本發(fā)明涉及一種具有酶活性的新型多肽及其用途。本發(fā)明也涉及產(chǎn)生所述多肽的方法、編碼核酸分子、重組細胞的方法和使用所述多肽降解含聚酯材料的方法。本發(fā)明的多肽特別適合于降解聚乳酸和如同塑性材料的含有聚乳酸的材料。發(fā)明背景聚酯特別是以塑性材料形式用于從食品包裝至醫(yī)學領域、服裝、汽車工業(yè)等的大量
技術(shù)領域：
中。作為一實例，某些聚酯(例如聚對苯二甲酸乙二酯–PET、聚乳酸–PLA等)用于制造衣服和包裝，而且也以熱固性樹脂形式用于制造汽車或其它零件。因此，歷經(jīng)過去數(shù)十年，含聚酯塑料的產(chǎn)量已顯著增加。這些塑料中超過50％用于單次使用拋棄式應用，諸如包裝、農(nóng)用薄膜、拋棄式消費品或用于在制造后1年內(nèi)被丟棄的短期產(chǎn)品。遺憾的是，視局部環(huán)境因素如紫外光暴露水平、溫度、適合微生物的存在等而定，塑料可存留數(shù)十年。因此，在世界范圍內(nèi)，大量塑料堆積在填埋場所中和天然棲息地中，從而產(chǎn)生遞增的環(huán)境問題。用以降低與塑料的積累相關(guān)的環(huán)境和經(jīng)濟影響的一種解決方案是再循環(huán)，其中以機械方式再加工塑性材料以制造新產(chǎn)品。然而，實際再循環(huán)方法使用大量電力，特別是在擠出步驟期間，并且所用設備也是昂貴的，從而導致相較于原始塑料可為不具競爭性的高昂價格。用于再循環(huán)塑料的另一潛在方法由允許回收聚合物的化學組分的化學再循環(huán)組成。所得單體可接著用于再制造塑料或制備其它合成化學品。然而，迄今為止，所述再循環(huán)方法僅已對純化聚合物執(zhí)行，并且對由結(jié)晶和非晶聚合物和添加劑的混合物構(gòu)成的原有塑料制品并不高效。此外，所述再循環(huán)方法是昂貴的，從而導致單體相較于原始單體不具競爭性。在另一方面，酶促降解被視為一種理想廢物處理方法，因為酶可加速塑料的水解，并且可被并入有機材料的自然循環(huán)中。此外，水解物(即單體和寡聚物)可作為聚合物的材料再循環(huán)。因此，通過酶來使塑料制品中含有的聚合物解聚作為現(xiàn)有以及不令人滿意的方法的替代方案而受到極大關(guān)注。然而，這個途徑迄今為止未導致降解含聚酯材料的有效以及工業(yè)酶促方法的落實。實際上，已知許多細菌能夠降解聚酯。舉例來說，關(guān)于聚乳酸，有對源于放線菌(Actinomycetes)諸如擬無枝菌酸菌屬種(Amycolatopsissp.)(菌株K104-1)以及源于溶淀粉類芽孢桿菌(Paenibacillusamylolyticus)(菌株TB-13)的降解酶的報道。然而，迄今為止，所鑒定的多肽具有不良降解能力，并且僅允許降解呈乳液形式的聚合物。存在有限數(shù)目的關(guān)于能夠降解呈薄膜或丸粒形式的含聚酯材料的微生物的報道，并且此外，它們的酶是不充分了解的。鑒于先前所述，對在降解聚酯方面，并且更特別是在降解塑料制品中含有的聚酯方面具有活性的新型酶存在需要。發(fā)明概述由申請人進行的研究已導致鑒定出一種源于馬杜拉放線菌屬種(Actinomadurasp.)，并且具有聚酯降解活性的新型多肽。這個多肽在本領域中從未被報道或分離，并且給開發(fā)降解含聚酯材料的工業(yè)方法帶來實質(zhì)性改進。本發(fā)明尤其基于對具有降解聚酯的卓越性質(zhì)的這個新型多肽的鑒定。本發(fā)明涉及一種用以在工業(yè)規(guī)模上獲得對塑料制品中含有的聚酯的降解的解決方案，所述塑料制品的降解產(chǎn)物(單體和寡聚物)可被再次用于經(jīng)濟地以及可靠地產(chǎn)生新聚酯。因此，本發(fā)明涉及具有酶活性的新型多肽、它們的制造和用途。本發(fā)明也涉及編碼這些多肽的核酸、載體、表達這些多肽的重組細胞和它們的用途。本發(fā)明進一步涉及包含至少一種本發(fā)明的多肽的組合物和用于從含聚酯材料諸如由聚酯制得的塑料制品產(chǎn)生目標寡聚物和/或單體的方法。本發(fā)明也涉及含有這些多肽和/或表達這些多肽的重組細胞中的至少一種的可生物降解的塑料化合物或塑料物品。因此，本發(fā)明的一目標涉及一種分離的多肽，其包含與如SEQIDN°1所示的全長氨基酸序列具有至少94％、95％、99％或100％，優(yōu)選至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且具有聚酯降解活性。在一特定實施方式中，多肽的氨基酸殘基序列由于在一個或多個位置處的氨基酸殘基的氨基酸殘基取代而不同于SEQIDN°1。在一優(yōu)選實施方式中，氨基酸殘基取代在氨基酸殘基序列中引入半胱氨酸或額外鹽橋，并且由此相較于天然多肽(即具有如SEQIDN°1所示的氨基酸殘基序列的多肽)的熱穩(wěn)定性，使多肽的熱穩(wěn)定性增加。本發(fā)明的另一目標在于提供一種包含如SEQIDN°1或SEQIDN°5所示的氨基酸序列的多肽。在一特定實施方式中，多肽包含一個或若干個糖基化氨基酸殘基。本發(fā)明的另一目標是一種編碼如上定義的多肽的核酸。本發(fā)明也涉及一種包含如上定義的核酸的表達盒和一種包含如上定義的核酸或表達盒的載體。本發(fā)明也涉及一種含有至少一個如上定義的核酸或表達盒或載體的重組細胞或宿主細胞，優(yōu)選是重組微生物，并且涉及其優(yōu)選展現(xiàn)酶活性的提取物。本發(fā)明的另一目標在于提供一種產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，其包括(i)培養(yǎng)如上定義的重組細胞，(ii)回收培養(yǎng)上清液，以及任選地(iii)分離或純化多肽。本發(fā)明也公開一種包含如上定義的多肽或表達所述多肽的重組細胞或其提取物的組合物。本發(fā)明進一步涉及如上定義的多肽、相應核酸、表達盒、載體、重組細胞、重組細胞提取物或組合物用于酶促降解含聚酯材料，優(yōu)選是含PLA材料，甚至更優(yōu)選是含PLLA材料的用途。本發(fā)明的另一目標在于提供一種用于降解含聚酯材料的方法，其中使含聚酯材料與如上定義的多肽、相應核酸、表達盒、載體、重組細胞或重組細胞提取物或組合物接觸。方法有利地進一步包括收集所得單體和/或寡聚物的步驟。本發(fā)明也涉及一種用于從含聚酯材料產(chǎn)生單體和/或寡聚物的方法，其包括使含聚酯材料暴露于如上定義的多肽、相應核酸、表達盒、載體、重組細胞或重組細胞提取物或組合物，以及任選地回收單體和/或寡聚物。本發(fā)明的另一目標在于提供一種包含如上定義的多肽和/或表達所述多肽的重組細胞的含聚酯材料。本發(fā)明也提供一種用于產(chǎn)生所述含聚酯材料的方法，其包括混合聚酯和如上定義的多肽和/或表達所述多肽的重組細胞的步驟，其中所述混合步驟在所述聚酯處于部分或完全熔融狀態(tài)所處的溫度下，優(yōu)選在擠出過程期間進行。本發(fā)明進一步涉及包含與如SEQIDN°1所示的全長氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、92％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且具有用于降解含聚酯材料的聚酯降解活性的多肽的用途。附圖說明圖1.由陰離子型純化獲得的pH10流穿物的SDS-Page凝膠的照片，其顯示本發(fā)明的多肽的分子量是27kDa；圖2.本發(fā)明的多肽的氨基酸序列(SEQIDN°1)，其中突出顯示最重要的殘基；圖3：顯示聚酯酶催化NaturePlastPLLA粉末(33g/L)水解和乳酸產(chǎn)生隨PLLA粒度而變化的圖；圖4：顯示聚酯酶催化7001DPLA粉末(33g/L)水解和乳酸產(chǎn)生隨PLA粒度而變化的圖；圖5：顯示聚酯酶催化PLA薄膜(17g/L)水解和乳酸產(chǎn)生的圖；圖6：顯示聚酯酶催化PLA商業(yè)物件(PLA杯子、盤子、薄膜和餐具)(33g/L)水解和乳酸產(chǎn)生的圖。圖7：顯示PLA在包含CaCO3和Ca(OH)2的培養(yǎng)基中水解的圖。圖8：顯示在28℃、37℃和45℃下在pH9,5的Tris緩沖液中，含有96％PLA和4％的本發(fā)明的多肽的含PLA材料的水解以及含有100％PLA的對照水解的圖。發(fā)明詳述本發(fā)明大體上涉及一種包含如SEQIDN°1所示的氨基酸序列的至少生物活性部分的分離的多肽，其能夠使聚酯，更優(yōu)選是聚乳酸解聚。優(yōu)選在20℃至90℃，以及至少20℃至60℃的溫度范圍內(nèi)具有活性的這個多肽可用于降解聚酯塑性材料。這個多肽或它的編碼核酸序列也可用于產(chǎn)生可用于導致含聚酯材料降解的重組微生物。所述重組微生物可進一步展現(xiàn)天然或重組聚合物合成活性，以致所述微生物能夠再次使用由聚酯降解產(chǎn)生的單體和/或寡聚物。以下是對本發(fā)明的描述，包括其以一般性方式給出的優(yōu)選實施方式。本發(fā)明以在下文標題“實施例”下給出的公開內(nèi)容進一步例示，所述公開內(nèi)容提供支持本發(fā)明的實驗數(shù)據(jù)和執(zhí)行本發(fā)明的手段。定義本公開將通過參照以下定義而得以最充分了解。術(shù)語“分離的”或“分離”意指物質(zhì)被從它的原始環(huán)境(例如天然環(huán)境)移除。舉例來說，分離的多肽通常缺少細胞的它通常與其相伴或它通常與其一起摻混或溶解的至少一些多肽或其它組分。分離的多肽包括呈純化或部分純化形式的所述天然產(chǎn)生的多肽、重組多肽、由宿主細胞表達或分泌的多肽、以及宿主細胞或其培養(yǎng)物或提取物中的多肽。在一優(yōu)選方面，多肽是至少10％純的，優(yōu)選至少50％純的，更優(yōu)選至少60％、70％、80％、90％純的，如通過SDS-PAGE所測定。純度小于100％在本文中表示多肽制劑含有它天然地或重組地與其相伴的其它多肽物質(zhì)。關(guān)于核酸，術(shù)語分離的或純化的指示例如所述核酸不處于它的天然基因組情形下(例如在載體、表達盒中，連接于啟動子，或人工引入異源性宿主細胞中)。術(shù)語“修飾”在本文中意指對由SEQIDN°1或其同源性序列組成的多肽的任何化學修飾以及對編碼這種多肽的DNA的遺傳操作。修飾可為一個或若干個氨基酸的取代、缺失和/或插入。因此，術(shù)語“突變體”和“變體”可互換用于指代由SEQIDN°1組成的在確定殘基處具有鑒定的氨基酸取代、缺失和/或插入的多肽。術(shù)語“糖基化”意指物質(zhì)包含一個或若干個連接于多肽的氨基酸殘基的聚糖。在本發(fā)明的情形下，糖基化涵蓋連接于天冬酰胺殘基的酰胺氮的N連接的聚糖、連接于絲氨酸或酪氨酸殘基的羥基氧的O連接的聚糖、連接于色氨酸殘基的碳的C連接的聚糖。術(shù)語“重組體”是指通過遺傳工程改造產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體、載體、多肽或細胞。如本文所用，術(shù)語“序列同一性”或“同一性”是指由比對兩個多肽序列獲得的在各位置中的匹配物(同一氨基酸殘基)的數(shù)目(％)。序列同一性通過在對準以便使重疊和同一性最大，同時使序列空位數(shù)最少時比較序列來確定。特定來說，視兩個序列的長度而定，序列同一性可使用許多數(shù)學整體或局部比對算法中的任一種來確定。長度類似的序列優(yōu)選使用歷經(jīng)整個長度來將序列最優(yōu)比對的整體比對算法(例如Needleman和Wunsch算法；Needleman和Wunsch,1970)來比對，而長度實質(zhì)上不同的序列優(yōu)選使用局部比對算法(例如Smith和Waterman算法(Smith和Waterman,1981)或Altschul算法(Altschul等,1997；Altschul等,2005))來比對。出于確定氨基酸序列同一性百分比的目的的比對可以以屬于本領域中的技能的各種方式實現(xiàn)，例如使用可在因特網(wǎng)網(wǎng)站諸如http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/或http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/)上獲得的可公開獲得的計算機軟件。