本國際專利申請要求于2014年10月23日提交的美國臨時(shí)專利申請62/067,908號，于2015年4月16日提交的美國臨時(shí)專利申請62/148,656號，于2015年7月2日提交的美國臨時(shí)專利申請62/188,353號，及于2015年8月27日提交的美國臨時(shí)專利申請62/210,795號的權(quán)益，將其內(nèi)容通過引用整體并入本文。序列表本申請與電子格式的序列表一起提交。該序列表以題為“Sequence_Listing_STP25.txt”的文件提供，其在2015年9月30日創(chuàng)建，最后修改時(shí)間為2015年10月22日，大小為83,000字節(jié)。將電子格式的序列表的信息以其整體通過引用并入本文。
背景技術(shù)：
：單域抗體(sdAb)作為單抗原結(jié)合蛋白或作為較大蛋白質(zhì)或多肽中的抗原結(jié)合域的應(yīng)用與應(yīng)用常規(guī)抗體或抗體片段相比提供了許多顯著的優(yōu)點(diǎn)。sdAb的優(yōu)點(diǎn)包括：僅需要單個(gè)域就可以高親和性和高選擇性結(jié)合抗原；sdAb可以從單個(gè)基因表達(dá)且不需要翻譯后修飾；sdAb對熱、pH、蛋白酶和其他變性劑或條件是高度穩(wěn)定的；sdAb的制備成本低；并且sdAb可以接近常規(guī)抗體不可及的靶標(biāo)和表位。有許多疾病或病癥，諸如癌癥，是由諸如核苷酸和蛋白質(zhì)等異常細(xì)胞內(nèi)或跨膜組分引起的?？衫卯惓＝M分的消除來預(yù)防或治療疾病或病癥。有許多可用于治療的藥物化合物，但是這些化合物可能無效、不可遞送或?qū)ξ词苡绊懙募?xì)胞有毒性。其他治療包括使用含有外源靶向序列的治療性蛋白質(zhì)或試劑，這樣治療劑可被細(xì)胞膜中的受體識別，使得治療劑能夠穿過細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞。一旦治療劑在細(xì)胞內(nèi)，治療劑可以與靶標(biāo)組分相互作用以治療疾病。然而，外源靶向序列的應(yīng)用可限制治療劑所靶向的細(xì)胞類型，并且增加了制造治療劑的成本。由于前述原因，需要不依賴于外源靶向序列或化學(xué)組合物來進(jìn)入細(xì)胞的治療或預(yù)防疾病的組合物和方法，并且其在身體內(nèi)僅有效靶向受影響的細(xì)胞。本發(fā)明涉及單域抗體(sdAb)，包含該sdAb的蛋白質(zhì)和多肽。sdAb針對引起病癥或疾病的細(xì)胞內(nèi)組分。本發(fā)明還包括編碼sdAb、蛋白質(zhì)和多肽的核酸、和包含sdAb的組合物。本發(fā)明包括組合物、sdAb、蛋白質(zhì)或多肽在預(yù)防、治療或診斷目的上的應(yīng)用。本發(fā)明還包括針對本發(fā)明的sdAb的單克隆抗體的應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式是針對細(xì)胞內(nèi)組分的單域抗體(sdAb)。所述細(xì)胞內(nèi)組分可以例如是蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、糖、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、TNF-α、和KRAS。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及抗STAT3sdAb?？蛇x地，該抗STAT3sdAb包含SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及包含編碼抗STATsdAb的氨基酸序列的分離的多肽，例如，SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示的多肽。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞表達(dá)sdAb的氨基酸序列，例如，SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式是包含sdAb或多肽，和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。可選地，所述sdAb包括含SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示氨基酸序列的抗STAT3sdAb，且所述多肽包括含SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示氨基酸序列的分離的多肽。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是診斷受試者中由STAT3介導(dǎo)的病癥的方法，所述方法包括以下步驟：a)使生物樣品與sdAb或多肽接觸；b)測定所述生物樣品中STAT3的量；和c)將步驟(b)中測定的量與標(biāo)準(zhǔn)品比較，其量的差異指示所述病癥的存在。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是預(yù)防或治療由STAT3介導(dǎo)的疾病或病癥，或者預(yù)防所述疾病的復(fù)發(fā)，或者用于治療癌癥，或者由異常細(xì)胞增殖引起的疾病的方法，其包括對有需要的受試者施用抗STAT3sdAb或多肽?？蛇x地，所述sdAb包括含SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示氨基酸序列的抗STAT3sdAb，且所述多肽包括含SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示氨基酸序列的分離的多肽。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式是抗TNF-αsdAb?？蛇x地，所述抗TNF-αsdAb包括SEQIDNO:5、SEQIDNO:6或SEQIDNO:7所示的氨基酸序列。本發(fā)明還包括含SEQIDNO:5、SEQIDNO:6或SEQIDNO:7所示氨基酸序列的分離的多肽。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是表達(dá)SEQIDNO:5、SEQIDNO:6或SEQIDNO:7所示氨基酸序列的宿主細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明還是含sdAb或多肽、和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物?？蛇x地，所述sdAb包括含SEQIDNO:5、SEQIDNO:6或SEQIDNO:7所示氨基酸序列的抗TNF-αsdAb，且所述多肽包括含SEQIDNO:5、SEQIDNO:6或SEQIDNO:7所示氨基酸序列的分離的多肽。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是診斷受試者中由TNF-α介導(dǎo)的病癥的方法，所述方法包括以下步驟：a)使生物樣品與sdAb或多肽接觸；b)測定所述生物樣品中TNF-α的量；和c)將步驟(b)中測定的量與標(biāo)準(zhǔn)品比較，其量的差異指示所述病癥的存在。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明描述了預(yù)防或治療由TNF-α介導(dǎo)的疾病或病癥，或者所述疾病或病癥的復(fù)發(fā)，或者用于治療癌癥或由異常細(xì)胞增殖引起的疾病的方法，其包括對有需要的哺乳動物施用抗TNF-αsdAb、或多肽?？蛇x地，所述抗TNF-αsdAb包括SEQIDNO:5、SEQIDNO:6或SEQIDNO:7所示的氨基酸序列，且所述多肽包括分離的多肽，所述分離的多肽包含SEQIDNO:5、SEQIDNO:6或SEQIDNO:7所示的氨基酸序列。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式是抗KRASsdAb?？蛇x地，所述抗KRASsdAb包括SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。一方面，本發(fā)明包括分離的多肽，其中，所述分離的多肽包含SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。另一方面，本發(fā)明包括表達(dá)SEQIDNO:2所示氨基酸序列的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是一種藥物組合物，其包括sdAb或多肽，和藥學(xué)上可接受的載體?？蛇x地，所述sdAb包括含SEQIDNO:2所示氨基酸序列的抗KRASsdAb，且所述多肽包括含SEQIDNO:2所示氨基酸序列的分離的多肽。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是診斷受試者中由KRAS介導(dǎo)的病癥的方法，所述方法包括以下步驟：a)使生物樣品與sdAb或多肽接觸；b)測定所述生物樣品中KRAS的量；和c)將步驟(b)中測定的量與標(biāo)準(zhǔn)品比較，其量的差異指示所述病癥的存在?？蛇x地，所述sdAb包括含SEQIDNO:2所示氨基酸序列的抗KRASsdAb，且所述多肽包括含SEQIDNO:2所示氨基酸序列的分離的多肽。本發(fā)明還包括使用抗KRASsdAb治療疾病的方法，所述方法包括給有需要的受試者施用有效量的抗KRASsdAb。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明描述了預(yù)防或治療由KRAS介導(dǎo)的疾病或病癥，或者所述疾病或病癥的復(fù)發(fā)，或者用于治療癌癥或由異常細(xì)胞增殖引起的疾病的方法，其包括對有需要的哺乳動物施用抗KRASsdAb或多肽?？