一種嗜熱堿性重組含錳過(guò)氧化氫酶及其畢赤酵母表達(dá)載體和工程菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種嗜熱堿性重組含錳過(guò)氧化氫酶及其表達(dá)載體和工程菌。本發(fā)明提供一種重組含錳過(guò)氧化氫酶的多核苷酸序列，如SEQIDNo：1所示。本發(fā)明根據(jù)畢赤酵母密碼子使用偏愛(ài)性，對(duì)ThermusthermophilusHB27來(lái)源的錳過(guò)氧化氫酶基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，當(dāng)優(yōu)化后的錳過(guò)氧化氫酶在畢赤酵母中表達(dá)時(shí)，5L發(fā)酵罐培養(yǎng)液中最高可檢測(cè)到過(guò)氧化氫酶酶活約為12000U/mL。
【專利說(shuō)明】一種嗜熱堿性重組含錳過(guò)氧化氫酶及其畢赤酵母表達(dá)載體和工程菌
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種嗜熱堿性重組含錳過(guò)氧化氫酶及其畢赤酵母表達(dá)載體和工程菌。
【背景技術(shù)】
[0002]過(guò)氧化氫酶(Catalase，簡(jiǎn)稱CAT)，催化分解過(guò)氧化氫為水和氧氣。CAT廣泛應(yīng)用于食品、紡織、造紙和醫(yī)藥等行業(yè)，其中在紡織工業(yè)中主要用于布料漂白后殘余H2O2的消除。與傳統(tǒng)工藝的水洗或化學(xué)助劑相比，CAT具有減少污染、提高后續(xù)印染質(zhì)量等優(yōu)點(diǎn)；但值得關(guān)注的是，印染工序通常是在高溫(T>70°C)堿性(pH>9)環(huán)境中進(jìn)行的，這就需要CAT具備嗜熱嗜堿的應(yīng)用特性。盡管CAT來(lái)源豐富，幾乎存在于所有的需氧微生物中，但市場(chǎng)上目前仍缺乏具備優(yōu)良紡織應(yīng)用特性的CAT。
[0003]過(guò)氧化氫酶按催化中心結(jié)構(gòu)差異可分為兩類:(I)含鐵卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)CAT，又稱鐵過(guò)氧化氫酶(FeCAT) ;(2)由錳離子代替鐵離子的卟啉結(jié)構(gòu)，又稱錳過(guò)氧化氫酶(MnCAT)，目前已發(fā)現(xiàn)約280種FeCAT和30種MnCAT。近年來(lái)，研究者發(fā)現(xiàn)個(gè)別來(lái)源于高溫堿性環(huán)境中的古細(xì)菌可以產(chǎn)生具有嗜熱嗜堿特性的MnCAT,例如:Metallosphaera hakonensis來(lái)源的MnCAT，在pH8.0-10.0環(huán)境中處理60min酶活損失小于20% ;在70°C下處理50min，酶活殘留率約在60%(Alkal1-tolerant high-activity catalase from a thermophilic bacteriumand its overexpression in Escherichia coli，Protein expression and purification，2008.57 (2): 255-26 0.)。但目前這類嗜熱MnCAT的研究仍處于初級(jí)階段，國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的該類MnCAT最高發(fā)酵酶活力僅約為20U/ml，國(guó)內(nèi)也鮮有報(bào)道。大腸桿菌和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前工業(yè)生產(chǎn)中最為成熟的基因工程表達(dá)系統(tǒng)，目前關(guān)于該酶在畢赤酵母中的表達(dá)的文獻(xiàn)還未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明鑒于上述情況，根據(jù)畢赤酵母密碼子使用偏愛(ài)性，對(duì)Thermusthermophilus HB27來(lái)源的錳過(guò)氧化氫酶基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，提供一種嗜熱堿性重組含錳過(guò)氧化氫酶及其畢赤酵母表達(dá)載體和工程菌，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明提供一種重組含錳過(guò)氧化氫酶的多核苷酸，其序列如SEQ ID No:1所示。
