1.一種鼠李糖乳桿菌凍干粉的制備方法,其特征在于,包括如下步驟:
1)制備發(fā)酵用的菌種
1.1)劃線培養(yǎng):鼠李糖乳桿菌菌粉用無菌水稀釋后,于MC培養(yǎng)基上分區(qū)劃線,37℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)48~72小時;
1.2)一級純化培養(yǎng):挑取MC培養(yǎng)基平皿上的單菌落,接種至裝有MRS液體培養(yǎng)基的試管中,密封,37℃培養(yǎng)箱恒溫靜置培養(yǎng)17~24小時,得一級純化菌懸液;
1.3)二級純化培養(yǎng):按3~5%接種量,將培養(yǎng)好的一級菌懸液接種至裝有MRS液體培養(yǎng)基的三角瓶中,密封,37℃培養(yǎng)箱恒溫靜置培養(yǎng)17~24小時,得二級純化菌懸液;
1.4)菌泥制備與保存:將二級純化菌懸液進行離心,12000rpm離心10分鐘得到菌泥,將菌泥溶解于MRS液體培養(yǎng)基與50%甘油溶液組成的混合液中,得菌泥混合液,將菌泥混合液分裝在已滅菌的凍存管中,封口膜密封,凍存于-40~-80℃低溫冰箱內,得鼠李糖乳桿菌菌泥凍存管,備用;
2)菌種發(fā)酵
2.1)凍存菌泥復蘇:取存于低溫冰箱內的鼠李糖乳桿菌菌泥凍存管,立即放入37℃水浴鍋內進行菌種復蘇,至凍存管內液體全部融化;
2.2)菌種一級培養(yǎng):將復蘇好的菌泥混合液1~2ml直接接種至裝有基礎培養(yǎng)基的三角瓶中,三角瓶密封,37℃培養(yǎng)箱恒溫靜置培養(yǎng)17~24小時;
2.3)菌種二級培養(yǎng):按照2~6%接種量,將一級培養(yǎng)結束的菌懸液接種至裝有基礎培養(yǎng)基的三角瓶中,基礎培養(yǎng)基裝液體積占三角瓶容積的40%,三角瓶密封,37℃培養(yǎng)箱恒溫靜置培養(yǎng)17~24小時;
2.4)菌種三級培養(yǎng):按照2~6%接種量,將二級培養(yǎng)結束的菌懸液接種至裝有基礎培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中,基礎培養(yǎng)基裝液體積占發(fā)酵罐容積的60%,開啟發(fā)酵罐攪拌槳,轉速為100rpm,通氣量為0,37℃恒溫培養(yǎng)8~15小時;
2.5)菌種四級發(fā)酵:按照2~6%接種量,將三級培養(yǎng)結束的菌懸液接種至裝有優(yōu)化培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中,優(yōu)化培養(yǎng)基裝液體積占發(fā)酵罐容積的60%,開啟發(fā)酵罐攪拌槳,轉速為100rpm,通氣量為0,37℃恒溫培養(yǎng),在發(fā)酵開始3小時后,通過流加食品級NaOH溶液來維持菌液的恒pH為5.50~6.00,培養(yǎng)周期8~15小時,直至監(jiān)測到菌液OD600值停止增長,立即停止發(fā)酵;
3)凍干粉的制備
3.1)發(fā)酵液離心:發(fā)酵結束后,將發(fā)酵罐罐體溫度調低,當罐內發(fā)酵液溫度低于20℃時,準備利用離心設備進行離心,離心結束后,收集離心設備轉鼓內的菌泥;
3.2)冷凍干燥:菌泥收集完畢后,按照菌泥:凍干保護劑=1:1~2的體積比,向菌泥中添加凍干保護劑,并攪拌、混合均勻,分裝到冷凍干燥機托盤,然后將冷凍干燥機托盤放入冷凍干燥機內進行菌粉的凍干,保持真空度0~1.0Pa,持續(xù)凍干57~72小時;