蛇x地，所述抗KRASsdAb包括SEQIDNO:2所示的氨基酸序列，且所述多肽包括含SEQIDNO:2所示氨基酸序列的分離的多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明描述了施用本發(fā)明sdAb的方法，所述方法包括靜脈內(nèi)施用、肌內(nèi)施用、口服施用、直腸施用、眼內(nèi)施用、腸內(nèi)施用、胃腸外施用、皮下施用、透皮施用、作為滴眼劑施用、作為鼻噴霧劑施用、通過吸入或霧化施用、局部施用，以及作為可植入藥物施用。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明描述了使用本發(fā)明的sdAb與一種或多種化合物組合治療疾病、預(yù)防疾病或預(yù)防疾病復(fù)發(fā)的方法。可選地，所述一種或多種化合物是轉(zhuǎn)錄抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明描述了測量sdAb水平的方法，所述方法包括以下步驟：a)產(chǎn)生針對sdAb的一個(gè)或多個(gè)域的小鼠單克隆抗體；b)進(jìn)行免疫測定以測定受試者中sdAb的量；和c)對受試者中sdAb的量進(jìn)行定量。附圖說明參考以下描述、所附權(quán)利要求和附圖，將更好地理解本發(fā)明的這些和其他特征、方面和優(yōu)點(diǎn)，其中：圖1是VHH13抗STAT3sdAb表達(dá)載體pTT21-sttVHH13的示意圖；圖2是VHH14抗STAT3sdAb表達(dá)載體pTT21-sttVHH14的示意圖；圖3描述了使用抗STAT3細(xì)菌VHH13STAT3(SEQIDNO:3)和抗STAT3細(xì)菌VHH14STAT3(SEQIDNO:4)的免疫沉淀測定的結(jié)果；圖4描述了使用抗STAT3細(xì)菌VHH13STAT3(SEQIDNO:3)的免疫沉淀測定的結(jié)果；圖5示出了在MDA-MB-231異種移植模型中，以0.5mg/kg/日給藥的抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb的生長抑制；圖6示出了在MDA-MB-231異種移植模型中，以1mg/kg每日兩次～2mg/kg每日兩次或2mg/kg/日的劑量范圍給藥的抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQ.ID.NO.3)sdAb的生長抑制；圖7示出了在MDA-MB-231異種移植模型中，以5mg/kg/每日兩次給藥的抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb的生長抑制；圖8示出了在DU145異種移植模型中，以5mg/kg/每日兩次給藥的抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb的生長抑制；圖9示出了在PANC-1異種移植模型中，以5mg/kg/每日兩次給藥的抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb的生長抑制；圖10示出了在MCF-7異種移植模型中，以1mg/kg/每日三次給藥的抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb的生長抑制；圖11示出了在BT-474異種移植模型中，以1mg/kg/每日三次給藥的抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb的生長抑制；圖12示出了TNF-α在U937細(xì)胞中的細(xì)胞毒性；圖13示出了星形孢菌素(Staurosporine)在U937細(xì)胞中的細(xì)胞毒性；和圖14示出了抗TNF-αsdAb對TNF-α細(xì)胞毒性的抑制。具體實(shí)施方式本文使用的以下術(shù)語及其變體具有以下給出的含義，除非在使用該術(shù)語的語境中明確指出不同含義。除非在本文語境的用法另有指示，本文使用的術(shù)語“一個(gè)”、“一種”和“該”及類似的指示語應(yīng)被解釋為覆蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)。術(shù)語“抗原決定簇”是指由抗原結(jié)合分子(諸如本發(fā)明的sdAb或多肽)識別的抗原上的表位，更具體是由抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合位點(diǎn)識別的抗原上的表位。術(shù)語“抗原決定簇”和“表位”也可以互換使用。能夠結(jié)合特定抗原決定簇、表位、抗原或蛋白質(zhì)、對它們具有親和性和/或具有特異性的氨基酸序列被稱為“抗”或“針對”該抗原決定簇、表位、抗原或蛋白質(zhì)。如本文所使用的術(shù)語“包括”和該術(shù)語的變體，例如“包含”和“含有”，不意在排除其他添加劑、組分、整體或步驟。預(yù)期本文所述的sdAb、多肽和蛋白質(zhì)可以包含所謂的“保守”氨基酸取代，其通?？杀幻枋鰹檫@樣的氨基酸取代：其中一種氨基酸殘基被類似化學(xué)結(jié)構(gòu)的另一種氨基酸殘基取代，并且對多肽的功能、活性或其他生物學(xué)性質(zhì)幾乎沒有或基本上沒有影響。保守氨基酸取代是本領(lǐng)域眾所周知的。保守性取代是下列(a)-(e)組中的一個(gè)氨基酸被同組內(nèi)的另一個(gè)氨基酸取代的取代：(a)小的脂肪族非極性或弱極性殘基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；(b)極性帶負(fù)電荷的殘基及其(不帶電荷的)酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；(c)極性帶正電荷的殘基：His、Arg和Lys；(d)大的脂肪族非極性殘基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；和(e)芳族殘基：Phe、Tyr和Trp。其他的保守性取代包括：Ala轉(zhuǎn)變?yōu)镚ly或轉(zhuǎn)變?yōu)镾er；Arg轉(zhuǎn)變?yōu)長ys；Asn轉(zhuǎn)變?yōu)镚ln或轉(zhuǎn)變?yōu)镠is；Asp轉(zhuǎn)變?yōu)镚lu；Cys轉(zhuǎn)變?yōu)镾er；Gln轉(zhuǎn)變?yōu)锳sn；Glu轉(zhuǎn)變?yōu)锳sp；Gly轉(zhuǎn)變?yōu)锳la或轉(zhuǎn)變?yōu)镻ro；His轉(zhuǎn)變?yōu)锳sn或轉(zhuǎn)變?yōu)镚ln；Ile轉(zhuǎn)變?yōu)長eu或轉(zhuǎn)變?yōu)閂al；Leu轉(zhuǎn)變?yōu)镮le或轉(zhuǎn)變?yōu)閂al；Lys轉(zhuǎn)變?yōu)锳rg、轉(zhuǎn)變?yōu)镚ln或轉(zhuǎn)變?yōu)镚lu；Met轉(zhuǎn)變?yōu)長eu、轉(zhuǎn)變?yōu)門yr或轉(zhuǎn)變?yōu)镮le；Phe轉(zhuǎn)變?yōu)镸et、轉(zhuǎn)變?yōu)長eu或轉(zhuǎn)變?yōu)門yr；Ser轉(zhuǎn)變?yōu)門hr；Thr轉(zhuǎn)變?yōu)镾er；Trp轉(zhuǎn)變?yōu)門yr；Tyr轉(zhuǎn)變?yōu)門rp；和/或Phe轉(zhuǎn)變?yōu)閂al、轉(zhuǎn)變?yōu)镮le或轉(zhuǎn)變?yōu)長eu。本文所使用的“域”通常是指抗體鏈的球狀區(qū)域，特別是指重鏈抗體的球狀區(qū)域，或指基本上由這樣的球狀區(qū)域組成的多肽。sdAb的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)通常由四個(gè)框架區(qū)或“FR”組成，其被稱為“框架區(qū)1”或“FR1”；“框架區(qū)2”或“FR2”；“框架區(qū)3”或“FR3；和“框架區(qū)4”或“FR4”?？蚣軈^(qū)被分別稱為“互補(bǔ)決定區(qū)1”或“CDR1”；“互補(bǔ)決定區(qū)2”或“CDR2”；和“互補(bǔ)決定區(qū)3”或“CDR3”的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)或“CDR”所中斷。如本文使用的術(shù)語“人源化sdAb”是指在天然存在的VHH序列的氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被來自人的常規(guī)4-鏈抗體的VH域中相應(yīng)位置處存在的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基替代的sdAb。其可以通過本領(lǐng)域眾所周知的方法進(jìn)行。例如，sdAb的FR可以由人可變FR替代。如本文使用的“分離的”核酸或氨基酸已經(jīng)與通常與其結(jié)合的至少一種其他組分分離，所述其他組分諸如其來源或介質(zhì)、另一種核酸、另一種蛋白質(zhì)/多肽、另一種生物學(xué)組分或大分子或污染物、雜質(zhì)或次要組分。術(shù)語“哺乳動物”被定義為屬于哺乳綱的個(gè)體，其包括但不限于，人類、家畜和農(nóng)場動物、以及動物園、運(yùn)動和寵物動物，例如牛、馬、綿羊、狗和貓。如本文使用的“藥學(xué)上可接受的載體”旨在包括與藥物施用相容的任何和全部溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。合適的載體在最新版本的Remington'sPharmaceuticalSciences中描述，其為本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)。這種載體或稀釋劑的優(yōu)選實(shí)例包括但不限于，水、鹽水、林格氏溶液、葡萄糖溶液、PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)、和5％人血清白蛋白。還可以使用脂質(zhì)體、陽離子脂質(zhì)和非水性載劑，例如不揮發(fā)油。