本發(fā)明涉及一株鏈霉菌屬多糖降解菌及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

多糖是由重復(fù)的單一糖單元或復(fù)雜糖單元通過糖苷鍵連接而成的多聚物，既有線性分子，也有支鏈狀分子，或網(wǎng)絡(luò)狀聚合物。多糖的種類多、數(shù)量大，廣泛存在于自然界中，如：高等植物中的纖維素、木聚糖、甘露聚糖等，海藻中的瓊膠、褐藻膠、卡拉膠，甲殼動(dòng)物中的幾丁質(zhì)，以及微生物來源的肽聚糖、黃原膠等。這些多糖不但是組成生物體的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，還是儲(chǔ)存能量的介質(zhì)，是重要的生物資源之一^[1]。而且，多糖及其降解產(chǎn)物具有多種重要生理活性，在醫(yī)藥、化妝品、食品工業(yè)及農(nóng)業(yè)等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。從微生物中分離的多糖降解酶可以通過水解、裂解等多種方式催化糖苷鍵的斷裂，生成具有新穎生物活性的低聚糖組分，從而產(chǎn)生巨大經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

多糖降解菌^[2,3]是指能以多種類型的多糖為唯一碳源生長的菌株。多糖降解菌所產(chǎn)多糖降解酶的類型多樣，具有重要開發(fā)價(jià)值。目前，已報(bào)道的多糖降解菌主要分離自海洋。韓文君等在海泥中篩選到的海洋細(xì)菌Persicobacter sp.JZB09^[4]、Flammeovirga sp.MY04^[5]均能利用10種以上的多糖為唯一碳源生長。國際享有盛名的2株多糖降解菌Zobellia galactanivorans^[6]、Saccharophagus degradans 2-40^[7]也是分離自海洋環(huán)境。相比之下，來源于陸地土壤的多糖降解菌鮮有報(bào)道。

鏈霉菌是放線菌門中種類最多的一個(gè)屬，廣泛存在于土壤中，是絲狀的革蘭氏陽性細(xì)菌，主要通過孢子繁殖，絕大多數(shù)鏈霉菌對(duì)人體無害^[8,9]。鏈霉菌是產(chǎn)生各種抗生素的主要來源，源于鏈霉菌的抗生素包括紅霉素、四環(huán)素、鏈霉素、氯霉素、新霉素、制霉菌素、卡那霉素、放線菌酮和兩性霉素等^[10]，因此，對(duì)于鏈霉菌的已有研究主要集中于菌株產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)的能力和大小等方面。關(guān)于鏈霉菌產(chǎn)多糖降解酶的研究主要集中于菌株所產(chǎn)單一多糖降解酶，如幾丁質(zhì)酶、木聚糖酶及纖維素酶等^[11-13]，少見單一鏈霉菌能夠產(chǎn)生多種類型多糖降解酶的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一株來源于植物藥材川貝母根系土壤中的能降解、利用多種不同類型多糖的鏈霉菌及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一株鏈霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株，2016年4月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)：CGMCC No.12351。

鏈霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株，革蘭氏染色陽性，在固體培養(yǎng)基上觀測(cè)，菌落呈花朵狀，中間肉狀凸起，較濕潤，邊緣呈放射狀且干燥，能產(chǎn)生黃色素，如圖1A所示；采用普通光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察氣生菌絲生長豐茂，分枝較多，呈樹枝狀，孢子呈長圓形，如圖1B所示。用于菌體形態(tài)觀察的固體培養(yǎng)基為TSB固體培養(yǎng)基，組分如下：胰蛋白胨17g/L，植物蛋白胨3g/L，氯化鈉5g/L，磷酸二氫鉀2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，瓊脂20g/L，余量水，pH7.2。

鏈霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株，經(jīng)測(cè)定，其16S rRNA的基因序列長度為1448bp，如SEQ ID NO.1所示。通過使用美國生物工程信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)BLASTN程序比對(duì)，本發(fā)明的菌株的16S rRNA的基因序列與NCBI注冊(cè)的鏈霉菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(Streptomyces)16S rRNA的基因序列具有較高的同源性。經(jīng)比對(duì)，與標(biāo)準(zhǔn)菌株Streptomyces cyaneofuscatus ATCC 19746，Streptomyces griseus ATCC 23345親緣關(guān)系最近，相似度分別為99.2％、99.5％，但是上述標(biāo)準(zhǔn)菌株未見能夠降解多種多糖的報(bào)道。

