本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種谷氨酸棒桿菌菌株及其在發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸中的應用。

背景技術：

L-色氨酸(L-valine)是人體八種必需氨基酸之一，也是一種芳香族氨基酸，在人體及各種動物的代謝過程中有顯著的功能，對人和動物的生長發(fā)育、新陳代謝都起著重要作用，目前被廣泛應用于加工飼料、保健食品、配方膳、氨基酸醫(yī)藥。

L-色氨酸的生產(chǎn)方法主要有提取法、化學合成法、發(fā)酵法。提取法和化學合成法由于原料來源受限制、生產(chǎn)成本高、收率低，污染嚴重，難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-色氨酸具有原料成本低、反應條件溫和、容易實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點，是一種非常經(jīng)濟的生產(chǎn)方法，也是目前絕大多數(shù)廠家用來生產(chǎn)氨基酸的方法，包括添加前體發(fā)酵法及直接發(fā)酵法兩種。但是由于L-色氨酸前體物質如絲氨酸或L-吲哚乙酸等價格昂貴，目前己很少采用此法生產(chǎn)L-色氨酸。而直接發(fā)酵法是借助于微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通過對特定微生物的誘變處理，選育出營養(yǎng)缺陷型及氨基酸結構類似物抗性突變株，以解除代謝調(diào)節(jié)中的反饋抑制和反饋阻遏作用，從而達到過量積累某種氨基酸的目的。

谷氨酸棒桿菌作為一類重要的工業(yè)氨基酸生產(chǎn)的安全菌株，已成為一個工業(yè)生物技術及轉化的平臺菌株，每年生產(chǎn)數(shù)百萬噸的氨基酸，其中包括作為風味增強劑的L-谷氨酸和作為飼料和食品添加劑的L-賴氨酸等等。隨著對這類重要的工業(yè)菌株的不斷認識，谷氨酸棒桿菌在氨基酸的發(fā)酵方面，除了L-谷氨酸和L-賴氨酸這類大宗氨基酸之外，還包括許多的小品種氨基酸，如三類支鏈氨基酸(branched-chain amino acid，BCAAs)：L-纈氨酸、L-異亮氨酸及L-亮氨酸，也逐漸開發(fā)了用于生產(chǎn)其他類有商業(yè)價值的化合物，例如有機酸、二元胺以及醇類化合物等。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種谷氨酸棒桿菌菌株及其在發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸中的應用。

本發(fā)明提供的谷氨酸棒桿菌FNT112(Corynebacterium glutamicum FNT112)，已于2016年07月19日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC；地址：中國武漢，武漢大學；郵編：430072)，保藏編號為CCTCC NO：M 2016398。谷氨酸棒桿菌FNT112(Corynebacterium glutamicum FNT112)CCTCC NO：M 2016398簡稱為谷氨酸棒桿菌FNT112。

本發(fā)明還保護所述谷氨酸棒桿菌FNT112在生產(chǎn)L-色氨酸中的應用。

本發(fā)明還保護一種培養(yǎng)所述谷氨酸棒桿菌FNT112的方法，包括如下步驟：采用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)所述谷氨酸棒桿菌FNT112。

所述培養(yǎng)可在培養(yǎng)瓶中進行。

所述培養(yǎng)的條件具體可為33℃振蕩培養(yǎng)(220r/min)，培養(yǎng)時間48小時。

所述培養(yǎng)還可在發(fā)酵罐中進行。

所述培養(yǎng)的條件具體可為發(fā)酵全過程pH 7.0，維持發(fā)酵罐中的葡萄糖含量為0.5-1.0g/100mL(每當培養(yǎng)體系中的還原糖濃度低于0.5g/100mL時，加入70％的葡萄糖水溶液使得培養(yǎng)體系中的還原糖濃度達到1.0g/100mL)，溶氧(DO)30-50％，攪拌300rpm，溫度33℃，培養(yǎng)時間48小時。