[0006]所述多核苷酸序列根據(jù)Thermus thermophilus來(lái)源的猛過(guò)氧化氫酶基因核苷酸序列，按照畢赤酵母(Pichia pastoris)密碼子使用偏愛(ài)件(http://gcua.schoedl.de/seqoverall v2.html)優(yōu)化設(shè)計(jì)。
[0007]本發(fā)明第二方面提供一種重組含錳過(guò)氧化氫酶，由所述的多核苷酸序列編碼。
[0008]本發(fā)明第三方面提供一種重組含錳過(guò)氧化氫酶表達(dá)載體(pPIC3.5K_MnCAT)，包含所述重組含錳過(guò)氧化氫酶的多核苷酸序列。[0009]優(yōu)選的,所述表達(dá)載體為pPIC系列表達(dá)載體。
[0010]更優(yōu)選的,所述pPIC系列表達(dá)載體為pPIC3.5K。所述pPIC3.5K購(gòu)自Invitrogen公司。
[0011]本發(fā)明第四方面提供一種工程菌(KM71/pPIC3.5K_MnCAT)，所述工程菌由所述重組含錳過(guò)氧化氫酶表達(dá)載體(PPIC3.5K-MnCAT)轉(zhuǎn)化獲得。
[0012]優(yōu)選的，所述工程菌由所述重組含錳過(guò)氧化氫酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母獲得。
[0013]更優(yōu)選的，所述畢赤酵母為畢赤酵母KM71。
[0014]本發(fā)明第五方面提供所述重組含錳過(guò)氧化氫酶的制備方法，包括如下步驟:[0015]將所述工程菌在種子培養(yǎng)基中活化后,轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)菌濃0D600達(dá)到100-120時(shí)，添加MnCl2,同時(shí)添加甲醇并進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0016]所得培養(yǎng)液的菌體破碎上清液中CAT酶活力可達(dá)12000U/ml。
[0017]本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，選擇適合的蛋白純化技術(shù)對(duì)所得培養(yǎng)液的具體破碎上清液進(jìn)行處理，以期獲得目標(biāo)重組含錳過(guò)氧化氫酶。
[0018]優(yōu)選的，所得培養(yǎng)液的菌體破碎上清液可依次通過(guò)常規(guī)蛋白純化方法中的疏水層析、陰離子交換和凝膠過(guò)濾等步驟進(jìn)行蛋白純化。
[0019]優(yōu)選的，所述種子培養(yǎng)基中活化的具體方法為:YPD培養(yǎng)基中，于30°C下200rpm/min 培養(yǎng) 19-22h。
[0020]優(yōu)選的，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為BMGY培養(yǎng)基或BSM培養(yǎng)基。
[0021]當(dāng)進(jìn)行發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)培養(yǎng)基中甘油耗盡時(shí)，進(jìn)行流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，控制甘油在培養(yǎng)液中的終濃度小于10g/l。
[0022]優(yōu)選的，轉(zhuǎn)接時(shí)按10%轉(zhuǎn)接。
[0023]優(yōu)選的，所述MnCl2添加完畢時(shí)的終濃度lmmol/L。
[0024]優(yōu)選的，所述添加MnCl2添加的方法為:直接將MnCl2加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，或?qū)⒕w離心收集后，重懸于新的含有MnCl2的發(fā)酵培養(yǎng)基中。
[0025]優(yōu)選的，所述添加甲醇的具體方法為:定期向培養(yǎng)基中補(bǔ)加甲醇至目標(biāo)濃度，或采用連續(xù)流加甲醇的方式，保持濃度為0.25%-l%(V/V)。
[0026]優(yōu)選的，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的具體條件為:在30°C流加甲醇誘導(dǎo)72_120h。