所述介質(zhì)和試劑用于藥物活性物質(zhì)的應(yīng)用是本領(lǐng)域眾所周知的。除非任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與如上定義的治療劑不相容，否則考慮將其用于本發(fā)明的組合物中。“定量免疫測定”是指通過使用抗體測量樣品中存在的抗原的量的任何方法。進(jìn)行定量免疫測定的方法包括但不限于，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、特異性分析物標(biāo)記和再捕獲測定(SALRA)、液相色譜、質(zhì)譜法、熒光激活細(xì)胞分選等。術(shù)語“溶液”是指包含溶劑和溶質(zhì)的組合物，并且包括真溶液和懸浮液。溶液的實(shí)例包括溶解在液體中的固體、液體或氣體和懸浮在液體中的顆?；蚰z束。術(shù)語“特異性”是指特定抗原結(jié)合分子或抗原結(jié)合蛋白分子可以結(jié)合的不同類型的抗原或抗原決定簇的數(shù)目?？乖Y(jié)合蛋白的特異性可以基于親和性和/或親和力來確定。由抗原與抗原結(jié)合蛋白(KD)的解離的平衡常數(shù)表示的親和性是抗原決定簇與抗原結(jié)合蛋白上的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間的結(jié)合強(qiáng)度的量度：KD值越小，抗原決定簇與抗原結(jié)合分子之間的結(jié)合強(qiáng)度越強(qiáng)(或者說，親和性也可以表達(dá)為親和常數(shù)(KA)，其為1/KD)。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將會是清楚的是，可以根據(jù)感興趣的特異性抗原確定親和性。親和力是抗原結(jié)合分子和抗原之間的結(jié)合強(qiáng)度的量度。親和力與抗原決定簇及其抗原結(jié)合分子上的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間的親和性以及抗原結(jié)合分子上存在的相關(guān)結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目有關(guān)?？乖Y(jié)合蛋白與抗原或抗原決定簇的特異性結(jié)合可以通過任何已知的方式測定，諸如Scatchard分析和/或競爭性結(jié)合測定，例如放射免疫測定(RIA)、酶免疫測定(EIA)和夾心競爭測定。如本文使用的術(shù)語“重組”是指使用遺傳工程方法(例如，克隆和擴(kuò)增)來產(chǎn)生本發(fā)明的sdAb?！皢斡蚩贵w”、“sdAb”或“VHH”通常可被定義為包含由被三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)中斷的四個(gè)框架區(qū)組成的氨基酸序列的多肽或蛋白質(zhì)。其以FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4表示。本發(fā)明的sdAb還包括含sdAb氨基酸序列的多肽或蛋白質(zhì)。通常，sdAb在諸如美洲駝等駱駝科中產(chǎn)生，但也可以使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)合成產(chǎn)生。如本文使用的，于天然存在的重鏈抗體中存在的可變域也將被稱為“VHH域”，以將其與存在于常規(guī)4鏈抗體中的被稱為“VH域”的重鏈可變域，及與存在于常規(guī)4鏈抗體中的被稱為“VL域”的輕鏈可變域區(qū)分開?！癡HH”和“sdAb”在本文中可互換使用。sdAb或多肽的氨基酸殘基的編號依照由Kabat等人(“Sequenceofproteinsofimmunologicalinterest，”USPublicHealthServices，NIHBethesda，MD，出版號91)給出的VH域的一般編號方式。根據(jù)該編號，sdAb的FR1包含位置1-30的氨基酸殘基，sdAb的CDR1包含位置31-36的氨基酸殘基，sdAb的FR2包含位置36-49的氨基酸，sdAb的CDR2包含位置50-65的氨基酸殘基，sdAb的FR3包含位置66-94的氨基酸殘基，sdAb的CDR3包含位置95-102的氨基酸殘基，且sdAb的FR4包含位置103-113的氨基酸殘基。術(shù)語“合成的”是指通過體外化學(xué)或酶促合成產(chǎn)生。如本文所用的術(shù)語“靶標(biāo)”是指被sdAb識別的任何組分、抗原或部分。術(shù)語“細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)”是指存在于細(xì)胞內(nèi)的任何組分、抗原或部分?！翱缒ぐ袠?biāo)”是位于細(xì)胞膜內(nèi)的組分、抗原或部分?！凹?xì)胞外靶標(biāo)”是指位于細(xì)胞外的組分、抗原或部分。如本文使用的“治療組合物”是指旨在具有治療效果的物質(zhì)，例如藥物組合物、遺傳物質(zhì)、生物制劑和其他物質(zhì)。遺傳物質(zhì)包括旨在具有直接或間接遺傳治療效果的物質(zhì)，例如遺傳載體、遺傳調(diào)節(jié)元件、遺傳結(jié)構(gòu)元件、DNA、RNA等。生物制品包括是活物質(zhì)或來源于旨在具有治療效果的活物質(zhì)。如本文使用的短語“治療有效量”和“預(yù)防有效量”是指在疾病或疾病的明顯癥狀的治療、預(yù)防或控制中提供治療益處的量。治療有效量可以治療疾病或病癥、疾病癥狀、或?qū)膊〉膬A向，其目的是治療、治愈、緩解、減輕、改變、補(bǔ)救、改良、改善或影響疾病、疾病的癥狀、或疾病的傾向。治療有效的具體量可以由普通醫(yī)生容易地確定，并且可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的因素而變化，例如疾病類型、患者的病史和年齡、疾病的階段、以及其他治療劑的施用。本發(fā)明涉及針對細(xì)胞內(nèi)組分的單域抗體(sdAb)，以及包含所述sdAb的蛋白質(zhì)和多肽，和編碼所述蛋白質(zhì)和多肽的核苷酸。本發(fā)明還涉及針對細(xì)胞間、跨細(xì)胞和細(xì)胞外靶標(biāo)或抗原的sdAb。本發(fā)明還包括編碼sdAb、蛋白質(zhì)和多肽的核酸、和包含sdAb的組合物。本發(fā)明包括用于預(yù)防、治療或診斷目的的組合物、sdAb、蛋白質(zhì)或多肽的應(yīng)用。sdAb具有許多獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征和功能特性，使得sdAb高度有利于用作功能性抗原結(jié)合域或蛋白質(zhì)。sdAb在不存在輕鏈可變域的情況下功能性結(jié)合抗原，并且可以作為單個(gè)相對小的功能性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)單元、域或蛋白質(zhì)。這將sdAb與常規(guī)抗體的域區(qū)分開，所述常規(guī)抗體本身不用作抗原結(jié)合蛋白或域，而需要與諸如Fab片段或ScFv's片段等常規(guī)抗體片段組合以結(jié)合抗原。sdAb可以使用本領(lǐng)域眾所周知的方法獲得。例如，獲得sdAb的一種方法包括(a)用一種或多種抗原免疫駱駝科動物，(b)從被免疫的駱駝科動物中分離外周淋巴細(xì)胞，獲得總RNA并合成相應(yīng)的cDNA，(c)構(gòu)建編碼VHH域的cDNA片段的文庫，(d)使用PCR將步驟(c)中獲得的編碼VHH域的cDNA轉(zhuǎn)錄至mRNA，將mRNA轉(zhuǎn)化為核糖體展示形式，并通過核糖體展示選擇VHH域，和(e)在合適的載體中表達(dá)VHH域，可選地，純化表達(dá)的VHH域。獲得本發(fā)明的sdAb的另一種方法是使用用于核酸合成的技術(shù)制備編碼sdAb的核酸，隨后在體內(nèi)或體外表達(dá)該核酸。作為另一種選擇，本發(fā)明的sdAb、多肽和蛋白質(zhì)可以使用用于制備蛋白質(zhì)、多肽或其他氨基酸序列的合成或半合成技術(shù)來制備。本發(fā)明的sdAb通常會結(jié)合靶標(biāo)的所有天然存在的或合成的類似物、變體、突變體、等位基因、部分和片段，或至少結(jié)合含有與本發(fā)明的sdAb在野生型靶標(biāo)中結(jié)合的抗原決定簇或表位基本上相同的一個(gè)或多個(gè)抗原決定簇或表位的靶標(biāo)的類似物、變體、突變體、等位基因、部分和片段靶標(biāo)。本發(fā)明的sdAb可以以與本發(fā)明的sdAb結(jié)合至野生型靶標(biāo)具有的親和性和特異性相同、或者更高或更低的親和性和/或特異性結(jié)合所述類似物、變體、突變體、等位基因、部分和片段。還在本發(fā)明的范圍內(nèi)考慮本發(fā)明的sdAb結(jié)合靶標(biāo)的某些類似物、變體、突變體、等位基因、部分和片段，但不結(jié)合其他。此外，本發(fā)明的sdAb可以是人源化的，并且可以是單價(jià)或多價(jià)的，和/或多特異性的。此外，本發(fā)明的sdAb可以結(jié)合靶標(biāo)蛋白質(zhì)的磷酸化形式以及靶標(biāo)蛋白質(zhì)的非磷酸化形式。sdAb可以連接到其他分子，例如白蛋白或其他大分子。此外，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，sdAb是多價(jià)的，即sdAb可以具有針對兩個(gè)以上不同靶標(biāo)表位的兩個(gè)以上蛋白質(zhì)或多肽。在這樣的多價(jià)sdAb中，蛋白質(zhì)或多肽可以例如針對相同的表位、基本上等價(jià)的表位、或不同的表位。不同的表位可以位于相同的靶標(biāo)上，或者它可以位于兩個(gè)以上不同的靶標(biāo)上。還預(yù)期本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)sdAb的序列可以與一個(gè)或多個(gè)接頭序列連接或接合。