本發(fā)明還保護一種培養(yǎng)所述谷氨酸棒桿菌FNT112的方法，包括如下步驟(a)和步驟(b)：

步驟(a)：采用種子培養(yǎng)基培養(yǎng)谷氨酸棒桿菌FNT112；

步驟(b)：將步驟(a)的產(chǎn)物接種至發(fā)酵培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

本發(fā)明還保護一種生產(chǎn)L-色氨酸的方法，包括如下步驟：培養(yǎng)谷氨酸棒桿菌FNT112。

所述方法還包括：培養(yǎng)結束后收集培養(yǎng)體系，離心，收集上清液。

所述離心具體可為20℃、6000rpm離心15min。

所述離心具體可為4℃、6000rpm離心15min。

本發(fā)明還保護一種生產(chǎn)L-色氨酸的方法，包括如下步驟：采用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)谷氨酸棒桿菌FNT112。

所述培養(yǎng)可在培養(yǎng)瓶中進行。

所述培養(yǎng)的條件具體可為33℃振蕩培養(yǎng)(220r/min)，培養(yǎng)時間48小時。

所述培養(yǎng)還可在發(fā)酵罐中進行。

所述培養(yǎng)的條件具體可為發(fā)酵全過程pH 7.0，維持發(fā)酵罐中的葡萄糖含量為0.5-1.0g/100mL(每當培養(yǎng)體系中的還原糖濃度低于0.5g/100mL時，加入70％的葡萄糖水溶液使得培養(yǎng)體系中的還原糖濃度達到1.0g/100mL)，溶氧(DO)30-50％，攪拌300rpm，溫度33℃，培養(yǎng)時間48小時。

所述方法還包括：培養(yǎng)結束后收集培養(yǎng)體系，離心，收集上清液。

所述離心具體可為20℃、6000rpm離心15min。

所述離心具體可為4℃、6000rpm離心15min。

本發(fā)明還保護一種生產(chǎn)L-色氨酸的方法，包括如下步驟(a)和步驟(b)：

步驟(a)：采用種子培養(yǎng)基培養(yǎng)谷氨酸棒桿菌FNT112；

步驟(b)：將步驟(a)的產(chǎn)物接種至發(fā)酵培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

本發(fā)明還保護一種用于培養(yǎng)所述谷氨酸棒桿菌FNT112的試劑盒，包括發(fā)酵培養(yǎng)基。所述試劑盒還包括種子培養(yǎng)基。

本發(fā)明還保護一種用于生產(chǎn)L-色氨酸的試劑盒，包括發(fā)酵培養(yǎng)基。所述試劑盒還包括種子培養(yǎng)基。所述試劑盒還包括谷氨酸棒桿菌FNT112。

以上任一所述步驟(a)和步驟(b)可在培養(yǎng)瓶中進行。

所述步驟(a)的培養(yǎng)條件具體可為33℃振蕩培養(yǎng)(220r/min)，培養(yǎng)時間16小時。

所述步驟(b)的培養(yǎng)條件具體可為33℃振蕩培養(yǎng)(220r/min)，培養(yǎng)時間48小時。

所述步驟(a)具體可為將谷氨酸棒桿菌FNT112接種至種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到種子液。

所述種子液OD_562nm＝40。

所述步驟(b)中，所述步驟(a)的產(chǎn)物(種子液)與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比具體可為1∶10。

所述步驟(b)后還包括步驟(c)：培養(yǎng)結束后收集培養(yǎng)體系，離心，收集上清液。

所述離心具體可為20℃、6000rpm離心15min。

以上任一所述步驟(a)和步驟(b)還可在發(fā)酵罐中進行。

所述步驟(a)的培養(yǎng)條件具體可為攪拌300rpm，溶氧(DO)30-50％，溫度33℃，pH 7.0，培養(yǎng)時間16小時。

所述步驟(b)的培養(yǎng)條件具體可為：pH 7.0，維持發(fā)酵罐中的葡萄糖含量為0.5-1.0g/100mL(每當培養(yǎng)體系中的還原糖濃度低于0.5g/100mL時，加入70％的葡萄糖水溶液使得培養(yǎng)體系中的還原糖濃度達到1.0g/100mL)，溶氧(DO)30-50％，攪拌300rpm，溫度33℃，培養(yǎng)時間48小時。

