本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體的說是涉及生物堿類化合物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：手足口病(HFMD)是由多種腸道病毒引起的常見傳染病，主要通過消化道、呼吸道和密切接觸等途徑傳播，以嬰幼兒發(fā)病為主。手足口病主要由RNA病毒科腸道病毒屬柯薩奇病毒A16型(CoxA16)及腸道病毒71型(EV71)感染引起，以71型病毒最為嚴(yán)重。HFMD主要表現(xiàn)為發(fā)熱伴肌陣攣、口腔黏膜潰瘍性皰疹及四肢末端水皰樣皮疹，嚴(yán)重可引起腦炎、腦干腦炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹、急性遲緩性癱瘓等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病，危害嚴(yán)重。目前，盡管針對EV71病毒的疫苗已經(jīng)獲批上市，但仍沒有直接靶向病毒的藥物，臨床主要采取對癥治療的策略；而廣譜抗病毒藥物利巴韋林在應(yīng)用于嬰幼兒時有致畸和抑制生長發(fā)育的風(fēng)險。流行性感冒，是流感病毒引起的一種具有高度傳染性的急性吸道疾病，是對人類健康威脅最大的傳染病之一，具有發(fā)病率高、流行廣等特點，至今尚不能有效控制。流感病毒可通過空氣飛沫傳播，傳播迅速，一旦大規(guī)模爆發(fā)難以控制。流感起病急驟，并發(fā)癥發(fā)生率高，可引起全身不適，包括打噴嚏、咳嗽、頭痛、發(fā)熱發(fā)冷、疲倦乏力、食欲不振等癥狀，其危害性更體現(xiàn)在嚴(yán)重時引起的肺炎、充血性心力衰竭及其他并發(fā)癥，常危及嬰幼兒、老年人及免疫力低下者的生命。2009年甲型H1N1流感，我國內(nèi)地累計報告重癥病例4328例，死亡326例；2013年中國出現(xiàn)的H7N9禽流感病毒感染人病例共計130例，其中35人死亡，該疫情再度引起了社會對流感的廣泛關(guān)注以及對抗流感病毒藥物研發(fā)的迫切需求。目前，治療流感的西藥主要有M2離子通道抑制劑(金剛烷胺和金剛乙胺)、NA抑制劑(奧司他韋和扎那米韋)和流感疫苗。金剛烷胺和金剛乙胺僅對甲型流感病毒有抑制作用，且存在不良反應(yīng)。奧司他韋作為一線抗流感病毒藥物使用，但陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了奧司他韋耐藥株出現(xiàn)并傳播，且價格昂貴。扎那米韋主要用于流感的早期治療，但不適用于兒童，對有哮喘或慢性阻塞性肺病的患者可能有增加支氣管痙攣的危險。而疫苗僅對己知道的流感病毒亞型有預(yù)防作用，對由抗原性漂移或抗原性轉(zhuǎn)換所產(chǎn)生的新型流感病毒無效，流感疫苗研制和使用相對滯后。中藥抗流感病毒具有整體調(diào)節(jié)、多靶點治療的特點，具有較強的抗病毒作用，其作用往往是廣譜的，不僅能抑制病毒增殖、抑制炎癥反應(yīng)和解熱，同時還具有免疫調(diào)節(jié)功能，從根本上抵制病毒侵害，中藥復(fù)方多成分、多途徑、多靶點的特點可以達到“整體綜合調(diào)節(jié)”的效果，較單一抗流感病毒的化學(xué)藥物優(yōu)勢明顯。近年來，中藥治療手足口和流感的抗病毒研究逐漸引起人們的關(guān)注，而且由于很多中藥組分屬于天然提取藥物，具有副作用小等優(yōu)點，因此研究抗病毒中藥成分，能夠彌補化學(xué)藥物的不足，擴寬治療途徑。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供具有式Ⅰ結(jié)構(gòu)的生物堿類化合物在制備治療病毒性疾病藥物或在制備病毒抑制劑中的應(yīng)用，使其對流感病毒和腸道病毒引起的病毒性疾病，如手足口病和流感有較好地治療效果，同時對所述病毒有抑制作用。本發(fā)明所述具有式Ⅰ結(jié)構(gòu)的生物堿類化合物具有如下結(jié)構(gòu)：其中，R為-OH或＝O；當(dāng)R為-OH時，式Ⅰ化合物為貝母甲素(貝母素甲)，當(dāng)R為＝O時，式Ⅰ化合物為貝母乙素(貝母素乙)。本發(fā)明所述生物堿類化合物可從平貝母中提取獲得，也可通過市售途徑購買，目前針對貝母甲素和貝母乙素的具體作用還沒有相關(guān)的記載。本發(fā)明經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，2個生物堿類化合物對流感病毒神經(jīng)氨酸酶具有較好的抑制活性，抗流感病毒活性明顯；同時對腸道病毒誘導(dǎo)的細胞病變均有抑制作用，能提高病毒感染細胞的存活率，具有抗手足口病毒作用，故本發(fā)明提出了上述應(yīng)用和發(fā)明目的。