[0027]本發(fā)明根據(jù)畢赤酵母密碼子使用偏愛(ài)性，對(duì)Thermus thermophilus HB27來(lái)源的錳過(guò)氧化氫酶基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，當(dāng)優(yōu)化后的MnCAT在畢赤酵母中表達(dá)時(shí)，搖瓶發(fā)酵液中最高可檢測(cè)到CAT酶活為5700U/mL ;而當(dāng)該MnCAT工程菌在5L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)液中最高可檢測(cè)到CAT酶活約為12000U/mL，本發(fā)明通過(guò)基因密碼子優(yōu)化及發(fā)酵優(yōu)化首次實(shí)現(xiàn)了 Thermus thermophilus HB27來(lái)源的MnCAT在畢赤酵母中的高效表達(dá),且其發(fā)酵酶活值達(dá)到約12000U/mL，有利于該酶的進(jìn)一步應(yīng)用開(kāi)發(fā)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1表達(dá)載體pPIC3.5K-MnCAT的物理圖譜。
[0029]圖2表達(dá)載體pPIC3.5K-MnCAT的酶切鑒定；
[0030]MiMarke λ -EcoT14I digest ；1:SnaB I 和 Not I 雙酶切后的 DNA 片段。
[0031]圖3重組畢赤酵母E.coli PB-Ol的SDS-PAGE圖；[0032]M:Protein MW Marker ;1_3:KM71/pPIC3.5K_MnCAT。
【具體實(shí)施方式】
[0033]以下通過(guò)特定的具體實(shí)例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說(shuō)明書(shū)所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過(guò)另外不同的【具體實(shí)施方式】加以實(shí)施或應(yīng)用，本說(shuō)明書(shū)中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒(méi)有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。
[0034]在進(jìn)一步描述本發(fā)明【具體實(shí)施方式】之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍；在本發(fā)明說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一”和“這個(gè)”包括復(fù)數(shù)形式。
[0035]當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說(shuō)明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本【技術(shù)領(lǐng)域】技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。 [0036]除非另外說(shuō)明，本發(fā)明中所公開(kāi)的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說(shuō)明，具體可參見(jiàn)SambiOOk等 MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring HarborLaboratory Press,1989and Third edition, 2001 ；Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY,John ffiley&Sons,New York,1987and periodic updates ；the seriesMETHODS IN ENZYM0L0GY,Academic Press,San Diego ;WoIffe，CHROMATIN STRUCTURE ANDFUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998 ；METH0DS IN ENZYM0L0GY,Vol.304,Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.ffolffe,eds.),Academic Press, San Diego,1999 ;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol.119, Chromatin Protocols (P.B.Becker,ed.)Humana Press, Totowa, 1999 等。