本領域技術(shù)人員可確定適用于測量比對的參數(shù)，包括為歷經(jīng)所比較序列的全長實現(xiàn)最大對準所需的任何算法。出于本文目的，氨基酸序列同一性％數(shù)值是指使用成對序列比對程序EMBOSSNeedle產(chǎn)生的數(shù)值，所述程序使用Needleman-Wunsch算法產(chǎn)生兩個序列的最優(yōu)整體比對，其中所有搜索參數(shù)都設為缺省值，即評分矩陣＝BLOSUM62，空位開放＝10，空位延伸＝0.5，末端空位罰分＝false，末端空位開放＝10，并且末端空位延伸＝0.5。如本文所用的術(shù)語“表達”是指多肽的產(chǎn)生中涉及的任何步驟，包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。在本文中，術(shù)語“肽”、“多肽”、“蛋白質(zhì)”和“酶”可互換采用，并且是指由肽鍵連接的氨基酸的鏈，而與形成所述鏈的氨基酸的數(shù)目無關(guān)。氨基酸在本文中由它們的根據(jù)以下命名法的單字母或三字母代碼表示：A：丙氨酸(Ala)；C：半胱氨酸(Cys)；D：天冬氨酸(Asp)；E：谷氨酸(Glu)；F：苯丙氨酸(Phe)；G：甘氨酸(Gly)；H：組氨酸(His)；I：異亮氨酸(Ile)；K：賴氨酸(Lys)；L：亮氨酸(Leu)；M：甲硫氨酸(Met)；N：天冬酰胺(Asn)；P：脯氨酸(Pro)；Q：谷氨酰胺(Gln)；R：精氨酸(Arg)；S：絲氨酸(Ser)；T：蘇氨酸(Thr)；V：纈氨酸(Val)；W：色氨酸(Trp)和Y：酪氨酸(Tyr)。在本發(fā)明的情形下，“含聚酯材料”是指包含至少一種呈結(jié)晶、半結(jié)晶或完全非晶形式的聚酯的制品，諸如塑料制品。在一特定實施方式中，含聚酯材料是指由至少一種塑性材料制得的任何物品，諸如塑料薄片、管子、棒條、型材、模型、薄膜、大塊等，所述物品含有至少一種聚酯以及可能其它物質(zhì)或添加劑諸如塑化劑、無機或有機填料。在一特定實施方式中，含聚酯材料含有聚酯和至少一種附加的聚合物諸如聚烯烴，其相對于彼此以它們不能被易于分開的方式安置。優(yōu)選地，含聚酯材料由結(jié)晶和非晶聚酯、和/或半結(jié)晶聚酯以及添加劑的混合物構(gòu)成。更優(yōu)選地，含聚酯材料是制造的塑料制品，如包裝、農(nóng)用薄膜、拋棄式物品等。在另一特定實施方式中，含聚酯材料是指處于熔融或固體狀態(tài)，適于制備塑料制品的塑料化合物或塑料制劑。在本發(fā)明的情形下，塑料化合物涵蓋至少一種聚酯和至少一種本發(fā)明的多肽和/或表達所述多肽的重組細胞的均質(zhì)摻合物，其中所述多肽和/或重組細胞能夠降解所述聚酯。優(yōu)選地，塑料化合物由半結(jié)晶和/或非晶聚合物、或半結(jié)晶聚合物以及添加劑的混合物構(gòu)成。在本描述中，“聚酯”涵蓋聚對苯二甲酸乙二酯(PET)、聚對苯二甲酸丙二酯(PTT)、聚對苯二甲酸丁二酯(PBT)、聚對苯二甲酸乙二酯共對苯二甲酸異山梨醇酯(PEIT)、聚乳酸(PLA)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(D-乳酸)(PDLA)、聚(D,L-乳酸)(PDLLA)、PLA立體復合物(scPLA)、聚羥基鏈烷酸酯(PHA)、聚(3-羥基丁酸酯)(P(3HB)/PHB)、聚(3-羥基戊酸酯)(P(3HV)/PHV)、聚(3-羥基己酸酯)(P(3HHx))、聚(3-羥基辛酸酯)(P(3HO))、聚(3-羥基癸酸酯)(P(3HD))、聚(3-羥基丁酸酯-共-3-羥基戊酸酯)(P(3HB-共-3HV)/PHBV)、聚(3-羥基丁酸酯-共-3-羥基己酸酯)(P(3HB-共-3HHx)/(PHBHHx))、聚(3-羥基丁酸酯-共-5-羥基戊酸酯)(PHB5HV)、聚(3-羥基丁酸酯-共-3-羥基丙酸酯)(PHB3HP)、聚羥基丁酸酯-共-羥基辛酸酯(PHBO)、聚羥基丁酸酯-共-羥基十八酸酯(PHBOd)、聚(3-羥基丁酸酯-共-3-羥基戊酸酯-共-4-羥基丁酸酯)(P(3HB-共-3HV-共-4HB))、聚丁二酸丁二酯(PBS)、聚丁二酸丁二酯共己二酸丁二酯(PBSA)、聚己二酸丁二酯共對苯二甲酸丁二酯(PBAT)、聚呋喃酸乙二酯(PEF)、聚己內(nèi)酯(PCL)、聚(己二酸乙二酯)(PEA)以及這些聚合物的摻合物/混合物。“聚合物”是指結(jié)構(gòu)由多個由共價化學鍵連接的重復單元構(gòu)成的化合物或化合物的混合物。在本發(fā)明的情形下，術(shù)語聚合物包括由單一類型的重復單元構(gòu)成的天然或合成聚合物(即均聚物)或由不同重復單元的混合物構(gòu)成的天然或合成聚合物(即共聚物)。根據(jù)本發(fā)明，“寡聚物”是指含有2至約20個單體單元的分子。新的分離的多肽本發(fā)明涉及一種能夠降解在它們的分子結(jié)構(gòu)中具有酯鍵的塑料的新型多肽。更特定來說，本發(fā)明公開一種新近鑒定和分離的展現(xiàn)聚酯酶活性的多肽。所述多肽最初從角蛋白降解馬杜拉放線菌(Actinomadurakeratinilytica)T16-1或DSMZ45195的天然細菌菌株分離。引起關(guān)注的是，本發(fā)明的多肽能夠水解天然和人造聚酯中的酯鍵。在第一方面，本發(fā)明涉及一種包含與以下提供的如SEQIDN°1所示的全長氨基酸序列具有至少94％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且具有聚酯降解活性的分離的多肽。有利的是，多肽包含與如SEQIDN°1所示的全長氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。SEQIDN°1：ATQNNPPSWGLDRIDQTNLPLSRSYTYNSTGAGVNAYIIDTGIYTAHSDFGGRATNVYDALGGNGQDCNGHGTHVAGTVGGAAYGVAKAVNLRGVRVLNCSGSGTTSGVIAGMNWVASNHVKPAVANMSLGGGYSSSLNTAANNLASSGVFLAVAAGNETTNACNRSPASAANATTVAASTSTDARASYSNYGSCVHLYAPGSSITSAWLNGGTNTISGTSMATPHVAGTAALYKATYGDASFSTIRSWLVSNATSGVITGNVSGTPNLLLNKRSL如本文所用，本發(fā)明的多肽也可被稱為具有聚酯酶活性的多肽，或可互換地被稱為聚酯酶。本發(fā)明的一特定目標在于提供一種分離的多肽，其包含與如SEQIDN°1所示的全長氨基酸序列具有至少94％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且具有聚乳酸降解活性，并且更優(yōu)選是聚-(L-乳酸)降解活性。在一特定實施方式中，多肽包含與如SEQIDN°1所示的全長氨基酸序列具有至少94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一特定實施方式中，分離的多肽包含如SEQIDN°1所示的氨基酸序列的所有或生物活性部分。更具體來說，多肽的“生物活性部分”指定那個多肽的賦予或展現(xiàn)整個多肽的聚酯酶活性的部分?；钚圆糠挚衫缳x予底物特異性或親和力，它可含有催化位點。多肽的活性部分也指定多肽的成熟形式(即其在多肽的N末端不含有信號肽)。在一實施方式中，生物活性部分包括如SEQIDN°1所示的氨基酸序列的至少一部分，所述至少一部分包括形成多肽的催化位點的氨基酸His71、Asp40和Ser221。或者，或此外，活性部分有利地包含氨基酸Ala172、Ala174和His197和/或形成鈣結(jié)合位點的氨基酸Asp12、Asp15和Gln16和/或形成二硫鍵的氨基酸Cys68-Cys100和Cys164–Cys195和/或形成聚酯結(jié)合位點的氨基酸。在一特定實施方式中，生物活性部分包含SEQIDN°1的氨基酸12至221或由所述氨基酸構(gòu)成。在另一實施方式中，生物活性部分包含SEQIDN°1的氨基酸40至221或由所述氨基酸構(gòu)成。本發(fā)明的另一目標在于提供一種包含如SEQIDN°1或SEQIDN°5所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成的多肽。本發(fā)明的另一目標在于提供一種包含SEQIDN°5的對應于多肽的肽信號的氨基酸1至29或由所述氨基酸構(gòu)成的肽。SEQIDN°5：MRRRTLPIAVLAAVPLAVAGALPAGAAPAAPAVPVAMAAAGQGVAGQYIVTLKKGVSVDSTVAKRGIRTQHRFGKVLNGFSAKLTDDQLSKLRTTPGVASIEQDAVITVDATQNNPPSWGLDRIDQTNLPLSRSYTYNSTGAGVNAYIIDTGIYTAHSDFGGRATNVYDALGGNGQDCNGHGTHVAGTVGGAAYGVAKAVNLRGVRVLNCSGSGTTSGVIAGMNWVASNHVKPAVANMSLGGGYSSSLNTAANNLASSGVFLAVAAGNETTNACNRSPASAANATTVAASTSTDARASYSNYGSCVHLYAPGSSITSAWLNGGTNTISGTSMATPHVAGTAALYKATYGDASFSTIRSWLVSNATSGVITGNVSGTPNLLLNKRSL本發(fā)明的另一目標在于提供如SEQIDN°1所示的多肽的變體，其包含SEQIDN°1的多肽的一個或若干個氨基酸殘基的取代、缺失和/或插入，具有聚酯降解活性。在一特定實施方式中，相較于天然多肽，變體展現(xiàn)更大熱穩(wěn)定性。舉例來說，通過氨基酸殘基的取代和/或插入，從而相較于天然氨基酸序列在氨基酸序列中產(chǎn)生附加的半胱氨酸殘基來引入二硫鍵?；蛘呋虼送?，可在多肽的氨基酸序列中引入額外鹽橋。在一特定實施方式中，相對于SEQIDN°1，變體包含一個或若干個選自T175C、R247C、N139D、S170R、N143R、N173E、S194P、H197D、L210P、G212N、I217K、R166K、T160A、L138A或其組合的取代，并且具有聚酯降解活性，優(yōu)選是PLA降解活性。在一特定實施方式中，變體包含具有取代T175C和R247C的氨基酸序列SEQIDN°1或由所述氨基酸序列組成，并且具有聚酯降解活性，優(yōu)選是PLA降解活性。在另一特定實施方式中，變體包含具有取代N139D和S170R的氨基酸序列SEQIDN°1或由所述氨基酸序列組成，并且具有聚酯降解活性，優(yōu)選是PLA降解活性。在另一特定實施方式中，變體包含具有取代N143R和N173E的氨基酸序列SEQIDN°1或由所述氨基酸序列組成，并且具有聚酯降解活性，優(yōu)選是PLA降解活性。在一特定實施方式中，變體包含具有取代T175C、R247C、N139D、S170R、N143R、N173E、S194P、H197D、L210P、G212N、I217K、R166K、T160A和L138A的氨基酸序列SEQIDN°1或由所述氨基酸序列組成，并且具有聚酯降解活性，優(yōu)選是PLA降解活性。在一特定實施方式中，相較于如SEQIDN°1所示的氨基酸序列，變體包含至多14個氨基酸殘基取代，并且具有聚酯降解活性，優(yōu)選是PLA降解活性。在另一實施方式中，相較于如SEQIDN°1所示的氨基酸序列，變體包含至多17個氨基酸殘基取代。有利的是，變體比SEQIDN°1的天然多肽具有更好聚酯降解活性。更優(yōu)選地，變異多肽比SEQIDN°1的天然多肽在高溫下具有更大穩(wěn)定性。在另一實施方式中，多肽包含一個或若干個糖基化。舉例來說，多肽包含如SEQIDN°1所示的氨基酸序列，其中至少一個氨基酸殘基被糖基化。有利的是，所述糖基化多肽相較于天然多肽(SEQIDN°1的未糖基化多肽)顯示更大穩(wěn)定性，具體來說更大熱穩(wěn)定性。