本發(fā)明涉及食品微生物發(fā)酵工程領(lǐng)域，特別是涉及一種采用不定型固體附著物實(shí)現(xiàn)乳酸菌高密度發(fā)酵的技術(shù)。

背景技術(shù)：

乳酸菌，是指一群能利用可發(fā)酵性碳水化合物，產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽性細(xì)菌的通稱。乳酸菌是一類對(duì)人體有益的微生物菌群，而且廣泛分布在自然界。乳酸菌發(fā)酵能夠產(chǎn)生大量的有機(jī)酸、醇類及各種氨基酸等代謝物，具有抑制腐敗均、提高消化率、防癌等生理功效。乳酸菌的應(yīng)用歷史非常悠久，如今廣泛應(yīng)用于發(fā)酵乳制品行業(yè)、食品加工業(yè)、飼料調(diào)制、醫(yī)藥衛(wèi)生以及禽畜疾病的防治。

隨著我國(guó)發(fā)酵乳制品工業(yè)的迅猛發(fā)展，積極研究并大力開發(fā)高效濃縮型酸奶發(fā)酵劑，對(duì)于推動(dòng)我國(guó)乳酸菌發(fā)酵劑產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，促進(jìn)我國(guó)發(fā)酵乳制品工業(yè)的發(fā)展，具有重要的意義。而乳酸菌超濃縮發(fā)酵劑制備的關(guān)鍵是要實(shí)現(xiàn)對(duì)其高活性、高密度的培養(yǎng)，因此乳酸菌高密度培養(yǎng)工程技術(shù)研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和廣闊前景。

乳酸菌高密度培養(yǎng)可以用來生產(chǎn)發(fā)酵劑、益生菌制劑、乳酸、細(xì)菌素，以及其他產(chǎn)物等，但乳酸菌在培養(yǎng)過程中的發(fā)酵液的酸化及代謝產(chǎn)物會(huì)抑制乳酸菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致培養(yǎng)的菌體密度及生物量積累的連續(xù)性受到嚴(yán)重阻遏。

菌體培養(yǎng)過程中，產(chǎn)物抑制系數(shù)影響生長(zhǎng)速率及產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率。而控制pH值的變化僅能部分地減緩這種抑制?，F(xiàn)有技術(shù)中，為了實(shí)現(xiàn)乳酸菌的高密度發(fā)酵，可以采用（1）補(bǔ)料、增加膜過濾裝置來稀釋或去除代謝廢物，解除生長(zhǎng)抑制；也可以采?。?）固定化或微膠囊化來固定細(xì)胞，防止代謝物影響到乳酸菌的生長(zhǎng)。另外，還可以采用（3）生物膜誘導(dǎo)法，通過外源刺激使乳酸菌形成生物膜，實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)；最后，也有學(xué)者通過（4）數(shù)學(xué)模型觀察細(xì)胞生長(zhǎng)周期并計(jì)算出細(xì)胞濃度的變化趨勢(shì)、生物合成活力，以及底物消耗率等，最終獲得最佳目的物生產(chǎn)模型或高密度培養(yǎng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種采用不定型固體附著物實(shí)現(xiàn)乳酸菌高密度發(fā)酵的技術(shù)，采用無定型固體懸浮物誘導(dǎo)乳酸菌產(chǎn)生生物膜，從而實(shí)現(xiàn)乳酸菌的高密度培養(yǎng)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種采用不定型固體附著物實(shí)現(xiàn)乳酸菌高密度發(fā)酵的技術(shù)，包括以下步驟：

（1）選擇長(zhǎng)勢(shì)旺盛，并且保證接種后能夠在4-8h達(dá)到完成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的優(yōu)良乳酸菌菌種進(jìn)行活化，將活化后的乳酸菌菌種接種于乳酸菌培養(yǎng)基中；

（2）于37℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后，收獲菌體，即可。

上述一種采用不定型固體附著物實(shí)現(xiàn)乳酸菌高密度發(fā)酵的技術(shù)，優(yōu)選的方案是，步驟（1）所述乳酸菌菌種可以是唾液乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和乳酸片球菌中的一種。

上述一種采用不定型固體附著物實(shí)現(xiàn)乳酸菌高密度發(fā)酵的技術(shù)，優(yōu)選的方案是，步驟（1）所述乳酸菌菌種的接種量為0.5~1%。

上述一種采用不定型固體附著物實(shí)現(xiàn)乳酸菌高密度發(fā)酵的技術(shù)，優(yōu)選的方案是，步驟（1）所述乳酸菌培養(yǎng)基為PY培養(yǎng)基。

上述一種采用不定型固體附著物實(shí)現(xiàn)乳酸菌高密度發(fā)酵的技術(shù)，優(yōu)選的方案是，所述PY培養(yǎng)基由以下重量組分的原料組成：未水解大分子蛋白質(zhì)50g，蛋白胨5g，胰蛋白胨5g，酵母粉10g，無水乙酸鈉20g，KH₂PO₄ 6g，MgSO₄?7H₂O 0.6g，MnSO₄?4H₂O 0.2g，水1000 mL。