接頭可以例如是含有絲氨酸、甘氨酸和丙氨酸的組合的蛋白質(zhì)序列。應(yīng)用本發(fā)明的sdAb的部分、片段、類似物、突變體、變體、等位基因和/或衍生物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要它們適合于所述的應(yīng)用。因?yàn)楸景l(fā)明的sdAb主要用于治療和/或診斷應(yīng)用，所以它們針對哺乳動物，優(yōu)選人類靶標(biāo)。然而，本文所述的sdAb可能與來自其他物種的靶標(biāo)交叉反應(yīng)，例如與來自一個(gè)或多個(gè)其他物種的靈長類動物或其他動物(例如小鼠、大鼠、兔、豬或狗)的靶標(biāo)交叉反應(yīng)，特別是在與靶標(biāo)相關(guān)的疾病相關(guān)的動物疾病和病癥模型中。另一方面，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明的sdAb的核酸。這樣的核酸可以例如是遺傳構(gòu)建體的形式。另一方面，本發(fā)明涉及表達(dá)或能夠表達(dá)本發(fā)明的sdAb，和/或含有編碼本發(fā)明的sdAb的核酸的宿主或宿主細(xì)胞。sdAb的序列可用于插入任何生物體的基因組，以產(chǎn)生經(jīng)遺傳修飾的生物體(GMO)。其實(shí)例包括但不限于，植物、細(xì)菌、病毒和動物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于制備或產(chǎn)生sdAb、編碼sdAb的核酸、表達(dá)或能夠表達(dá)這種sdAb的宿主細(xì)胞、含有本發(fā)明的sdAb的產(chǎn)品和組合物的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及本文所述的sdAb、編碼sdAb的核酸、宿主細(xì)胞、產(chǎn)品和組合物的應(yīng)用和用途。所述產(chǎn)品或組合物可以例如是用于治療或預(yù)防疾病的藥物組合物，或者用于診斷應(yīng)用的產(chǎn)品或組合物。sdAb可用于多種測定，例如ELISA測定和質(zhì)譜測定，以測量sdAb的血清和組織水平。另一方面，可以將編碼本發(fā)明的一種或多種sdAb的核酸插入生物體的基因組中以治療或預(yù)防疾病。本發(fā)明通常涉及sdAb，以及包含或基本上由一種或多種所述sdAb組成的蛋白質(zhì)或多肽，其可用于預(yù)防、治療和/或診斷目的。在本發(fā)明中詳述的方法和組合物可用于治療本文所述的疾病，并且可以以本文所述或以其他已知的任何劑量和/或制劑，以及以本文所述的或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他任何施用途徑進(jìn)行使用。本發(fā)明的sdAb，特別是本發(fā)明的抗STAT3VHH、抗KRASVHH、和抗TNF-αVHH可用于治療和預(yù)防惡性疾病，其包括但不限于：多發(fā)性骨髓瘤、白血病(HTLV-1依賴性、紅白血病、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)和大顆粒淋巴細(xì)胞性白血病(LGL))、淋巴瘤(EBV相關(guān)/伯基特氏病、蕈樣真菌病、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL))、乳腺癌、三陰性乳腺癌、頭頸癌、黑素瘤、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、骨肉瘤、卡波西氏肉瘤、尤文氏肉瘤、肝細(xì)胞癌、膠質(zhì)瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、結(jié)腸直腸癌、Wilm's腫瘤、腎癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、食道癌、皮膚鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、和任何轉(zhuǎn)移性癌癥。sdAb可用于癌癥患者以幫助預(yù)防或減輕由于癌癥引起的體重減輕或惡病體質(zhì)。本發(fā)明的sdAb，特別是抗STAT-3和抗TNF-αsdAb也可用于治療和預(yù)防疾病，例如但不限于：自身免疫性疾病(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏病、細(xì)菌性結(jié)腸炎、哮喘、硬皮病、狼瘡、腦脊髓炎、動脈炎、血管炎、腎小球腎炎、葡萄膜炎、葡萄膜視網(wǎng)膜炎、多發(fā)性硬化)、多囊性腎病、皮膚病(例如牛皮癬、斑禿、特應(yīng)性皮炎、瘢痕疙瘩/增生性瘢痕、脂肪瘤、佩吉特氏病、和光化性角化病)、化膿性汗腺炎、移植(例如實(shí)體器官、骨髓、手、面部、四肢、任何身體部位)、與癌癥和衰老相關(guān)的肌營養(yǎng)不良和肌肉萎縮、子宮內(nèi)膜異位、黃斑變性、視網(wǎng)膜變性、中風(fēng)、癲癇、創(chuàng)傷性腦和脊髓損傷、高血壓、心臟肥大、阿爾茨海默病、肺動脈高血壓、2型糖尿病、和強(qiáng)直性脊柱炎。此外，sdAb可以針對孤兒疾病。這些罕見孤兒疾病的實(shí)例包括但不限于，三陰性乳腺癌、胰腺癌、AML(急性粒細(xì)胞性白血病)、頭頸癌、多發(fā)性骨髓瘤和化療耐藥性癌癥?？梢酝ㄟ^靶向感染細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)病毒蛋白來治療病毒感染。諸如HIV逆轉(zhuǎn)錄酶等病毒蛋白可以阻斷病毒的生命周期。本發(fā)明的sdAb還可以靶向諸如埃博拉VP24等細(xì)胞內(nèi)病毒蛋白，從而阻斷埃博拉關(guān)閉宿主抗病毒免疫應(yīng)答的能力。本發(fā)明的sdAb可用于靶向存在細(xì)胞內(nèi)分子的過表達(dá)的疾病?？梢杂胹dAb治療亨廷頓氏病。本發(fā)明的sdAb可以與一種或多種化合物一起使用。例如，本發(fā)明的sdAb可以與JAK/STAT抑制劑一起使用，例如姜黃素、白藜蘆醇、葫蘆素A、葫蘆素B、葫蘆素E、葫蘆素I、葫蘆素Q、黃酮吡啶醇、脫氧秋蘭霉素、環(huán)戊烯酮衍生物、N-?；呓z氨酸內(nèi)酯、靛玉紅衍生物、甲異靛、酪氨酸磷酸化抑制劑(Tyrphostins)、含鉑化合物(例如IS3-295)、肽模擬物、反義寡核苷酸、S3I-201、磷酸酪氨酸三肽衍生物、HIV蛋白酶抑制劑(例如奈非那韋、茚地那韋、沙奎那韋、和利托那韋)、JSI-124、XpYL、Ac-pYLPQTV-NH2、ISS610、CJ-1383、乙胺嘧啶、二甲雙胍、阿米莫德、S3I-M2001、STX-0119；N-[2-(1,3,4-噁二唑基)]-4喹啉甲酰胺衍生物、S3I-1757、LY5；5,8-二氧代-6(吡啶-3-基氨基)-5,8-二氫-萘-1-磺酰胺、阿那白霉素(withacinstin)、司泰替(Stattic)、STA-21、LLL-3、LLL12、XZH-5、SF-1066、SF-1087、17o、隱丹參酮、FLL32、FLL62、C188-9、BP-1108和BP-1075、肉盤菌內(nèi)酯、JQ1,5,15DPP、WP1066、氯硝柳胺、SD1008、硝呋酚酰肼、隱丹參酮、BBI醌和Ruxolitnib磷酸鹽。所述一種或多種化合物可以增加治療反應(yīng)并增大本發(fā)明的sdAb的有效性。此外，可以通過將與肽、肽模擬物和其他藥物(例如但不限于，西咪替丁、阿托伐他汀、塞來昔布、二甲雙胍和西咪替丁)組合來提高sdAb的有效性。此外，對于放射治療，抗STAT3sdAb可將放射抗性癌癥轉(zhuǎn)化為放射敏感性癌癥。還預(yù)期本發(fā)明的一種或多種sdAb可以組合，或本發(fā)明的sdAb可以與其他sdAb組合。預(yù)期本發(fā)明的某些sdAb可以穿過細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而不需要sdAb上的額外靶向蛋白序列的輔助，并且不需要指導(dǎo)sdAb結(jié)合細(xì)胞表面受體和跨細(xì)胞膜的外源化合物的輔助。在穿過細(xì)胞膜后，這些sdAb可靶向跨膜或細(xì)胞內(nèi)分子或抗原。這些細(xì)胞內(nèi)或跨膜靶標(biāo)可以例如是蛋白質(zhì)、糖、脂質(zhì)、核酸、突變蛋白、病毒蛋白和朊病毒。sdAb靶標(biāo)可以作為酶、細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白、細(xì)胞膜分子的細(xì)胞內(nèi)部分、細(xì)胞器膜內(nèi)的分子、任何類型的RNA分子、DNA或染色體的任何區(qū)域、甲基化或非甲基化核酸、在細(xì)胞的合成機(jī)制中部分組裝的分子、第二信使分子、和細(xì)胞信號機(jī)制內(nèi)的分子。靶標(biāo)可以包括細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞器、和細(xì)胞膜中的所有分子。用于分泌或放置在細(xì)胞膜中的分子可以在離開細(xì)胞之前在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)被靶向。sdAb靶標(biāo)可以在人類、動物、植物、真菌、寄生蟲、原生生物、細(xì)菌、病毒、朊病毒、原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中?？捎杀景l(fā)明的sdAb靶向的細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)信號分子和蛋白質(zhì)基團(tuán)的一些實(shí)例是：癌基因產(chǎn)物、激素、細(xì)胞因子、生長因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激酶(包括酪氨酸激酶、絲氨酸激酶、和蘇氨酸激酶)、磷酸酶、泛素、環(huán)核苷酸、環(huán)化酶(腺苷?