舉例來說，氨基酸序列SEQIDN°1的至少一個天冬酰胺殘基被糖基化，并且寡糖連接在所述天冬酰胺殘基的酰胺氮處。更特定來說，SEQIDN°1包含一種選自以下的氨基酸殘基的至少一個糖基化：N28、N99、N127、N158、N165、N173、N253、N262或其組合。在一優(yōu)選實施方式中，SEQIDN°1包含一種選自以下的氨基酸殘基的至少一個糖基化：N28、N158、N165。本發(fā)明的多肽在20℃至90℃，優(yōu)選20℃至60℃，更優(yōu)選30℃至55℃，甚至更優(yōu)選40℃至50℃的溫度范圍內(nèi)，甚至更優(yōu)選在45℃下特別具有活性。在一特定實施方式中，多肽在60℃與90℃之間的溫度下，優(yōu)選在80℃下仍然具有活性。類似地，本發(fā)明的多肽在5至11的pH范圍內(nèi)，優(yōu)選在7至10的pH范圍內(nèi)，更優(yōu)選在8.5至9.5的pH范圍內(nèi)，甚至更優(yōu)選在8至9的pH范圍內(nèi)特別具有活性。本發(fā)明的分離的多肽有利地具有至少0.02g.mg-1.h-1、0.05g.mg-1.h-1、0.1g.mg-1.h-1、0.15g.mg-1.h-1、0.2g.mg-1.h-1、0.5g.mg-1.h-1、1g.mg-1.h-1、1.5g.mg-1.h-1或2g.mg-1.h-1的生產(chǎn)力。就“生產(chǎn)力”來說，其意指在包括在8與9之間的pH下以及在45℃+/-5℃的溫度下，每單位多肽以及每單位時間形成的降解產(chǎn)物(即單體)的量。本發(fā)明的多肽特別適用于降解聚乳酸(PLA)，并且更特別是聚(L-乳酸)(PLLA)。在一特定實施方式中，本發(fā)明的多肽具有對映特異性。這意指多肽能夠作用于聚酯中的L-對映異構(gòu)體，而對D-對映異構(gòu)體無效，或相反。本發(fā)明的多肽可通過重組技術(shù)來產(chǎn)生，或它可從天然來源(即微生物并且更特別是細菌、酵母或真菌)分離或純化，或它可人工產(chǎn)生。在本發(fā)明的情形下，與多肽相關(guān)的術(shù)語“源于微生物”指示多肽已從這種微生物分離，或多肽包含從這種微生物分離或表征的多肽的氨基酸序列的所有或生物活性部分。更特定來說，本發(fā)明的多肽可由重組芽孢桿菌(Bacillus)、重組大腸桿菌(E.Coli)或重組解脂耶羅威亞酵母(Yarrowialipolytica)產(chǎn)生。本發(fā)明的多肽可通過本領域中本身已知的技術(shù)諸如色譜法(例如離子交換、親和、尺寸排阻、反相等)和沉淀(例如鹽析、等電點、有機溶劑、非離子型親水性聚合物等)來純化，并且借助常規(guī)技術(shù)儲存。多肽可進一步被修飾以改進例如它的穩(wěn)定性或活性。它可按原樣，以純化形式，單獨或與附加的酶組合用于催化含聚酯材料的降解和/或再循環(huán)中涉及的酶促反應。多肽可呈溶解形式，或處于固相上。特定來說，它可結(jié)合于細胞膜或脂質(zhì)囊泡，或結(jié)合于例如呈珠粒、管柱、板等形式的合成載體諸如玻璃、塑料、聚合物、過濾器、膜。本發(fā)明的另一目標在于提供一種包含本發(fā)明的分離的多肽和/或相應核酸、表達盒、載體、重組細胞或重組細胞提取物，以及任選地，添加劑、賦形劑等的組合物。在本發(fā)明的情形下，術(shù)語“組合物”涵蓋所有種類的包含呈分離或至少部分純化形式的本發(fā)明的多肽的組合物。組合物可為液體或干燥的，例如呈粉末形式。在一些實施方式中，組合物是凍干物。舉例來說，組合物可包含本發(fā)明的多肽和/或編碼多肽的重組細胞或其提取物，以及任選地，賦形劑和/或試劑等。適當賦形劑涵蓋通常用于生物化學中的緩沖劑；用于調(diào)整pH的試劑；防腐劑(preservative)諸如苯甲酸鈉、山梨酸鈉或抗壞血酸鈉；保存劑(conservative)；保護劑或穩(wěn)定劑諸如淀粉、糊精、阿拉伯樹膠、鹽、糖例如山梨糖醇、海藻糖或乳糖、甘油、聚乙二醇、聚乙烯二醇、聚丙二醇、丙二醇；螯合劑諸如EDTA；氨基酸；載體諸如溶劑或水溶液；等。本發(fā)明的組合物可通過混合多肽與一種或若干種賦形劑來獲得。本發(fā)明的組合物可包含以重量計，0.1％至90％，優(yōu)選0.1％至50％，更優(yōu)選0.1％至30％，甚至更優(yōu)選0.1％至5％的本發(fā)明的多肽，以及以重量計，10％至99.9％，優(yōu)選50％至99.9％，更優(yōu)選30％至99.9％，甚至更優(yōu)選95％至99.9％的賦形劑。一優(yōu)選組合物包含以重量計，0.1與5％之間的本發(fā)明的多肽。在一特定實施方式中，組合物可進一步包含展現(xiàn)酶活性的附加的多肽。本發(fā)明的多肽的量將易于由本領域技術(shù)人員視例如待降解的含聚酯材料的性質(zhì)和/或組合物中含有的附加的酶/多肽而改適。在一特定實施方式中，將本發(fā)明的分離的多肽連同一種或若干種賦形劑，尤其是能夠穩(wěn)定或保護多肽免遭降解的賦形劑一起溶解于水性介質(zhì)中。舉例來說，可將本發(fā)明的多肽溶解于水中，最終與附加的組分諸如甘油、山梨糖醇、糊精、淀粉、二醇諸如丙二醇、鹽等在一起。可接著干燥所得混合物以便獲得粉末。用于干燥所述混合物的方法為本領域技術(shù)人員所熟知，并且包括不限于凍干、冷凍干燥、噴霧干燥、超臨界干燥、下向通風蒸發(fā)、薄層蒸發(fā)、離心蒸發(fā)、傳送帶干燥、流化床干燥、轉(zhuǎn)鼓干燥或其任何組合。在另一特定實施方式中，本發(fā)明的組合物包含至少一種表達本發(fā)明的多肽的重組細胞或其提取物?！凹毎奶崛∥铩敝付◤募毎@得的基本上不含活細胞的任何部分，諸如細胞上清液、細胞碎片、細胞壁、DNA提取物、酶或酶制劑或通過化學、物理和/或酶促處理來由細胞獲得的任何制劑。優(yōu)選提取物是酶活性提取物。本發(fā)明的組合物可包含一種或若干種本發(fā)明的重組細胞或其提取物，以及任選地，一種或若干種附加的細胞。在一特定實施方式中，組合物由表達和分泌本發(fā)明的多肽的重組微生物的凍干培養(yǎng)基組成或包含所述凍干培養(yǎng)基。在一特定實施方式中，粉末包含本發(fā)明的多肽和穩(wěn)定量/增溶量的甘油、山梨糖醇或糊精諸如麥芽糖糊精和/或環(huán)糊精、淀粉、二醇諸如丙二醇、和/或鹽。在另一實施方式中，將本發(fā)明的多肽固定在固體載體上。多肽可通過在現(xiàn)有技術(shù)下描述的任何適當方法來固定，例如共價結(jié)合、吸附、包埋或膜限制。廣泛多種載體可用于固定本發(fā)明的多肽。待選擇的載體取決于它所致力的用途。適宜載體涵蓋而不限于塑料、金屬、無機載體，諸如玻璃、二氧化硅、氧化鋁、膨潤土、羥磷灰石、鎳/氧化鎳、鈦、氧化鋯、聚合載體等。載體可呈表面、粉末、微米或納米珠粒、凝膠、溶劑溶脹或水溶脹凝膠或基質(zhì)、網(wǎng)狀基質(zhì)或凝膠、膜、纖維載體、多孔載體等的形式。用于固定多肽的方法為熟練技術(shù)人員所熟知(參見例如Tischer和Wedekind,TopicsinCurrentChemistry,1999,200,95-126以及Alloue等,BiotechnolAgronSocEnviron2008,12,57-68；其公開內(nèi)容以引用的方式并入本文)。一旦制備，本發(fā)明的載體即可直接用于反應介質(zhì)中。換句話說，本發(fā)明的載體可僅添加在反應介質(zhì)中。當載體具有溶劑溶脹性時，可選擇反應的溶劑以便提供適當載體溶脹來致使可到達所固定多肽，而不損害多肽的催化活性。作為一種替代方案，載體可用于制備反應器，其可為例如酶反應器、膜反應器、連續(xù)流反應器諸如攪拌槽反應器、連續(xù)操作的填充床反應器、或連續(xù)操作的流化床反應器、或填充床反應器。在一些實施方式中，本發(fā)明的載體是可再循環(huán)的，并且可連續(xù)使用數(shù)次。核酸本發(fā)明的另一目標是一種編碼如上定義的多肽的核酸。如本文所用，術(shù)語“核酸”、“核酸序列”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核苷酸序列”可互換使用，并且是指脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的序列。核酸可為DNA(cDNA或gDNA)、RNA、或兩者的混合物。它可呈單鏈形式或呈雙鏈體形式，或是兩者的混合物。它可具有重組、人工和/或合成來源，并且它可包含修飾的核苷酸，所述修飾的核苷酸包含例如修飾的鍵、修飾的嘌呤或嘧啶堿基、或修飾的糖。本發(fā)明的核酸可呈分離或純化形式，并且通過本領域中本身已知的技術(shù)來制備、分離和/或操作，例如克隆和表達cDNA文庫、擴增、酶促合成或重組技術(shù)。核酸也可通過如例如Belousov(1997)NucleicAcidsRes.25:3440-3444中所述的熟知化學合成技術(shù)來在體外合成。本發(fā)明也涵蓋在嚴格條件下雜交于編碼如上定義的多肽的核酸的核酸。優(yōu)選地，所述嚴格條件包括在2XSSC/0.1％SDS中在約42℃下孵育雜交濾膜約2.5小時，隨后在1XSSC/0.1％SDS中在65℃下洗滌濾膜4次，每次15分鐘。所用方案描述于諸如Sambrook等(MolecularCloning:aLaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarborN.Y.(1988))和Ausubel(CurrentProtocolsinMolecularBiology(1989))的參考書目中。本發(fā)明也涵蓋編碼本發(fā)明的多肽的核酸，其中所述核酸的序列或所述序列的至少一部分已使用優(yōu)化密碼子用法進行工程改造。本發(fā)明的一特定實施方式在于一種編碼如上定義的多肽的分離的核酸，其包含如下公開的如SEQIDN°2所示的序列。SEQIDN°2：5’gccacgcagaacaacccgccgtcgtggggcctggaccgcatcgaccagacgaacctgccgctgtcgcgcagctacacctacaattccaccggcgcgggcgtgaacgcctacatcatcgacaccggcatctacaccgcgcactccgacttcggcggccgcgccaccaacgtctacgacgccctcggcggcaacggccaggactgcaacggccacggcacccacgtcgcgggcaccgtcggcggcgccgcctacggcgtggccaaggcggtcaacctgcgcggcgtgcgcgtgctcaactgcagcggcagcggcaccacctccggtgtcatcgccggcatgaactgggtggccagcaaccacgtcaagcccgccgtggcgaacatgtcgctgggcggcggctactcctcctccctgaacacggccgccaacaacctggccagctccggcgtgttcctggccgtcgccgcgggcaacgagaccaccaacgcctgcaaccgctcgccggccagcgccgccaacgccaccacggtcgccgcgagcaccagcaccgacgcccgggcctcctacagcaactacggctcgtgcgtccacctgtacgcgcccggctcgtccatcacctccgcctggctgaacggcggcaccaacaccatcagcggcacgtcgatggccacgccgcacgtggccgggaccgccgccctctacaaggcgacctacggcgacgcctcgttcagcaccatccgcagctggctggtcagcaacgccacctccggcgtcatcaccggcaacgtgtcgggcaccccgaacctgctgctgaacaagcgctccctg3’或者，本發(fā)明的核酸可由本發(fā)明的多肽的序列推導，并且可根據(jù)核酸將在其中轉(zhuǎn)錄的宿主細胞改適密碼子用法。這些步驟可根據(jù)為本領域技術(shù)人員所熟知的方法進行，并且所述方法中的一些描述于參考手冊Sambrook等(Sambrook等,2001)中。