所述步驟(a)具體可為將谷氨酸棒桿菌FNT112接種至種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到種子液。

所述種子液OD_562nm＝40。

所述步驟(b)中，所述步驟(a)的產(chǎn)物(種子液)與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1∶5。

所述步驟(b)后還包括步驟(c)：培養(yǎng)結束后收集培養(yǎng)體系，離心，收集上清液。

所述離心具體可為4℃、6000rpm離心15min。

以上任一所述種子培養(yǎng)基由溶質和溶劑組成；所述溶質及其在所述種子培養(yǎng)基中的濃度如下：葡萄糖2-3g/100ml，玉米漿干粉0.4-0.6g/100ml，豆粕水解液8-12g/100ml，酵母膏0.2-0.4g/100ml，(NH₄)₂SO₄ 0.4-0.6g/100ml，MgSO₄·7H₂O 0.02-0.08g/100ml，KH₂PO₄·3H₂O 0.02-0.08g/100ml，L-酪氨酸0.08-0.15g/100ml，L-苯丙氨酸0.05-0.1g/100ml，碳酸鈣0.5-1.5g/100ml；所述溶劑為水。

所述溶質及其在所述種子培養(yǎng)基中的濃度具體可為：葡萄糖2.5g/100ml，玉米漿干粉0.5g/100ml，豆粕水解液10g/100ml，酵母膏0.3g/100ml，(NH₄)₂SO₄ 0.5g/100ml，MgSO₄·7H₂O 0.05g/100ml，KH₂PO₄·3H₂O 0.04g/100ml，L-酪氨酸0.11g/100ml，L-苯丙氨酸0.07g/100ml，碳酸鈣1g/100ml。

以上任一所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基由溶質和溶劑組成；所述溶質及其在所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度如下：葡萄糖12-13g/100ml，豆粕水解液6-8g/100ml，(NH₄)₂SO₄ 2-3g/100ml，KH₂PO₄·3H₂O 0.02-0.08g/100ml，MgSO₄·7H₂O 0.02-0.08g/100ml，L-酪氨酸0.08-0.15g/100ml，L-苯丙氨酸0.05-0.1g/100ml，維生素B1 15-25μg/100ml，維生素H 5-15μg/100ml，CaCO₃ 3-4g/100ml；所述溶劑為水。

所述溶質及其在所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體可為：葡萄糖12.5g/100ml，豆粕水解液甲7g/100ml，(NH₄)₂SO₄ 2.5g/100ml，KH₂PO₄·3H₂O 0.05g/100ml，MgSO₄·7H₂O 0.05g/100ml，L-酪氨酸0.11g/100ml，L-苯丙氨酸0.07g/100ml，維生素B1 20μg/100ml，維生素H 10μg/100ml，CaCO₃ 3.5g/100ml。

所述溶質及其在所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體可為：葡萄糖13g/100ml，豆粕水解液甲8g/100ml，(NH₄)₂SO₄ 3g/100ml，KH₂PO₄·3H₂O 0.08g/100ml，MgSO₄·7H₂O 0.08g/100ml，L-酪氨酸0.15g/100ml，L-苯丙氨酸0.1g/100ml，維生素B1 25μg/100ml，維生素H 15μg/100ml，CaCO₃ 4g/100ml。

所述溶質及其在所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體可為：葡萄糖12g/100ml，豆粕水解液甲6g/100ml，(NH₄)₂SO₄ 2g/100ml，KH₂PO₄·3H₂O 0.02g/100ml，MgSO₄·7H₂O 0.02g/100ml，L-酪氨酸0.08g/100ml，L-苯丙氨酸0.05g/100ml，維生素B1 15μg/100ml，維生素H 5μg/100ml，CaCO₃ 3g/100ml。