[0037]所述重組含錳過(guò)氧化氫酶表達(dá)載體(pPIC3.5K-MnCAT)的構(gòu)建方法為:將所述重組含錳過(guò)氧化氫酶的多核苷酸序列兩端設(shè)計(jì)限制性內(nèi)切酶SnaB I和Not I酶切位點(diǎn)，重組含錳過(guò)氧化氫酶的多核苷酸序列經(jīng)SnaB I和Not I雙酶切后克隆至經(jīng)相同酶切后的胞內(nèi)表達(dá)載體PPIC3.5K上，構(gòu)建重組含錳過(guò)氧化氫酶表達(dá)載體。所述表達(dá)載體經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5ci中進(jìn)行保存。
[0038]重組含錳過(guò)氧化氫酶的多核苷酸序列中不具備但載體pPIC3.5K多克隆位點(diǎn)上具有限制性內(nèi)切酶SnaB I和Not I酶切位點(diǎn)。
[0039]所述表達(dá)載體pPIC3.5K-MnCAT的物理圖譜如圖1。
[0040]所述表達(dá)載體pPIC3.5K-MnCAT的SnaB I和Not I雙酶切圖譜如圖2所示。
[0041]所述工程菌(KM71/pPIC3.5K_MnCAT)的構(gòu)建方法為:從工程菌DH5 α /pPIC3.5K-MnCAT 中提取重組表達(dá)質(zhì)粒 pPIC3.5K_MnCAT，質(zhì)粒 pPIC9K_MnCAT 經(jīng) Sal I 進(jìn)行線性化酶切后，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母KM71感受態(tài)細(xì)胞，涂布于MD平板，挑取在MD平板上長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子，點(diǎn)種于含0.25-5mg/ml梯度濃度G418的YPD平板上培養(yǎng)，從而獲得基因工程菌P.pastoris KM71/pPIC3.5K_MnCAT。
[0042]工程菌P.pastoris KM71/pPIC3.5K_MnCAT在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)19_22h后，按10%轉(zhuǎn)接至發(fā)酵罐培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以25%的氨水控制pH5.0，30°C培養(yǎng)至菌濃0D600達(dá)到100-120時(shí)，流加0.25%-l%(V/V)的甲醇和ImM的Mncl2進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)72h，菌體破碎上清液中的酶活力可達(dá)約12000U/ml。
[0043]錳過(guò)氧化氫酶酶活的測(cè)定方法具體如下:采用分光光度法37°C測(cè)定CAT的酶活力，反應(yīng)體積為3mL，包括0.1mL的酶液樣品和2.9mL含10mmol/L H2O2的50mmol/LpH8.0Tris-HCl緩沖液，H2O2的分解速率用紫外分光光度計(jì)在240nm下測(cè)定。酶活活力單位(U/mL)的定義為:在37°C、pH8.0的條件下每分鐘分解I μ mo I H2O2所需的CAT酶量為一個(gè)
酶活單位。[0044]實(shí)施例1錳過(guò)氧化氫酶MnCAT酵母表達(dá)基因工程菌的構(gòu)建
[0045]1.1基于畢赤酵母密碼子使用偏愛(ài)性優(yōu)化設(shè)計(jì)的MnCAT基因
[0046]根據(jù)畢赤酵母(Pichia pastoris)密碼子使用的偏愛(ài)件(http://gcua.schoedl.de/seaoverall v2.html)優(yōu)化設(shè)計(jì)，所得密碼子優(yōu)化后的MnCAT基因具有如序列SEQ IDNo:1所示的核苷酸序列。
[0047]1.2MnCAT 酵母表達(dá)載體 pPIC3.5K_MnCAT 的構(gòu)建
[0048]在MnCAT基因的5’ -端和3’ -端分別設(shè)計(jì)該基因中不具備但載體pPIC3.5K多克隆位點(diǎn)上具有的限制性內(nèi)切酶SnaB I和Not I酶切位點(diǎn)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司直接合成，MnCAT基因片段經(jīng)SnaB I和Not I雙酶切后與至經(jīng)相同酶切后的表達(dá)載體pPIC3.5K進(jìn)行T4連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α的感受態(tài)細(xì)胞中，涂布至含IOOmg/L氨芐青霉素的LB平板，挑取單克隆菌落轉(zhuǎn)接至含100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行限制性內(nèi)切酶SnaB I和Not I的雙酶切鑒定。