上述一種采用不定型固體附著物實(shí)現(xiàn)乳酸菌高密度發(fā)酵的技術(shù)，優(yōu)選的方案是，所述PY培養(yǎng)基的pH為6.8。

上述一種采用不定型固體附著物實(shí)現(xiàn)乳酸菌高密度發(fā)酵的技術(shù)，優(yōu)選的方案是，步驟（2）所述發(fā)酵的時(shí)間為36-48h。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

（1）本發(fā)明提供的發(fā)酵技術(shù)無需補(bǔ)料，可以一次性完成發(fā)酵過程；可以采用一般性發(fā)酵罐，無需投資專用發(fā)酵罐；

（2）本發(fā)明可以獲得乳酸菌菌體，所有以乳酸菌生物量為發(fā)酵目的的生產(chǎn)過程均可以應(yīng)用，而固定化（生物膜）的高密度培養(yǎng)技術(shù)無法獲得乳酸菌菌體，只能以乳酸菌代謝物作為目標(biāo)產(chǎn)物；

（3）本發(fā)明提供的發(fā)酵技術(shù)，在發(fā)酵結(jié)束后，菌落總數(shù)可以達(dá)到10^10-12 cfu/mL；獲得的發(fā)酵劑由酸凝蛋白包裹，實(shí)現(xiàn)了大部分的菌體包埋；

（4）由本發(fā)明發(fā)酵技術(shù)獲得的菌體耐高溫、抗逆性強(qiáng)，在模擬胃酸、膽鹽環(huán)境中存活率提高2-3倍。

附圖說明

圖1-3顯示為本發(fā)明和對(duì)照組發(fā)酵技術(shù)所得菌落總數(shù)的對(duì)比圖。

圖4-6顯示為本發(fā)明和對(duì)照組發(fā)酵產(chǎn)物的耐高溫對(duì)比圖。

圖7-9顯示為本發(fā)明和對(duì)照組發(fā)酵產(chǎn)物的胃酸耐受力對(duì)比圖。

圖10-12顯示為本發(fā)明和對(duì)照組發(fā)酵產(chǎn)物的膽鹽耐受力對(duì)比圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但保護(hù)范圍不限于此。本發(fā)明所用原料皆可從市場(chǎng)購(gòu)買。

實(shí)施例1 一種采用不定型固體附著物實(shí)現(xiàn)乳酸菌高密度發(fā)酵的技術(shù)，包括以下步驟：

（1）選擇長(zhǎng)勢(shì)旺盛，并且保證接種后能夠在4-8h達(dá)到完成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的優(yōu)良唾液乳桿菌菌種進(jìn)行活化，將活化后的唾液乳桿菌菌種接種于pH為6.8的PY培養(yǎng)基中，所述唾液乳桿菌菌種的接種量為0.5~1%，所述PY培養(yǎng)基由以下重量組分的原料組成：未水解大分子蛋白質(zhì)50g，蛋白胨5g，胰蛋白胨5g，酵母粉10g，無水乙酸鈉20g，KH₂PO₄ 6g，MgSO₄?7H₂O 0.6g，MnSO₄?4H₂O 0.2g，水1000 mL；

（2）于37℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)36-48h，培養(yǎng)完成后，收獲菌體，即可。

實(shí)施例2 一種采用不定型固體附著物實(shí)現(xiàn)乳酸菌高密度發(fā)酵的技術(shù)，包括以下步驟：

（1）選擇長(zhǎng)勢(shì)旺盛，并且保證接種后能夠在4-8h達(dá)到完成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的優(yōu)良發(fā)酵乳桿菌菌種進(jìn)行活化，將活化后的發(fā)酵乳桿菌菌種接種于pH為6.8的PY培養(yǎng)基中，所述發(fā)酵乳桿菌菌種的接種量為0.5~1%，所述PY培養(yǎng)基由以下重量組分的原料組成：未水解大分子蛋白質(zhì)50g，蛋白胨5g，胰蛋白胨5g，酵母粉10g，無水乙酸鈉20g，KH₂PO₄ 6g，MgSO₄?7H₂O 0.6g，MnSO₄?4H₂O 0.2g，水1000 mL；

（2）于37℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)36-48h，培養(yǎng)完成后，收獲菌體，即可。