在本發(fā)明所述應(yīng)用的具體實施方式中，所述病毒性疾病為手足口病和/或流感，所述病毒為流感病毒和/或腸道病毒。其中，所述流感病毒可以是甲型流感病毒，例如H1N1型流感病毒和/或H3N2型流感病毒；所述腸道病毒可以是柯薩奇病毒和/或腸道病毒EV71型，柯薩奇病毒可以選自柯薩奇病毒A16型。本發(fā)明通過實驗證明了式Ⅰ生物堿類化合物對腸道病毒、流感病毒誘導(dǎo)的細胞病變均有抑制作用，能提高病毒感染細胞的存活率，抑制病毒的復(fù)制，提高病毒感染動物的生存率，延長感染動物的生存時間，緩解病毒感染引發(fā)的病癥，明顯減少流感病毒感染所致的小鼠死亡，延長小鼠的平均存活時間；能夠明顯抑制流感病毒感染所致小鼠肺部感染，有效緩解小鼠的肺部感染癥狀。上述試驗結(jié)果表明式Ⅰ生物堿類化合物應(yīng)用到藥物或抑菌劑中會具有顯著療效，本發(fā)明提供了式Ⅰ生物堿類化合物針對腸道病毒及其引發(fā)的疾病的活性劑量為20-100mg/kg/d，針對流感病毒及其引發(fā)的疾病的活性劑量為5-80mg/kg/d。所述藥物和抑菌劑可獨立選自口服給藥劑型、注射給藥劑型、外用給藥制劑。所述藥物和抑菌劑包括式Ⅰ生物堿類化合物和藥學(xué)上可接受的載體。在本發(fā)明中，所述藥學(xué)上可接受的載體可根據(jù)藥劑學(xué)領(lǐng)域的常用輔料，根據(jù)劑型和實際情況進行恰當(dāng)選擇，例如常用的輔料有淀粉、低取代羥丙基纖維素、微粉硅膠、硬脂酸鎂、淀粉漿、蔗糖、糊精、羧甲基淀粉鈉、滑石粉、聚山梨酯、聚乙二醇、注射用大豆磷脂和注射用甘油等；所述口服給藥劑型可以為片劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、溶液劑、乳劑、混懸劑；口服給藥劑型中式Ⅰ生物堿類化合物的質(zhì)量分數(shù)為17.5～88％，更優(yōu)選為20～80％，最優(yōu)選為25～75％。所述外用給藥劑型可以為栓劑、貼劑或凝膠劑。所述注射給藥劑型可以為注射液、凍干粉等。由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了式Ⅰ生物堿類化合物在制備治療病毒性疾病藥物或在制備病毒抑制劑中的應(yīng)用。式Ⅰ結(jié)構(gòu)的生物堿類化合物來源于天然中草藥植物平貝母，副作用小，對腸道病毒和流感病毒均有抑制作用，并對其引起的病毒性疾病有較好的治療效果，提供了利用中藥成分治療手足口病和流感的新途徑。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例5中貝母甲素對MDCK狗腎細胞的毒性；圖2為本發(fā)明實施例6中貝母甲素對流感病毒株H1N1的抑制活性；圖3為本發(fā)明實施例6中貝母甲素對流感病毒株H3N2的抑制活性。具體實施方式本發(fā)明公開了具有式Ⅰ結(jié)構(gòu)的生物堿類化合物在制備治療病毒性疾病藥物或在制備病毒抑制劑中的應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明所述應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的應(yīng)用進行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。在本發(fā)明的具體實施方式中，采用中國藥品生物制品檢定所提供的貝母甲素和貝母乙素。在具體實施方式中，本發(fā)明采用MTS法測定貝母乙素對腸道病毒EV71和CoxA16病毒感染Vero細胞的保護及抑制病毒復(fù)制作用，結(jié)果表明貝母乙素對抗EV71病毒EC50為87mg/L，約合202μmol/L，抗CoxA16病毒EC50為83mg/L，約合194μmol/L。同時，貝母乙素能夠抑制病毒在宿主細胞內(nèi)的復(fù)制，降低病毒載量，具有促進病毒轉(zhuǎn)陰的作用。本發(fā)明以腹腔注射的方式進行了貝母乙素對腸道病毒EV71型所致小鼠感染的療效測試，結(jié)果表明，貝母乙素明顯抑制EV71病毒導(dǎo)致的小鼠死亡，顯著延長小鼠的存活時間達51.2％；本發(fā)明以腹腔注射的方式進行了貝母乙素對柯薩奇病毒A16型所致小鼠感染的療效測試，結(jié)果表明，貝母乙素明顯抑制柯薩奇病毒A16型導(dǎo)致的小鼠死亡，顯著延長小鼠的存活時間達39.4％；貝母乙素與陽性對照藥利巴韋林的抑制效果相似，能夠不同程度地緩解病毒導(dǎo)致的小鼠死亡，延長小鼠存活時間，并能抑制病毒導(dǎo)致的炎癥因子釋放，緩解炎癥等癥狀。