根據(jù)序列分析，重組質(zhì)粒pPIC3.5K-MnCAT經(jīng)SnaBI和Not I雙酶切后，應(yīng)分別獲得897Ibp和914bp大小的DNA片段。如圖2所示，DNA凝膠電泳的結(jié)果與預(yù)期值相符。將酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒pPIC3.5K_MnCAT送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示MnCAT基因序列與SEQID No:1序列一致，表明表達(dá)載體pPIC3.5K-MnCAT的構(gòu)建成功。
[0049]注:LB培養(yǎng)基組分為:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L。
[0050]1.3 重組表達(dá)菌株 KM71/pPIC3.5K_MnCAT 的構(gòu)建
[0051]重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC3.5K-MnCAT經(jīng)Sal I單酶切線性化后，電轉(zhuǎn)化P.pastorisKM71感受態(tài)細(xì)胞，涂布于MD平板，倒置于30°C培養(yǎng)至出現(xiàn)重組單菌落，挑取單菌落，點(diǎn)種至分別含0.25,0.5、1、2、4和5mg/ml梯度濃度G418的YPD平板上，最終在含4mg/ml G418的YPD平板上獲得可高效表達(dá)Mn-CAT的重組菌P.pastoris KM71/pPIC3.5K_MnCAT。
[0052]注:YH)培養(yǎng)基(g/L)組分為:蛋白胨20，酵母膏10，葡萄糖20。
[0053]實(shí)施例2重組菌KM71/pPIC3.5K_MnCAT的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)
[0054]2.1搖瓶種子培養(yǎng)
[0055]將重組菌KM71/pPIC3.5K_MnCAT 接種至 50mL YPD 培養(yǎng)基中，30°C、200rpm/min 培養(yǎng) 19-22h ；[0056]2.2搖瓶發(fā)酵培養(yǎng):
[0057]將種子培養(yǎng)液按10%的接種量轉(zhuǎn)接至50mL BMGY培養(yǎng)基中，30°C、200r/min培養(yǎng)19-22h ；4°C,6000r/min離心收集菌體，并用25mL含終濃度為lmmol/L MnCl2的BMMY培養(yǎng)基重懸菌體，30°C、200rpm/min培養(yǎng)，每20h向培養(yǎng)基中補(bǔ)加100%甲醇至終濃度為0.25%(V/V)進(jìn)行Mn-CAT的誘導(dǎo)表達(dá)，培養(yǎng)120h后，離心收集菌體、破碎細(xì)胞后對(duì)上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)在33Kda處存在明顯的蛋白條帶，與文獻(xiàn)報(bào)道的MnCAT蛋白分子量一致(圖3);破碎細(xì)胞后對(duì)上清液進(jìn)行酶活測(cè)定，結(jié)果顯示破碎上清液中CAT酶活力達(dá)到5700U/ml ο
[0058]將菌體破碎上清液于4°C，7000r/min離心15min，取上清；上清液中加入70%固體硫酸銨鹽析過(guò)夜，4°C,7000r/min離心15min,取沉淀物用適量pH7.6的磷酸緩沖液溶解，透析過(guò)夜,加入20%硫酸銨后通過(guò)0.4μ m膜過(guò)濾后制成上樣樣品；上疏水層析柱(Butyl-Toyopearl650-M, T0S0)，柱子用50mM磷酸鉀緩沖液(其中含有1.0mM，pH7.6的硫酸銨)平衡，平衡好以后，線性洗脫(洗脫液為:50mM磷酸鉀緩沖液中含有0-1.0mM的硫酸銨)，得到的含過(guò)氧化氫酶的部分在50mM的pH7.6的Tris-HCl進(jìn)行透析(目的是去硫酸銨)；取透析液上陰離子交換柱(DE-52DEAE_cellulose, Whatman),柱子先用50mM的pH7.6的Tris-HCl進(jìn)行平衡，平衡后線性洗脫(洗脫液為:50mM的pH7.6的Tris-HCl中含0-1.0mM的KCl),收集含酶部分，濃縮(用Centricon-30, Millipore進(jìn)行濃縮)；濃縮液上凝膠柱(S-200HR Seph-acryl, GE-Healthcare),柱子平衡、洗脫都用50mM ρΗ7.6的磷酸鉀緩沖液其中含0.15Μ的KCl ;收集到的含酶液(用50mM的pH7.6的Tris-HCl)脫鹽，獲得純化后的酶液。