本發(fā)明的核酸可進一步包含可用于導致或調(diào)控多肽在所選宿主細胞或系統(tǒng)中表達的附加的核苷酸序列，諸如調(diào)控區(qū)，即啟動子、增強子、沉默子、終止子、信號肽等。本發(fā)明進一步涉及一種表達盒，其包含本發(fā)明的核酸可操作地連接于一種或多種指導所述核酸在適合宿主細胞中表達的控制序列。通常，表達盒包含本發(fā)明的核酸可操作地連接于轉(zhuǎn)錄啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子，或由本發(fā)明的核酸可操作地連接于轉(zhuǎn)錄啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子組成。本發(fā)明也涉及一種包含如上定義的核酸或表達盒的載體。術(shù)語“載體”是指用作將重組遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移至宿主細胞中的運載體的DNA分子。主要類型的載體是質(zhì)粒、噬菌體、病毒、粘粒和人工染色體。載體自身通常是由插入物(異源性核酸序列、轉(zhuǎn)基因)和充當載體的“骨架”的較大序列組成的DNA序列。將遺傳信息轉(zhuǎn)移至宿主中的載體的目的通常在于在靶標細胞中分離、繁殖或表達插入物。稱為表達載體(表達構(gòu)建體)的載體具體來說適合于在靶標細胞中表達異源性序列，并且通常具有驅(qū)動編碼多肽的異源性序列的表達的啟動子序列。通常，存在于表達載體中的調(diào)控元件包括轉(zhuǎn)錄啟動子、核糖體結(jié)合位點、終止子以及任選存在的操縱子。優(yōu)選地，表達載體也含有用于在宿主細胞中自主復制的復制起點、可選擇標記、有限數(shù)目的適用限制性酶切位點以及高拷貝數(shù)潛力。表達載體的實例是克隆載體、修飾的克隆載體、特異性設計的質(zhì)粒和病毒。在不同宿主中提供適合多肽表達水平的表達載體在本領域中是熟知的。本領域中熟知的細菌表達載體包括pET11a(Novagen)、λgt11(Invitrogen)。本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明的核酸、表達盒或載體用于轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導宿主細胞的用途。對載體的選擇將通常取決于載體與將向其中引入載體的宿主細胞的相容性。本發(fā)明也涉及一種包含本發(fā)明的核酸、盒或載體的宿主細胞或重組細胞。宿主細胞可以以短暫或穩(wěn)定方式加以轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導。將本發(fā)明的表達盒或載體引入宿主細胞中以使盒或載體作為染色體組成部分或作為自我復制性染色體外載體加以維持。可使用標準技術(shù)將表達盒或載體引入宿主細胞中。所述技術(shù)的實例包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合和電穿孔。宿主細胞可為可被遺傳修飾，并且優(yōu)選被培養(yǎng)的任何細胞。細胞可為真核的或原核的，諸如哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、微生物諸如酵母、真菌或細菌細胞等。在一特定實施方式中，宿主細胞選自大腸桿菌(EscherischiaColi)、芽孢桿菌(Bacillus)、乳酸菌(Lacticacidbacteria)、鏈霉菌(Streptomyces)、木霉(Trichoderma)、曲霉(Aspergillus)、畢赤酵母(Pichia)或耶羅威亞酵母(Yarrowia)。應了解本發(fā)明關(guān)于任何特定細胞類型不受限制，并且可遵循公知常識應用于所有種類的細胞。術(shù)語“宿主細胞”也涵蓋親本宿主細胞的由于在復制期間發(fā)生的突變而不與所述親本宿主細胞相同的任何子代。在一特定實施方式中，宿主細胞是酵母，優(yōu)選是耶羅威亞酵母，并且產(chǎn)生的多肽是顯示較大熱穩(wěn)定性的糖基化多肽。在一優(yōu)選實施方式中，多肽由包含一種選自N28、N158或N165的氨基酸殘基的至少一個糖基化的SEQIDN°1組成。在一特定實施方式中，本發(fā)明提供一種被工程改造以表達如SEQIDN°2所示的核酸或其表達盒的宿主細胞。在一特定實施方式中，本發(fā)明提供一種被工程改造以表達如SEQIDN°2所示的核酸或其表達盒的重組枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。在另一特定實施方式中，本發(fā)明提供一種被工程改造以表達如SEQIDN°2所示的核酸或其表達盒的重組大腸桿菌。在另一特定實施方式中，本發(fā)明提供一種被工程改造以表達如SEQIDN°2所示的核酸或其表達盒的重組解脂耶羅威亞酵母(Yarrowialipolytica)。在另一實施方式中，本發(fā)明提供一種包含和表達編碼多肽的核苷酸序列的宿主細胞，所述多肽包含與如SEQIDN°1所示的全長氨基酸序列具有至少94％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且具有聚酯降解活性。在另一實施方式中，本發(fā)明提供一種包含和表達編碼多肽的核苷酸序列的宿主細胞，所述多肽包含與如SEQIDN°1所示的全長氨基酸序列具有至少94％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且具有PLA降解活性，更優(yōu)選是PLLA降解活性。在一特定實施方式中，宿主細胞是重組微生物。本發(fā)明實際上允許對具有改進的用以降解含聚酯材料的能力的微生物的工程改造。舉例來說，本發(fā)明的序列可用于對真菌或細菌的已稱為能夠降解聚酯的野生型菌株進行補充，以改進和/或增加菌株能力。在一特定實施方式中，本發(fā)明提供一種包含和表達編碼多肽的核苷酸序列的重組枯草芽孢桿菌，所述多肽包含與如SEQIDN°1所示的全長氨基酸序列具有至少94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且具有聚酯降解活性，優(yōu)選是PLA降解活性，更優(yōu)選是PLLA降解活性。在另一特定實施方式中，本發(fā)明提供一種包含和表達編碼多肽的核苷酸序列的重組大腸桿菌，所述多肽包含與如SEQIDN°1所示的全長氨基酸序列具有至少94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且具有聚酯降解活性，優(yōu)選是PLA降解活性，更優(yōu)選是PLLA降解活性。在另一特定實施方式中，本發(fā)明提供一種包含和表達編碼多肽的核苷酸序列的重組解脂耶羅威亞酵母，所述多肽包含與如SEQIDN°1所示的全長氨基酸序列具有至少94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且具有聚酯降解活性，優(yōu)選是PLA降解活性，更優(yōu)選是PLLA降解活性。有利的是，多肽的一個或若干個氨基酸殘基被糖基化。更優(yōu)選地，多肽由包含一種選自N28、N158或N165，優(yōu)選至少N158的氨基酸殘基的至少一個糖基化的SEQIDN°1組成。本發(fā)明的另一目標在于提供一種產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，其包括(i)培養(yǎng)如上定義的重組細胞，(ii)回收培養(yǎng)上清液，以及任選地(iii)分離或純化所述多肽。本發(fā)明進一步涉及通過這個產(chǎn)生方法獲得的所述多肽?；蛘撸景l(fā)明的多肽可通過無細胞方法產(chǎn)生(Kim等JBiosci.Bioeng.July2009；Spirin等(2007)FrontMatterinCell-FreeProteinSynthesis:MethodsandProtocols)，或可被化學合成。降解含聚酯材料本發(fā)明提供使用本發(fā)明的多肽來在好氧或厭氧條件下降解和/或再循環(huán)含聚酯材料的方法，所述含聚酯材料如同由聚酯制得或含有聚酯的塑料制品。實際上，由于本發(fā)明的多肽的高聚酯解聚效率，所以它相較于其它已知化學或微生物聚酯降解手段更加有利。本發(fā)明的多肽具有增加的解聚速率，特別是對于PLA解聚來說。因此，本發(fā)明的一目標在于使用本發(fā)明的多肽或相應重組細胞或其提取物或組合物來酶促降解含聚酯材料。在一優(yōu)選實施方式中，多肽或相應重組細胞、其提取物或組合物用于酶促降解含PLA材料，并且更優(yōu)選用于酶促降解含PLLA材料。本發(fā)明的另一目標在于使用包含與如SEQIDN°1所示的全長氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且具有聚酯降解活性的多肽來降解含聚酯材料。本發(fā)明的另一目標在于提供一種用于降解含聚酯材料的方法，其中使含聚酯材料與本發(fā)明的多肽或相應重組細胞或其提取物或組合物接觸。有利的是，含聚酯材料的聚酯被解聚直至成為單體和/或寡聚物。在一特定實施方式中，所有目標聚酯都被解聚直至成為形成材料的原始聚酯的單體。在降解方法的一實施方式中，至少一種聚酯被降解以產(chǎn)生可再聚合單體和/或寡聚物，其有利地被回收以再次使用。在另一實施方式中，含聚酯材料的聚酯被完全降解。在一優(yōu)選實施方式中，含聚酯材料包含PLA，更優(yōu)選是PLLA，并且至少乳酸單體和/或寡聚物被回收以例如進行再循環(huán)或甲烷化(methanisation)。在另一實施方式中，含聚酯材料包含PLA和至少一種優(yōu)選選自以下的附加的聚酯：聚對苯二甲酸丙二酯(PTT)、聚對苯二甲酸丁二酯(PBT)、聚對苯二甲酸乙二酯(PET)、聚己二酸丁二酯共對苯二甲酸丁二酯(PBAT)、聚羥基鏈烷酸酯(PHA)、聚丁二酸丁二酯(PBS)、聚己內(nèi)酯(PCL)、聚(己二酸乙二酯)(PEA)以及這些聚酯的摻合物/混合物?；蛘呋虼送?，含聚酯材料可進一步含有至少一種聚酰胺(也稱為尼龍)和/或至少一種優(yōu)選選自聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)以及這些聚合物的摻合物/混合物的聚烯烴、和/或至少一種由乙烯基單體即含有碳-碳雙鍵的小分子制得的乙烯基聚合物?；蛘呋虼送?，含聚酯材料可進一步含有至少一種優(yōu)選選自淀粉、面粉、纖維素及其摻合物/混合物的天然聚合物(即非石化衍生)。在一特定實施方式中，含聚酯材料包含聚羥基鏈烷酸酯(PHA)和/或聚對苯二甲酸乙二酯(PET)和/或聚己二酸丁二酯共對苯二甲酸丁二酯(PBAT)或這些聚酯的摻合物/混合物。根據(jù)本發(fā)明，含聚酯材料也可含有金屬化合物、無機化合物、玻璃化合物、天然或合成纖維、紙、木材、木材化合物如同木質(zhì)素、纖維素或半纖維素、淀粉及其衍生物。本發(fā)明也涉及一種從含聚酯材料產(chǎn)生單體和/或寡聚物的方法，其包括使含聚酯材料暴露于本發(fā)明的多肽或相應重組細胞或其提取物或組合物，以及任選地回收單體和/或寡聚物。本發(fā)明方法特別適用于產(chǎn)生乳酸單體。當使用重組微生物時，所述微生物有利地展現(xiàn)修飾的代謝以防止從降解的聚酯獲得的單體和/或寡聚物被消耗。舉例來說，微生物中降解所述單體和/或寡聚物的酶已被缺失或剔除?；蛘?，可在含有至少一種可由重組微生物使用的碳源的培養(yǎng)基中執(zhí)行本發(fā)明方法以使所述微生物優(yōu)先消耗這個碳源而非單體和/或寡聚物。有利的是，使含聚酯材料與含有重組微生物、作為碳源的葡萄糖等、以及可用氮源的培養(yǎng)基接觸，所述氮源包括有機氮源(例如蛋白胨、肉類提取物、酵母提取物、玉米漿)或無機氮源(例如硫酸銨、氯化銨)。必要時，培養(yǎng)基可進一步含有無機鹽(例如鈉離子、鉀離子、鈣離子、鎂離子、硫酸根離子、氯離子、磷酸根離子)。