同時，本發(fā)明采用了MTS法測定了貝母甲素對甲型流感病毒的抑制活性，結(jié)果表明，貝母甲素對流感病毒株A/PuertoRico/8/1934(H1N1)和A/Human/Hubei/3/2005(H3N2)的抑制活性較好，在20μM時對H1N1抑制率可達75.1％。本發(fā)明測定了貝母甲素對流感病毒神經(jīng)氨酸酶的抑制作用，根據(jù)貝母甲素、空白對照組、酶液對照組和陽性對照藥奧司他韋組的熒光值計算出貝母甲素對流感病毒神經(jīng)氨酸酶的抑制率和半數(shù)抑制濃度(IC50)，結(jié)果表明，貝母甲素對流感病毒神經(jīng)氨酸酶的抑制率為64.35％；半數(shù)抑制濃度(IC50)為13.4±1.24μM，說明貝母甲素對流感病毒神經(jīng)氨酸酶具有較好的抑制作用。本發(fā)明還分別以灌胃(口服)和注射的方式進行了貝母甲素對甲型流感病毒所致小鼠感染的療效測試，結(jié)果表明，貝母甲素在劑量20/40/80mg/kg/day時灌胃給藥6天，小鼠的存活率分別為20％、50％和70％，平均存活天數(shù)分別為8.7±1.8天、10.4±2.1天和12.4±2.7天，肺指數(shù)抑制率分別為21％、35％和48％，陽性對照奧司他韋的小鼠存活率為80％，平均存活時間為13.5±2.4天，肺指數(shù)抑制率為53％；貝母甲素在劑量20/40/80mg/kg/day時注射給藥6天，小鼠的存活率分別為30％、50％和80％，平均存活天數(shù)分別為8.9±2.1天、10.6±2.4天和12.8±1.8天，肺指數(shù)抑制率分別為20％、32％和49％，陽性對照奧司他韋的小鼠存活率為80％，平均存活時間為13.1±2.0天，肺指數(shù)抑制率為51％。由此可見，貝母甲素與陽性對照藥奧司他韋對甲型流感病毒的抑制效果相似，貝母甲素能夠明顯減少流感病毒感染所致的小鼠死亡，延長小鼠的平均存活時間；能夠明顯抑制流感病毒感染所致小鼠肺部感染，有效緩解小鼠的肺部感染癥狀。下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明。實施例1：貝母乙素的細胞毒性1、實驗材料細胞與培養(yǎng)方法：采用非洲綠猴腎細胞(Vero)為細胞模型，采用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號：150713)，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細胞生長至90％密度后胰酶消化(Gibco公司，批號：1535318)傳代，傳代比例1/3-1/4。試劑：MTS細胞增殖定量檢測試劑盒，購自Promega公司(批號：0000158071)；貝母乙素，購自上海永恒生物科技有限公司，批號YH20150425。儀器：微孔板讀數(shù)儀，購自MolecularDevices公司，型號：SpectraMaxM2e；倒置顯微鏡，購自O(shè)lympus公司，型號：CKX41；二氧化碳培養(yǎng)箱，購自ThermoScientific公司，型號：FormaSteri-Cycle371；生物安全柜，購自上海潔佳空氣凈化技術(shù)有限公司。2、實驗方法取培養(yǎng)至90％密度的Vero細胞，0.25％胰酶消化后，用含10％胎牛血清的M199培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度至1×105mL-1，每孔接種100μL細胞懸液于96孔板中。加入200μL不同濃度的含藥M199培養(yǎng)基(樣品從2000μg/mL-1起連續(xù)2倍梯度稀釋6個梯度，胎牛血清終濃度為2.5％)，同時設(shè)置對照組(培養(yǎng)基中不含任何受試藥物)，各組處理含3個復(fù)孔，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后進行細胞增殖定量檢測，用酶標(biāo)儀于490nm處檢測各孔吸光值(A)。以100％×[A(樣品組)/A(對照組)]作為各組處理的細胞存活率，計算樣品對Vero細胞的半數(shù)毒性濃度(TC50)。3、實驗結(jié)論如表1所示，貝母乙素對Vero細胞的毒性作用呈明顯的量效關(guān)系，細胞活性隨給藥濃度提高而逐步降低，表明貝母乙素對細胞的毒性逐步增加，根據(jù)表1數(shù)據(jù)計算得貝母乙素對Vero細胞TC50＝747mg/L，約合1.74mmol/L。