產(chǎn)生物乳化劑的嗜熱地芽孢桿菌及其在高凝油開采中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物化工和能源開采技術(shù)領(lǐng)域，具體來說，涉及到一種高產(chǎn)生物乳化 劑的基因工程菌及其在高凝油開采中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物表面活性劑是一類由動物、植物、微生物產(chǎn)生，具有疏水基團和親水基團的兩 親性物質(zhì)。生物表面活性劑按照分子量的大小可以分為兩類：一類是低分子量的表面活性 劑，如糖脂、磷脂、脂肪酸、短鏈肽等，它們的活性作用主要是降低油-水的界面張力；另一 類多為生物大分子，又稱為乳化劑，它們一般不會使油水界面張力降的很低，但對油-水界 面具有很強的親和力，能吸附在分散的油滴表面，防止油滴聚集，從而使這種乳狀液穩(wěn)定。 目前研宄較多的乳化劑主要有Emulsan、Liposan、Alasan。
[0003] 隨著人們環(huán)保和可持續(xù)發(fā)展意識的增強，相對于化學(xué)合成的表面活性劑，由活細 胞產(chǎn)生的自然表面活性劑受到了越來越多的關(guān)注。在自然表面活性劑中，這些由微生物產(chǎn) 生的表活劑表面活性高，具有很好的親水親油性能，較為適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。由各類微 生物產(chǎn)生的生物表活劑具有結(jié)構(gòu)多樣性、可降解性、低毒、耐高溫等優(yōu)良特性，使其在工業(yè)、 農(nóng)業(yè)、紡織行業(yè)、醫(yī)療各領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。
[0004] 近年來，常溫菌株生產(chǎn)表活劑的研宄越來越多，例如關(guān)于生產(chǎn)鼠李糖脂的菌株生 產(chǎn)溫度均在30-37°C，而對于嗜熱菌產(chǎn)表活劑的探索卻相對匱乏，但是嗜熱菌株產(chǎn)表活劑的 優(yōu)勢不容忽視。由于他們的生長環(huán)境需要高溫條件，使得生產(chǎn)乳化劑的過程有著更快的反 應(yīng)速度，可以降低發(fā)酵液的粘度便于菌種呼吸，降低污染雜菌的危險等。
[0005] 南開大學(xué)的專利200710056753. 4公開了一株嗜熱地芽孢桿菌DM-2及其對重質(zhì)烷 烴的降解效果和乳化原油效果；專利200710061323. 1公開了菌株DM-2生產(chǎn)生物乳化劑的 方法及其應(yīng)用，相比這兩個專利公開的菌株DM-2,其乳化劑產(chǎn)量低，僅為0. 4-0. 6g/L，從一 定意義上制約了其使用效果和成本，所以利用基因工程改造的方法提高生物乳化劑的產(chǎn)量 和菌株的乳化效果具有重要的意義。此外，利用廉價碳源進行生物乳化劑的發(fā)酵以進一步 降低生物乳化劑的成本也具有很高的應(yīng)用價值。
[0006] 高凝油是一種特種油資源，具有凝固點高（>40°C)、含蠟高（>36% )的特點，且 膠質(zhì)和瀝青質(zhì)的含量也比較高（最高可達13% )。凝固點和含蠟量呈一定的相關(guān)性，T= 30. 879+0. 508f(T=凝固點，°C;f=含蠟量，％ )。高凝油的這些特性使得它具有獨特 的流變性表征：1、當所處環(huán)境的溫度在析蠟點以上時，高凝油處于溶解狀態(tài)，其流動性與一 般原油一致；2、當所處溫度降到析蠟點溫度以下反常點溫度以上時，就會有分子聚集現(xiàn)象 的發(fā)生，并伴有蠟晶析出，高凝油呈懸浮狀，近似流體；3、當所處溫度繼續(xù)下降到反常點溫 度以下時，蠟晶析出量會增多，此時高凝油為假塑性流體；4、當所處溫度下降到凝固點以下 時，此時液態(tài)烴就會失去流動性，成為塑性流體。
[0007]高凝油油藏在世界分布較廣，中國是高凝油資源最為豐富的國家之一，已知中國 高凝油資源量可達50X108噸以上，占世界高凝油資源的30~40%，其中遼河盆地的資源 最為豐富。從目前高凝油油藏開發(fā)效果看，存在著諸多的問題：含水上升較快，析蠟溫度較 高（接近地層溫度），采出程度不高，原油地層粘度低，水驅(qū)效率較低，熱采成本較高等。針 對高凝原油油藏地質(zhì)特點和油藏流體特性，傳統(tǒng)的采油方式主要原理是動力加熱開采，使 高凝油不能達到它的凝固點，從而以液體形式開采，以期降低開采難度。但這種技術(shù)也存在 一定缺陷或制約，有些開采技術(shù)的成本相對較高，經(jīng)濟效益從而受損，如水利活塞泵采油技 術(shù)，它的井管復(fù)雜，成本高，密封度很難達標，限制了發(fā)展。目前，除了熱采技術(shù)外，微生物采 油技術(shù)是高凝油開采經(jīng)濟上可行的三采技術(shù)之一，但是開采效果不穩(wěn)定，急需進一步深入 研宄，找出穩(wěn)定的菌種體系和開采方案。