本發(fā)明涉及有機(jī)合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及閉花木酮Cleistanone衍生物、制備方法及其用途。

背景技術(shù)：

致病菌的擴(kuò)散及其耐藥性的增強(qiáng)嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命，抗菌藥物已作為常規(guī)用藥廣泛用于艾滋病、器官移植以及慢性消耗性疾病(如癌癥、糖尿病、尿毒癥等)的治療，雖然目前臨床上使用的抗菌藥劑(如酮康唑、阿米卡星、慶大霉素、活力康唑、伊曲康唑、特比萘芬、二性霉素、氟康唑等)對(duì)皮膚及淺表部位感染的療效較好，但這些抗菌藥物的蓄積毒性較強(qiáng)，常常引起肝腎損傷、消化道刺激、頭暈、過(guò)敏等，所以尋找作用機(jī)理獨(dú)特的新型抗菌藥物成為當(dāng)今藥物研發(fā)的熱點(diǎn)之一。

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)是一種革蘭氏陰性螺旋狀細(xì)菌。研究顯示，幽門螺桿菌是急、慢性胃炎以及胃、十二指腸潰瘍的主要致病原因,并可能與胃癌和胃粘膜相關(guān)性淋巴樣組織(MALT)惡性淋巴瘤發(fā)病有關(guān)。最近，世界衛(wèi)生組織將Hp歸為I類致癌物，它在胃癌發(fā)展中起主導(dǎo)作用。目前流行的治療Hp感染的方案是同時(shí)服用質(zhì)子泵抑制劑(PPI)加兩種抗生素(克拉霉素，阿莫西林、四環(huán)素、甲硝唑等選二種)的三聯(lián)療法。影響三聯(lián)療法的最主要因素被認(rèn)為是Hp對(duì)抗菌劑的耐藥性；另一嚴(yán)重問題是質(zhì)子泵抑制劑會(huì)誘發(fā)消化不良，大量抗菌劑則導(dǎo)致消化道內(nèi)菌群的嚴(yán)重毀滅。因此，尋找高效、安全的抗Hp活性一類新藥物成為一個(gè)重要和迫切的任務(wù)。

近年來(lái)全球結(jié)核病的發(fā)病呈增高趨勢(shì)，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì)，目前全球受結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染的人口占世界人口的三分之一，其中5～10％的感染者成為結(jié)核病患者。我國(guó)每年出現(xiàn)活動(dòng)性肺結(jié)核病人130萬(wàn)例，其中傳染性肺結(jié)核約60萬(wàn)例，其中傳染性肺結(jié)核約60萬(wàn)例，是全球結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一。

自抗結(jié)核藥物相繼問世，使結(jié)核病的治療起到劃時(shí)代的變化。然而由于結(jié)核病患者的治療管理尚不十分規(guī)范，不規(guī)則化療，濫用抗結(jié)核藥物，使結(jié)核病耐藥情況日益嚴(yán)重，且耐藥性的變化更趨向于多種藥物同時(shí)耐藥，這給結(jié)核病的防治工作造成極大困難。因此尋找新的抗結(jié)核藥物，尤其是抗多藥耐藥性的抗結(jié)核藥物對(duì)保護(hù)人民身體健康，具有重要意義。

從天然產(chǎn)物中尋找化合物或先導(dǎo)化合物并進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾獲得其衍生物，從而得到高效低毒的潛在藥物最有重要價(jià)值。

本發(fā)明涉及的化合物閉花木酮Cleistanone是一個(gè)2011年發(fā)表(VanTrinhThiThanhetal.,2011.Cleistanone:ATriterpenoidfromCleistanthusindochinensiswithaNewCarbonSkeleton.Volume2011,Issue22,pages4108–4111,August2011)的化合物，我們對(duì)化合物閉花木酮Cleistanone進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，獲得了一個(gè)新的閉花木酮Cleistanone衍生物，并對(duì)其抗菌活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，其具有抗菌活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開了一個(gè)閉花木酮Cleistanone衍生物，其結(jié)構(gòu)為：

