本發(fā)明屬于屬于天然產(chǎn)物領(lǐng)域，具體涉及兩個結(jié)構(gòu)新穎的倍半萜類化合物及其在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
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新穎結(jié)構(gòu)天然產(chǎn)物的持續(xù)發(fā)現(xiàn)是藥物研發(fā)的重要源泉之一。目前，從極端環(huán)境微生物，特別是從南極來源真菌中，獲得骨架新穎的活性次生代謝產(chǎn)物已逐漸成為天然藥物研究的重要方向之一。在對南極來源真菌的次生代謝產(chǎn)物的研究過程中，我們分離獲得兩個新穎骨架的倍半萜類化合物，它們具有很強的抗炎作用，且在有效劑量下，未發(fā)現(xiàn)有細胞毒性。因此是開發(fā)成為結(jié)構(gòu)新穎、活性高效、低毒副作用的抗炎藥物的理想侯選化合物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的第一個目的的是提供兩個具有抗炎活性的新骨架倍半萜類化合物及其藥用鹽。

本發(fā)明的兩個倍半萜類化合物或其藥用鹽，其結(jié)構(gòu)如式(Ⅰ)和(Ⅱ)所示：

化合物1的結(jié)構(gòu)如(Ⅰ)所示，化合物2的結(jié)構(gòu)如式(Ⅱ)所示。

本發(fā)明的第二個目的是上述倍半萜類化合物的制備方法，所述的倍半萜類化合物是從曲霉(Aspergillus sp.)SCSIO 05702的發(fā)酵培養(yǎng)物中制備分離得到的。

優(yōu)選，具體步驟如下：

a、制備曲霉(Aspergillus sp.)SCSIO 05702的發(fā)酵培養(yǎng)物；

b、將發(fā)酵培養(yǎng)物的發(fā)酵液和菌絲體分離，發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯萃取液，濃縮后得到浸膏A；菌絲體先用丙酮浸提，合并浸提液，浸提液回收丙酮后剩余水混合液用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液濃縮后得到浸膏B，將浸膏A和浸膏B合并，得到粗提物；粗提物經(jīng)中壓正相硅膠柱層析，二氯甲烷/甲醇從100:0梯度洗脫至0:100，收集二氯甲烷/甲醇體積比為95:5洗脫的餾分；將該餾分進行葡聚糖凝膠Sephadex LH-20層析純化處理，以二氯甲烷/甲醇體積比1:1作為流動相洗脫，收集餾分再經(jīng)純化后得到如式(Ⅰ)和式(Ⅱ)所示的化合物。

所述的a步驟的制備曲霉(Aspergillus sp.)SCSIO 05702的發(fā)酵培養(yǎng)物優(yōu)選通過以下方法制備：將活化的曲霉(Aspergillus sp.)SCSIO 05702接入種子培養(yǎng)基中，25℃，180rpm，培養(yǎng)72h制得種子液，將種子液以體積百分比5％的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃，搖床培養(yǎng)35d，而制得發(fā)酵培養(yǎng)物，所述的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為每升培養(yǎng)基中含有：甘露醇20g、麥芽糖20g、葡萄糖10g、谷氨酸鈉10g、KH₂PO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.3g、酵母浸膏3g、玉米干粉0.3g、余量為水，pH 7.5。按上述組份和含量混合均勻，然后121℃，滅菌30min。

本發(fā)明的第三個目的是提供曲霉(Aspergillus sp.)SCSIO 05702在制備上述如式(Ⅰ)或式(Ⅱ)所示的倍半萜類化合物中的應(yīng)用。

本發(fā)明通過實驗發(fā)現(xiàn)，化合物1和2對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞株RAW264.7產(chǎn)生的一氧化氮具有較強的抑制作用，在濃度為25μM時，其抑制率分別為70.1％和67.1％，在相同濃度下，對RAW264.7細胞無細胞毒活性，因此可望開發(fā)成為無毒的抗炎新藥。

因此，本發(fā)明的第四個目的是提供如式(Ⅰ)或式(Ⅱ)所示的倍半萜類化合物在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。

綜上可知，本發(fā)明的曲霉(Aspergillus sp.)SCSIO 05702能夠產(chǎn)生具有抗炎活性的新穎倍半萜類化合物，該類化合物對LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞株RAW264.7釋放NO具有較強的抑制作用，因此能夠用于制備抗炎藥物。

本發(fā)明為制備具有抗炎活性的一類結(jié)構(gòu)新穎的倍半萜類化合物的生產(chǎn)制備提供了一種新的方法，為開發(fā)高效、低毒的抗炎藥物提供了理想的侯選化合物。

本發(fā)明的曲霉(Aspergillus sp.)SCSIO 05702于2015年01月06日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為：CGMCC No.10279。

