本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及產(chǎn)生天然紅色素微生物赤紅球菌及其紅色素制備方法。更具體的說是：一種發(fā)酵生產(chǎn)紅色素赤紅球菌的菌種，該菌種是本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的一株能有效生產(chǎn)紅色素的新菌株，用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)提取簡單且穩(wěn)定性好。
背景技術(shù)：
色素是廣泛應用于食品工業(yè)、化妝品生產(chǎn)、紡織和日用品生產(chǎn)中，為產(chǎn)品帶來較好的附加值。但合成色素的潛在危害性致癌、致畸等，其應用日益受到排斥，而天然色素越來越受到人們的青睞。天然色素的來源主要分為動物色素、植物色素、微生物色素和礦物色素等。動、植物來源色素己經(jīng)不能滿足工業(yè)高速發(fā)展的需求。近年來，致力于尋找可供代替的天然色素的研究增多，而這些研究大部分把目光投向了微生物色素。一些微生物在生長過程中會產(chǎn)生色素，而且微生物色素生長快、易培養(yǎng)、可簡單地大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，微生物色素漸漸成為一種獲取天然色素的重要途徑。更重要的是其安全性、適用范圍以及最大用量都比人工合成色素有明顯的優(yōu)勢。紅色色素作為三大基本色素之一具有很高的“黃金含量”它可與藍、黃品系天然色素調(diào)配成多種色調(diào)，使天然色素的色彩更加豐富 。天然紅色色素不僅可以賦予食品繽紛的色彩,而且有一些還具有多種生理功能,可廣泛用于醫(yī)藥、食品和化妝品領(lǐng)域。研究和開發(fā)無毒的天然紅色色素已經(jīng)成為色素發(fā)展的總趨勢,己經(jīng)形成了以天然色素為主導的市場。因此天然紅色色素的研究和開發(fā)有著廣闊的前景和發(fā)展?jié)摿Α?/p>
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種赤紅球菌（CGMCC No.12604）發(fā)酵生產(chǎn)天然紅色素的培養(yǎng)基配方及天然紅色素的提取工藝。所制備的天然紅色素可作為食品添加劑、飼料添加劑或精制后作為藥品或彩妝類化妝品的高級添加劑。
本發(fā)明的一個目的是提供一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)天然紅色素的菌種，其分類屬赤紅球菌（Rhodococcus ruber）,保藏號為CGMCC No. 12604。
本發(fā)明的另一個目的是公開了采用赤紅球菌（Rhodococcus ruber）,保藏號為CGMCC No. 12604菌種制備天然紅色素的方法。
本發(fā)明還一個目的是公開了的采用赤紅球菌（Rhodococcus ruber）,保藏號為CGMCC No. 12604菌種發(fā)酵生產(chǎn)天然紅色素的制備方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開的技術(shù)內(nèi)容如下：
一種赤紅球菌，其分類屬赤紅球菌（Rhodococcus ruber）,保藏號為CGMCC No. 12604。
本發(fā)明提供的CGMCC No. 12604菌株是一株能生產(chǎn)天然紅色素的新菌株，用該菌株發(fā)酵糖質(zhì)原料生產(chǎn)紅色素。
抗真菌脂肽微生物發(fā)酵菌株，其分類屬赤紅球菌（Rhodococcus ruber）,保藏號為CGMCC No. 12604，保藏日期2016年6月12日。保藏地點：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（China General Microbiological Cultuer Collection Centre）進行保藏，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼：100101。
赤紅球菌的生理生化特性如下：
該菌細胞為桿狀，革蘭染色均勻，且為陽性，不產(chǎn)生芽孢。在肉湯培養(yǎng)基平板上菌落呈圓形或不規(guī)則狀，菌株菌落邊緣整齊呈圓形,表面光滑濕潤紅色。菌株無鞭毛 ,不運動, 不發(fā)光, 紅色素只產(chǎn)在胞內(nèi) ,培養(yǎng)基內(nèi)無色素。
本發(fā)明進一步公開了采用赤紅球菌（Rhodococcus ruber）,保藏號為CGMCC No. 12604菌種制備天然紅色素的方法：
（1）種子培養(yǎng)和培養(yǎng)基