本發(fā)明閉花木酮Cleistanone衍生物(III)可通過(guò)下面方法制備：

(1)閉花木酮Cleistanone(I)與1,2-二溴乙烷反應(yīng)得到閉花木酮Cleistanone的O-溴乙基衍生物(II)；

(2)閉花木酮Cleistanone的O-溴乙基衍生物(II)與二甲胺發(fā)生取代反應(yīng)制得閉花木酮Cleistanone衍生物(III)。

進(jìn)一步的閉花木酮Cleistanone衍生物(III)的制備方法為：

(1)將440mg化合物閉花木酮Cleistanone(I)溶于10mL苯，向溶液中加入0.04g的四丁基溴化銨，3.760g的1,2-二溴乙烷和6mL的50％氫氧化鈉溶液；混合物在25攝氏度攪拌24h；24h之后將反應(yīng)液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取兩次，合并有機(jī)相溶液；然后對(duì)有機(jī)相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌3次，再用無(wú)水硫酸鈉干燥，最后減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品；產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化，流動(dòng)相為：石油醚/丙酮＝100:1，v/v，收集黃色集中洗脫帶即得到閉花木酮Cleistanone的O-溴乙基衍生物(II)的黃色固體。

(2)將273mg的閉花木酮Cleistanone的O-溴乙基衍生物溶于20mL乙腈當(dāng)中，向其中加入345mg的無(wú)水碳酸鉀，84mg的碘化鉀和900mg的二甲胺，混合物加熱回流16h；反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取三次，合并有機(jī)相；依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機(jī)相，再用無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品；產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化，流動(dòng)相為：石油醚/丙酮＝100:1，v/v，收集淡黃色集中洗脫帶即得到閉花木酮Cleistanone衍生物(III)的淡黃色固體。

本發(fā)明公開的化合物可以制成藥學(xué)上可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體。

藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的閉花木酮Cleistanone衍生物(III)具有較好的抗菌作用。本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的鹽與其化合物具有同樣的藥效。

進(jìn)一步的，化合物III的體外實(shí)驗(yàn)表明，化學(xué)物III具有很強(qiáng)的抗人體真菌活性，因此本發(fā)明的化學(xué)物III有望被用于制備新型抗人體真菌藥物。

進(jìn)一步的，化合物III的體外實(shí)驗(yàn)表明，化合物III具有很強(qiáng)的抗幽門螺旋桿菌活性，說(shuō)明對(duì)于與幽門螺旋桿菌密切相關(guān)的急、慢性胃炎、胃、十二脂腸潰瘍等疾病來(lái)講，化合物III是一個(gè)極具開發(fā)潛力的化合物。它可直接用于相應(yīng)疾病的治療以及相關(guān)藥物的制備。

進(jìn)一步的，化合物III的體外實(shí)驗(yàn)表明，化合物III具有很強(qiáng)的抑制大腸桿菌、熒光假單孢菌、金黃色葡萄球、變形桿菌、新生隱球菌的作用，所以化合物III可作為具有抗細(xì)菌作用的化合物，并有望在制備抗細(xì)菌藥物中得到應(yīng)用。

進(jìn)一步的，根據(jù)初步試驗(yàn)的結(jié)果，本發(fā)明用固體培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定了該化合物對(duì)卡介苗、結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv株和耐多藥結(jié)核分枝桿菌(MDRMTB)三種結(jié)核菌的最小抑菌濃度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)化合物III具有很強(qiáng)的抗結(jié)核菌和抗耐藥性結(jié)核菌活性，可作為治療結(jié)核菌感染疾病的先導(dǎo)化合物，也可用于制備治療結(jié)核病藥物。

以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實(shí)施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。具體實(shí)施方式

實(shí)施例1化合物閉花木酮Cleistanone的制備

化合物Cleistanone(I)的制備方法參照VanTrinhThiThanh等人發(fā)表的文獻(xiàn)(VanTrinhThiThanhetal.,2011.Cleistanone:ATriterpenoidfromCleistanthusindochinensiswithaNewCarbonSkeleton.Volume2011,Issue22,pages4108–4111,August2011)的方法。

實(shí)施例2閉花木酮Cleistanone的O-溴乙基衍生物(II)的合成

將化合物I(440mg，1.00mmol)溶于10mL苯，向溶液中加入四丁基溴化銨(TBAB)(0.04g)，1,2-二溴乙烷(3.760g，20.00mmol)和6mL的50％氫氧化鈉溶液?；旌衔镌?5攝氏度攪拌24h。24h之后將反應(yīng)液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取兩次，合并有機(jī)相溶液。然后對(duì)有機(jī)相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌3次，再用無(wú)水硫酸鈉干燥，最后減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為：石油醚/丙酮＝100:1，v/v)，收集黃色集中洗脫帶即得到化合物II的黃色固體(344mg，63％)。