鏈霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株，采用16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建方法：應(yīng)用MEGA6.0軟件包中的Clustal W對(duì)測(cè)得的16S rRNA基因序列以及基因庫中的相似序列，一起進(jìn)行多序列比對(duì)，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行1000次Bootstraps檢驗(yàn)，獲得統(tǒng)計(jì)樹，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，CB16菌株與鏈霉菌屬的模式菌株聚類，且位于該分支內(nèi)部。因此，將CB16菌株鑒定至鏈霉菌屬。

上述16S rRNA基因測(cè)序的基本方法是：用細(xì)菌基因組提取試劑盒(天根)制備菌株的基因組DNA，以菌株的基因組DNA為模板，使用細(xì)菌16S rRNA基因的通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，用膠回收試劑盒(天根)純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳驗(yàn)證后，連接到pEASY-Blunt Simple Cloning Vector，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)氨芐抗性篩選，獲得陽性克隆。16S rRNA基因測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，將所得序列與美國國家生物信息中心(NCBI)收錄的標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)。

上述鏈霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株的培養(yǎng)方法，步驟如下：

(1)取鏈霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株劃線于固體培養(yǎng)基上，25～30℃倒置活化培養(yǎng)3～7天，制得活化后菌株；

(2)取步驟(1)制得的活化后菌株接種至液體培養(yǎng)基中，在溫度為25～30℃、轉(zhuǎn)數(shù)為150～220轉(zhuǎn)/分鐘的條件下，搖床培養(yǎng)3～7天，制得種子液；

(3)取步驟(2)制得的種子液，按1～10％的體積百分比接種于液體培養(yǎng)基中，在溫度為25～30℃、轉(zhuǎn)數(shù)為150～220轉(zhuǎn)/分鐘的條件下，擴(kuò)大培養(yǎng)3～7天，制得鏈霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌液。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中的固體培養(yǎng)基，每升組分如下：

胰蛋白胨17g，植物蛋白胨3g，氯化鈉5g，磷酸二氫鉀2.5g，葡萄糖2.5g，瓊脂20g，水定容至1L，pH7.2。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)和(3)中的液體培養(yǎng)基，每升組分如下：

碳源1～20g、NaCl 0.5g、K₂HPO₄ 0.5g、KNO₃ 1g、FeSO₄ 0.01g、MgSO₄·7H₂O 0.5g，水定容至1L，pH值6.5～7.5。

根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的碳源選自：纖維素、羧甲基纖維素、木聚糖、甘露聚糖、幾丁質(zhì)、殼聚糖、淀粉、果膠、海藻酸鈉、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素C、硫酸軟骨素E或黃原膠之一。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述液體培養(yǎng)基每升組分如下：

胰蛋白胨17g、植物蛋白胨3g、氯化鈉5g、磷酸二氫鉀2.5g、葡萄糖2.5g，水定容至1L，pH 7.2。

上述鏈霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株在降解復(fù)合型多糖中的應(yīng)用。

一種復(fù)合型多糖降解酶制劑的制備方法，步驟如下：

(i)取上述鏈霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌液，按1～10％的體積百分比接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度為25～30℃、轉(zhuǎn)速為150～220轉(zhuǎn)/分鐘的條件下，擴(kuò)大培養(yǎng)3～7天，制得鏈霉菌CB16菌株發(fā)酵液；

(ii)取步驟(i)制得的鏈霉菌CB16菌株的發(fā)酵液，固液分離，取液體，加入硫酸銨，使飽和度為80％，離心后收集80％硫酸銨飽和度下所得沉淀，并用20～50倍體積的TGE緩沖液重懸沉淀，透析去除硫酸銨，制得復(fù)合型多糖降解酶制劑。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(i)中的發(fā)酵培養(yǎng)基為高氏Ⅱ號(hào)培養(yǎng)基，每升組分如下：

可溶性淀粉20g，葡萄糖20g，牛肉浸膏3g，酵母浸膏10g，CaCO₃ 0.5g，NaCl 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，水定容至1L，pH7.0。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(ii)中，固液分離為離心，條件為：12000×g、4℃離心5～20min。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(ii)中，離心為：15,000×g，4℃離心5～20min。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(ii)中，TGE緩沖液組分如下：