此外，培養(yǎng)基也可補充以痕量組分，諸如維生素、少量元素和氨基酸。在一特定實施方式中，含聚酯材料可在與本發(fā)明的聚酯酶接觸之前預處理，以物理改變它的結(jié)構(gòu)，以便增加聚酯與聚酯酶之間的接觸面。舉例來說，可使含聚酯材料轉(zhuǎn)變成乳液或粉末，其被添加至含有本發(fā)明的多肽和/或重組微生物或其提取物的液體介質(zhì)中?；蛘?，可在添加至含有重組微生物、其提取物和/或多肽的液體介質(zhì)中之前通過切割、沖擊、壓碎、研磨、分段、低溫研磨等來將含聚酯材料機械研磨、?；?、丸粒化等，以減小材料的形狀和尺寸。機械預處理也可為聲波處理、離心、剪切、碰撞、采用高壓均質(zhì)器、用轉(zhuǎn)鼓進行浸漬或液化、采用螺旋壓機、圓盤篩粉碎機或活塞壓機?；蛘呋蛄硗?，可應用熱預處理。這可用微波實現(xiàn)。所述熱預處理可提供消毒、巴斯德滅菌(pasteurization)或滅菌。在另一實施方式中，含聚酯材料被化學預處理以改進它的結(jié)構(gòu)，并且增加聚酯與本發(fā)明的多肽之間的接觸面?？墒褂脡A、酸、溶劑或離子液體。也可執(zhí)行臭氧化。在一特定實施方式中，也可在降解之前分選、洗滌、消毒、滅菌和/或生物清潔含聚酯材料。根據(jù)本發(fā)明，可組合若干預處理。為降解含聚酯材料所需的時間可視含聚酯材料自身(即塑料制品的性質(zhì)和來源、它的組成、形狀等)、所用多肽的類型和數(shù)量、以及各種工藝參數(shù)(即溫度、pH、附加的試劑等)而變化。本領域技術(shù)人員可易于使工藝參數(shù)適于含聚酯材料。有利的是，在包括在20℃與90℃之間，優(yōu)選在20℃與60℃之間，更優(yōu)選在30℃與55℃之間，更優(yōu)選是40℃至50℃，甚至更優(yōu)選在45℃的溫度下執(zhí)行方法。更通常地，使溫度維持在失活溫度以下，所述失活溫度對應于多肽被失活和/或重組微生物不再合成多肽所處的溫度。介質(zhì)的pH可在5-11的pH范圍內(nèi)，優(yōu)選在7-10的pH范圍內(nèi)，更優(yōu)選在8.5-9.5的pH范圍內(nèi)，甚至更優(yōu)選在8-9的pH范圍內(nèi)。有利的是，根據(jù)目標聚酯以及目標單體/寡聚物的溶解性調(diào)整pH以改進工藝效率。優(yōu)選地，調(diào)整pH以維持在多肽的最優(yōu)pH下。實際上，聚酯的解聚產(chǎn)生誘導pH降低的酸性單體和寡聚物。添加稀釋堿或飽和堿諸如氫氧化鈣可用于抵消這個酸化，并且將pH維持成最優(yōu)pH。有利的是，多肽的添加量以重量計在含聚酯材料的0.001％至5％的范圍內(nèi)，優(yōu)選在0.001％至1％的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在0.001％至0.1％的范圍內(nèi)，甚至更優(yōu)選在0.001％至0.05％的范圍內(nèi)。在一特定實施方式中，在優(yōu)選包括在30rpm與2000rpm之間的攪拌下執(zhí)行方法，以有利于多肽與含聚酯材料之間的接觸。在一特定實施方式中，添加至少親脂性試劑和/或親水性試劑至介質(zhì)中以改進解聚步驟?？商砑诱T導劑諸如聚酯或其衍生物的寡聚物至包含重組微生物的培養(yǎng)基中以改進多肽產(chǎn)生?？商砑颖砻婊钚詣┲T如吐溫(Tween)或小蛋白質(zhì)如疏水蛋白(hydrophobin)至介質(zhì)中以改進聚酯與多肽或重組微生物之間的界面能，并且改進降解效率。有機物質(zhì)或離子液體可用于溶脹聚酯，并且增加微生物或多肽對它的可到達性。用于解聚塑性材料的至少一種聚酯直至成為單體/寡聚物的反應時間有利地包括在5小時或更少與110小時之間，更優(yōu)選在24小時與72小時之間。所述反應時間可允許解聚充分進展，并且將不是在經(jīng)濟上不利的。對于在甲烷化場所中的厭氧生物降解，或?qū)τ谠谔烊画h(huán)境中的好氧生物降解，反應時間可較長久。任選地，可依序或連續(xù)回收由解聚產(chǎn)生的單體和/或寡聚物。視起始含聚酯材料而定，可回收單一類型的單體和/或寡聚物或若干不同類型的單體和/或寡聚物?？墒褂盟羞m合純化方法進一步純化回收的單體和/或寡聚物，并且調(diào)節(jié)成可再聚合形式。純化方法的實例包括汽提方法、通過水溶液來分離、蒸汽選擇性冷凝、在生物過程之后過濾和濃縮介質(zhì)、分離、蒸餾、真空蒸發(fā)、提取、電滲析、吸附、離子交換、沉淀、結(jié)晶、濃縮以及酸添加脫水和沉淀、納濾、酸催化劑處理、半連續(xù)方式蒸餾或連續(xù)方式蒸餾、溶劑提取、蒸發(fā)濃縮、蒸發(fā)結(jié)晶、液體/液體萃取、氫化、共沸蒸餾方法、吸附、柱色譜法、簡單真空蒸餾和微濾，所述純化方法可以組合或不組合?？稍倬酆蠁误w和/或寡聚物可接著再次用于例如合成聚酯。有利的是，再聚合具有相同性質(zhì)的聚酯。然而，有可能混合回收的單體和/或寡聚物與其它單體和/或寡聚物，以例如合成新的共聚物?；蛘撸厥盏膯误w可作為化學中間體用于產(chǎn)生新的目標化合物。在一特定實施方式中，在適于允許進行聚合反應的條件下，使用水解酶進行再聚合?？商砑右l(fā)劑至單體/寡聚物溶液中以有利于聚合反應。本領域技術(shù)人員可易于使工藝參數(shù)適于單體/寡聚物以及待合成的聚合物。在一特定實施方式中，在反應器中執(zhí)行本發(fā)明方法?！胺磻鳌敝付ㄟm于維持和轉(zhuǎn)化塑料物品的任何裝置或裝備或設施。反應器可包括進口和出口裝置以供給/收集介質(zhì)、營養(yǎng)物、氣體等。反應器可為閉合的或開放的，諸如槽罐。塑料化合物和物品本發(fā)明的另一目標在于提供一種含聚酯材料，其中包括本發(fā)明的多肽和/或表達和分泌所述多肽的重組微生物。在一特定實施方式中，所述含聚酯材料可為塑料化合物。因此，本發(fā)明的一目標在于提供一種塑料化合物，其含有本發(fā)明的多肽和/或重組細胞和/或其組合物或提取物；以及至少一種聚酯。在一優(yōu)選實施方式中，聚酯選自聚乳酸，優(yōu)選選自PLLA。特定來說，塑料化合物可含有優(yōu)選選自以下的附加的聚合物：聚酯，諸如PDLA、PBAT、PHA、PCL、PET；聚烯烴，諸如聚乙烯、聚丙烯；或天然聚合物，諸如淀粉、纖維素或面粉；及其摻合物/混合物。更特定來說，塑料化合物可含有選自PBAT和面粉或淀粉的附加的聚合物。在一特定實施方式中，用于制備塑料化合物的多肽包含與如SEQIDN°1所示的全長氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、92％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。特定來說，本發(fā)明涉及一種包括以下步驟的方法：在聚酯處于部分或完全熔融狀態(tài)所處的溫度下混合所述聚酯和本發(fā)明的降解所述聚酯的多肽和/或重組細胞以使所述多肽和/或所述重組細胞整合至含聚酯材料的恰好結(jié)構(gòu)中。在一特定實施方式中，將重組微生物的孢子包括至含聚酯材料中。舉例來說，可在聚酯的玻璃轉(zhuǎn)變溫度與熔點之間的溫度下混合本發(fā)明的多肽和/或重組微生物和聚酯?；蛘撸稍趯谒鼍埘サ娜埸c或以上的溫度下混合生物實體和聚烯烴。在一特定實施方式中，在80℃與250℃之間，優(yōu)選100℃與200℃之間的溫度下混合多肽/微生物和聚酯。或者，在高于80℃，優(yōu)選高于100℃，甚至更優(yōu)選高于130℃的溫度下混合多肽/微生物和聚酯。更通常地，多肽和/或重組微生物有利地至少抵抗聚酯的擠出溫度。更優(yōu)選地，使用擠出、雙螺桿擠出、單螺桿擠出、注射模制、鑄造、熱成形、旋轉(zhuǎn)模制、壓制、壓延、壓平、涂布、層化、擴展、拉擠成型、擠出吹掃-模制、擠出-膨脹、壓制-粒化、水包油包水雙重乳液蒸發(fā)或由本領域技術(shù)人員所知的任何技術(shù)進行混合步驟。所得塑料化合物整合包埋在化合物的主體中的本發(fā)明的多肽/微生物。有利的是，所述塑料化合物可用于制造其中也包括本發(fā)明的多肽/微生物的塑料物品。在一特定實施方式中，所得塑料化合物或塑料物品是符合至少一種由本領域技術(shù)人員所知的相關(guān)標準和/或標簽的可生物降解的塑料化合物或塑料物品，所述相關(guān)標準和/或標簽諸如標準EN13432、標準ASTMD6400、良好生物降解土壤(OKBiodegradationSoil，標簽)、良好生物降解水(OKBiodegradationWater，標簽)、良好堆肥(OKCompost，標簽)、良好家庭堆肥(OKCompostHome，標簽)。可生物降解的塑料化合物或塑料物品是指在環(huán)境條件下至少部分地轉(zhuǎn)化成水、二氧化碳或甲烷和生物質(zhì)的塑料化合物或塑料物品。如實施例中所說明，本發(fā)明的優(yōu)選塑料化合物或塑料物品可在水中生物降解。優(yōu)選地，以重量計，約90％的塑料化合物或塑料物品在小于90天內(nèi)，更優(yōu)選在小于60天內(nèi)，甚至更優(yōu)選在小于30天內(nèi)，在水中被生物降解。或者或此外，塑料化合物或塑料物品可在暴露于存在于地貌中的濕潤和溫度條件時被生物降解。優(yōu)選地，以重量計，約90％的塑料化合物或塑料物品在環(huán)境中在小于3年的情況下，更優(yōu)選在小于2年內(nèi)，甚至更優(yōu)選在小于1年內(nèi)被生物降解?；蛘?，塑料化合物或塑料物品可在工業(yè)堆肥條件下被生物降解，其中將溫度維持在50℃以上。本發(fā)明的其它方面和優(yōu)勢將在以下實施例中公開，所述實施例應被視為具有說明性而不限制本申請的范圍。實施例實施例1：純化和鑒定來自角蛋白降解馬杜拉放線菌T16-1的聚酯酶從泰國森林土壤分離的角蛋白降解馬杜拉放線菌NBRC104111菌株T16-1(Sukkum等2009)由于它的上清液具有高PLA降解活性而被選擇。在發(fā)酵罐中產(chǎn)生酶在10L發(fā)酵罐(BiostatCplus)中進行批式實驗。500mL酵母麥芽培養(yǎng)液(YM，Sigma-Aldrich)預培養(yǎng)物用于接種4.5L基礎培養(yǎng)基(2.4g/L明膠；4g/L(NH4)2SO4；0.2g/LMgSO4.7H2O；0.5g/L酵母提取物；4g/LK2HPO4；2g/LKH2PO4，用NaOH調(diào)整在pH6.8下)。將溫度調(diào)控在46℃下，并且以添加10％(v/v)H3PO4溶液來將pH維持在6.8下。使攪拌速率固定在70rpm下以使得能夠溫和混合，并且調(diào)控通氣率(0.6至1.6vvm)以提供反應器高于20％的空氣飽和度的溶氧水平，以避免培養(yǎng)中存在任何氧限制。使發(fā)酵罐連接于計算機，并且MFCS/DA軟件對受控參數(shù)(pH、溫度、溶氧分壓和H3PO4添加)進行線上采集并允許線上監(jiān)測和調(diào)控這些參數(shù)。培養(yǎng)持續(xù)時間是50小時。通過離心(13000g–10分鐘)來回收含有細胞外酶的上清液，并且保存在4℃下。聚酯酶純化使用500mLAmicon槽室(MerckMillipore)和具有10KDa的孔尺寸的纖維素再生膜(GEHealthcareLifeScience)將培養(yǎng)物的上清液濃縮40倍。相對于50mM甘氨酸-NaOHpH10緩沖液來透析所得溶液。AKTA純化器裝置(GEHealthcareLifeScience)用于使用陰離子交換純化HiTrapQFF1mL管柱(GEHealthcareLifeScience)進行多肽純化，以50mM甘氨酸-NaOH(pH10)作為上樣緩沖液。用含0至1M梯度NaCl的50mM甘氨酸-NaOHpH10緩沖液進行洗脫。在TCA沉淀(v/v)之后，通過無染色劑SDS-PAGE凝膠(Bio-Rad)以及通過在含有瓊脂糖(1％)和PLLA乳液(0.5％，NaturePlast)的混合物的板中測試酶產(chǎn)生暈圈的能力來闡明本發(fā)明的聚酯酶在包括流穿級分的不同級分中的存在性。