1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ5.04(s,1H),4.82(s,1H),3.94(d,J＝26.5Hz,1H),3.87(d,J＝26.5Hz,2H),3.57(s,2H),2.40(d,J＝14.0Hz,1H),2.39(d,J＝14.0Hz,1H),2.27(s,1H),2.21(s,1H),2.15(s,1H),1.82(s,1H),1.62(s,2H),1.57(d,J＝3.3Hz,1H),1.54(d,J＝3.3Hz,1H),1.50(d,J＝1.2Hz,1H),1.47(d,J＝1.2Hz,1H),1.39(d,J＝15.3Hz,2H),1.34(d,J＝15.3Hz,1H),1.26(dd,J＝32.6,13.7Hz,4H),1.13(d,J＝18.0Hz,2H),1.05(s,6H),0.98(s,1H),0.88(s,12H),0.78(s,3H),0.74(s,1H)。

13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δ216.59(s),154.50(s),105.23(s),74.63(s),69.85(s),59.71(s),52.55(s),51.21(s),47.92(s),44.10(s),42.25(s),41.73(s),40.64(s),40.16(s),38.88(s),38.65(s),37.21(s),36.23(s),33.34(d,J＝1.1Hz),32.96(s),29.91(s),27.18(s),26.03(s),24.23(s),23.96(s),20.77(s),18.48(s),17.98(s),16.93(s)。

HRMS(ESI)m/z[M+H]+calcdforC32H52BrO2:547.3151；found547.3159.

實(shí)施例3閉花木酮Cleistanone的O-(二甲胺基)乙基衍生物(III)的合成

將化合物II(273mg，0.5mmol)溶于20mL乙腈當(dāng)中，向其中加入無(wú)水碳酸鉀(345mg，2.5mmol)，碘化鉀(84mg，0.5mmol)和二甲胺(900mg，20mmol)，混合物加熱回流16h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取三次，合并有機(jī)相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機(jī)相，再用無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為：石油醚/丙酮＝100:1，v/v)，收集淡黃色集中洗脫帶即得到化合物III的淡黃色固體(160.7mg,61％)。

1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ5.02(s,1H),4.81(s,1H),3.85(s,1H),3.51(s,2H),2.84(s,6H),2.64(s,2H),2.38(d,J＝13.0Hz,2H),2.26(s,1H),2.17(s,1H),2.17(s,1H),1.83(s,1H),1.66(s,2H),1.54(d,J＝6.0Hz,2H),1.46(d,J＝0.9Hz,2H),1.34(d,J＝13.5Hz,3H),1.26(dd,J＝31.1,13.9Hz,4H),1.16(d,J＝13.5Hz,2H),1.07(s,6H),0.98(s,1H),0.85(s,12H),0.76(s,3H),0.73(s,1H).

13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δ216.60(s),154.51(s),105.19(s),74.62(s),65.68(s),59.75(s),57.63(s),52.57(s),51.18(s),47.87(s),45.54(s),44.12(s),42.29(s),41.79(s),40.62(s),40.12(s),38.82(s),38.67(s),37.25(s),36.29(s),33.32(s),32.92(s),29.85(s),27.20(s),26.07(s),24.29(s),23.94(s),20.73(s),18.42(s),18.00(s),16.97(s).

HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcdforC34H58NO2:512.4468；found:512.4463。

實(shí)施例4本發(fā)明所涉及化合物II和III片劑的制備

取20克化合物II或者III或者其藥學(xué)上可接受的鹽當(dāng)中的一種，加入制備片劑的常規(guī)輔料180克，混勻，常規(guī)壓片機(jī)制成1000片。

實(shí)施例5本發(fā)明所涉及化合物II和III膠囊的制備：

取20克化合物II或者III或者其藥學(xué)上可接受的鹽當(dāng)中的一種，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉180克，混勻，裝膠囊制成1000粒。