表1貝母乙素對Vero細胞活力的影響(％，均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n＝3)*表示各組數(shù)據(jù)與對照組相比，在P<0.05的水平上具有顯著差異本實施例明確了貝母乙素對Vero細胞的毒性情況，TC50＝516mg/L，約合1.2mmol/L，貝母乙素在31.25μg/mL時對MDCK細胞無細胞毒性。實施例2：貝母乙素對EV71和CoxA16病毒感染Vero細胞的保護及抑制病毒復(fù)制作用1、實驗材料采用非洲綠猴腎細胞(Vero)為細胞模型，采用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號：150713)，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細胞生長至90％密度后胰酶消化(Gibco公司，批號：1535318)傳代，傳代比例1/3-1/4。EV71病毒BJ09/07株，GenBank登錄號JQ319054.1，CoxA16病毒TS10/08株，GenBank登錄號JX068829。臨用前測定EV71病毒半數(shù)細胞病變劑量(TCID50)為108/mL，CoxA16TCID50為108.5/mL。MTS細胞增殖定量檢測試劑盒，購自Promega公司(批號：0000158071)；貝母乙素，購自上海永恒生物科技有限公司，批號YH20150425；總RNA提取試劑盒TRIzol購自美國Invitrogen公司(批號14105)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM購自寶生物工程(大連)有限公司(批號：AK2401)，EV71和CoxA16病毒載量檢測試劑盒購自上海之江生物科技股份有限公司(批號均為H20140301-3)。微孔板讀數(shù)儀，購自MolecularDevices公司，型號：SpectraMaxM2e；倒置顯微鏡，購自O(shè)lympus公司，型號：CKX41；二氧化碳培養(yǎng)箱，購自ThermoScientific公司，型號：FormaSteri-Cycle371；生物安全柜，購自上海潔佳空氣凈化技術(shù)有限公司；普通PCR儀，型號：2720，熒光定量PCR儀，型號：StepOnePlusTM，均購自ABI公司。2、實驗方法取培養(yǎng)至90％密度的Vero細胞，0.25％胰酶消化后，用含10％胎牛血清的M199培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度至1×105mL-1，每孔接種100μL細胞懸液于96孔板中。加入50μLCoxA16或EV71病毒懸液(100TCID50)，加入50μL不同濃度的含藥M199培養(yǎng)基(終濃度從500μg/mL開始以2倍梯度連續(xù)稀釋5個濃度，共計6個給藥濃度，胎牛血清終濃度為2.5％)，同時設(shè)置對照組(既不含病毒也不含藥)和模型組(僅含病毒)，各組處理含3個復(fù)孔，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后進行細胞增殖定量檢測，用酶標(biāo)儀于490nm處檢測各孔吸光值(A)。以100％×[A(樣品組)-A(模型組)]/[A(對照組)-A(模型組)]作為各組的保護率，計算樣品對CoxA16和EV71病毒細胞的半最大效應(yīng)濃度(EC50)。在研究感染細胞病毒載量的實例中，消化的細胞用10％胎牛血清的M199培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度至2×105mL-1，每孔接種1mL于6孔板中，加入1mL含2000TCID50病毒的M199培養(yǎng)基以及藥物(終濃度為250μg/mL)，同時設(shè)置對照組和模型組，各組處理含2個復(fù)孔，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8h后參照試劑盒說明書分別提取RNA，合成cDNA以及檢測病毒載量。3、實驗結(jié)論表2貝母乙素對EV71和CoxA16病毒的抑制率(％，均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n＝3)濃度(μg/mL)EV71抑制率(％)CoxA16抑制率(％)15.62518.81±3.1712.97±3.7431.2523.09±2.4633.26±2.5762.534.72±3.3942.63±3.3712556.37±1.9752.08±4.6425078.93±4.4977.25±3.4250062.84±2.1960.70±2.57如表2所示，貝母乙素對EV71和CoxA16病毒的抑制呈劑量依賴效應(yīng)，抑制率隨給藥劑量增加逐漸提高，其中250μg/mL濃度的病毒抑制效果最佳。