好氧，菌體呈長桿狀；60℃生長活躍，在30℃下和75℃上不生長。
(2)60℃下培養(yǎng)48h，菌落呈圓形，邊緣規(guī)則，中央凸起，直徑2～3mm。
(3)利用引物(27f)：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′和(1492r)：5′-GGTTAC CTT GTT ACG ACT T-3′經(jīng)PCR擴增該菌株的16S rRNA基因，將獲得序列提交到EzTaxon數(shù)據(jù)庫進行比對，結(jié)果顯示該菌與Anoxybacillus rupiensis R270的相似性最高，為99.3％。
本發(fā)明還提供含有所述嗜熱菌A.rupiensis ZQ2的接種劑，含有A.rupiensis ZQ2活菌數(shù)為106-108CFU/g。
ZQ2接種劑的制備方法，包括以下步驟：
(1)種子液制備：將A.rupiensis ZQ2斜面菌種接種至LB固態(tài)斜面上60℃下培養(yǎng)2-3d；將活化的菌種接種于LB液態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)。
(2)發(fā)酵液制備：將種子液接種至滅菌的發(fā)酵罐中發(fā)酵。
(3)接種劑：將麥麩、秸稈、米糠、黃豆粉等物料混合，按5-10％接種發(fā)酵液，發(fā)酵，干燥，篩分制得嗜熱菌A.rupiensis ZQ2的接種劑。
其中，步驟(1)中所述菌種活化的方法是：取4℃保存的A.rupiensis ZQ2斜面菌種接種至LB斜面上培養(yǎng)至豐厚，在60℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3d。
步驟(1)中所述種子液的方法是：用接種環(huán)挑取菌苔轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基中，在水浴搖床上培養(yǎng)2-3d。培養(yǎng)條件為溫度50-65℃，轉(zhuǎn)速120-200rpm/min。
步驟(2)中所述發(fā)酵液制備的方法是：按5-10％比例將種子液接種至滅菌的發(fā)酵罐LB液體培養(yǎng)基中，在溫度50-65℃，轉(zhuǎn)速120-200rpm/min條件下發(fā)酵，得發(fā)酵液。
步驟(3)中所述接種劑制備方法是：取麥麩、秸稈、米糠、黃豆粉等物料等物料混合，混合均勻后接種發(fā)酵液進行固態(tài)發(fā)酵3-5d，經(jīng)干燥、篩分后得到。所述麥麩、秸稈、米糠、黃豆粉的混合質(zhì)量比是：(1-2)∶(1-3)∶(1-3)∶(1-2)。
本發(fā)明還提供所述嗜熱菌A.rupiensis ZQ2的接種劑在有機固廢堆肥化中的應(yīng)用：按重量比1％-5％將嗜熱菌A.rupiensis ZQ2的接種劑至有機固體廢物混合物料進行發(fā)酵。所述 有機固廢初始含水率為55-65％、C/N為25-35、pH 6-8。
本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供的嗜熱菌A.rupiensis ZQ2是在60℃下篩選出來的，熱穩(wěn)定性好，碳源利用率廣，代謝活性不受高溫堆肥溫度的抑制，適應(yīng)性強；同時，將本發(fā)明接種劑應(yīng)用于有機固廢高溫堆肥處理，可大大縮短堆肥的發(fā)酵周期，提高堆肥處理效率，降低處理成本。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例1 ZQ2的分離
稱取10g高溫期污泥堆肥樣品置于裝有10個玻璃珠與10mL無菌水的250mL錐形瓶中，置于水浴搖床上60℃、160rpm/min培養(yǎng)4gh，吸取10mL培養(yǎng)好的液體培養(yǎng)液接種于90mL滅菌的液體培養(yǎng)基中，置于水浴搖床上60℃、160rpm/min培養(yǎng)48h，如此發(fā)復培養(yǎng)4次，然后吸取1mL培養(yǎng)液進行平板稀釋并涂布于LB平板，置于培養(yǎng)箱中60℃培養(yǎng)。每天觀察，待長出菌落后，仔細觀察菌落特征，確定不同類型菌株，采用LB培養(yǎng)基平板上進行劃線分離純化，從平板上菌落形態(tài)特征和簡單染色后顯微鏡下多視野確認菌體形態(tài)一致后得到純菌，并繼續(xù)在60℃下傳代培養(yǎng)5代，淘汰生長不穩(wěn)定的菌株，得到嗜熱菌A.rupiensis ZQ2(以下簡稱ZQ2)。將ZQ2轉(zhuǎn)接轉(zhuǎn)至LB培養(yǎng)基斜面，培養(yǎng)至豐厚在4℃保藏備用。
其中，LB培養(yǎng)基的配制方法是：酵母提取物5.0g，細菌蛋白胨10.0g，去離子水1000mL，pH 7.2，在121℃下滅菌25min。
實施例2 ZQ2鑒定
將實施例1所得到的本發(fā)明嗜熱菌ZQ2在LB培養(yǎng)基平板上，60℃下培養(yǎng)48h，菌落呈圓形，邊緣規(guī)則，中央凸起，直徑1～2mm。