50mM Tris，50mM NaCl，5mM EDTA，5mM二硫蘇糖醇(DTT)，5.0％體積百分比的甘油(Glycerol)，余量水，pH 7.9。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(ii)中，透析為采用分子截留量10,000Da的透析袋，進(jìn)行攪拌透析。

有益效果

本發(fā)明首次從高山川貝母根系土壤中分離獲得一株鏈霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株，該菌株能以陸地植物、海藻、動(dòng)物以及微生物來源的多種類型的多糖為唯一碳源生長(圖2)，所產(chǎn)多糖降解酶的種類豐富，是一株多能型多糖降解菌，利用該菌株制備的復(fù)合型多糖降解酶制劑可降解植物、海藻、動(dòng)物和微生物多糖，尤其對(duì)來源于高等動(dòng)物結(jié)締組織的透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素C和硫酸軟骨素E降解活性顯著(圖4)，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，這與現(xiàn)有已知的鏈霉菌(Streptomyces sp.)功能完全不相同。

附圖說明

圖1、鏈霉菌CB16菌株的基本形態(tài)學(xué)特征照片；

其中，A、培養(yǎng)3天、6天和10天后菌株在TSB培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；

B、左圖為光學(xué)顯微鏡照片，中圖和右圖為電鏡照片；

圖2、鏈霉菌CB16菌株在唯一碳源培養(yǎng)基中生長的最高菌體濃度柱狀圖；

圖3、鏈霉菌CB16菌株基于16S rRNA基因序列繪制的進(jìn)化樹；

圖4、鏈霉菌CB16菌株復(fù)合型多糖降解酶制劑對(duì)多糖降解能力的分析柱狀圖；

圖5、復(fù)合型多糖降解酶制劑降解透明質(zhì)酸所得產(chǎn)物的HPLC分析曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。

實(shí)施例1、川貝母根系土壤微生物的分離與純化

取川貝母根系土壤浸出液，上清液1mL加入到9mL無菌水中，分別稀釋至濃度為10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5的5個(gè)濃度梯度。將稀釋后的菌懸液與50℃左右的高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基充分混勻，每個(gè)濃度做兩個(gè)平行，28℃培養(yǎng)7天。將形態(tài)較為典型的放線菌菌落挑出，然后經(jīng)過3次平板劃線分離純化后，挑單菌落于TSB液體培養(yǎng)基中，28℃、200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)3天，取培養(yǎng)物1.6ml加入400μl甘油，混勻后于-80℃冰箱長期保存。

上述TSB液體培養(yǎng)基，每升組分如下：

胰蛋白胨17g，植物蛋白胨3g，氯化鈉5g，磷酸二氫鉀2.5g，葡萄糖2.5g，水定容至1L，pH7.2。

高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基，每升組分如下：

可溶性淀粉20g，KNO₃ 10g，NaCl 0.5g，F(xiàn)eSO₄ 0.01g，MgSO₄ 0.5g，瓊脂15g，重鉻酸鉀0.1g，水定容至1L，pH7.2～7.4。

實(shí)施例2、多糖降解菌的篩選

把實(shí)施例1中所得到的菌株，分別接種到唯一碳源液體培養(yǎng)基上，200轉(zhuǎn)/分鐘、30℃培養(yǎng)72h，觀察菌液渾濁情況，同時(shí)取培養(yǎng)上清進(jìn)行咔唑反應(yīng)檢測(cè)碳源的消耗情況。依據(jù)上述兩個(gè)指標(biāo)選擇產(chǎn)酶菌株。將在各唯一碳源培養(yǎng)基中均渾濁以及咔唑反應(yīng)數(shù)值較小的菌株挑取到TSB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并保種記為CB16。

上述唯一碳源培養(yǎng)基的配制方法是：

向離子培養(yǎng)基中分別添加多糖底物至終濃度為0.10％(w/v)；

上述多糖底物選自：纖維素，羧甲基纖維素，木聚糖，甘露聚糖，幾丁質(zhì)，殼聚糖，淀粉，果膠，瓊脂糖，海藻酸鈉，透明質(zhì)酸，硫酸軟骨素A，硫酸軟骨素C，硫酸軟骨素E，硫酸乙酰肝素，硫酸皮膚素或黃原膠；在115℃高壓滅菌20min。

上述離子培養(yǎng)基，每升組分如下：

NaCl 0.5g、K₂HPO₄ 0.5g、KNO₃ 1g、FeSO₄ 0.01g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、蒸餾水定容至1L，調(diào)pH值7.2～7.4。