附圖說明：

圖1是化合物1關(guān)鍵的¹H–¹H COSY(加粗黑線)和HMBC(單箭頭)相關(guān)；

圖2是化合物2關(guān)鍵的¹H–¹H COSY(加粗黑線)和HMBC(單箭頭)相關(guān)；

圖3是化合物1和2的實測CD及計算ECD圖譜。

具體實施方式：

以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。

實施例1：如式(Ⅰ)所示的化合物1和如式(Ⅱ)所示的化合物2的制備和結(jié)構(gòu)鑒定

一、如式(Ⅰ)所示的化合物1和如式(Ⅱ)所示的化合物2的制備

1、種子培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基)：按每升培養(yǎng)基中重量計算，含有甘露醇20g，麥芽糖20g，葡萄糖10g,谷氨酸鈉10g，KH₂PO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，酵母浸膏3g，玉米干粉0.3g，余量為水，pH 7.5。每升是這樣配制的：將甘露醇20g，麥芽糖20g，葡萄糖10g,谷氨酸鈉10g，KH₂PO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，酵母浸膏3g，玉米干粉0.3g加入到水中，然后用水定容至1L，調(diào)pH值至7.5，然后121℃，滅菌30min。

2、發(fā)酵

2.1、種子培養(yǎng)：將活化的曲霉(Aspergillus sp.)SCSIO 05702接入每瓶含有50mL種子培養(yǎng)基的250mL的錐形培養(yǎng)瓶中，25℃，180rpm，培養(yǎng)72h制得種子液。

2.2、發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液以5％的接種量(體積百分比)接入到30L發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃，搖床培養(yǎng)35d，而制得發(fā)酵培養(yǎng)物。

3、萃?。簩l(fā)酵液和菌絲體分離，發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液，減壓蒸餾濃縮后得到浸膏A；菌絲體先用丙酮超聲提取3次，每次15min，合并浸提液，浸提液減壓回收丙酮后剩余水混合液用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液減壓蒸餾濃縮后得到浸膏B，將浸膏A和浸膏B合并，得到粗提物(28.6g)。

4、化合物1和化合物2的分離

將浸膏A和浸膏B合并的粗提物(28.6g)正相硅膠柱層析，二氯甲烷/甲醇從100:0梯度洗脫至0:100，收集二氯甲烷/甲醇體積比為95:5洗脫的餾分，進一步經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱子，采用二氯氯仿-甲醇(體積比1:1)洗脫，洗脫得到的餾分命名為洗脫物；

上述洗脫物采用高效液相HPLC進行精細分離，洗脫體系為：甲醇/水(體積比60：40)，柱子：YMC-pack ODS-A,10×250mm,5μm，流速為4mL/min，得到化合物1(20.5mg，保留時間是26.1min)。

洗脫物采用高效液相HPLC進行精細分離，洗脫體系為：乙腈/水(體積比38：62)，柱子：YMC-pack ODS-A,10×250mm,5μm，流速4mL/min，得到化合物2(9.5mg，保留時間是22.2min)。

二、化合物1和化合物2的結(jié)構(gòu)鑒定

對化合物1和化合物2進行結(jié)構(gòu)分析測試，得到以下理化性質(zhì)數(shù)據(jù)：

化合物1:淡黃色油狀；[α]²⁵_D-87.8(c 1.0,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)202(4.13)nm；CD(0.2μg/mL,MeOH),λmax(Δε)207(-11.22),225(-5.48),and 245(-14.49)nm；¹H和¹³C NMR數(shù)據(jù)見表1；(–)-HRESIMS m/z 251.1645[M–H]^–(calcd for C₁₅H₂₃O₃,251.1653).

化合物2:淡黃色油狀；[α]²⁵_D-91.9(c 0.95,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)203(4.26),376(3.40)nm；CD(0.2μg/mL,MeOH),λmax(Δε)207(-7.28),228(-1.21),and 247(-9.68)nm；¹H和¹³C NMR數(shù)據(jù)見表1；(–)-HRESIMS m/z 265.1450[M–H]^–(calcd for C₁₅H₂₁O₄,265.1445).

表1.化合物1和化合物2的¹H-和¹³C-NMR數(shù)據(jù)歸屬。

在Bruker Avance 500NMR色譜儀上測量所得，溶劑為CD₃OD。

化合物1關(guān)鍵的¹H–¹H COSY(加粗黑線)和HMBC(單箭頭)相關(guān)如圖1所示，化合物2關(guān)鍵的¹H–¹H COSY(加粗黑線)和HMBC(單箭頭)相關(guān)如圖2所示。化合物1和2的實測CD及計算ECD圖譜如圖3所示。

由此鑒定化合物1的結(jié)構(gòu)如式(Ⅰ)所示，化合物2的結(jié)構(gòu)如式(Ⅱ)所示。

實施例3化合物1和化合物2的抗炎活性測定

化合物1和化合物2對RAW264.7巨噬細胞中脂質(zhì)過氧化酶(LPS)誘導(dǎo)NO生成具有抑制活性，實驗方法參考文獻(Wang,J.F.；Dong,S.S.；Wang,Y.H.；Lu,Q.；Zhong,H.M.；Du,G.H.；Zhang,L.；Cheng,Y.X.Cyclic diarylheptanoids from Myrica nana inhibiting nitric oxide release.Bioorg.Med.Chem.2008,16,8510–8515)，活性結(jié)果所示：在25μM的濃度下，化合物1和化合物2表現(xiàn)出很強的抑制活性，其抑制率分別為70.1％和67.1％。相同劑量下，陽性對照藥地塞米松的抑制率為92.6％。此外，在25μM的濃度下，化合物1和化合物2沒有表現(xiàn)出細胞毒活性，因此提示能夠被用于制備低毒高效的抗炎藥物。

表2.化合物1和化合物2對LPS-誘導(dǎo)的NO生成的抑制活性結(jié)果