采用的發(fā)酵菌株為CGMCC No. 12604，種子培養(yǎng)基組成（g/L）：葡萄糖10~30g，蛋白胨2~5g，酵母粉5 g/L、氯化鈉 10 g/L、K2HPO4 2~6g，pH 7.0～7.2；150~180轉(zhuǎn)/分鐘搖床震蕩培養(yǎng)，30~40℃，36~48h。
（2）采用的發(fā)酵菌株為CGMCC No. 12604，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為（g/L）：糖質(zhì)原料20~40g，蛋白胨2~15g，酵母粉15 g/L、玉米漿15 g/L，氯化鈉 10 g/L、檸檬酸鈉1.5~3g，MgSO4·7H20 0.1~ 0.2g，K2HPO4 2~6g，pH 7.0～7.2；
（3）發(fā)酵培養(yǎng)：按1%-10%（v/v）的接種量將培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30~40℃，發(fā)酵通氣量為5~13m3/h，罐壓 0.02~0.09 MPa，攪拌速度120-150轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時間120~144小時，發(fā)酵過程中通入無菌空氣，用氨水或液堿維持發(fā)酵液pH在6.5~7.5，發(fā)酵過程中通入無菌空氣，用氨水或液堿維持發(fā)酵液pH在6.5~7.5，發(fā)酵結(jié)果紅色素產(chǎn)量為1~2g/L。
（4）紅色素提取方法:采用反復凍融破壁法和超聲波破壁法，取發(fā)酵液于離心管中，4000r/min 離心10min，棄去上清液，用去離子水洗滌沉淀得濕菌體，立即放置于-20°C冰箱12h連續(xù)重復兩次，加入100%乙醇混勻，在冰浴上進行超聲波破碎處理，超聲功率200w，超聲時間5s，間隔時間5s，總時間30min，離心去除菌體，即可得到乙醇色素提取液。
本發(fā)明所述的制備方法，其中糖質(zhì)原料包括：葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、可溶性淀粉糖化液或玉米粉糖化液。
本發(fā)明更加詳細的描述如下：
（1）微生物菌株的篩選與鑒定：
將菌株分別接種到 1% 葡萄糖、蔗糖、L- 阿拉伯糖、甘露醇等糖的無機鹽液體培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)3~7d，觀察菌株生長狀況。該菌株能利用糊精 、吐溫40 、吐溫80、D-果糖、α-D-葡萄糖、α-甘露糖、D-阿洛酮糖、D-核糖、蔗糖等多種糖類乙酸、β-羥乙酸、α-羥乙酸、戊酮酸、乳酸、丙酸、丙酮酸、L- 谷氨酸等有機酸還可以利用丙酮酸甲酯、琥珀酸單甲基酯，但不能利用D-乳酸甲酯。不能利用葡萄糖產(chǎn)氣，能在 NaCl 濃度為 2% 的環(huán)境下生長，為革蘭氏陽性菌，與赤紅球菌的生長特性一致菌株的生理生化特征均與布坎南和吉本斯等（1984）編著的《伯杰細菌鑒定手冊》第八版和東秀珠、蔡妙英（2001）編著的《常見細菌鑒定手冊》中描述的赤紅球菌菌相同。
（2）16SrDNA 序列測定: 對該菌株的16SrDNA 序列進行基因克隆, 擴增獲得 1438bp 的序列。將該 16SrDNA 序列在GenBank 中進行同源性比對可知,該菌株與赤紅球菌(Rhodococcus ruber)親緣關(guān)系最為接近,相似性達 99%。通過該菌株生長生理特性和16SrDNA 序列測定結(jié)果判斷其為赤紅球菌。菌株的16SrDNA 的序列如下：
Rhodococcus sp. (CGMCC No. 12604) 16S rDNA gene
TCGAACGCTGGGGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGTAAGGCCCTTTCGGGGGTACACGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACCGGGTCTAATACCGGATATGAGCTCCTGCCGCATGGTGGGGGTTGGAAAGTTTTTCGGTGCAGGATGAGTCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGACCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGTCTTCGGATTGTAAACTCCTTTCAGTAGGGACGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTGCCAGCAACCACGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCACGTCGTCTGTGAAATCCTCCAGCTCAACTGGGGGCGTGCAGGCGATACGGGCAGACTTGAGTACTACAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGTAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGAGCAGATACCCTGGTAAGTCCATGCCGTAAGCGGTGGGCGCTAGGTGTGGGGTCCTTCCACGGATTCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGTCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTAGGCTTGACATATACAGGACGACGGCAGAGATGTCGTTTCCCTTGTGGCTTGTATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTCAGATGCTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTGTCTCATGTTGCCAGCACGTTATGGTGGGGACTCGTGAGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCTAGTACAGAGGGCTGCGAGACCGCGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCTAGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCTTGTGGAGGGAGCCGTCGAAGGTGGGATCTCGCGATTTGA
（3）微生物菌株的培養(yǎng)與發(fā)酵生產(chǎn)紅色素：
斜面和種子培養(yǎng)基的組成（g/L）：葡萄糖1~3，胰蛋白胨5~10，酵母粉3~6，NaCl 6~12，去離子水配制，pH 7.2～7.5；固體培養(yǎng)基需加15g瓊脂粉。
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成（g/L）：糖質(zhì)原料20~40g，蛋白胨2~15g，酵母粉15 g、玉米漿15 g，氯化鈉 10 g、檸檬酸鈉1.5~3g，MgSO4·7H20 0.1~ 0.2g，K2HPO4 2~6g，pH 7.0～7.2；發(fā)酵培養(yǎng)：按1%~10%（v/v）的接種量將培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30~40℃，發(fā)酵通氣量為5~13m3/h，罐壓 0.02~0.09 MPa，攪拌速度120-150轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時間120~144小時，發(fā)酵過程中通入無菌空氣，用氨水或液堿維持發(fā)酵液pH在6.5~7.5，發(fā)酵過程中通入無菌空氣，用氨水或液堿維持發(fā)酵液pH在6.5~7.5，發(fā)酵結(jié)果紅色素產(chǎn)量為1~2g/L。
本發(fā)明用于發(fā)酵的糖質(zhì)原料可以是葡萄糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、玉米粉糖化液。發(fā)酵過程通入無菌空氣，用氨水或液堿維持發(fā)酵液的pH在6.5~7.5，發(fā)酵液中細菌紅色素產(chǎn)量為1~2g/L。
紅色素提取方法:采用反復凍融破壁法和超聲波破壁法，取發(fā)酵液于離心管中，4000r/min 離心10min，棄去上清液，用去離子水洗滌沉淀得濕菌體，立即放置于-20℃冰箱12h反復凍融兩次，加入100%乙醇混勻，在冰浴上進行超聲波破碎處理，超聲功率200w，超聲時間5s間隔時間5s，總時間30min。離心去除菌體，即可得到乙醇色素提取液。
本發(fā)明進一步考察了采用赤紅球菌（Rhodococcus ruber）,保藏號為CGMCC No. 12604菌種制備的天然紅色素的穩(wěn)定性情況：
（1）光對色素的影響：取色素液置室內(nèi)紫外燈光下照射，在0、1、2、3、4、5h進行測定吸光度并觀察顏色變化情況。其保存率分別為100%、97.9%、97.8%、97.7%、91.9%、88.9%。該色素對紫外光較穩(wěn)定。取色素液置室內(nèi)白幟光下照射，在0、1、2、3、4、5h進行測定吸光度并觀察顏色變化情況。其保存率分別為100%、100%、100%、97.7 %、97 %、96.7%。該色素液在白幟光下很穩(wěn)定。
（2）溫度對色素的影響： 取色素液在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、條件下分別加熱0.5h 后，分別測定其溶液吸光度，其保存率分別為99.7%、99.4%、99%、98.9%、98.6%、98.1%、94.4%、92.7%。該色素溶液較耐高溫，常溫下穩(wěn)定性高。