3.3)收集凍干粉,按質量要求進行粉碎后包裝。
2.如權利要求1所述的制備方法,其特征在于,步驟1.4)所述MRS液體培養(yǎng)基與50%甘油溶液的體積比為1:1,MRS液體培養(yǎng)基與50%甘油溶液組成的混合液與離心前菌懸液的體積比為1:10。
3.如權利要求1所述的制備方法,其特征在于,步驟2)中基礎培養(yǎng)基的制備,配方:酵母蛋白胨6.0~10.0g/L、葡萄糖19.0~25.0g/L、酵母浸出物2.0~4.0g/L、乙酸鈉4.5~6.0g/L、硫酸鎂0.4~0.6g/L、吐溫80 0.5~0.75g/L、低聚異麥芽糖1.0~2.5g/L、磷酸二氫鉀1.5~3.0g/L、余量為無菌水,pH值6.20~6.80;按照配方比例稱量、加熱溶解,如果培養(yǎng)基的pH值低于6.20,則用1mol/L食品級NaOH溶液調培養(yǎng)基pH值至6.20~6.80,115℃下滅菌30min。
4.如權利要求1所述的制備方法,其特征在于,步驟2)中優(yōu)化培養(yǎng)基的制備,配方:酵母蛋白胨11.0~15.0g/L、葡萄糖25.0~30.0g/L、酵母浸出物6.0~8.0g/L、乙酸鈉2.0~3.0g/L、硫酸鎂0.10~0.15g/L、吐溫80 0.5~0.75g/L、低聚異麥芽糖1.0~2.5g/L、磷酸二氫鉀1.5~3.0g/L、余量為無菌水,pH值6.20~6.80;按照配方比例稱量、加熱溶解,如果培養(yǎng)基的pH值低于6.20,則用1mol/L食品級NaOH溶液調培養(yǎng)基pH值至6.20~6.80,115℃下滅菌30min。
5.如權利要求1所述的制備方法,其特征在于,步驟3.1)所述離心設備采用管式離心機,離心前對轉鼓進行蒸汽滅菌30min,轉速為10000~15000rpm。
6.如權利要求1所述的制備方法,其特征在于,步驟3.2)中凍干保護劑配方為:脫脂奶粉60.0~80.0g/L、麥芽糊精30.0~45.0g/L、海藻糖100.0~300.0g/L、吐溫80 0.5~0.75g/L、甘油8.0~15.0g/L、谷氨酸鈉0.8~1.0g/L、余量為無菌水,pH值為6.80~7.50。
7.如權利要求6所述的制備方法,其特征在于,所述凍干保護劑的制備方法為:
按配方比例準確稱取脫脂奶粉,取配方中部分無菌水用于完全溶解脫脂奶粉,于115℃下滅菌30min,得溶液A;
其他組分按照配方比例稱量、混合,用配方中剩余部分的無菌水溶解,于115℃下滅菌30min,得溶液B;
滅菌結束放置至室溫后,在無菌間內將溶液A和溶液B混合均勻得pH值為6.80~7.50的凍干保護劑,將制備好的凍干保護劑冷藏于-4℃冰箱內備用。
8.如權利要求7所述的制備方法,其特征在于,若凍干保護劑的pH值低于6.80,則用1mol/L食品級NaOH溶液調pH值至6.80~7.50。
9.如權利要求1所述的制備方法,其特征在于,步驟3.2)中采用冷凍干燥機進行菌粉凍干時,冷凍干燥機的溫度和凍干時間按區(qū)段設置,具體為,第1區(qū)段:凍干時長3h,溫度設定為-25℃;第2區(qū)段:凍干時長40~55h,溫度設定為-25℃;第3區(qū)段:凍干時長4h,溫度設定為-10℃;第4區(qū)段:凍干時長4h,溫度設定為10℃;第5區(qū)段:凍干時長2h,溫度設定25℃;第6區(qū)段:凍干時長4h,溫度設定為30℃。