測定多肽N末端序列在從凝膠被動提取之后，通過Edman微量測序技術(shù)，使用494微量測序儀裝置(PerkinElmerAppliedBiosystems)在Rouen的Pissaro平臺(France)中對所需條帶中含有的多肽進行N末端測序。分子生物學技術(shù)除非另外規(guī)定，否則用于DNA操作的一般性程序如先前所描述(SambrookJ,RussellDW.2001.Molecularcloning:alaboratorymanual,第3版ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)。限制酶和T4DNA連接酶從NewEnglandBiolabs獲得，并且根據(jù)制造商說明書加以使用。使用CloneAmpHiFiPCR預混合物(Takara-Clontech)進行PCR。合成寡核苷酸由Eurogentec合成。使用GenElutePCR提純試劑盒(Sigma-Aldrich)純化PCR產(chǎn)物。使用熱激方法將質(zhì)粒DNA引入大腸桿菌DH5α菌株(Invitrogen)中。使用QIAprep旋轉(zhuǎn)質(zhì)粒小型制備試劑盒(Qiagen)從大腸桿菌獲得質(zhì)粒DNA。使用加強型小型試劑盒(Qiagen)獲得總RNA樣品，并且隨后，使用Ribo-ZeroTMrRNA移除試劑盒(Epicentre)消減核糖體RNA。RNA測序使用IlluminaTruSeq鏈式mRNA試劑盒和超高通量測序系統(tǒng)IluminaHiSeq2500構(gòu)建對應于角蛋白降解馬杜拉放線菌T16-1在存在/不存在PLLA(NaturePlast，500μm)下的表達譜的兩個RNA文庫。使用TruSeqSBS試劑盒(Ilumina)的化學v3獲得雙端讀段(2x100ob)。生物信息學利用TBLASTN、BLASTX和BLASTP(AltschulSF等1997.GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofpolypeptidedatabasesearchprograms.NucleicAcidsRes.25:3389–3402)，使用可在國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)訪問的非冗余序列數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)庫搜索。使用VectorNTI軟件(LifeTechnologies)進行序列分析，并且用ClustalW軟件(ThompsonJD,HigginsDG,GibsonTJ.1994.CLUSTALW:improvingthesensitivityofprogressivemultiplesequencealignmentthroughsequenceweighting,position-specificgappenaltiesandweightmatrixchoice.NucleicAcids.Res.22:4673–4680)進行多重局部比對。結(jié)果多肽純化使用陰離子交換柱，在pH10下實現(xiàn)多肽純化。在含有PLA的瓊脂糖板上測試不同級分的活性。指示PLA水解的暈圈形成僅在流穿級分的情況下獲得。在β-巰基乙醇的情況下進行的SDS-PAGE顯示流穿級分含有獨特條帶(圖1)。這個純化方法使得能夠獲得呈現(xiàn)待獲得的PLA水解活性的純多肽。將多肽的分子量評估為27kDa。對條帶中含有的成熟蛋白質(zhì)的N末端測序顯示獨特的含28個氨基酸的序列：ATQNNPPSWGLDRIDQTNLPLSRSYTYN(SEQIDN°3)在流穿物中純化的多肽顯示對PLA粉末的解聚活性。多肽的比活性是每mg酶以及每小時產(chǎn)生4.8g乳酸(根據(jù)下述方案)。RNA測序結(jié)果允許鑒定編碼其序列顯示與先前通過N末端測序鑒定的28個氨基酸的100％同一性的多肽的DNA序列。以下再現(xiàn)所確定的DNA序列(SEQIDN°4)，其中加下劃線序列對應于假設肽信號和前肽：5’atgagacgacgtaccctgcccatcgccgtcctcgccgccgttcccctggccgtggcgggcgccctgcccgccggagccgcccccgccgcccccgccgtcccggtcgccatggcggccgccggacagggcgtcgccggacagtacatcgtgacgctgaagaagggcgtctcggtcgactcgaccgtcgccaagcgcggaatccgcacccagcaccgtttcggcaaggtgctgaacggcttctccgccaagctcaccgatgaccaactgtccaagctgcgcaccacgcccggtgtcgcgtccatcgagcaggacgccgtcatcacggtggacgccacgcagaacaacccgccgtcgtggggcctggaccgcatcgaccagacgaacctgccgctgtcgcgcagctacacctacaattccaccggcgcgggcgtgaacgcctacatcatcgacaccggcatctacaccgcgcactccgacttcggcggccgcgccaccaacgtctacgacgccctcggcggcaacggccaggactgcaacggccacggcacccacgtcgcgggcaccgtcggcggcgccgcctacggcgtggccaaggcggtcaacctgcgcggcgtgcgcgtgctcaactgcagcggcagcggcaccacctccggtgtcatcgccggcatgaactgggtggccagcaaccacgtcaagcccgccgtggcgaacatgtcgctgggcggcggctactcctcctccctgaacacggccgccaacaacctggccagctccggcgtgttcctggccgtcgccgcgggcaacgagaccaccaacgcctgcaaccgctcgccggccagcgccgccaacgccaccacggtcgccgcgagcaccagcaccgacgcccgggcctcctacagcaactacggctcgtgcgtccacctgtacgcgcccggctcgtccatcacctccgcctggctgaacggcggcaccaacaccatcagcggcacgtcgatggccacgccgcacgtggccgggaccgccgccctctacaaggcgacctacggcgacgcctcgttcagcaccatccgcagctggctggtcagcaacgccacctccggcgtcatcaccggcaacgtgtcgggcaccccgaacctgctgctgaacaagcgctccctgtaa3’(SEQIDN°4)編碼的多肽呈現(xiàn)具有386個氨基酸的序列(以下SEQIDN°5)，其中-殘基1至29對應于肽信號，-殘基30至110對應于假設前肽，并且-殘基111至386對應于成熟多肽。SEQIDN°5(加下劃線前肽序列；加雙下劃線肽信號)：APAVPVAMAAAGQGVAGQYIVTLKKGVSVDSTVAKRGIRTQHRFGKVLNGFSAKLTDDQLSKLRTTPGVASIEQDAVITVDATQNNPPSWGLDRIDQTNLPLSRSYTYNSTGAGVNAYIIDTGIYTAHSDFGGRATNVYDALGGNGQDCNGHGTHVAGTVGGAAYGVAKAVNLRGVRVLNCSGSGTTSGVIAGMNWVASNHVKPAVANMSLGGGYSSSLNTAANNLASSGVFLAVAAGNETTNACNRSPASAANATTVAASTSTDARASYSNYGSCVHLYAPGSSITSAWLNGGTNTISGTSMATPHVAGTAALYKATYGDASFSTIRSWLVSNATSGVITGNVSGTPNLLLNKRSL成熟多肽序列(SEQIDN°1)：ATQNNPPSWGLDRIDQTNLPLSRSYTYNSTGAGVNAYIIDTGIYTAHSDFGGRATNVYDALGGNGQDCNGHGTHVAGTVGGAAYGVAKAVNLRGVRVLNCSGSGTTSGVIAGMNWVASNHVKPAVANMSLGGGYSSSLNTAANNLASSGVFLAVAAGNETTNACNRSPASAANATTVAASTSTDARASYSNYGSCVHLYAPGSSITSAWLNGGTNTISGTSMATPHVAGTAALYKATYGDASFSTIRSWLVSNATSGVITGNVSGTPNLLLNKRSL對這個含276個氨基酸的成熟多肽計算的理論分子量是27.7kDa，此對應于在從角蛋白降解馬杜拉放線菌T16-1的上清液純化聚酯酶之后觀察到的分子量。根據(jù)與已知多肽的同源性，具有聚酯酶活性的多肽揭示存在兩個推定鈣結(jié)合位點，其中第一位點具有殘基Ala172、Ala174和His197，并且第二位點具有殘基Asp12、Asp15和Gln16。多肽的催化位點由氨基酸His71、Asp40和Ser221組成。此外，也已在多肽序列中鑒定兩個在殘基Cys68-Cys100和Cys164–Cys195之間的推定二硫鍵(圖2)。實施例2：表征來自角蛋白降解馬杜拉放線菌T16-1的聚酯酶。確定酶的最優(yōu)pH和溫度，并且研究酶的熱穩(wěn)定性。多肽的最優(yōu)pH和溫度酶的最優(yōu)pH是8.5。在50℃下，在7與9之間的pH范圍內(nèi)，用含600μg酶的2mL緩沖液以及20mgGoodfellowPLA薄膜在磁力攪拌的管中進行解聚測試。在pH7下，酶顯示少許活性。在37℃、45℃和50℃下，在pH8.5下，用含600μg酶的2mLpH8,5Tris-HCl緩沖液以及20mgGoodfellowPLA薄膜進行解聚測試。酶的最優(yōu)溫度是50℃。聚酯酶熱穩(wěn)定性在4℃至60℃的溫度范圍內(nèi)實現(xiàn)聚酯酶穩(wěn)定性測定。在4℃下，聚酯酶持續(xù)數(shù)月保持穩(wěn)定。酶的穩(wěn)定性與活性之間的折中對應于45℃的溫度。在45℃下，酶半衰期是2.5周。此外，在凍干程序之后不存在聚酯降解活性損失。實施例3：開發(fā)PLA降解方法。鑒于乳酸是潛在抑制劑并且在反應期間劇烈降低pH，這些實驗的目的在于解決產(chǎn)生乳酸的問題。將酶和PLA引入并限制在10kDa的透析管中。這個管對乳酸可滲透，并且被放置在一定體積的緩沖液中，從而允許在恒定pH下操作，并且稀釋乳酸，由此限制它的潛在抑制作用。酶促PLA降解在PLA的水解動力學分析期間研究目標多肽(SEQIDN°1)的降解能力。通過HPLC分析來追蹤PLA向乳酸的轉(zhuǎn)化。在10kDa透析管(纖維素膜，寬度25mm，Sigma-AldrichD9777-100FT)中進行PLA降解測定。將含90μg酶的3mL100mMTrisHClpH8,5緩沖液、PLLA粉末(Natureplast500μm)、PLA薄膜(Goodfellow，50μm厚度)或PLA物件引入并限制在透析管中。將管放置在50mL(除非另外規(guī)定)100mMTris-HCl緩沖液中以控制pH至8.5。將緩沖液補充以卡那霉素(40μg/mL)以避免任何污染。在45℃下在攪拌(150rpm)下孵育反應。這個程序的目標在于控制反應的pH，并且避免由乳酸達成的潛在酶抑制。通過對管外部的緩沖液進行HPLC分析(管柱：AminexHPX-87H(300mm×7.8mm)，流動相：5mMH2SO4，溫度：50℃，流速：0.5mL.min-1，注射體積：20μL)來定量降解產(chǎn)物(乳酸和可溶性寡聚物)。乳酸(Sigma-AldrichL1750-10G)、二聚體和三聚體(自制)的標準物用于外部校正。為定量這個方法的好處，用以下透析系統(tǒng)實現(xiàn)PLA水解：在45℃下磁力攪拌的管中，所述管含有引入管中的50mgPLA薄膜(Goodfellow，50μm厚度，2％D-乳酸)、含90μg酶的3mL100mMTris-HClpH8.5緩沖液。在反應24小時之后，在提出的反應器中獲得55％轉(zhuǎn)化率。實施例4：評估對具有不同粒度測定值的PLA/PLLA的聚酯酶活性。