根據(jù)表2中數(shù)據(jù)計算得貝母乙素抗EV71病毒EC50為87mg/L，抗CoxA16病毒EC50為83mg/L(0.194mmol/L)。表3貝母乙素對EV71和CoxA16病毒復(fù)制的抑制作用(均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n＝6)*表示各組數(shù)據(jù)與對照組相比，在P<0.05的水平上具有顯著差異如表3所示，250μg/mL貝母乙素能夠顯著抑制細胞內(nèi)EV71和CoxA16病毒復(fù)制，降低病毒載量，表明貝母乙素具有促進病毒轉(zhuǎn)陰的作用。本實施例明確了貝母乙素對EV71和CoxA16病毒的抑制性情況，研究表明貝母乙素對抗EV71病毒EC50為87mg/L，約合202μmol/L，抗CoxA16病毒EC50為83mg/L，約合194μmol/L。同時，貝母乙素能夠抑制病毒在宿主細胞內(nèi)的復(fù)制，降低病毒載量，具有促進病毒轉(zhuǎn)陰的作用。實施例3：貝母乙素對EV71病毒感染的治療作用1、實驗材料5日齡ICR小鼠(Musmusculus)，購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場。EV71病毒BJ09/07株，GenBank登錄號JQ319054.1。臨用前測定EV71病毒半數(shù)細胞病變劑量(TCID50)為108/mL。利巴韋林注射液(辰欣藥業(yè)有限公司，批號：140903642，RBV)、注射液用生理鹽水、一次性無菌注射器。細胞因子IL-6(批號：117467012)、TNF-α(批號：116660009)和MCP-1(批號：105130013)ELISA測定試劑盒，購自eBioscience公司。2、實驗方法(1)病毒液配制：根據(jù)病毒TCID50值，臨用前將病毒稀釋至107TCID50/mL。(2)藥液配制：貝母乙素(購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號：141113)采用注射用生理鹽水稀釋至所需劑量，0.22μm微孔濾膜過濾后待用。利巴韋林注射液于臨用前搖勻開瓶，采用生理鹽水稀釋至所需劑量。(3)分組、造模與給藥：5日齡小鼠按照如下設(shè)計進行分組、造模及給藥：小鼠隨機按為11組：空白對照組、EV71模型組、貝母乙素高、中和低劑量組(100、50和20mg/kg)以及利巴韋林組(10mg/kg)，每組含13只小鼠。各組小鼠分別腹腔注射EV71病毒懸液，每只0.1mL，空白對照組以注射生理鹽水代替。給藥：造模結(jié)束后，每只小鼠進行腹腔注射給藥(空白對照組和模型組以注射生理鹽水代替)，每次0.1mL，每日1次，連續(xù)給藥13日。造模后第6天每組各取3只乳鼠，取血清測定細胞因子IL-6、TNF-α和MCP-1含量。動物實驗過程的所有操作，都根據(jù)科技部2006年頒布的《關(guān)于善待動物的指導(dǎo)性意見》進行。3、實驗結(jié)論如表4所示，與陽性藥利巴韋林注射液相似，中劑量組(50mg/kg)貝母乙素明顯抑制EV71病毒導(dǎo)致的小鼠死亡，顯著延長小鼠的存活時間達51.2％；其他各劑量的貝母乙素也具有相似的藥效，不同程度地緩解病毒導(dǎo)致的小鼠死亡，延長小鼠存活時間。表4貝母乙素注射給藥緩解EV71病毒導(dǎo)致的小鼠死亡(n＝10)和*表示該組數(shù)據(jù)與EV71組相比，P<0.05。如表5所示，EV71病毒感染導(dǎo)致小鼠血清中IL-6、TNF-α和MCP-1含量異常升高，50mg/kg貝母乙素明顯平抑EV71病毒導(dǎo)致的小鼠細胞因子升高(P<0.05)。表5小鼠血清細胞因子含量(ng/L，n＝3)組別IL-6TNF-αMCP-1空白對照組24.22±5.19*38.07±4.36*112.94±12.94*EV71153.73±26.86187.26±17.36387.59±31.68EV71+10042.83±7.89*58.31±8.35*187.82±8.81*EV71+5030.72±6.44*49.06±6.83*133.53±10.98*EV71+2098.48±7.59*147.67±7.58*336.09±16.06*EV71+RBV53.61±8.93*60.75±10.48*179.83±11.38*＊表示該組數(shù)據(jù)與EV71相比P<0.05。