以上任一所述豆粕水解液為使用中性蛋白酶將豆粕粉酶解后得到的。

所述中性蛋白酶可通過商購途徑得到。

所述中性蛋白酶的酶活力為10萬U/g。

所述中性蛋白酶的使用濃度為1g/100ml。

所述豆粕水解液的制備方法具體可為：取豆粕粉，加去離子水拌勻，調(diào)pH值為7.0，55℃預熱1個小時，加入中性蛋白酶，酶解3h。

每100g豆粕粉加入5000U中性蛋白酶。

每100g豆粕粉加入400mL去離子水。

以上任一所述豆粕水解液還可以通過商購途徑得到。

谷氨酸棒桿菌作為一類重要的工業(yè)氨基酸生產(chǎn)的安全菌株，同時也是非常具有效率的異源蛋白表達的宿主，但在芳香族氨基酸如L-色氨酸的發(fā)酵應用方面，特別是涉及優(yōu)質高產(chǎn)L-色氨酸的菌株選育方面報道較少。L-色氨酸產(chǎn)生菌產(chǎn)酸水平的高低，就菌種自身而言，除了關鍵酶基因的高效表達外，還主要取決于芳香族氨基酸中其他支路途徑是否切斷或弱化以及其反饋調(diào)節(jié)機制是否被解除和被解除的程度。從遺傳角度來講，選育有利于L-色氨酸積累的營養(yǎng)缺陷型和結構類似物抗性突變株，是獲得L-色氨酸高產(chǎn)菌的關鍵，因此建立有效的育種方法及篩選優(yōu)良菌株顯得十分必要。

本發(fā)明提供了谷氨酸棒桿菌FNT112以及培養(yǎng)谷氨酸棒桿菌FNT112的方法和通過培養(yǎng)谷氨酸棒桿菌FNT112生產(chǎn)L-色氨酸的方法。本發(fā)明提供的谷氨酸棒桿菌FNT112可直接發(fā)酵得到L-色氨酸，工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵的發(fā)酵液中的L-色氨酸含量高達40.5g/L。本發(fā)明具有重大的應用價值和產(chǎn)業(yè)前景。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。

谷氨酸棒桿菌ATCC 21851：美國模式培養(yǎng)物集存庫，ATCC編號：21851。

中性蛋白酶：南寧龐博生物工程有限公司，酶活力10萬U/g；酶活力定義：在測定條件(30±0.2℃；pH值7.5)每分鐘水解酪蛋白釋出的三氯乙酸可溶物在275nm波長有吸光度與1微克酪氨酸的吸光度相當時，所需的酶量即為一個活力單位，用u/g表示。

玉米漿干粉：棣波皓生物科技有限公司。

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，葡萄糖5g，瓊脂粉20g，加入950ml蒸餾水，溶質溶解后，用5mol/L NaOH水溶液調(diào)pH至7.0，并用蒸餾水定容至1L，121℃高壓蒸汽滅菌21min。

LBG培養(yǎng)基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，葡萄糖5g，加入950ml蒸餾水，溶質溶解后，用5mol/L NaOH水溶液調(diào)pH至7.0，并用蒸餾水定容至1L，121℃高壓蒸汽滅菌21min。

原生質體穩(wěn)定液(SMM)：蔗糖171.15g，氯化鎂1.9g，順丁烯二酸2.32g，蒸餾水950mL溶解，用5mol/L NaOH水溶液調(diào)pH至7.0，再用蒸餾水定容至1L，121℃高壓蒸汽滅菌21min。

豆粕水解液甲：100g豆粕粉，加400mL去離子水拌勻，調(diào)pH值為7.0，55℃預熱1個小時，加入5ml中性蛋白酶(濃度為1g/100ml)，酶解3h。