實(shí)施例6閉花木酮Cleistanone的O-(二甲胺基)乙基衍生物(III)抗人體真菌活性

抗人體真菌活性實(shí)驗(yàn)是采用濃度稀釋的方法，每次測(cè)定重復(fù)三次，測(cè)試的病原菌有紅色毛癬菌、羊毛狀小孢子菌和斷發(fā)癬菌，菌液濃度為105個(gè)/mL。閉花木酮Cleistanone的O-(二甲胺基)乙基衍生物(III)起始濃度為50.00μg/mL(5％二甲基亞砜DMSO)，梯度稀釋至0.10μg/mL，等量體積的菌液和測(cè)試樣品混合培養(yǎng)在96孔板中(形成的最終濃度有：25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10和0.05μg/mL)，人體真菌培養(yǎng)溫度分別為28℃，培養(yǎng)時(shí)間24h后觀察，若發(fā)現(xiàn)沒有菌落形成的處理孔中最低的那個(gè)濃度為樣品最低抗菌濃度，即MIC值。該實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照為酮康唑，化學(xué)物III抗人體真菌結(jié)果見表1。

表1化學(xué)物III抗人體真菌MIC值(μg/mL)

結(jié)論：化學(xué)物III具有很強(qiáng)的抗人體真菌活性，因此本發(fā)明的化學(xué)物III有望被用于制備新型抗人體真菌藥物。

實(shí)施例7化合物III抗幽門螺桿菌活性

1)供試菌株

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC43504購(gòu)于美國(guó)菌種保存中心(AmericanTypeCultureCollection，ATCC)。13株Hp臨床菌株采自南京市鼓樓醫(yī)院胃鏡室接受胃鏡檢查的患者；在連續(xù)胃鏡檢查中對(duì)消化性潰瘍、十二指腸球炎或疣狀胃炎的患者，先經(jīng)快速尿素酶實(shí)驗(yàn)確定為Hp陽(yáng)性者，再取胃竇黏膜1-2塊，切碎后接種于含8％馬血清、三甲氧芐氨嘧啶(trimethropin,TMP)1.25g/L、多粘菌素(polymyxin)B2500U/L、萬(wàn)古霉素(vancomycin)10mg/L的Columbia選擇性瓊脂培養(yǎng)基中，于37℃在微氧環(huán)境下(5％O2,10％CO2和85％N2)培養(yǎng)72小時(shí)。收集細(xì)菌，經(jīng)涂片革蘭氏染色，氧化酶、觸酶和尿素酶鑒定為陽(yáng)性后，傳代純培養(yǎng)，所得菌株作為實(shí)驗(yàn)菌株。

2)菌株培養(yǎng)

我們采用微需氧袋(購(gòu)自上海醫(yī)科大學(xué))進(jìn)行HP的菌株培養(yǎng)，它可通過(guò)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生Hp所需要的微需氧環(huán)境。

3)生物活性測(cè)定

采用紙片法(Microbiologicalpapermethod)測(cè)定化合物對(duì)幽門螺桿菌的抑制作用，用瓊脂稀釋法來(lái)測(cè)定供試樣品的最低抑菌濃度(minimalinhibitoryconcentration,MIC)。

I.紙片法實(shí)驗(yàn)

(A)準(zhǔn)備培養(yǎng)基將配制好的Columbia培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，冷卻至50-60℃，加8％馬血清或綿羊血，混勻傾注于已經(jīng)滅菌的培養(yǎng)皿中，每皿7-10ml，培養(yǎng)基厚度為1.5mm(無(wú)菌操作)。

(B)轉(zhuǎn)接實(shí)驗(yàn)菌(涂菌)用微量取樣器取稀釋好的108CFU/ml(1OD660＝108CFU/ml)Hp的菌懸液0.1ml均勻地涂抹在適宜的培養(yǎng)皿表面。倒置于37℃烘干箱中15min后取出，目的使瓊脂表面干燥，備用。

(C)貼樣品紙片用微量取樣器取6μl待測(cè)樣品(質(zhì)量濃度2mg/ml)注入已經(jīng)滅菌的圓濾紙片上。用無(wú)菌鑷子鑷取含樣品的紙片和對(duì)照空白紙片，按無(wú)菌操作分別紙片緊貼于含菌瓊脂表面，每隔一定距離貼一張紙片。每種菌做3皿，所得結(jié)果求其平均值。

(D)培養(yǎng)將各平皿置于微需氧袋中，封口，打開氣體發(fā)生器，再置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。

(E)測(cè)抑菌圈直徑取出平板后，分別測(cè)量各紙片周圍抑菌圈直徑的大小。參照對(duì)照組的結(jié)果，可得出待測(cè)樣品敏感實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。重復(fù)三次。