上述數(shù)據(jù)表明貝母乙素治療性注射給藥能夠降低EV71病毒致小鼠死亡，延長小鼠存活時間，并能抑制病毒導(dǎo)致的炎癥因子釋放，緩解炎癥等癥狀。實施例4：貝母乙素對柯薩奇病毒A16型感染的治療作用1、實驗材料5日齡ICR小鼠(Musmusculus)，購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場。CoxA16病毒TS10/08株，GenBank登錄號JX068829，CoxA16TCID50為108.5/mL。利巴韋林口服液(廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技產(chǎn)業(yè)園有限公司，批號：150908，RBVO)、生理鹽水、乳鼠灌胃器。細胞因子IL-6(批號：117467012)、TNF-α(批號：116660009)和MCP-1(批號：105130013)ELISA測定試劑盒，購自eBioscience公司。2、實驗方法(1)病毒液配制：根據(jù)病毒TCID50值，臨用前將病毒稀釋至107TCID50/mL。(2)藥液配制：貝母乙素(購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號：141113)采用生理鹽水稀釋至所需劑量。利巴韋林口服液臨用前搖勻開瓶，采用生理鹽水稀釋至所需劑量(0.32g/kg)。(3)分組、造模與給藥：5日齡小鼠按照如下設(shè)計進行分組、造模及給藥：小鼠隨機分為11組：空白對照組、CoxA16模型組、貝母乙素高、中和低劑量組(400、200和100mg/kg)以及利巴韋林組(0.32g/kg)，每組含13只小鼠。給藥：每只小鼠進行灌胃給藥(空白對照組和模型組以生理鹽水代替)，每次0.1mL，每日1次，連續(xù)給藥15天。給藥后第3天進行造模，各組小鼠分別腹腔注射CoxA16病毒懸液，每只0.1mL，空白對照組以注射生理鹽水代替。造模后第6天每組各取3只乳鼠，取血清測定細胞因子IL-6、TNF-α和MCP-1含量。動物實驗過程的所有操作，都根據(jù)科技部2006年頒布的《關(guān)于善待動物的指導(dǎo)性意見》進行。3、實驗結(jié)論如表6所示，與陽性藥利巴韋林口服液相似，中劑量組(200mg/kg)貝母乙素明顯抑制CoxA16病毒導(dǎo)致的小鼠死亡，顯著延長小鼠的存活時間達39.4％。同時，其他各劑量的貝母乙素也具有相似的藥效，不同程度地緩解病毒導(dǎo)致的小鼠死亡，延長小鼠存活時間。表6貝母乙素口服給藥緩解CoxA16病毒導(dǎo)致的小鼠死亡(n＝10)組別死亡率(％)平均生存時間(天)空白對照組0$15#CoxA1610010.4±0.3CoxA16+40020$13.2±0.6#CoxA16+20010$14.5±0.4#CoxA16+10040$11.1±0.7#CoxA16+RBVO50$12.0±0.5#$和#表示該組數(shù)據(jù)與CoxA16組相比，P<0.05。如表7所示，CoxA16病毒感染導(dǎo)致小鼠血清中IL-6、TNF-α和MCP-1含量異常升高，200mg/kg貝母乙素明顯抑制CoxA16病毒引起的小鼠細胞因子升高(P<0.05)。表7小鼠血清細胞因子含量(ng/L，n＝3)組別IL-6TNF-αMCP-1空白對照組34.57±5.16*53.17±8.09*140.42±10.58*CoxA16171.41±19.67195.64±16.76402.24±21.94CoxA16+40058.35±6.59*69.94±7.49*234.84±16.05*CoxA16+20042.58±3.90*56.67±8.36*154.64±5.28*CoxA16+10088.56±6.80*136.51±7.29*237.81±11.84*CoxA16+RBVO63.94±4.36*86.43±8.68*212.62±6.06**表示該組數(shù)據(jù)與CoxA16組相比P<0.05。上述數(shù)據(jù)表明貝母乙素預(yù)防性口服給藥能夠降低CoxA16病毒致小鼠死亡，延長小鼠存活時間，并能抑制病毒導(dǎo)致的炎癥因子釋放，緩解炎癥等癥狀。實施例5：貝母甲素的細胞毒性細胞與病毒：流感病毒A/PuertoRico/8/1934(H1N1)株，流感病毒A/Human/Hubei/3/2005(H3N2)株，均由中國科學(xué)院武漢病毒研究所陳緒林研究員惠贈；MDCK狗腎細胞，購于美國ATCC細胞庫；藥物：奧司他韋羧酸鹽，購于上海佰世凱化學(xué)科技有限公司；貝母甲素購于中國藥品生物制品檢定所；動物：BALB/c小鼠，18～20g，雌雄各半，南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場。