在水解PLA粉末(PLLANaturePlast，含有4％D-乳酸的PLAIngeo7001D)期間評估酶活性。通過將商業(yè)丸粒微粉化和研磨來獲得不同粒度(100-250μm、250-500μm、500μm-1mm和1-2mm)(表1)。表1：PLA(Ingeo7001D)和PLLA(Natureplast)粉末的特征：粒度和結(jié)晶度。粒度Tg(℃)結(jié)晶度(％)PLAIngeo7001D100-250μm623250-500μm607500μm-1mm63411mm-2mm6242PLLANatureplast100-250μm5823250-500μm5724500μm-1mm59341mm-2mm6443差示掃描量熱法(DSC)測試用于使用Q100TA-RCS90儀器，在鋁盤中，在氮氣氛圍(50mL/min)下，在10℃/min的掃描速率下從-50℃至300℃對約8mg樣品測定PLA的玻璃溫度(Tg)和結(jié)晶度。在實施例3中所述的反應器方法中，用100mgPLA粉末、含60μg酶的2mL100mMTris-HClpH8.5緩沖液測定具有不同粒度的兩種不同PLA粉末的水解性能。具有相同尺寸的PLA和PLLA粉末的水解是相同的，從而指示存在4％D-乳酸并不對水解性能有害。在范圍5至24％內(nèi)的PLA結(jié)晶度對水解性能具有較低影響。相反地，粒度對PLA和PLLA粉末的水解速率存在強烈影響：粉末越細小，水解速率越高效。這可通過固相與液相之間的交換面的增加來解釋。(圖3和4)。在100-250μm的范圍內(nèi)的粒度使得能夠在24小時內(nèi)獲得68％的轉(zhuǎn)化率。如果在反應器中添加10mMCaCl2，那么在反應80小時之后獲得500μmPLLA粉末NaturePlast的95％的轉(zhuǎn)化率。實施例5：PLA濃度對酶活性的影響用與實施例3中所述相同的方案，含90μg酶的3mL100mMTris-HClpH8.5緩沖液，在水解PLLA粉末期間，在不同濃度(33至300g/L)下評估酶活性。結(jié)果呈現(xiàn)于表2中。PLLA濃度越高，形成乳酸的生產(chǎn)力越高，在300g/L濃度的PLLA的情況下，傾向于達成0.2g乳酸/mg酶/h。表2：在聚酯酶催化不同濃度PLLA水解期間在反應10小時獲得的生產(chǎn)力。生產(chǎn)力10hPLLA33g/LPLLA100g/LPLLA200g/LPLLA300g/Lg乳酸/mg酶/h0.070.150.170.19改進因子1x2.1x2.3x2.6實施例6：聚酯酶催化PLA薄膜水解成乳酸。在水解PLA薄膜(Goodfellow，50μm厚度，2％D-乳酸)期間使用實施例3中呈現(xiàn)的相同實驗方案。在45℃、pH8.5下，用含90μg聚酯酶的3mL100mMTris-HClpH8.5緩沖液和50mg薄膜(17g/L)進行動力學分析。聚酯酶能夠?qū)⒈∧に獬扇樗?。?8小時內(nèi)獲得76％的轉(zhuǎn)化率，在72小時內(nèi)獲得82％的轉(zhuǎn)化率(圖5)。實施例7：聚酯酶催化PLA商業(yè)物件水解成乳酸。在聚酯酶催化水解商業(yè)物件(PLA杯子、盤子、薄膜和餐具)期間使用實施例3中呈現(xiàn)的相同實驗方案。對這些物件的粉末(250-500μm)進行水解測試。使用100mg商業(yè)物件粉末，含90μg酶的3mL100mMTris-HClpH8.5緩沖液。無論是什么PLA物件，水解的初始速率都是相對類似的(在10小時，從對于薄膜的27％至對于杯子的44％)。相比于用PLLANaturePlast粉末獲得的結(jié)果(37％)，這在相同范圍內(nèi)。然而，值得注意的是PLA杯子比PLLA粉末更易于轉(zhuǎn)化成乳酸。在48小時之后獲得PLA杯子的98％的轉(zhuǎn)化率。在72小時內(nèi)，對于薄膜和盤子，分別獲得向乳酸的93％和84％的轉(zhuǎn)化率。餐具是最難以降解的物件，其中最多60％的物件轉(zhuǎn)化成乳酸。它含有約1％的TiO2，并且顯示TiO2的存在不導致這個現(xiàn)象。聚酯酶能夠?qū)⑺猩虡I(yè)物件都水解成乳酸(圖6)。實施例8：使用SEQIDN°1的酶的再循環(huán)方法這些實驗的目的在于驗證本發(fā)明的PLA降解解決方案的工業(yè)實用性，其中將SEQIDN°1的酶和PLA引入不具有任何透析系統(tǒng)的反應器中。直接用通過如實施例1中所述的發(fā)酵獲得的酶產(chǎn)生培養(yǎng)基進行PLA降解測定。通過離心(13000g–10分鐘)來回收含有細胞外酶的上清液，并且保存在4℃下。直接添加400mgPLANatureplast粉末(粒度<500μm)至25ml上清液中。添加300mg碳酸鈣和100mg氫氧化鈣以中和在水解期間釋放的乳酸，并且維持溶液的pH超過7。在反應開始時，pH在9.0與9.8之間。在45℃下，在攪拌(300rpm)下孵育反應混合物140小時。在反應期間，收集若干混合物樣品(1ml)，并且于0.22μm過濾器上過濾。如實施例2中所述通過HPLC來分析20μl濾液以定量乳酸和可溶性寡聚物(DP2)。在反應144小時之后，獲得17.5g/l乳酸和0.52g/lDP2寡聚物。PLA向乳酸的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率大于77％(圖7)。實施例9：通過本發(fā)明的不同特定多肽來比較PLA降解已修飾氨基酸序列SEQIDN°1以改進它的熱穩(wěn)定性。第一策略在于通過在SEQIDN°1的殘基位置175和247處引入兩個半胱氨酸殘基(T175C和R247C)來在氨基酸殘基序列SEQIDN°1中進行兩個氨基酸殘基取代以將附加的二硫鍵引入在多肽的結(jié)構(gòu)中。第二策略在于在SEQIDN°1的氨基酸殘基139與170之間或在氨基酸殘基143與173之間引入額外鹽橋。因此，第一所得變體含有氨基酸殘基取代N139D和S170R，并且第二所得變體含有氨基酸殘基取代N143R和N173E。第三策略在于對如SEQIDN°2所示的核酸序列進行定點誘變以產(chǎn)生5個變體，各自含有一個選自S194P、H197D、L210P、G212N和I217K的氨基酸殘基取代。已測試SEQIDN°1的各自含有選自R166K、T160A和L138A的氨基酸殘基取代的其它變體，并且已測量到活性與SEQIDN°1的天然多肽相當。實施例10：重組表達和純化SEQIDN°1的聚酯酶。在以下三種不同宿主中表達SEQIDN°1的聚酯酶：解脂耶羅威亞酵母、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌。10A-在解脂耶羅威亞酵母中重組表達聚酯酶在酵母解脂耶羅威亞酵母中，更確切來說在菌株JMY1212中，在組成型啟動子TEF控制下表達SEQIDN°1的聚酯酶，如先前由Bordes等,2007(F.Bordes,F.Fudalej,V.Dossat,J.M.Nicaud,etA.Marty(2007)Anewrecombinantproteinexpressionsystemforhigh-throughputscreeningintheyeastYarrowialipolytica.J.ofMibrob.Meth.,70,3,493-502)所述。對應于繼之以表達成熟聚酯酶的基因的序列的前肽的序列針對解脂耶羅威亞酵母的密碼子用法加以優(yōu)化。將這個序列整合在編碼來自解脂耶羅威亞酵母的脂肪酶lip2的基因的分泌信號序列的下游。接著在含有培養(yǎng)基Y1T2O3(總計50mL)的錐形燒瓶(Erlenmeyerflask)(500mL)中成功表達聚酯酶，所述培養(yǎng)基由酵母提取物(10g/L)、細菌用胰蛋白胨(20g/L)和葡萄糖(30g/L)構(gòu)成，用磷酸鹽緩沖液(100mM，pH6.8)緩沖。在28℃下孵育細胞24小時直至葡萄糖完全消耗。在10,000rpm下離心細胞10分鐘，并且將上清液直接用于反應中。表達水平類似于在角蛋白降解馬杜拉放線菌T16-1的情況下獲得的表達水平，但它的熱穩(wěn)定性較高。盡管在角蛋白降解馬杜拉放線菌T16-1中產(chǎn)生的酶在60℃下5小時之后損失78％的活性，但在解脂耶羅威亞酵母中表達的酶在相同處理之后具有完全活性。10B-在枯草芽孢桿菌中重組表達SEQIDN°1的聚酯酶克隆并在枯草芽孢桿菌中表達SEQIDN°1的聚酯酶，如商業(yè)Takara試劑盒中所述。對應于繼之以表達成熟聚酯酶的基因的序列的前肽的序列針對枯草芽孢桿菌的密碼子用法加以優(yōu)化。將這個序列整合在枯草芽孢桿菌的分泌信號序列的下游。表達水平類似于在角蛋白降解馬杜拉放線菌T16-1的情況下獲得的表達水平。10C-在大腸桿菌中重組表達SEQIDN°1的聚酯酶克隆并在大腸桿菌中，并且更確切來說在BL21、Origami和Rosetta菌株中表達SEQIDN°1的聚酯酶。對應于繼之以表達成熟聚酯酶的基因的序列的前肽的序列針對大腸桿菌的密碼子用法加以優(yōu)化。將這個序列在有或無組氨酸標簽的情況下整合在用于達成周質(zhì)表達的PelB信號序列或編碼麥芽糖結(jié)合蛋白的基因的下游。表達水平比在角蛋白降解馬杜拉放線菌T16-1的情況下獲得的表達水平高2至3倍。使用組氨酸標簽，將蛋白質(zhì)純化并在使用PLA(Ingeo7001D)的250-500μm粉末下測試PLA解聚。相比于在角蛋白降解馬杜拉放線菌T16-1中表達的酶，在大腸桿菌中產(chǎn)生的酶呈現(xiàn)相同比活性。實施例11：產(chǎn)生含有SEQIDN°1的多肽的可生物降解的塑料化合物11A-塑料化合物產(chǎn)生方法制備塑料化合物，其包含先前在65℃下干燥4小時的呈?；问降腜LA聚合物(來自Natureplast的聚乳酸PLE003)和SEQIDN°1的多肽的固體制劑。先前根據(jù)以下步驟制備多肽固體制劑：培養(yǎng)產(chǎn)生所述多肽的微生物，過濾所述培養(yǎng)物，隨后利用3kD膜進行超濾和透濾，添加10g.l麥芽糖糊精，并且使混合物霧化以獲得處于干燥粉末形式下的多肽。使用混配機或共旋轉(zhuǎn)雙螺桿擠出機(“CoperionZSK18megalab”)。這個混配機依次包括第一進料元件、兩個混合元件以及第二進料元件?；炫錂C包括9個連續(xù)加熱區(qū)Z1至Z9，其中可獨立地控制和調(diào)控溫度。另一區(qū)域Z10存在于區(qū)域Z9之后，對應于雙螺桿的頭部。根據(jù)這個實驗，使96重量％的PLA與4重量％的SEQIDN°1的PLA解聚酶的液體制劑混合，并且擠出，其中溫度概況描述于下表3中。表3：混配機的溫度概況區(qū)域Z1Z2Z3Z4Z5Z6Z7Z8Z9Z10(頭部)T℃135℃150℃170℃180℃140℃140℃140℃140℃140℃140℃將PLA以9,6kg/h的流量引入主進料斗(在Z1區(qū)域之前)中。PLA穿過區(qū)域Z1至Z5，其中溫度被增加直至180℃(Z4)，從而產(chǎn)生熔融PLA。接著通過副進料器N°2將酶以0,4kg/h的流量引入Z6中，其中溫度被降低至140℃。接著通過雙螺桿在200Rpm下的旋轉(zhuǎn)來將酶和PLA從區(qū)域Z7至區(qū)域Z9混合在一起。從Z1至Z9的滯留時間是約1分30秒。PLA和生物實體的混合物接著到達包括兩個直徑是2.5mm的孔的螺桿頭部(Z10)，其中混合物被推動以形成丸粒，其接著在水中冷卻并干燥，隨后進行調(diào)節(jié)。獲得處于粒化形式下的塑料化合物，其含有96重量％的PLA以及4重量％的SEQIDN°1的PLA解聚酶的制劑。所述塑料化合物可用于通過本領域中本身熟知的任何技術(shù)來產(chǎn)生塑料物品。11B-包含PLA和SEQIDN°1的多肽的塑料化合物的降解測試。已使用以下各物進行不同可生物降解性比較測試：-根據(jù)實施例11A產(chǎn)生的塑料化合物，其含有96重量％的PLA以及4重量％的本發(fā)明的PLA解聚酶的制劑-如實施例11A中所述產(chǎn)生的PLA化合物，其含有100重量％的PLA(即剝奪PLA解聚酶)，稱為對照在以下不同溫度下進行所述測試：28℃、37℃或45℃。