[0059]將獲得的Mn-CAT蛋白進(jìn)行N端測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示所得Mn-CAT蛋白序列無(wú)誤，結(jié)果符合預(yù)期。
[0060]注:BMGY培養(yǎng)基組分:甘油10g/L，YNB13.4g/L，生物素4X 10_4g/L，磷酸鉀緩沖液
0.lmol/L (pH6.0)。
[0061]BMMY培養(yǎng)基組分:甲醇40mL/L，YNB13.4g/L，生物素4X 10_4g/L，磷酸鉀緩沖液
0.lmol/L (pH6.0)。
[0062]實(shí)施例3重組菌KM71/pPIC3.5K_MnCAT的5L發(fā)酵罐培養(yǎng)
[0063]3.1發(fā)酵罐種子培養(yǎng)
[0064]將重組菌KM71/pPIC3.5K_MnCAT 接種至 50mL 種子培養(yǎng)基中，30°C、200rpm/min 培養(yǎng) 19-22h。
[0065]發(fā)酵罐種子培養(yǎng)基組分為:蛋白胨15g/L，酵母膏15g/L，甘油10g/L，生物素4X 10-4g/L，磷酸鉀緩沖液 0.lmol/L (pH6.0)。
[0066]3.2發(fā)酵罐發(fā)酵
[0067]將種子培養(yǎng)液按10%的 接種量轉(zhuǎn)接至裝液量為2L的發(fā)酵罐BSM培養(yǎng)基中，發(fā)酵參數(shù)為--溫度30°C，pH5.0，通過(guò)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速控制溶氧在15-20% ;當(dāng)初始培養(yǎng)基中的甘油耗盡時(shí)，開(kāi)始流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，控制甘油在培養(yǎng)液中的終濃度小于10g/l ;當(dāng)重組菌生長(zhǎng)至0D_100-120時(shí)，開(kāi)始連續(xù)流加甲醇，控制甲醇在培養(yǎng)液中的體積終濃度小于1.5%(V/V),并添加終濃度為ImM的MnCl2,誘導(dǎo)培養(yǎng)72h，收集菌體、破碎細(xì)胞后對(duì)上清液進(jìn)行酶活測(cè)定，結(jié)果顯示破碎上清液中CAT酶活力達(dá)到約12000U/ml。[0068]將菌體破碎上清液于4°C，7000r/min離心15min，取上清；上清液中加入70%固體硫酸銨鹽析過(guò)夜，4°C,7000r/min離心15min,取沉淀物用適量pH7.6的磷酸緩沖液溶解，透析過(guò)夜,加入20%硫酸銨后通過(guò)0.4μ m膜過(guò)濾后制成上樣樣品；上疏水層析柱(Butyl-Toyopearl650-M, T0S0)，柱子用50mM磷酸鉀緩沖液(其中含有1.0mM，pH7.6的硫酸銨)平衡，平衡好以后，線性洗脫(洗脫液為:50mM磷酸鉀緩沖液中含有0-1.0mM的硫酸銨)，得到的含過(guò)氧化氫酶的部分在50mM的pH7.6的Tris-HCl進(jìn)行透析(目的是去硫酸銨)；取透析液上陰離子交換柱(DE-52DEAE_cellulose, Whatman),柱子先用50mM的pH7.6的Tris-HCl進(jìn)行平衡，平衡后線性洗脫(洗脫液為:50mM的pH7.6的Tris-HCl中含0-1.0mM的KCl),收集含酶部分，濃縮(用Centricon-30, Millipore進(jìn)行濃縮)；濃縮液上凝膠柱(S-200HR Seph-acryl, GE-Healthcare),柱子平衡、洗脫都用50mM pH7.6的磷酸鉀緩沖液其中含0.15M的KCl ;收集到的含酶液(用50mM的pH7.6的Tris-HCl)脫鹽，獲得純化后的酶液。
[0069]將獲得的Mn-CAT蛋白進(jìn)行N端測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示所得Mn-CAT蛋白序列無(wú)誤，結(jié)果符合預(yù)期。[0070]注:BSM培養(yǎng)基=CaSO40.93g/L, K2S0418.2g/L, MgSO4.7Η2014.9g/L, Κ0Η4.13g/L,甘油 30.0g/L，85% 磷酸 26.7mL/L, PTM14.35mL/L。
[0071 ] PTM 微量元素液:CuS04.5H206g/L, KI0.08g/L, MnSO4.H203g/L, NaMoO3.2H200.2g/L, H3BO30.02g/L, CoCl220g/L, ZnCl220g/L, FeSO4.7H2065g/L,生物素 0.2g/L, H2S045.0mL/L。