儀器：CO2培養(yǎng)箱，美國ThermoFisherScientific；酶標(biāo)儀，MolecularDevices；生物安全柜，購自HealForce公司。MDCK細胞按5×104個/ml濃度接種到96孔板中，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。貝母甲素以不同濃度5μM、10μM、20μM、40μM、80μM、160μM加入細胞，每組3個復(fù)孔。培養(yǎng)48h后，加入10％MTS,在酶標(biāo)儀A490nm下測定吸光值，計算細胞存活率，確定藥物的最大無毒濃度。結(jié)果如圖1所示，圖1為本發(fā)明實施例5中貝母甲素對MDCK狗腎細胞的毒性。由圖1可知，貝母甲素在20μM時對MDCK細胞無細胞毒性。實施例6：貝母甲素對甲型流感病毒的抑制活性所需試驗材料見實施例5。MDCK細胞按5×104個/mL濃度接種96孔培養(yǎng)板，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)形成細胞單層。加入1640培養(yǎng)基稀釋(1:160)的流感病毒A/PuertoRico/8/1934(H1N1)或A/Human/Hubei/3/2005(H3N2)感染細胞，每孔100μL，37℃孵育2h后，棄去病毒液。加入最大無毒濃度下的貝母甲素和陽性對照藥奧司他韋(5μM)，每組設(shè)3個復(fù)孔。細胞于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，MTS測定OD490nm，計算抑制率。病毒抑制率％＝(OD加藥組-OD病毒對照組)/(OD正常細胞對照組-OD病毒對照組)×100％。實驗結(jié)果見圖2-3，圖2為本發(fā)明實施例6中貝母甲素對流感病毒株H1N1的抑制活性；圖3為本發(fā)明實施例6中貝母甲素對流感病毒株H3N2的抑制活性。由圖2和圖3可以看出，貝母甲素對流感病毒株A/PuertoRico/8/1934(H1N1)和A/Human/Hubei/3/2005(H3N2)的抑制活性較好，在20μM時對H1N1抑制率可達75.1％。實施例7：貝母甲素對流感病毒神經(jīng)氨酸酶的抑制作用所需試驗材料見實施例5。96孔黑板，每孔依次加入35μLMES緩沖液，30μL以MES稀釋的病毒尿囊液，再加入10μL的不同濃度稀釋的貝母甲素，置于37℃孵育5min，實驗同時設(shè)置空白對照組、酶液對照組、陽性對照藥奧司他韋組(5μM)。然后避光每孔加入25μL的神經(jīng)氨酸酶特異性熒光底物MUNANA。于37℃孵育20min后，每孔加入100μL的終止液。于激發(fā)波長360nm發(fā)射波長440nm處測定熒光強度，計算貝母甲素對神經(jīng)氨酸酶活性的抑制率及流半數(shù)抑制濃度(IC50)。神經(jīng)氨酸酶酶活抑制率＝(空白對照組的熒光值-加藥組的熒光值)/(空白組的熒光值-背景組的熒光值)100％。結(jié)果如表8所示，貝母甲素對A/PuertoRico/8/1934(H1N1)流感病毒神經(jīng)氨酸酶具有抑制活性，抗流感病毒活性明顯。表8貝母甲素和奧司他韋對A/PuertoRico/8/1934(H1N1)神經(jīng)氨酸酶的抑制率和半數(shù)抑制濃度(IC50)組別濃度(μM)抑制率(％)IC50(μM)貝母甲素2064.35±0.4713.4±1.24奧司他韋597.68±0.35(0.27±0.01)×10-3實施例8：貝母甲素灌胃(口服)給藥對甲型流感病毒所致小鼠感染的治療效果所需試驗材料見實施例5。分組將小鼠隨機分為6組，隨機正常組、模型組、高劑量組、中劑量、低劑量組、陽性藥奧司他韋組，每組10只。造模：小鼠乙醚麻醉后，模型組和貝母甲素給藥組用生理鹽水按照1:1600(V/V)稀釋A/PuertoRico/8/1934(H1N1)毒株尿囊液，滴鼻感染小鼠，每只小鼠滴鼻60μL。滴鼻感染流感病毒2h后，高、中、低劑量組小鼠灌胃給予貝母甲素，每只0.2mL，正常組給于等量生理鹽水，每天給藥1次，連續(xù)給藥6天。連續(xù)14天觀察各組小鼠的存活情況，計算死亡保護率和平均存活時間。于感染病毒后第5天禁食禁水8h，記錄體重，摘除眼球放血致死，酒精消毒，解剖，無菌取出全肺，用生理鹽水清洗肺組織2次，用濾紙吸干，記錄肺重。