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種高產(chǎn)生物乳化劑的嗜熱脂肪地芽孢桿菌基因工程菌和 該菌株的發(fā)酵液在高凝油開采中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明提供的嗜熱地芽孢桿菌A-2,該菌種已于2014年12月10日保藏在"中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心"（北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號），保藏 號為CGMCCNo. 10151，建議分類命名：嗜熱脂肪土芽孢桿菌（Geobacillussp.)。
[0010] 本發(fā)明提供的嗜熱地芽孢桿菌A-2,是利用芽孢桿菌表達載體pUCG18,將嗜熱地 芽孢桿菌DM-2 (見2007100567534號專利）的糖基轉(zhuǎn)移酶orf05703在自身多拷貝表達而 制成的基因工程菌。
[0011] 本發(fā)明同時提供了一種生物乳化劑，該生物乳化劑是一種糖蛋白類生物乳化劑， 由菌株A-2在45-70°C條件下利用葡萄糖、乙酸鈉、乙醇、十六烷或橄欖油這5種不同類型的 碳源中的一種發(fā)酵產(chǎn)生，產(chǎn)量可達3-4g/L。具體發(fā)酵條件如下：將保藏于甘油管中的菌株 A-2活化，涂布LB平板，60°C培養(yǎng)過夜。挑取單菌落，接種到5mL的LB試管，60°C，200rpm， 培養(yǎng)12h。再以1 %的接種量接種到LB三角瓶中作為種子液，培養(yǎng)至00_為0. 5-0. 8,即處 于對數(shù)期內(nèi)，5%接種到產(chǎn)乳化劑的發(fā)酵培養(yǎng)基中，60°C，200rpm，培養(yǎng)48h。
[0012] 所述產(chǎn)乳化劑的發(fā)酵培養(yǎng)基配方以g/L計為：K2HP04?3H204.8 ;KH2P041. 5 ; (NH4) 2S041 ;檸檬酸三鈉0? 5 ;MgS04?7H20 0? 2 ;酵母提取物0? 1 ;CaCl2?2H20 0? 002 ; MnCl2 ? 4H200. 0004 ;NiCl2 ? 6H20 0? 0004 ;ZnS04 ? 7H20 0? 0004 ;FeCl3 ? 6H20 0? 0002 ; NaM〇04?2H20 0. 0002 ;蒸餾水1000ml，其中碳源為葡萄糖、乙酸鈉、乙醇、十六烷或橄欖油5 類中的一種，各碳源的添加量分別為5g/L。
[0013] 所述生物乳化劑的組成按質(zhì)量比計為72%多糖和28%蛋白，該生物乳化劑對正 己烷、柴油、二甲苯、十六烷、橄欖油和原油均有顯著的乳化效果，乳化指數(shù)達到100%，是一 種耐高溫、耐鹽和耐酸堿的高效乳化劑。
[0014] 本發(fā)明提供的菌株A-2發(fā)酵液對高凝油有顯著的乳化作用，能夠?qū)⒏吣腿闋钜?的凝固點由42°C降低到4°C，粘度由57mPa?f降低到1. 3mPa?s、降粘率達到97. 72%， 降凝率達到90. 48%。
[0015] 本發(fā)明提供的菌株A-2發(fā)酵液（生物乳化劑）可應(yīng)用于高凝油井的增產(chǎn)中，每口 油井注入菌株A-2的發(fā)酵液2-4噸和乳化劑發(fā)酵培養(yǎng)基90方，具體應(yīng)用方法如下：
[0016] 方法一：反替菌株A-2的乳化劑發(fā)酵培養(yǎng)基15方，排量0.5方/分鐘，關(guān)閉油管閥 門，注入2噸菌株A-2的發(fā)酵液，反擠菌株A-2的乳化劑發(fā)酵培養(yǎng)基75方，擠入排量0. 5方 /分鐘，用15方清水頂替，頂替排量0. 5方/分鐘，關(guān)井7天后開井生產(chǎn)?；蛘?，
[0017] 方法二：反替菌株A-2的乳化劑發(fā)酵培養(yǎng)基15方，排量0.5方/分鐘，關(guān)閉油管閥 門，注入2噸菌株A-2的發(fā)酵液，反擠菌株A-2的發(fā)酵培養(yǎng)基30方，擠入排量0. 5方/分鐘， 用15方清水頂替，頂替排量0. 5方/分鐘，關(guān)井7天，反替菌株A-2的發(fā)酵培養(yǎng)基15方，排 量0. 5方/分鐘，再注入菌株A-2的發(fā)酵液2噸，排量1方/分鐘，反擠菌株A-2的發(fā)酵培 養(yǎng)基30方，擠入排量0. 5方/分鐘，關(guān)井7天后開井生產(chǎn)。其中A井生產(chǎn)時間為90天，與 注入微生物發(fā)酵液前1個月數(shù)據(jù)對比，每天增油0. 7噸，90天累計增油61. 6噸，產(chǎn)量基本穩(wěn) 定；B井生產(chǎn)時間為90天，與