；网B嘌呤基)、G蛋白、磷酸二酯酶、GTP酶超家族、免疫球蛋白(抗體、Fab片段、結(jié)合劑、sdAb)、免疫球蛋白超家族、肌醇磷酸脂質(zhì)、類固醇受體、鈣調(diào)蛋白、CD組(CD4、CD8、CD28等)、轉(zhuǎn)錄因子、TGF-β、TNF-α和β、TNF配體超家族、缺刻(notch)受體信號分子、hedgehog受體信號分子、Wnt受體信號分子、toll樣受體信號分子、胱天蛋白酶(caspase)、肌動蛋白、肌球蛋白、肌肉生長抑制素、12-脂肪氧化酶、15-脂氧合酶、脂氧合酶超家族、逆轉(zhuǎn)錄酶、病毒及其蛋白質(zhì)、淀粉樣蛋白、膠原、G蛋白偶聯(lián)受體、突變的正常蛋白、朊病毒、Ras、Raf、Myc、Src、BCR/ABL、MEK、Erk、Mos、Tpl2、MLK3、TAK、DLK、MKK、p38、MAPK、MEKK、ASK、SAPK、JNK、BMK、MAP、JAK、PI3K、環(huán)氧合酶、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、Myc、p53、BRAF、NRAS、KRAS、HRAS和趨化因子。KRAS是來自哺乳動物ras基因家族的Kirstenras癌基因同源物。KRAS編碼作為小GTP酶超家族成員的蛋白質(zhì)。該蛋白參與到包括肺腺癌、粘液腺瘤、胰腺導(dǎo)管癌、和結(jié)腸直腸癌的各種惡性腫瘤中。在正常條件下，Ras家族成員在亞細(xì)胞膜區(qū)室化信號系統(tǒng)中影響細(xì)胞的生長和分化事件。然而，致癌Ras可以解除控制細(xì)胞增殖和凋亡的過程。開發(fā)靶向野生型和突變KRAS(G12D)的抗KRASsdAb，是為了破壞其在惡性細(xì)胞中的作用，所述惡性細(xì)胞例如是參與到結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、膽道癌、肺癌、白血病、和其他轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤中的細(xì)胞。不受特定機(jī)制的限制，認(rèn)為抗KRASsdAb在惡性細(xì)胞中結(jié)合KRAS并阻斷KRAS的下游信號傳導(dǎo)。另外，抗KRASsdAb可以成功治療對抗EGFR生物制劑(例如西妥昔單抗和帕尼單抗)有抗性的惡性腫瘤。使用本領(lǐng)域眾所周知的方法，使用重組人突變體KRAS(G12D)蛋白產(chǎn)生針對或可以結(jié)合KRAS或突變體KRAS(G12D)或其他KRAS突變體的表位的sdAb。此外，可以產(chǎn)生針對其他KRAS突變體的sdAb。為了產(chǎn)生抗KRASsdAb，在大腸桿菌中表達(dá)重組全長人KRAS(基因ID：3845)。獲得并篩選幾種sdAb。一種命名為KRAS_13的抗KRAS(G12D)sdAb的DNA序(SEQIDNO:1)列如下所示：5’Gaggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcagactggagggtctctgagactctcctgtgcagtttctggaaatatcggcagcagctactgcatgggctggttccgccaggctccagggaagaagcgcgaggcggtcgcacgtattgtacgtgatggtgccactggctacgcagactacgtgaagggccgattcaccatctcccgagacagcgccaagaacactctgtatctgcaaatgaacaggctgatacctgaggacactgccatctactactgtgcggcagacctgcccccaggttgtttgactcaggcgatttggaattttggttatcggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca-3’KRAS_13的抗KRAS(G12D)sdAb的氨基酸序列(SEQIDNO.2)如下所示，CDR用下劃線表示：EVQLVESGGGSVQTGGSLRLSCAVSGNIGSSYCMGWFRQAPGKKREAVARIVRDGATGYADYVKGRFTISRDSAKNTLYLQMNRLIPEDTAIYYCAADLPPGCLTQAIWNFGYRGQGTLVTVSS此外，本發(fā)明包括一種或多種針對本發(fā)明的抗KRASsdAb的一個(gè)或多個(gè)域的小鼠單克隆抗體。小鼠單克隆抗體可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法產(chǎn)生，例如，小鼠單克隆抗體可以通過小鼠雜交瘤產(chǎn)生。小鼠單克隆抗體可用于診斷測定，例如，該抗體可用于諸如ELISA或質(zhì)譜測定等免疫測定，以測量患者血清中存在的抗KRASsdAb的量。如下所述測試KRAS(G12D)sdAb對PANC-1人胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性。STAT3是攜帶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄功能激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物和轉(zhuǎn)錄激活物(STAT)的蛋白家族成員。STAT3廣泛表達(dá)，并響應(yīng)于諸如EGF、IL-6、PDGF、IL-2和G-CSF等各種細(xì)胞因子和生長因子通過作為DNA結(jié)合蛋白的酪氨酸和/或絲氨酸的磷酸化而被激活。STAT3磷蛋白形成同源二聚體或與STAT家族的其他成員形成異源二聚體，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核以調(diào)節(jié)各種基因的轉(zhuǎn)錄，并且因此在許多細(xì)胞過程中起關(guān)鍵作用，例如細(xì)胞生長、細(xì)胞凋亡、血管生成、免疫逃避和存活。可以將抗STAT3sdAb給予患者和其他生物體以治療由磷酸化和非磷酸化的STAT3引起的疾病，以及預(yù)防疾病的發(fā)展或疾病的復(fù)發(fā)。例如，由于其所服用的免疫抑制藥物，經(jīng)歷器官移植和骨髓移植的患者具有更高的皮膚SCCA和BCCA的風(fēng)險(xiǎn)。施用抗STAT3sdAb可以降低或消除這種風(fēng)險(xiǎn)。對于具有復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的惡性腫瘤治療的患者將受益于抗STAT3sdAb的治療?；诩易宀∈泛虷LA型，某些個(gè)體將面臨某些類型的自身免疫性疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加，并且可以受益于sdAb的治療，以降低發(fā)展該自身免疫性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。如在最近的NCI研究中所證實(shí)的，可以通過施用諸如GLG-302等抗STAT3藥物來降低乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)。除了抑制STAT3，由于這些分子之間的高度同源性，抗STAT3sdAb還可以抑制STAT1、STAT2、STAT4、STAT5a、STAT5b、和STAT6。使用重組人STAT3蛋白來產(chǎn)生針對STAT3的表位的或可以結(jié)合STAT3的表位的抗STATsdAb。為了產(chǎn)生抗STAT3sdAb，在Sf9昆蟲細(xì)胞中通過桿狀病毒表達(dá)重組全長人STAT3(基因ID：6774)。將抗STATsdAb克隆到可在細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的載體中，如圖1和圖2所示。本發(fā)明的抗STAT3sdAb可用于靶向細(xì)胞內(nèi)的STAT3和所有其他STAT分子，以抑制細(xì)胞生長，例如抑制癌細(xì)胞生長。此外，抗STAT3sdAb可在諸如銀屑病和經(jīng)由VEGF的黃斑變性等其他增殖性疾病中抑制細(xì)胞生長。不受特定作用機(jī)制的限制，認(rèn)為抗STAT3sdAb可通過降低抗原呈遞細(xì)胞(例如宿主樹突細(xì)胞)中的STAT3水平來消除癌癥誘導(dǎo)的免疫抑制。STAT3抑制促進(jìn)患者的先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)(即樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞、和B細(xì)胞)的抗癌反應(yīng)。如下所述，使用本領(lǐng)域眾所周知的方法，獲得幾種抗STATsdAb，并篩選其在癌細(xì)胞系中抑制癌細(xì)胞生長和誘導(dǎo)凋亡的能力。測試抗STAT3sdAb的細(xì)胞毒性和抗增殖活性。此外，在體外和體內(nèi)測試抗STAT3sdAb的耐受性。下面描述了針對抗STATsdAb的一個(gè)或多個(gè)域的小鼠單克隆抗體的產(chǎn)生。命名為VHH13的一種抗STAT3sdAb的氨基酸序列(SEQIDNO.3)如下所示：HVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSGISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSRFDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTQVTVSS用下劃線表示了三個(gè)CDR。命名為VHH14的第二種抗STAT3sdAb的氨基酸序列(SEQIDNO.4)如下所示：QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCVASTYTGCMGWFRQAPGKEREGVAALSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAAREGWECGETWLDRTAGGHTYWGQGTLVTVSS用下劃線表示了三個(gè)CDR。