（3）氧化劑對色素的影響：取色素溶液，用30%H2O2配置成0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%濃度的H2O2色素溶液，避光放置1h測其吸光度，其保存率分別為100%、99.8%、99.2%、98.1%、97.7%、97.5%。氧化劑H2O2對色素穩(wěn)定性的影響結(jié)果可見，色素在不同濃度的氧化劑下吸光度變化很小，與此相對應其顏色也無明顯變化，顯示該色素耐氧化劑性很好
（4）還原劑對色素的影響：取色素溶液，用Na2SO3配置成0、0.1、0.2、0.4、0.8mg/L濃度的Na2SO3色素溶液，避光放置1h測其吸光度，其保存率分別為100%、98.7%、97.6%、97.1%、96.4%。還原劑Na2SO3對色素穩(wěn)定性的影響結(jié)果可見，色素在不同濃度的還原劑下吸光度變化很小，與此相對應其顏色也無明顯變化，顯示該色素耐還原劑性很好。
（5）食品添加劑的影響:分別用山梨酸鉀、苯甲酸鈉、維生素C、檸檬酸鈉、乳酸配置成2mg/L的色素溶液，避光放置1h測其吸光度，其保存率分別為100%、100%、100%、100%、100%。色素液在食品添加劑影響下無任何變化，顯示該色素對食品添加劑非常穩(wěn)定。
本發(fā)明公開的產(chǎn)生天然紅色素的赤紅球菌及其制備方法與應用所具有的積極效果在于：
（1）赤紅球菌是一種無毒無害的微生物，可以進行工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)。
（2）由赤紅球菌菌體提取的色素對光和溫度的穩(wěn)定性好，可以廣泛應用于食品和化妝品中。
（3）提取完全、快速，生產(chǎn)工藝流程簡單、產(chǎn)品無毒性殘留，安全性高。
附圖說明
圖1為 紅球菌（Rhodococcus ruber）菌落形態(tài)圖；因為菌落產(chǎn)紅色素，所以呈紅色。
具體實施方式
下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實質(zhì)和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明所用原料及試劑均有市售。例如葡萄糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、玉米粉等均有市售。
實施例1
赤紅球菌，其分類屬赤紅球菌（Rhodococcus ruber）,保藏號為CGMCC No. 12604。
的篩選方法如下：
（1）取土壤樣品（富含腐殖質(zhì)）5克于種子培養(yǎng)基中，其中種子培養(yǎng)基組成（g/L）：葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母粉5 g、氯化鈉 10 g、K2HPO4 2g，pH 7.0～7.2；150~180轉(zhuǎn)/分鐘搖床震蕩培養(yǎng)，30~40℃，36~48h富集微生物。
（2）用接種環(huán)無菌挑?。?）富集的微生物菌液，在種子培養(yǎng)基組成（g/L）：葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母粉5 g、氯化鈉 10 g、K2HPO4 2g，pH 7.0～7.2，平板上劃線，靜置于培養(yǎng)箱中30~40℃，培養(yǎng)36~48h；
（3）觀察（2）平板中生長的紅色菌落，并將其無菌操作挑取到種子培養(yǎng)基組成（g/L）：葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母粉5 g、氯化鈉 10 g、K2HPO4 2~6g，pH 7.0～7.2，平板上劃線分離，靜置于培養(yǎng)箱中30℃，培養(yǎng)36h；
（4）經(jīng)過（3）分離得到的單菌落進行Biolog實驗，和16s rDNA序列測定和比對實驗。確定其菌株的種屬：
Biolog系統(tǒng)鑒定結(jié)果
實施例2
采用赤紅球菌（Rhodococcus ruber）,保藏號為CGMCC No. 12604菌種制備天然紅色素的方法：
（1）種子培養(yǎng)和培養(yǎng)基
采用的發(fā)酵菌株為CGMCC No. 12604，種子培養(yǎng)基組成（g/L）：葡萄糖20g，蛋白胨4g，酵母粉5 g、氯化鈉 10 g、K2HPO4 3g，pH 7.0～7.2；170轉(zhuǎn)/分鐘搖床震蕩培養(yǎng)，34℃，45h。
（2）采用的發(fā)酵菌株為CGMCC No. 12604，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為（g/L）：糖質(zhì)原料20~40g，蛋白胨4g，酵母粉15 g、玉米漿15 g，氯化鈉 10 g、檸檬酸鈉2.5，MgSO4·7H20 0.15g，K2HPO4 3g，pH 7.0～7.2。