生理生化測定表明，ZQ2革蘭氏陽性，，能夠產(chǎn)生孢子，在穩(wěn)定期時，細胞約0.4-0.7-0.8-1.2um，生長溫度的范圍為30-70℃，最適生長溫度為60℃。過氧化氫酶反應(yīng)呈陽性，不能水解明膠，不能降解硝酸鹽，吲哚反應(yīng)呈陰性，苯丙氨酸脫氨酶反應(yīng)呈陰性。能夠利用阿拉伯糖、纖維二糖、半乳糖、海藻糖、木糖等。
以本發(fā)明菌株ZQ2的DNA為模板，PCR擴增其16S rRNA序列，引物為(27f)：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′和(1492r)：5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3′。PCR反應(yīng)程序為：95℃預變性5min，95℃變性30s，53℃退火45s，72℃延伸90s，30個循環(huán)，72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測其純度后測序，再將得到的堿基序列在GenBank等國際 核酸序列數(shù)據(jù)庫內(nèi)進行同源序列搜索(Blast search)，找出該菌株與數(shù)據(jù)庫中同源性最高的模式菌株或保藏于ATCC或DSM等國際菌種保藏中心的菌株。根據(jù)比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該菌株與Anoxybacillus rupiensis R270的的16S rRNA序列具最高同源性，相似性最高為99.10％。
綜上所述，16S rRNA同源序列比對及相關(guān)生理生化特性，可以確定本發(fā)明菌株ZQ2屬于Anoxybacillus rupiensis，命名為A.rupiensis subsp.Rupiensis ZQ2，并于2016年7月8日保存于廣東省微生物菌種保藏中心(地址：廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓)，保藏號為GDMCC No.60056。
實施例3 ZQ2接種劑的制備
具體方法為：
(1)搖瓶培養(yǎng)：從ZQ2斜面上挑取菌苔一環(huán)接入裝有LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，60℃、200rpm/min搖床震蕩培養(yǎng)36h。
(2)發(fā)酵罐發(fā)酵：將上述培養(yǎng)好的ZQ2發(fā)酵液接入10L發(fā)酵罐中，60℃、200rpm/min發(fā)酵培養(yǎng)36h；所用的發(fā)酵培養(yǎng)基為LB液體培養(yǎng)基，其配方為(g/L)：酵母浸膏5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，水1000mL，pH 7.2。
(3)固態(tài)發(fā)酵：按質(zhì)量比為1∶1∶1∶1的比例將麥麩、秸稈、米糠、黃豆粉混合，調(diào)節(jié)水分至50％，pH7.0，高溫滅菌，冷卻，按10％的接種量接入上述發(fā)酵液，60℃進行固態(tài)發(fā)酵。
(4)發(fā)酵后處理：上述發(fā)酵后的固體培養(yǎng)基通過晾干、氣流粉碎，過篩，即為ZQ2接種劑。
(5)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗：產(chǎn)品質(zhì)量檢驗方法按照農(nóng)用微生物菌劑標準(GB 20287-2006)進行檢測。檢測結(jié)果表明，上述制劑中有效活菌數(shù)≥2×108CFU/g，產(chǎn)品合格。
實施例4 ZQ2接種劑的應(yīng)用
以下以城市污泥好氧堆肥說明本發(fā)明ZQ2接種劑的應(yīng)用效果。
按重量比1∶1∶1取市政污泥、木屑、秸稈初步混合均勻后，按總物料2％添加實施例3中制備的ZQ2接種劑，好氧堆肥發(fā)酵25d。另設(shè)不接種ZQ2高溫接種劑作為對照。其中，常規(guī)處理，每5d或溫度超過60℃進行翻堆；接種處理，每5d進行翻堆。通過堆肥溫度變化、C/N比、種子發(fā)芽指數(shù)判定堆肥的腐熟度。
表1為ZQ2接種劑對堆肥溫度的影響。從表1可以看出，堆肥接種ZQ2后，最高溫度可達75℃，達到最高溫度時間為發(fā)酵后第4d，高溫期可達10d，其最高溫度及高溫期維持時間均高于對照，并且達到最高溫度的時間也早于對照，說明ZQ2接種劑可明顯促進堆肥前期 發(fā)酵升溫，并提高堆肥溫度，而且高溫持續(xù)時間長，堆肥反應(yīng)效果好。
表2為ZQ2接種劑對堆肥腐熟度的影響。從表2可以看出，堆肥接種ZQ2后，堆肥C/N降低。與對照比較，發(fā)芽指數(shù)降低，并且發(fā)芽指數(shù)大于80％的時間明顯提早，說明ZQ2接種劑可明顯促進污泥，縮短堆肥發(fā)酵周期，促進堆肥快速腐熟，提高污泥的無害化與穩(wěn)定化。
表1.ZQ2接種劑對堆肥溫度的影響
表2.ZQ2接種劑對堆肥腐熟度的影響