豆粕水解液乙：山東陽成生物科技有限公司，產(chǎn)品編號：DP001。

再生培養(yǎng)基：蔗糖171.15g，氯化鎂1.9g，順丁烯二酸2.32g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，葡萄糖5g，瓊脂粉20g，蒸餾水950mL溶解，用5mol/L NaOH水溶液調(diào)pH至7.0，再用蒸餾水定容至1L，121℃高壓蒸汽滅菌21min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖25g，玉米漿干粉5g，豆粕水解液甲100g，酵母膏3g，(NH₄)₂SO₄5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，KH₂PO₄·3H₂O 0.4g，L-酪氨酸1.1g，L-苯丙氨酸0.7g，碳酸鈣10g，去離子水溶解并定容至1L，125℃高壓滅菌25min。各溶質在在中的濃度如下：葡萄糖2.5g/100ml，玉米漿干粉0.5g/100ml，豆粕水解液甲10g/100ml，酵母膏0.3g/100ml，(NH₄)₂SO₄0.5g/100ml，MgSO₄·7H₂O 0.05g/100ml，KH₂PO₄·3H₂O 0.04g/100ml，L-酪氨酸0.11g/100ml，L-苯丙氨酸0.07g/100ml，碳酸鈣1g/100ml。

發(fā)酵培養(yǎng)基：取葡萄糖，豆粕水解液甲，(NH₄)₂SO₄，KH₂PO₄·3H₂O，MgSO₄·7H₂O，L-酪氨酸，L-苯丙氨酸，維生素B1，維生素H，CaCO₃，加蒸餾水定容至1L；125℃高壓滅菌30min。按照上述方法分別制備得到發(fā)酵培養(yǎng)基甲、發(fā)酵培養(yǎng)基乙及發(fā)酵培養(yǎng)基丙。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基甲中，各溶質的濃度如下：葡萄糖12.5g/100ml，豆粕水解液甲7g/100ml，(NH₄)₂SO₄ 2.5g/100ml，KH₂PO₄·3H₂O 0.05g/100ml，MgSO₄·7H₂O 0.05g/100ml，L-酪氨酸0.11g/100ml，L-苯丙氨酸0.07g/100ml，維生素B1 20μg/100ml，維生素H 10μg/100ml，CaCO₃ 3.5g/100ml。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基乙中，各溶質的濃度如下：葡萄糖13g/100ml，豆粕水解液甲8g/100ml，(NH₄)₂SO₄ 3g/100ml，KH₂PO₄·3H₂O 0.08g/100ml，MgSO₄·7H₂O 0.08g/100ml，L-酪氨酸0.15g/100ml，L-苯丙氨酸0.1g/100ml，維生素B1 25μg/100ml，維生素H 15μg/100ml，CaCO₃ 4g/100ml。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基丙中，各溶質的濃度如下：葡萄糖12g/100ml，豆粕水解液甲6g/100ml，(NH₄)₂SO₄ 2g/100ml，KH₂PO₄·3H₂O 0.02g/100ml，MgSO₄·7H₂O 0.02g/100ml，L-酪氨酸0.08g/100ml，L-苯丙氨酸0.05g/100ml，維生素B1 15μg/100ml，維生素H 5μg/100ml，CaCO₃ 3g/100ml。

實施例1、谷氨酸棒桿菌FNT112的選育

一、谷氨酸棒桿菌FNT112的選育

1、將出發(fā)菌株谷氨酸棒桿菌ATCC 21851接種于斜面培養(yǎng)基，33℃活化培養(yǎng)18h。

2、將步驟1活化的菌株接種于40ml LBG培養(yǎng)基中，220r/min，33℃振蕩培養(yǎng)9h。

3、將步驟2培養(yǎng)的菌液0.8ml接種至裝有40ml LBG培養(yǎng)基的250ml三角燒瓶中，并加入1ml甘氨酸(10g/100ml)，220r/min，33℃繼續(xù)培養(yǎng)9h。

4、收集步驟3的菌液，取10mL于滅菌好的50ml離心管中，4000r/min離心15min，棄上清，收集菌體。

5、稱取0.15g溶菌酶，0.05g纖維素酶，溶解于10ml原生質體穩(wěn)定液(SMM)中，約10min后，待其全部溶解后4000r/min離心15min，上清液采用0.2μm膜過濾，收集濾液。

6、用步驟5的濾液將步驟4的菌體重懸，制備菌懸液，并鋪于直徑為6cm的滅菌平皿中，30℃，65rpm條件下進行酶解，每30min鏡檢一次，隨時觀察原生質體形成情況，當90％左右的細胞轉化為原生質體時，4000r/min離心15min，棄上清，用原生質體穩(wěn)定液(SMM)洗滌2次，最后用5ml原生質體穩(wěn)定液(SMM)重懸細胞，制得原生質體懸液。