按照式1和式2計算肺指數(shù)及肺指數(shù)抑制率。實驗結(jié)果及分析：(1)貝母甲素灌胃給藥對H1N1感染小鼠死亡的保護作用結(jié)果如表9所示，與模型組相比，貝母甲素高、中、低劑量組均能減少流感病毒感染所致的小鼠的死亡，延長小鼠的平均存活時間。表9貝母甲素灌胃給藥對H1N1感染小鼠死亡的保護作用組別濃度(mg/kg/day)存活數(shù)平均存活時間(天)正常組-10/1014.0±0.0**模型組-0/107.2±1.3高劑量807/10**12.4±2.7**中劑量405/10*10.4±2.1*低劑量202/108.7±1.8奧司他韋508/10**13.5±2.4***P<0.05，**P<0.01，與模型組比較。(2)貝母甲素灌胃給藥對H1N1感染小鼠肺的保護作用結(jié)果如表10所示，與模型組相比，貝母甲素高、中、低劑量組均能抑制流感病毒感染所致小鼠肺部感染，有效緩解肺部感染癥狀。表10貝母甲素灌胃給藥對H1N1感染小鼠肺指數(shù)的影響組別濃度(mg/kg/day)肺指數(shù)肺指數(shù)抑制率％正常組-0.63±0.03-模型組-2.14±0.04-高劑量801.10±0.03**48中劑量401.35±0.04***35低劑量201.61±0.02***21奧司他韋501.00±0.07**53*P<0.05，**P<0.01，與模型組比較。實施例9：貝母甲素注射給藥對甲型流感病毒所致小鼠感染的治療效果所需試驗材料見實施例5。分組將小鼠隨機分為6組，隨機正常組、模型組、高劑量組、中劑量、低劑量組、陽性藥奧司他韋組，每組10只。造模：小鼠乙醚麻醉后，模型組和貝母甲素給藥組用生理鹽水按照1:1600(V/V)稀釋A/PuertoRico/8/1934(H1N1)毒株尿囊液，滴鼻感染小鼠，每只小鼠滴鼻60μL。滴鼻感染流感病毒2h后，高、中、低劑量組小鼠尾靜脈注射給予貝母甲素，每只0.2mL，正常組給于等量生理鹽水，每天給藥1次，連續(xù)給藥6天。連續(xù)14天觀察各組小鼠的存活情況，計算死亡保護率和平均存活時間。于感染病毒后第5天禁食禁水8h，記錄體重，摘除眼球放血致死，酒精消毒，解剖，無菌取出全肺，用生理鹽水清洗肺組織2次，用濾紙吸干，記錄肺重。計算肺指數(shù)及肺指數(shù)抑制率。實驗結(jié)果及分析：(1)貝母甲素注射給藥對H1N1感染小鼠死亡的保護作用結(jié)果如表11所示，與模型組相比，貝母甲素高、中、低劑量組均能減少流感病毒感染所致的小鼠的死亡，延長小鼠的平均存活時間。表11貝母甲素注射給藥對H1N1感染小鼠死亡的保護作用組別濃度(mg/kg/day)存活數(shù)平均存活時間(天)正常組-10/1014.0±0.0**模型組-0/107.3±1.1高劑量208/10**12.8±1.8**中劑量105/10*10.6±2.4*低劑量53/108.9±2.1奧司他韋12.58/10**13.1±2.0***P<0.05，**P<0.01，與模型組比較。(2)貝母甲素注射給藥對H1N1感染小鼠肺的保護作用結(jié)果如表12所示，與模型組相比，貝母甲素高、中、低劑量組均明顯抑制流感病毒感染所致小鼠肺部感染，有效緩解肺部感染癥狀。表12貝母甲素注射給藥對H1N1感染小鼠肺指數(shù)的影響*P<0.05，**P<0.01，與模型組比較。實施例10：貝母甲素制備膠囊劑藥物將350g貝母甲素和32g淀粉、6g低取代羥丙基纖維素、4.5g微粉硅膠、1.5g硬脂酸鎂、及適量10％淀粉漿混合，裝入膠囊，得到貝母甲素的膠囊制劑1000粒。每日3次，每次1粒。實施例11：貝母乙素制備顆粒劑藥物將350g貝母乙素和1000g蔗糖及500g糊精混合，按照常規(guī)方法制成1000包貝母乙素顆粒劑。每日3次，每次1粒。實施例12：貝母甲素制備片劑藥物將350g貝母甲素和50g淀粉、7.5g羧甲基淀粉鈉、0.8g滑石粉、50g糊精、0.8g硬脂酸鎂及適量10％淀粉漿適混合，按照常規(guī)方法制成貝母甲素片劑1000片。每日3次，每次1片。實施例13：貝母乙素制備丸劑藥物將350g貝母乙素和12g聚乙二醇-6000、80.5g聚山梨酯-80、適量液狀石蠟混合，按照常規(guī)方法制成貝母乙素丸劑1000粒。每日3次，每次1粒。實施例14：貝母甲素制備注射劑藥物將200g貝母甲素和15g注射用大豆磷脂、25g注射用甘油，注射用水定容至1000mL，按照常規(guī)方法制成貝母甲素注射劑1000支。每日1次，每次1支，至少采用250mL5％葡萄糖注射液稀釋后靜脈滴注。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3