實(shí)施例3 一種采用不定型固體附著物實(shí)現(xiàn)乳酸菌高密度發(fā)酵的技術(shù)，包括以下步驟：

（1）選擇長(zhǎng)勢(shì)旺盛，并且保證接種后能夠在4-8h達(dá)到完成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的優(yōu)良乳酸片球菌菌種進(jìn)行活化，將活化后的乳酸片球菌菌種接種于pH為6.8的PY培養(yǎng)基中，所述乳酸片球菌菌種的接種量為0.5~1%，所述PY培養(yǎng)基由以下重量組分的原料組成：未水解大分子蛋白質(zhì)50g，蛋白胨5g，胰蛋白胨5g，酵母粉10g，無水乙酸鈉20g，KH₂PO₄ 6g，MgSO₄?7H₂O 0.6g，MnSO₄?4H₂O 0.2g，水1000 mL；

（2）于37℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)36-48h，培養(yǎng)完成后，收獲菌體，即可。

試驗(yàn)例 本發(fā)明一種采用不定型固體附著物實(shí)現(xiàn)乳酸菌高密度發(fā)酵的技術(shù)的試驗(yàn)研究：

1. 試驗(yàn)對(duì)象

實(shí)驗(yàn)組：以本發(fā)明添加了未水解蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基的發(fā)酵技術(shù)，分別對(duì)唾液乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和乳酸片球菌進(jìn)行高密度培養(yǎng)。

對(duì)照組：以不添加未水解蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的發(fā)酵技術(shù)，分別對(duì)唾液乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和乳酸片球菌進(jìn)行高密度培養(yǎng)。

2. 試驗(yàn)方法

2.1菌落總數(shù)的測(cè)量

菌落總數(shù)的測(cè)定采用平板計(jì)數(shù)法。取1 mL樣品用無菌水10倍梯度稀釋后，再吸取200 μL傾入培養(yǎng)皿中，接著倒入溫度不超過70℃的MRS瓊脂培養(yǎng)基。經(jīng)37℃培養(yǎng)48 h后，對(duì)肉眼可見的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。菌落數(shù)要求在30~300個(gè)為有效稀釋梯度，根據(jù)稀釋的倍數(shù)，計(jì)算出原樣品中的菌落數(shù)。由圖1-3可知，基礎(chǔ)培養(yǎng)基（對(duì)照組）培養(yǎng)結(jié)束后（24 h）菌落總數(shù)為10^8-9 cfu/mL，而本發(fā)明技術(shù)（實(shí)驗(yàn)組）發(fā)酵結(jié)束可以獲得菌落總數(shù)為10^10-12cfu/mL，相當(dāng)于對(duì)照組的100~1000倍。

2.2耐高溫實(shí)驗(yàn)

無菌條件下分別取培養(yǎng)12 h的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的乳酸菌菌液，轉(zhuǎn)移1mL至無菌離心管中，在50℃、60℃、70℃水浴30 min后，冰水迅速冷卻至常溫，然后測(cè)定初始及高溫水浴后的菌落總數(shù)。根據(jù)菌體存活率，判斷不同處理組乳酸菌的耐高溫能力。由圖4-6可知，本發(fā)明技術(shù)培養(yǎng)乳酸菌時(shí)，菌體耐高溫能力顯著增強(qiáng)，特別是60℃時(shí)處理30 min，對(duì)照組的乳酸菌全部死亡，而實(shí)驗(yàn)組均有不同程度的存活率。但是50℃處理時(shí)，對(duì)照組的菌體存活率為73~86%，實(shí)驗(yàn)組的存活率為85~95%。而70℃處理30min，所有的菌體全部死亡，存活率為0。

2.3模擬胃液及膽鹽配制及實(shí)驗(yàn)方法

模擬胃液參照J(rèn)J Ahire等（2011）的配方：蛋白胨8.3，葡萄糖3.5，NaCL2.05， KH₂PO₄0.6， CaCl₂ 0.11， KCL 0.37，膽鹽0.05，溶菌酶0.1，胃蛋白酶13.3（單位：mg/mL），最終pH值用1mol/L的HCL調(diào)節(jié)到2.50。使用時(shí)稀釋10倍。

測(cè)定菌體在模擬胃液中的存活率時(shí)，取乳酸菌菌液10000 g離心5 min，棄去上清液后，換成等量的模擬胃液（10倍稀釋），37℃培養(yǎng)30-180 min后，測(cè)量菌落總數(shù)。圖7-9表明，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的乳酸菌對(duì)模擬胃酸均有一定的耐受能力，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體存活率迅速下降。而實(shí)驗(yàn)組的存活率要顯著高于對(duì)照組（P < 0.05）。

膽鹽的配制是按照0.5-2%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，配制相應(yīng)的膽鹽溶液即可。圖10-12表明，受試乳酸菌對(duì)于膽鹽均表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受力。隨著膽鹽濃度的上升，菌體存活率有所下降?？傮w來說，實(shí)驗(yàn)組菌體存活率顯著高于對(duì)照組（P < 0.05）。

對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點(diǎn)來看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。不應(yīng)將權(quán)利要求中的任何附圖標(biāo)記視為限制所涉及的權(quán)利要求。