7、取步驟6的原生質體懸液5ml加入到直徑為6cm的平皿中，置于距30W紫外燈20cm處，攪拌照射45s取出，移入氯化鋰濃度為10g/L的25ml LBG培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6h，6h后取500ul菌液涂布在含有重氮乙酰絲氨酸以及5-甲基色氨酸的梯度平板上，33℃，培養(yǎng)具有重氮乙酰絲氨酸以及5-甲基色氨酸共同抗性的突變株。挑取抗性平板菌株，采用96孔板進行發(fā)酵培養(yǎng)，每孔裝液量為1mL，150rpm，振蕩培養(yǎng)48h，以出發(fā)菌株谷氨酸棒桿菌ATCC 21851為對照，篩選L-色氨酸產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高的菌株，獲得初篩菌株50株，再將這50株菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基甲進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，篩選L-色氨酸產(chǎn)量明顯提高的菌株(提高幅度＞20％)，獲得復篩突變株8株。

8、以步驟7得到的8株突變株為親本，按步驟1-6制備成原生質體懸液，等量混合后，分成2份，分別置于紫外線下滅活3min和60℃水浴滅活10min后重新混合，4000rpm離心15min，棄上清，用2ml的原生質體穩(wěn)定液(SMM)對混合細胞進行重懸，加入8ml 35％的PEG6000溶液，室溫融合30min，離心棄上清，用原生質體穩(wěn)定液(SMM)洗滌2次，重新懸浮于5ml的原生質體穩(wěn)定液(SMM)中。取500μL涂布于再生培養(yǎng)基至長出單克隆，完成細胞融合過程。對獲得的平板克隆經(jīng)過96孔板發(fā)酵培養(yǎng)初篩和搖瓶發(fā)酵復篩獲得一株產(chǎn)L-色氨酸能力明顯提高的谷氨酸棒桿菌突變株，編號FNT112。將編號FNT112的菌株命名為谷氨酸棒桿菌FNT112，進行斜面保存及甘油保種。

二、谷氨酸棒桿菌FNT112的保藏

谷氨酸棒桿菌FNT112(Corynebacterium glutamicum FNT112)于2016年07月19日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC；地址：中國武漢，武漢大學；郵編：430072)，保藏編號為CCTCC NO：M 2016398。谷氨酸棒桿菌FNT112(Corynebacterium glutamicum FNT112)CCTCC NO：M 2016398簡稱為谷氨酸棒桿菌FNT112。

三、谷氨酸棒桿菌FNT112的遺傳穩(wěn)定性

將谷氨酸棒桿菌FNT112進行傳代培養(yǎng)以考察其遺傳穩(wěn)定性，每3天傳代一次，傳代15代，每隔一代進行測定菌株發(fā)酵液中L-色氨酸含量，結果顯示谷氨酸棒桿菌FNT112傳代過程中發(fā)酵液中L-色氨酸含量無明顯變化，具有良好的遺傳穩(wěn)定性。谷氨酸棒桿菌FNT112的遺傳標記為L-酪氨酸營養(yǎng)缺陷型、L-苯丙氨酸營養(yǎng)缺陷型、重氮乙酰絲氨酸(AZ)抗性以及5-甲基色氨酸(5-MT)抗性。

實施例2、谷氨酸棒桿菌FNT112的發(fā)酵應用

一、搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸

1、將實施例1得到的谷氨酸棒桿菌FNT112接種至裝有30mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，8層紗布封口，33℃振蕩培養(yǎng)(220r/min)16小時，得到種子液(種子液的OD_562nm＝40)。

2、將3mL步驟1得到的種子液接種至裝有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，8層紗布封口，33℃振蕩培養(yǎng)(220r/min)48小時。