II.瓊脂稀釋法測(cè)定MIC

(A)藥物平板的制備首先將測(cè)試的化合物用二甲基亞砜(DMSO)溶液配制成0.5mg/ml的母液，再用無(wú)菌水稀釋，最終配成100.0，80.0，60.0，45.0，40.0，35.0，30.0，25.0，20.0，15.0，10.0，5.0和2.5μg/ml的濃度系列，DMSO在介質(zhì)中的濃度小于1％。將1ml配制好的測(cè)試化合物溶液與保溫于50℃的8ml哥倫比亞培養(yǎng)基，另加1ml保溫于50℃的馬血清充分混勻，澆制入培養(yǎng)皿中冷卻即成(培養(yǎng)皿中化學(xué)物的終濃度為10.0，8.0，6.0，4.5，4.0，3.5，3.0，2.5，2.0，1.5，1.0，0.5和0.25μg/ml，如果有抑菌作用，則MIC值即這些值當(dāng)中的一個(gè))。

(B)轉(zhuǎn)接實(shí)驗(yàn)菌(涂菌)用微量取樣器吸取稀釋好的1×108CFU/mlHp的菌懸液0.1ml均勻地涂抹在培養(yǎng)皿表面，倒置于37℃烘干箱中15min后取出，目的使瓊脂表面干燥，備用。

(C)確定MIC將待測(cè)培養(yǎng)皿在微需氧袋(含：85％N2,10％CO2和5％O2)中，保溫37℃貈籣:g遱鴵培養(yǎng)72小時(shí)，觀察Hp生長(zhǎng)情況，與空白組相對(duì)照，以完全沒有菌生長(zhǎng)的樣品最低濃度為最低抑菌濃度(minimalinhibitoryconcentration,MIC)值。陽(yáng)性對(duì)照為氨芐西林(Ampicillin)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

體外實(shí)驗(yàn)表明，化學(xué)物III具有很強(qiáng)的抗幽門螺旋桿菌活性，紙片法顯示其抑菌圈直徑為18mm(ATCC43504)。用瓊脂稀釋法顯示它能完全抑制5個(gè)隨機(jī)的臨床菌株和1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC43504)的生長(zhǎng)，最小抑菌濃度(MIC)均為2.5μg/ml。用氨芐西林作陽(yáng)性對(duì)照，其對(duì)6株測(cè)試菌完全抑制的最小濃度(MIC)為1.5μg/ml。

結(jié)論：化學(xué)物III具有較強(qiáng)的抑制幽門螺旋桿菌活性，說(shuō)明對(duì)于與幽門螺旋桿菌密切相關(guān)的急、慢性胃炎、胃、十二脂腸潰瘍等疾病來(lái)講，化學(xué)物III是一個(gè)極具開發(fā)潛力的化合物。它可直接用于相應(yīng)疾病的治療以及相關(guān)藥物的制備。

實(shí)施例8化學(xué)物III抗細(xì)菌活性

抗菌活性實(shí)驗(yàn)是采用濃度稀釋的方法，每次測(cè)定重復(fù)三次，測(cè)試病原菌有大腸桿菌、熒光假單孢菌、金黃色葡萄球、變形桿菌、新生隱球菌，菌液濃度為105個(gè)/mL?；衔颕II起始濃度為50.00μg/mL(5％二甲基亞砜DMSO)，梯度稀釋至0.10μg/mL，等量體積的菌液和測(cè)試樣品混合培養(yǎng)在96孔板中(形成的最終濃度有：25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10和0.05μg/mL)，細(xì)菌培養(yǎng)溫度分別為37℃，培養(yǎng)時(shí)間24h后觀察，若發(fā)現(xiàn)沒有菌落形成的處理孔中最低的那個(gè)濃度為樣品最低抗菌濃度，即MIC值。化合物III抗菌結(jié)果見表2。

表2化合物III抗細(xì)菌MIC值(μg/mL)

結(jié)論：化合物III具有很強(qiáng)的抗細(xì)菌活性，因此本發(fā)明的化合物III有望被用于制備新型抗細(xì)菌藥物。

實(shí)施例9化合物III抗結(jié)核菌活性

(1)固體培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定化合物III抗卡介苗(BCG)絕對(duì)濃度

從斜面上刮取卡介苗培養(yǎng)物，加入到3mlMiddlebrook7H9肉湯培養(yǎng)基中，加入少量玻璃珠，旋緊試管蓋，于漩渦振蕩器上劇烈振動(dòng)研磨，與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁?MacFarlandNo.1)比濁，即配成1mg/ml的卡介苗(BCG)菌懸液。