（3）發(fā)酵培養(yǎng)：按1%~10%（v/v）的接種量將培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度35℃，發(fā)酵通氣量為8m3/h，罐壓 0.05 MPa，攪拌速度120~150轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時間134小時，發(fā)酵過程中通入無菌空氣，用氨水或液堿維持發(fā)酵液pH在7.0，發(fā)酵過程中通入無菌空氣，用氨水或液堿維持發(fā)酵液pH在7.0，發(fā)酵結(jié)果紅色素產(chǎn)量為1.5g/L。
（4）紅色素提取方法:采用反復凍融破壁法和超聲波破壁法，取發(fā)酵液于離心管中，4000r/min 離心10min，棄去上清液，用去離子水洗滌沉淀得濕菌體，立即放置于-20°C冰箱12h連續(xù)重復兩次，加入100%乙醇混勻，在冰浴上進行超聲波破碎處理，超聲功率200w，超聲時間5s，間隔時間5s，總時間30min，離心去除菌體，即可得到乙醇色素提取液。
本發(fā)明用于發(fā)酵的糖質(zhì)原料可以是葡萄糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉或玉米粉
培養(yǎng)基可以是（g/L）:葡萄糖40g，蛋白胨4g，酵母粉15 g,玉米漿15 g，氯化鈉 10 g,檸檬酸鈉2.5g，MgSO4·7H20 0.15g，K2HPO4 3g，pH 7.0～7.2；；
培養(yǎng)基可以是（g/L）:蔗糖 25g，蛋白胨4g，酵母粉15 g,玉米漿15 g，氯化鈉 10 g,檸檬酸鈉2.5g，MgSO4·7H20 0.15g，K2HPO4 3g，pH 7.0～7.2；；
培養(yǎng)基可以是（g/L）:果糖 25g，蛋白胨4g，酵母粉15 g,玉米漿15 g，氯化鈉 10 g,檸檬酸鈉2.5g，MgSO4·7H20 0.15g，K2HPO4 3g，pH 7.0～7.2；
培養(yǎng)基可以是（g/L）:可溶性淀粉 20g，蛋白胨4g，酵母粉15 g,玉米漿15 g，氯化鈉 10 g,檸檬酸鈉2.5g，MgSO4·7H20 0.15g，K2HPO4 3g，pH 7.0～7.2；；
培養(yǎng)基可以是（g/L）:玉米粉 20g，蛋白胨4g，酵母粉15 g,玉米漿15 g，氯化鈉 10 g,檸檬酸鈉2.5，MgSO4·7H20 0.15g，K2HPO4 3g，pH 7.0～7.2；
天然紅色素可用于油性食品 、調(diào)味汁 、水產(chǎn)品加工 、蔬菜制品 、果凍 、冰淇淋 、奶油 、人造奶油 、干酪 、色拉 、調(diào)味醬 、米制品 、烘烤食品等食品中 ,還廣泛應用于化妝品和制藥業(yè)中。本發(fā)明制備的赤紅球菌紅色素它作為天然紅色素可以直接使用,也可以經(jīng)乳化或以粉末形式廣泛用于各個領(lǐng)域,如食品、 飼料、 餌料和保健品等,特別在食品加工業(yè)中應用十分廣泛?？捎糜谑烊庵破贰⒐麅?、飲料、糕點等，最大使用量為4g/kg。赤紅球菌紅色素對蛋白質(zhì)有良好的著色性能，色調(diào)貼近肉的自然色，有真實感。例如在火腿、香腸、布丁冰激凌中，酸奶等食品中，以 0.2~0.4 g/kg 的添加量；可達到理想的著色效果,色調(diào)自然,安全性高。
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<213> 人工序列
<400> 1
tcgaacgctg ggggcgtgct taacacatgc aagtcgaacg gtaaggccct ttcgggggta 60
cacgagtggc gaacgggtga gtaacacgtg ggtaatctgc cctgcacttc gggataagcc 120
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gtactacagg ggagactgga attcctggtg tagcggtgaa atgcgcagat atcaggagga 660
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gagcaaacag gagcagatac cctggtaagt ccatgccgta agcggtgggc gctaggtgtg 780
gggtccttcc acggattccg tgccgtagct aacgcattaa gcgccccgcc tggggagtac 840
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