如圖1，所述的鏈霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株，革蘭氏染色陽性，在固體培養(yǎng)基上的菌落呈花朵狀，中間肉狀凸起較濕潤，邊緣呈放射狀且干燥，能產(chǎn)生色素，氣生菌絲生長豐茂，分枝較多，呈樹枝狀，孢子呈長圓形。

如圖2所示，上述鏈霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株，不僅能利用陸生高等植物來源的多糖，如：微晶纖維素、羧甲基纖維素、木聚糖、甘露聚糖、淀粉和果膠；也能利用海藻來源的多糖，如：褐藻膠；還能夠利用動(dòng)物來源的多糖，尤其是來源于高等動(dòng)物結(jié)締組織的透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素C和硫酸軟骨素E，以及來源于甲殼動(dòng)物的幾丁質(zhì)和殼聚糖；另外，對(duì)于來源于微生物的黃原膠，降解利用能力顯著。通過對(duì)鏈霉菌CB16菌株的多糖利用能力分析，CB16菌株能夠在至少14種唯一碳源培養(yǎng)基中生長，說明該菌株是一株多糖降解菌。

將上述分離獲得的鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)CB16菌株，2016年4月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)：CGMCC No.12351。

實(shí)施例3、鏈霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株基于16S rRNA基因的分子鑒定

利用細(xì)菌基因組提取試劑盒(天根)制備菌株基因組DNA，以菌株基因組DNA為模板，使用細(xì)菌16S rRNA基因的通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，用膠回收試劑盒(天根)純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳驗(yàn)證后，連接到pEASY-Blunt Simple Cloning Vector，轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α。經(jīng)氨芐抗性篩選，獲得陽性克隆。16S rRNA基因測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，將序列與美國國家生物信息中心(NCBI)收錄的標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)，應(yīng)用MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

上述用于菌株16S rRNA基因擴(kuò)增的通用引物為：

正向引物為27f：5’-AGAGTTTGATCCTG GCT CAG-3’；

反向引物為1492r：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

上述用于菌株16S rRNA基因擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下，總體積30μL：

所用基因擴(kuò)增試劑購自大連寶生物技術(shù)有限公司。

上述用于菌株16S rRNA基因擴(kuò)增的程序?yàn)椋?/p>

94℃預(yù)變性5min；94℃變性30S，55℃退火30S，72℃延伸90S，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸15min；降溫至4℃并保溫15min。

上述基于16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建方法：

應(yīng)用MEGA6.0軟件包中的Clustal W對(duì)測(cè)得的16S rRNA基因序列以及基因庫中的相似序列，一起進(jìn)行多序列比對(duì)，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行1000次Bootstraps檢驗(yàn)，獲得統(tǒng)計(jì)樹。

結(jié)果如圖3所示，本發(fā)明篩選到的CB16菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株Streptomyces cyaneofuscatus ATCC 19746，Streptomyces griseus ATCC 23345親緣關(guān)系最近，16S rRNA基因之間的相似度分別為99.2％、99.5％。且基于16S rRNA基因構(gòu)建所得的統(tǒng)計(jì)樹表明，CB16菌株與鏈霉菌屬的模式菌株聚類，位于該分支內(nèi)部。因此，CB16菌株被鑒定至鏈霉菌屬。

實(shí)施例4、鏈霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株復(fù)合型多糖降解酶制劑的制備

(1)從-80℃冰箱劃線鏈霉菌CB16菌株于TSB固體培養(yǎng)基上，28℃倒置培養(yǎng)4天；

(2)挑取CB16單菌落至TSB液體培養(yǎng)基中，在溫度為28℃、轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘的條件下，搖床培養(yǎng)4天，制得種子液；

(3)將步驟(2)制得的種子液，按1％的體積百分比接種于高氏II號(hào)液體培養(yǎng)基中，在溫度為28℃、轉(zhuǎn)速為220轉(zhuǎn)/分鐘的條件下，擴(kuò)大培養(yǎng)6天，制得鏈霉菌CB16菌株發(fā)酵液；

(4)取步驟(3)制得的鏈霉菌CB16菌株的發(fā)酵液，用無菌紗布過濾去除大部分菌體，經(jīng)固液分離，取液體，加入硫酸銨，使飽和度為80％，15000×g、4℃離心20min后收集80％硫酸銨飽和度下所得沉淀，用20倍體積的TGE緩沖液重懸沉淀，并使用分子截留量為10,000Da的透析袋透析，以去除硫酸銨，制得胞外酶制劑。