試驗組甲采用的發(fā)酵培養(yǎng)基為液體發(fā)酵培養(yǎng)基甲。

試驗組乙采用的發(fā)酵培養(yǎng)基為液體發(fā)酵培養(yǎng)基乙。

試驗組丙采用的發(fā)酵培養(yǎng)基為液體發(fā)酵培養(yǎng)基丙。

3、將步驟2的發(fā)酵體系離心(室溫20℃、6000rpm、15min)，收集上清液(試驗組甲得到發(fā)酵液甲I、試驗組乙得到發(fā)酵液乙I、試驗組丙得到發(fā)酵液丙I)。

4、將谷氨酸棒桿菌ATCC 21851代替谷氨酸棒桿菌FNT112進行按照步驟1-3進行操作，收集上清液(采用液體發(fā)酵培養(yǎng)基甲得到對照液甲I、采用液體發(fā)酵培養(yǎng)基乙得到對照液乙I、采用液體發(fā)酵培養(yǎng)基丙得到對照液丙I)。

5、檢測步驟3得到的發(fā)酵液和步驟4得到的對照液中L-色氨酸含量(采用日立L-8800型氨基酸自動分析儀進行測定)。

結果表明，發(fā)酵液甲I中的L-色氨酸濃度為9.5g/L，發(fā)酵液乙I中的L-色氨酸濃度為9.0g/L，發(fā)酵液丙I中的L-色氨酸濃度為8.5g/L，對照液甲I中的L-色氨酸濃度為2.8g/L，對照液乙I中的L-色氨酸濃度為2.5g/L，對照液乙I中的L-色氨酸濃度為2.0g/L。

發(fā)酵液甲I中的L-色氨酸濃度最高。

6、采用豆粕水解液乙替代等濃度的豆粕水解液甲，按照步驟1-4進行實驗，得到發(fā)酵液甲II、發(fā)酵液乙II、發(fā)酵液丙II、對照液甲II、對照液乙II和對照液丙II。檢測各發(fā)酵液和對照液中的L-色氨酸含量。

結果表明，發(fā)酵液甲II中的L-色氨酸濃度為8.0g/L，發(fā)酵液乙II中的L-色氨酸濃度為7.0g/L，發(fā)酵液丙II中的L-色氨酸濃度為7.5g/L，對照液甲II中的L-色氨酸濃度為2.0g/L，對照液乙II中的L-色氨酸濃度為1.8g/L，對照液乙II中的L-色氨酸濃度為1.5g/L。

二、工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸

1、將氨酸棒桿菌FNT112采用30L全自動發(fā)酵罐進行發(fā)酵，發(fā)酵分為兩個階段(發(fā)酵全過程pH為7.0)：第一階段(采用30L發(fā)酵罐，種子培養(yǎng)基的裝液量為15L，培養(yǎng)時間為16小時)：攪拌300rpm，溶氧(DO)30-50％，溫度33℃，得到種子液(種子液的OD_562nm＝40)；第二階段(采用30L發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)基甲的裝液量為15L，將3L第一階段得到的種子液移種至15L發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)時間為48小時)：維持發(fā)酵罐中的葡萄糖含量為0.5-1.0g/100mL(每當培養(yǎng)體系中的還原糖濃度低于0.5g/100mL時，加入70％的葡萄糖水溶液使得培養(yǎng)體系中的還原糖濃度達到1.0g/100mL)，溶氧(DO)30-50％，攪拌300rpm，溫度33℃。

2、將步驟1的發(fā)酵體系離心(4℃、6000rpm、15min)，收集上清液(發(fā)酵液)。

3、將谷氨酸棒桿菌ATCC 21851代替谷氨酸棒桿菌FNT112進行按照步驟1-2進行操作，收集上清液(對照液)。

4、檢測步驟2得到的發(fā)酵液和步驟3得到的對照液中L-色氨酸含量(采用日立L-8800型氨基酸自動分析儀進行測定)。

結果表明，谷氨酸棒桿菌FNT112發(fā)酵液中的L-色氨酸濃度為40.5g/L，谷氨酸棒桿菌ATCC 21851發(fā)酵液中的L-色氨酸濃度為13.3g/L。