將化合物III用DMSO配成高濃度的原液，用含5％的吐溫-80無(wú)菌超純水稀釋原液至所需濃度，將稀釋好的化合物III按所需劑量加入到4mlMiddlebrook7H11瓊脂培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基已經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌15分鐘、冷卻至50～55℃)，混勻，制成含化合物III，濃度分別為6.0ug/ml，4.0ug/ml，3.0ug/ml，2.0ug/ml，1.5ug/ml，1.0ug/ml，0.75ug/ml，0.5ug/ml等濃度的斜面培養(yǎng)基。

將濃度為1mg/ml的卡介苗(BCG)菌懸液用接種環(huán)蘸取數(shù)環(huán)，分別接種于含化合物III系列濃度的培養(yǎng)基和空白對(duì)照培養(yǎng)基斜面上，置于37℃培養(yǎng)4～8周，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果如表3所示。

本實(shí)施例中所用Middlebrook7H9肉湯培養(yǎng)基和Middlebrook7H11瓊脂培養(yǎng)基為本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行結(jié)核菌培養(yǎng)時(shí)的常用培養(yǎng)基，其配方采用常規(guī)配方即可。

(2)固體培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定化合物III抗結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv株絕對(duì)濃度

從斜面上刮取結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv株培養(yǎng)物，加入到3mlMiddlebrook7H9肉湯培養(yǎng)基中，加入少量玻璃珠，旋緊試管蓋，于漩渦振蕩器上劇烈振動(dòng)研磨，與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁?MacFarlandNo.1)比濁，即配成1mg/ml的H37Rv株菌懸液。

將化合物III分別用DMSO配成高濃度的原液，用含5％的吐溫-80無(wú)菌超純水稀釋原液至所需濃度，將稀釋好的化合物III按所需劑量加入到4mlMiddlebrook7H11瓊脂培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基已經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌15分鐘、冷卻至50～55℃)，混勻，制成含化合物III，濃度分別為6.0ug/ml，4.0ug/ml，3.0ug/ml，2.0ug/ml，1.5ug/ml，1.0ug/ml，0.75ug/ml，0.5ug/ml等濃度的斜面培養(yǎng)基。

將濃度為1mg/ml的H37Rv株菌懸液用接種環(huán)蘸取數(shù)環(huán)，分別接種于含化合物III系列濃度的培養(yǎng)基和空白對(duì)照培養(yǎng)基斜面上，置于37℃培養(yǎng)4～8周，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果如表3所示。

(3)固體培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定化合物III抗結(jié)核分支桿菌臨床分離耐ISREMTB株絕對(duì)濃度

從斜面上刮取結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISREMTB株(耐異煙肼、鏈霉素、利福平、乙胺丁醇結(jié)核分枝桿菌臨床分離柱)培養(yǎng)物，加入到3mlMiddlebrook7H9肉湯培養(yǎng)基中，加入少量玻璃珠，旋緊試管蓋，于漩渦振蕩器上劇烈振動(dòng)研磨，與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁?MacFarlandNo.1)比濁，即配成1mg/ml的菌懸液。

將化合物III分別用DMSO配成高濃度的原液，用含5％的吐溫-80無(wú)菌超純水稀釋原液至所需濃度，將稀釋好的化合物III按所需劑量加入到4mlMiddlebrook7H11瓊脂培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基已經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌15分鐘、冷卻至50～55℃)，混勻，制成含化合物III，濃度分別為6.0ug/ml，4.0ug/ml，3.0ug/ml，2.0ug/ml，1.5ug/ml，1.0ug/ml，0.75ug/ml，0.5ug/ml等濃度的斜面培養(yǎng)基。

將濃度為1mg/ml的結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISREMTB株菌懸液用接種環(huán)蘸取數(shù)環(huán)，分別接種于含化合物III系列濃度的培養(yǎng)基和空白對(duì)照培養(yǎng)基斜面上，置于37℃培養(yǎng)4～8周，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果如表3所示。

表3固體培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定化合物III抗結(jié)核菌絕對(duì)濃度結(jié)果

結(jié)論：化合物III具有很強(qiáng)的抗結(jié)核菌和抗耐藥性結(jié)核菌活性，可作為治療結(jié)核菌感染疾病的先導(dǎo)化合物，也可用于制備治療結(jié)核病藥物。