將約1克PLA放置在100mLTris緩沖液(pH＝9,5)中。準確測量PLA的量以評估產(chǎn)生的乳酸的理論量。通過測量PLA的轉(zhuǎn)化率，更具體來說PLA向乳酸或乳酸的二聚體的解聚來評估化合物的可生物降解性。通過HPLC分析來追蹤這個轉(zhuǎn)化率。結(jié)果(圖8)顯示相比于對照PLA化合物，整合PLA解聚酶的PLA化合物顯示更大解聚速率(即可生物降解性)。相比于在28℃下，PLA化合物在37℃或45℃下的解聚甚至更好。序列表<110>卡比歐斯公司<120>具有聚酯降解活性的多肽及其用途<130>B1898PC00<160>5<170>PatentInversion3.5<210>1<211>276<212>PRT<213>artificialsequence<220><223>PAMPolypeptide<400>1AlaThrGlnAsnAsnProProSerTrpGlyLeuAspArgIleAspGln151015ThrAsnLeuProLeuSerArgSerTyrThrTyrAsnSerThrGlyAla202530GlyValAsnAlaTyrIleIleAspThrGlyIleTyrThrAlaHisSer354045AspPheGlyGlyArgAlaThrAsnValTyrAspAlaLeuGlyGlyAsn505560GlyGlnAspCysAsnGlyHisGlyThrHisValAlaGlyThrValGly65707580GlyAlaAlaTyrGlyValAlaLysAlaValAsnLeuArgGlyValArg859095ValLeuAsnCysSerGlySerGlyThrThrSerGlyValIleAlaGly100105110MetAsnTrpValAlaSerAsnHisValLysProAlaValAlaAsnMet115120125SerLeuGlyGlyGlyTyrSerSerSerLeuAsnThrAlaAlaAsnAsn130135140LeuAlaSerSerGlyValPheLeuAlaValAlaAlaGlyAsnGluThr145150155160ThrAsnAlaCysAsnArgSerProAlaSerAlaAlaAsnAlaThrThr165170175ValAlaAlaSerThrSerThrAspAlaArgAlaSerTyrSerAsnTyr180185190GlySerCysValHisLeuTyrAlaProGlySerSerIleThrSerAla195200205TrpLeuAsnGlyGlyThrAsnThrIleSerGlyThrSerMetAlaThr210215220ProHisValAlaGlyThrAlaAlaLeuTyrLysAlaThrTyrGlyAsp225230235240AlaSerPheSerThrIleArgSerTrpLeuValSerAsnAlaThrSer245250255GlyValIleThrGlyAsnValSerGlyThrProAsnLeuLeuLeuAsn260265270LysArgSerLeu275<210>2<211>828<212>DNA<213>artificialsequence<220><223>PAMnucleicacidsequence<400>2gccacgcagaacaacccgccgtcgtggggcctggaccgcatcgaccagacgaacctgccg60ctgtcgcgcagctacacctacaattccaccggcgcgggcgtgaacgcctacatcatcgac120accggcatctacaccgcgcactccgacttcggcggccgcgccaccaacgtctacgacgcc180ctcggcggcaacggccaggactgcaacggccacggcacccacgtcgcgggcaccgtcggc240ggcgccgcctacggcgtggccaaggcggtcaacctgcgcggcgtgcgcgtgctcaactgc300agcggcagcggcaccacctccggtgtcatcgccggcatgaactgggtggccagcaaccac360gtcaagcccgccgtggcgaacatgtcgctgggcggcggctactcctcctccctgaacacg420gccgccaacaacctggccagctccggcgtgttcctggccgtcgccgcgggcaacgagacc480accaacgcctgcaaccgctcgccggccagcgccgccaacgccaccacggtcgccgcgagc540accagcaccgacgcccgggcctcctacagcaactacggctcgtgcgtccacctgtacgcg600cccggctcgtccatcacctccgcctggctgaacggcggcaccaacaccatcagcggcacg660tcgatggccacgccgcacgtggccgggaccgccgccctctacaaggcgacctacggcgac720gcctcgttcagcaccatccgcagctggctggtcagcaacgccacctccggcgtcatcacc780ggcaacgtgtcgggcaccccgaacctgctgctgaacaagcgctccctg828<210>3<211>28<212>PRT<213>artificialsequence<220><223>N-terminalpolypeptidesequence<400>3AlaThrGlnAsnAsnProProSerTrpGlyLeuAspArgIleAspGln151015ThrAsnLeuProLeuSerArgSerTyrThrTyrAsn2025<210>4<211>1161<212>DNA<213>artificialsequence<220><223>DNAsequence<400>4atgagacgacgtaccctgcccatcgccgtcctcgccgccgttcccctggccgtggcgggc60gccctgcccgccggagccgcccccgccgcccccgccgtcccggtcgccatggcggccgcc120ggacagggcgtcgccggacagtacatcgtgacgctgaagaagggcgtctcggtcgactcg180accgtcgccaagcgcggaatccgcacccagcaccgtttcggcaaggtgctgaacggcttc240tccgccaagctcaccgatgaccaactgtccaagctgcgcaccacgcccggtgtcgcgtcc300atcgagcaggacgccgtcatcacggtggacgccacgcagaacaacccgccgtcgtggggc360ctggaccgcatcgaccagacgaacctgccgctgtcgcgcagctacacctacaattccacc420ggcgcgggcgtgaacgcctacatcatcgacaccggcatctacaccgcgcactccgacttc480ggcggccgcgccaccaacgtctacgacgccctcggcggcaacggccaggactgcaacggc540cacggcacccacgtcgcgggcaccgtcggcggcgccgcctacggcgtggccaaggcggtc600aacctgcgcggcgtgcgcgtgctcaactgcagcggcagcggcaccacctccggtgtcatc660gccggcatgaactgggtggccagcaaccacgtcaagcccgccgtggcgaacatgtcgctg720ggcggcggctactcctcctccctgaacacggccgccaacaacctggccagctccggcgtg780ttcctggccgtcgccgcgggcaacgagaccaccaacgcctgcaaccgctcgccggccagc840gccgccaacgccaccacggtcgccgcgagcaccagcaccgacgcccgggcctcctacagc900aactacggctcgtgcgtccacctgtacgcgcccggctcgtccatcacctccgcctggctg960aacggcggcaccaacaccatcagcggcacgtcgatggccacgccgcacgtggccgggacc1020gccgccctctacaaggcgacctacggcgacgcctcgttcagcaccatccgcagctggctg1080gtcagcaacgccacctccggcgtcatcaccggcaacgtgtcgggcaccccgaacctgctg1140ctgaacaagcgctccctgtaa1161<210>5<211>386<212>PRT<213>artificialsequence<220><223>Polypeptidesequence<400>5MetArgArgArgThrLeuProIleAlaValLeuAlaAlaValProLeu151015AlaValAlaGlyAlaLeuProAlaGlyAlaAlaProAlaAlaProAla202530ValProValAlaMetAlaAlaAlaGlyGlnGlyValAlaGlyGlnTyr354045IleValThrLeuLysLysGlyValSerValAspSerThrValAlaLys505560ArgGlyIleArgThrGlnHisArgPheGlyLysValLeuAsnGlyPhe65707580SerAlaLysLeuThrAspAspGlnLeuSerLysLeuArgThrThrPro859095GlyValAlaSerIleGluGlnAspAlaValIleThrValAspAlaThr100105110GlnAsnAsnProProSerTrpGlyLeuAspArgIleAspGlnThrAsn115120125LeuProLeuSerArgSerTyrThrTyrAsnSerThrGlyAlaGlyVal130135140AsnAlaTyrIleIleAspThrGlyIleTyrThrAlaHisSerAspPhe145150155160GlyGlyArgAlaThrAsnValTyrAspAlaLeuGlyGlyAsnGlyGln165170175AspCysAsnGlyHisGlyThrHisValAlaGlyThrValGlyGlyAla180185190AlaTyrGlyValAlaLysAlaValAsnLeuArgGlyValArgValLeu195200205AsnCysSerGlySerGlyThrThrSerGlyValIleAlaGlyMetAsn210215220TrpValAlaSerAsnHisValLysProAlaValAlaAsnMetSerLeu225230235240GlyGlyGlyTyrSerSerSerLeuAsnThrAlaAlaAsnAsnLeuAla245250255SerSerGlyValPheLeuAlaValAlaAlaGlyAsnGluThrThrAsn260265270AlaCysAsnArgSerProAlaSerAlaAlaAsnAlaThrThrValAla275280285AlaSerThrSerThrAspAlaArgAlaSerTyrSerAsnTyrGlySer290295300CysValHisLeuTyrAlaProGlySerSerIleThrSerAlaTrpLeu305310315320AsnGlyGlyThrAsnThrIleSerGlyThrSerMetAlaThrProHis325330335ValAlaGlyThrAlaAlaLeuTyrLysAlaThrTyrGlyAspAlaSer340345350PheSerThrIleArgSerTrpLeuValSerAsnAlaThrSerGlyVal355360365IleThrGlyAsnValSerGlyThrProAsnLeuLeuLeuAsnLysArg370375380SerLeu385當前第1頁1 2 3