[0072]流加補(bǔ)料生產(chǎn)培養(yǎng)基:50% (w/v)甘油(含4mL/L PTM微量元素液)。
[0073]流加補(bǔ)料誘導(dǎo)培養(yǎng)基:100%甲醇(含10mL/L PTM微量元素液)。
[0074]綜上所述，通過(guò)本發(fā)明所提供的重組含錳過(guò)氧化氫酶的序列所表達(dá)的CAT酶活力達(dá)到約12000U/ml，具高度產(chǎn)業(yè)利用價(jià)值，具備很好的應(yīng)用開(kāi)發(fā)潛力。
[0075]上述實(shí)施例僅例示性說(shuō)明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因此，舉凡所屬【技術(shù)領(lǐng)域】中具有通常知識(shí)者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。
【權(quán)利要求】
1.一種重組含錳過(guò)氧化氫酶的多核苷酸，其序列如SEQ ID No:l所示。
2.一種重組含錳過(guò)氧化氫酶，由權(quán)利要求1所述的多核苷酸序列編碼。
3.一種重組含錳過(guò)氧化氫酶表達(dá)載體，包含如權(quán)利要求1所述的重組含錳過(guò)氧化氫酶的多核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求3所述的重組含錳過(guò)氧化氫酶表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體為PPIC系列表達(dá)載體。
5.如權(quán)利要求4所述的重組含錳過(guò)氧化氫酶表達(dá)載體，其特征在于，所述pPIC系列表達(dá)載體為PPIC3.5K。
6.一種工程菌，所述工程菌由權(quán)利要求3-5任一權(quán)利要求所述的重組含錳過(guò)氧化氫酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)化獲得。
7.如權(quán)利要求6所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌由權(quán)利要求3-5任一權(quán)利要求所述的重組含錳過(guò)氧化氫酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母獲得。
8.如權(quán)利要求7所述的工程菌，其特征在于，所述畢赤酵母為畢赤酵母KM71。
9.一種重組含錳過(guò)氧化氫酶的制備方法，包括如下步驟:將權(quán)利要求6-8任一權(quán)利要求所述的工程 菌在種子培養(yǎng)基中活化后，轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)菌濃0D600達(dá)到100-120時(shí)，添加MnCl2和甲醇，并進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。
10.如權(quán)利要求9所述的一種重組含錳過(guò)氧化氫酶的制備方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基。
11.如權(quán)利要求9所述的一種重組含錳過(guò)氧化氫酶的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為BMGY培養(yǎng)基或BSM培養(yǎng)基。
12.如權(quán)利要求9所述的一種重組含錳過(guò)氧化氫酶的制備方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的具體條件為:在30°C流加甲醇誘導(dǎo)72-120h。
13.如權(quán)利要求9所述的一種重組含錳過(guò)氧化氫酶的制備方法，其特征在于，所得誘導(dǎo)培養(yǎng)培養(yǎng)液的菌體破碎上清液依次通過(guò)常規(guī)蛋白純化方法中的疏水層析、陰離子交換和凝膠過(guò)濾進(jìn)行蛋白純化，即得所述重組含錳過(guò)氧化氫酶。
【文檔編號(hào)】C12N15/53GK103882038SQ201410128235
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年4月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月1日
【發(fā)明者】趙志軍, 史吉平, 姜標(biāo), 孫俊孫, 何曉娟 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海高等研究院