所述步驟(1)、(2)中的TSB培養(yǎng)基為胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基，每升組分如下：

胰蛋白胨17g，植物蛋白胨3g，氯化鈉5g，磷酸二氫鉀2.5g，葡萄糖2.5g，水定容至1L，pH7.2；固體培養(yǎng)基中還加入了質(zhì)量濃度為2％的瓊脂。

上述用于菌株發(fā)酵的培養(yǎng)基為高氏Ⅱ號(hào)培養(yǎng)基，每升組分如下：

可溶性淀粉20g/L，葡萄糖20g/L，牛肉浸膏3g/L，酵母浸膏10g/L，CaCO₃ 0.5g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，水定容至1L，pH7.0。

所述的固液分離方法為離心，條件為：12,000×g，4℃離心10min。

上述TGE緩沖液的組分如下：

50mM Tris，50mM NaCl，5mM EDTA，5mM二硫蘇糖醇(DTT)，5.0％體積百分比的甘油(Glycerol)，余量水，pH 7.9。

所述的透析，使用分子截留量為10,000Da的透析袋，在低溫環(huán)境中對(duì)20～50倍體積的TGE緩沖液進(jìn)行攪拌透析。

實(shí)施例5、復(fù)合型多糖降解酶制劑對(duì)不同多糖降解能力的分析

將濃度3mg/mL的多糖底物、復(fù)合型多糖降解酶制劑、PBS緩沖液以及水按2：1：2：1(體積比)的比例混合后，在30℃、pH7.4下反應(yīng)12h，沸水浴中溫育10min使酶失活，12,000×g，4℃離心10min，取上清，作為復(fù)合型多糖降解酶制劑的酶解產(chǎn)物，用DNS法檢測(cè)生成的還原糖。

結(jié)果如圖4所示，鏈霉菌CB16菌株制備的復(fù)合型多糖降解酶制劑不僅能降解陸生高等植物來源的多糖，如：微晶纖維素、羧甲基纖維素、木聚糖、甘露聚糖、淀粉和果膠；也能降解海藻來源的多糖，如：褐藻膠；還能夠降解動(dòng)物來源的多糖，尤其是對(duì)來源于高等動(dòng)物結(jié)締組織的透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素C和硫酸軟骨素E具有較高降解活性；另外，對(duì)于來源于微生物的黃原膠，也具有一定的降解能力。因此，利用鏈霉菌CB16菌株制備的復(fù)合型多糖降解酶制劑可降解多種多糖，對(duì)來源于高等動(dòng)物結(jié)締組織的透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素C和硫酸軟骨素E降解活性顯著，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

實(shí)施例6、復(fù)合型多糖降解酶制劑降解透明質(zhì)酸所得產(chǎn)物的HPLC分析

將濃度3mg/mL的透明質(zhì)酸、復(fù)合型多糖降解酶制劑、PBS緩沖液以及水按2：1：2：1(體積比)的比例混合后，在30℃、pH7.4的條件下反應(yīng)12h，沸水浴中溫育10min使酶失活，12,000×g，4℃離心10min，取上清，作為復(fù)合型多糖降解酶制劑的酶解產(chǎn)物。用沸水浴預(yù)先滅活的酶，進(jìn)行對(duì)照組實(shí)驗(yàn)。

取上述酶解產(chǎn)物20μL進(jìn)行高效液相(HPLC)分析，所用凝膠柱為Superdex peptide10/300GL(GE)，流動(dòng)相為0.2M碳酸氫銨，流速為0.4mL/min；檢測(cè)條件為UV232nm。

結(jié)果如圖5所示，復(fù)合型多糖降解酶制劑與透明質(zhì)酸的反應(yīng)產(chǎn)物中，主產(chǎn)物的出峰時(shí)間約為42min，提示是不飽和的透明質(zhì)酸二糖。對(duì)照組的產(chǎn)物中檢測(cè)不到具有特征吸收的成分。因此，用鏈霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株制備的復(fù)合型多糖降解酶制劑，可用于生產(chǎn)透明質(zhì)酸二糖。

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SEQUENCE LISTING

<110> 滕州市悟通香料有限責(zé)任公司

<120> 一株鏈霉菌屬多糖降解菌及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用

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<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> Streptomyces sp.

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ttcgggtgtt accgactttc gtgacgtgac gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat 120

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