獲得的其他抗STAT3sdAb的蛋白質(zhì)序列如下：STAT3_10(SEQIDNO.5):(1)DVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCVASTYTGCMGWFRQAPGKEREGVAA(48)LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE(98)GWECGETWLDRTAGGHTYWGQGTQVTVSSSTAT3_34(SEQIDNO.6):(1)DVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCVASTYTGCMGWFRQAPGKEREGVAA(48)LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE(98)GWECGETWLDRTAGGHTYWGQGTQVTVSSSTAT3_19(SEQIDNO.7):(1)HVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCVASTYTGCMGWFRQAPGKEREGVAA(48)LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE(98)GWECGETWLDRTAGGHTYWGQGTQVTVSSSTAT3_14(SEQIDNO.8):(1)QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCVASTYTGCMGWFRQAPGKEREGVAA(48)LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE(98)GWECGETWLDRTAGGHTYWGQGTLVTVSSSTAT3_35(SEQIDNO.9):(1)QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCVASTYTGCMGWFRQAPGKEREGVAA(48)LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE(98)GWECGETWLDRTAGGHTYWGQGTLVTVSSSTAT3_9(SEQIDNO.10):(1)QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCVASTYTGCMGWFRQAPGKEREGVAA(48)LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE(98)GWECGETWLDRTAGGHTYWGQGTLVTVSSSTAT3_30(SEQIDNO.11):(1)QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCVASTYTGCMGWFRQAPGKEREGVAA(48)LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE(98)GWECGETWLDRTAGGHTYWGQGTLVTVSSSTAT3_23(SEQIDNO.12):(1)QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCVASTYTGCMGWFRQAPGKEREGVAA(48)LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE(98)GWECGETWLDRTAGSHTYWGQGTLVTVSSSTAT3_24(SEQIDNO.13):(1)EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCVASTYTGCMGWFRQAPGKEREGVAA(48)LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE(98)GWECGETWLDRTAGGHTYWGQGTLVTVSSSTAT3_36(SEQIDNO.14):(1)DVQLVESGGGSVQAGDSLRLSCVASTYTGCMGWFRQAPGKEREGVAA(48)LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE(98)GWECGETWLDRTAGGHTYWGQGTLVTVSSSTAT3_12(SEQIDNO.15):(1)QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG(51)ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR(101)FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTLVTVSSSTAT3_16(SEQIDNO.16):(1)QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG(51)ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTNNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR(101)FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTLVTVSSSTAT3_11(SEQIDNO.17):(1)EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG(51)ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR(101)FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTLVTVSSSTAT3_20(SEQIDNO.18):(1)DVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG(51)ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR(101)FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTLVTVSSSTAT3_2(SEQIDNO.19):(1)DVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG(51)ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR(101)FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTLVTVSSSTAT3_15(SEQIDNO.20):(1)DVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG(51)ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR(101)FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTLVTVSSSTAT3_6(SEQIDNO.21):(1)HVQLVESEGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG(51)ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR(101)FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTLVTVSSSTAT3_33(SEQIDNO.22):(1)QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG(51)ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR(101)FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTQVTVSSSTAT3_17(SEQIDNO.23):(1)QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG(51)ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR(101)FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTQVTVSSSTAT3_25(SEQIDNO.24):(1)EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG(51)ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMSSLKPEDTAMYYCATSR(101)FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTQVTVSSSTAT3_32(SEQIDNO.25):(1)DVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG(51)ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR(101)FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTQVTVSSSTAT3_13(SEQIDNO.26):(1)HVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG(51)ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR(101)FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTQVTVSSSTAT3_39(SEQIDNO.27):(1)HVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG(51)ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR(101)FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTQVTVSSSTAT3_4(SEQIDNO.28):(1)HVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG(51)ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR(101)FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTQVTVSSSTAT3_29(SEQIDNO.29):(1)HVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG(51)ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR(101)FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTQVTVSS相應(yīng)的抗STAT3DNA序列如下：Stat3_VHH-10(SEQIDNO.30):5’-gatgtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggaggctctctgagactctcctgtgtagcctctacatacaccggctgcatgggctggttccgccaggctcctggaaaggagcgcgagggagtcgcagctcttagtagccgtggttttgccgggcactataccgactccgtgaagggccgattctccatctcccgagactacgtcaagaatgcggtgtatctgcaaatgaacactgtgaaacctgaggacgctgccatgtactactgtgcagcacgggagggatgggagtgcggtgagacctggttggaccggaccgccgggggccatacctactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca-3’Stat3_VHH-14(SEQIDNO.31):5’-caggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggaggctctctgagactctcctgtgtagcctctacatacaccggctgcatgggctggttccgccaggctcctggaaaggagcgcgagggagtcgcagctcttagtagccgtggttttgccgggcactataccgactccgtgaagggccgattctccatctcccgagactacgtcaagaatgcggtgtatctgcaaatgaacactgtgaaacctgaggacgctgccatgtactactgtgcagcacgggagggatgggagtgcggtgagacctggttggaccggaccgccgggggccatacctactggggccaggggaccctggtcaccgtctcctca-3‘Stat3_VHH-12(SEQIDNO.32):5’-caggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcctgtgcagcctctggagccaatggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttccagggaaggagcgcgagggggtttctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacaccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttggttcaaccgatatatgtataacagttggggccaggggaccctggtcaccgtctcctca-3‘Stat3_VHH-13(SEQIDNO.33):5’-catgtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcctgtgcagcctctggagccaacggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttccagggaaggagcgcgagggggtttctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacaccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttggttcaaccgatatatgtataacagttggggccaggggacccaggtcactgtctcctca-3‘Stat3_VHH-20(SEQIDNO.34):5’-gatgtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcctgtgcagcctctggagccaatggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttccagggaaggagcgcgagggggtttctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacaccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttggttcaaccgatatatgtataacagttggggccaggggaccctggtcaccgtctcctca-3’Stat3_VHH-23(SEQIDNO.35):5’-caggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggaggctctctgagactctcctgtgtagcctctacatacaccggctgcatgggctggttccgccaggctcctggaaaggagcgcgagggagtcgcagctcttagcagccgtggttttgccgggcactataccgactccgtgaagggccgattctccatctcccgagactacgtcaagaatgcggtgtatctgcaaatgaacactgtgaaacctgaggacgctgccatgtactactgtgcagcacgggagggatgggagtgcggtgagacctggttggaccggaccgccgggagccatacctactggggccaggggaccctggtcaccgtctcctca-3‘Stat3_VHH-24(SEQIDNO.36):5’-gaggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggaggctctctgagactctcctgtgtagcctctacatacaccggctgcatgggctggttccgccaggctcctggaaaggagcgcgagggagtcgcagctcttagtagccgtggttttgccgggcactataccgactccgtgaagggccgattctccatctcccgagactacgtcaagaatgcggtgtatctgcaaatgaacactgtgaaacctgaggacgctgccatgtactactgtgcagcacgggagggatgggagtgcggtgagacctggttggaccgaaccgccgggggccatacctactggggccaggggaccctggtcaccgtctcctca-3‘Stat3_VHH-25(SEQIDNO.37):5’-gaggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcctgtgcagcctctggagccaatggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttccagggaaggagcgcgagggggtttctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggtcgattcaccatctcccaagacaacaccaagaacacgctgtatctgcaaatgagcagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttggttcaaccgatatatgtataacagttggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca-3’Stat3_VHH-19(SEQIDNO.38):5’-catgtgcagctggtggagtctggggggggctcggtgcaggctggaggctctctgagactctcctgtgtagcctctacatacaccggctgcatgggctggttccgccaggctcctggaaaggagcgcgagggagtcgcagctcttagtagccgtggttttgccgggcactataccgactccgtgaagggccgattctccatctcccgagactacgtcaagaatgcggtgtatctgcaaatgaacactgtgaaacctgaggacgctgccatgtactactgtgcagcacgggagggatgggagtgcggtgagacctggttggaccggaccgccgggggccatacctactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca-3‘Stat3_VHH-32(SEQIDNO.39):5’-gatgtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcctgtgcagcctctggagccaatggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttccagggaaggagcgcgagggggtttctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacaccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttggttcaaccgatatatgtataacagttggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca-3’Stat3_VHH-33(SEQIDNO.40):5’-caggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcctgtgcagcctctggagccaatggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttccagggaaggagcgcgagggggtttctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacaccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttggttcaaccgatatatgtataacagttggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca-3’Stat3_VHH-36(SEQIDNO.41):5’-gatgtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagactctctgagactctcctgtgtagcctctacatacaccggctgcatgggctggttccgccaggctcctggaaaggagcgcgagggagtcgcagctcttagtagccgtggttttgccgggcactataccgactccgtgaagggccgattctccatctcccgagactacgtcaagaatgcggtgtatctgcaaatgaacactgtgaaacctgaggacgctgccatgtactactgtgcagcacgggagggatgggagtgcggtgagacctggttggaccggaccgccgggggccatacctactggggccaggggaccctggtcactgtctcctca-3’Stat3_VHH-11(SEQIDNO.42):5’-gtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcctgtgcagcctctggagccaatggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttccagggaaggagcgtgagggggtttctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacaccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttggttcaaccgatatatgtataacagttggggccaggggaccctggtcactgtctcctca-3’Stat3_VHH-6(SEQIDNO.43):5’-gtgcagctggtggagtctgagggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcctgtgcagcctctggagccaatggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttccagggaaggagcgcgagggggtttctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacaccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttggttcaaccgatatatgtataacagttggggccaggggaccctggtcaccgtctcctca-3’Stat3_VHH-1(SEQIDNO.44):5’-gtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcctgtgcagcctctggagccaatggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttccagggaaggagcgcgagggggtttctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacaccaataacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttggttcaaccgatatatgtataacagttggggccaggggaccctggtcactgtctcctca-3’此外，本發(fā)明包括一種或多種針對本發(fā)明的抗STAT3sdAb的一個(gè)或多個(gè)域的小鼠單克隆抗體。小鼠單克隆抗體可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法產(chǎn)生，例如，小鼠單克隆抗體可以通過小鼠雜交瘤產(chǎn)生。小鼠單克隆抗體可用于診斷測定，例如，抗體可用于諸如ELISA等免疫測定，以測量患者血清中存在的抗STAT3sdAb的量。應(yīng)當(dāng)理解的是，該方法不限于抗STAT3sdAb，并且可以用于產(chǎn)生針對本發(fā)明的任何sdAb的小鼠抗體。TNF-α基因編碼屬于腫瘤壞死因子(TNF)超家族的多功能促炎細(xì)胞因子。這種細(xì)胞因子主要由巨噬細(xì)胞分泌。該細(xì)胞因子參與到調(diào)節(jié)廣譜的生物過程，其包括生長調(diào)節(jié)、分化、炎癥、病毒復(fù)制、腫瘤發(fā)生和自身免疫疾病；及調(diào)節(jié)在病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲感染中的生物過程。除了誘導(dǎo)腫瘤的出血性壞死，TNF被發(fā)現(xiàn)參與到腫瘤發(fā)生、腫瘤轉(zhuǎn)移、病毒復(fù)制、膿毒性休克、發(fā)熱、炎癥、惡病體質(zhì)、和包括克羅恩氏病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病以及移植物抗宿主病中。本發(fā)明提供針對TNF-α，特別是針對細(xì)胞或細(xì)胞膜內(nèi)的人TNF-α的sdAb、蛋白質(zhì)和多肽，以防止細(xì)胞分泌TNF-α。預(yù)期本發(fā)明的抗TNF-αsdAb和多肽可用于預(yù)防和/或治療與TNF-α相關(guān)和/或由TNF-α介導(dǎo)的疾病和病癥，例如炎癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、炎癥性腸綜合征、多發(fā)性硬化癥、阿狄森氏病、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、1型糖尿病、附睪炎、腎小球腎炎、格雷夫斯氏病、格林巴利綜合征、橋本氏病、溶血性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、男性不育癥、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、天皰瘡、牛皮癬、風(fēng)濕熱、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、硬皮病、干燥綜合征(Sjogren'ssyndrome)、脊椎關(guān)節(jié)病(spondyloarthropathy)、甲狀腺炎、血管炎、和由癌癥和惡病體質(zhì)引起的體重減輕。TNF-α以不同的形式存在；有單體和包括三聚體形式的多聚體形式。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的sdAb、蛋白質(zhì)和多肽結(jié)合不同形式(即單體形式或多聚體形式)的TNF-α。因此，當(dāng)本發(fā)明的sdAb、蛋白質(zhì)和多肽針對TNF-α?xí)r，應(yīng)當(dāng)理解的是，這也包括針對三聚體形式的TNF-α的sdAb、蛋白質(zhì)和多肽。已知TNF的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及通過TNF分子三聚體的TNF受體的交聯(lián)，其包含三個(gè)受體結(jié)合位點(diǎn)(例如參見Peppel等.，J.Exp.Med.，174(1991)，1483-1489)。使用重組人TNF-α蛋白產(chǎn)生針對或可結(jié)合TNF-α表位的sdAb。為了產(chǎn)生抗TNF-αsdAb，在大腸桿菌中表達(dá)重組全長人TNF-α(基因ID：7124)并用作靶標(biāo)抗原。獲得了針對TNF-α蛋白的35個(gè)sdAb。基于序列同源性將這些抗TNF-α抗體分成三組。命名為TNF-αVHH66sdAb的第一抗TNF-αsdAb的氨基酸序列(SEQIDNO.45)如下所示：HVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKEREGVATIDIDGLTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTAMYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRG-QGTLVTVSS用下劃線表示了三個(gè)CDR。命名為TNF-αVHH69sdAb的第二抗TNF-αsdAb的氨基酸序列(SEQIDNO.46)如下所示：EVQLVESGGGSVLAGGSLRLSCVASGFTSRYNYMAWFRQAPGKEREGVATIGTASGSADYYGSVKDRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAARTYGTISLTPSDYRYWGQGTLVTVSS用下劃線表示了三個(gè)CDR。命名為TNF-αVHH62sdAb的第三抗TNF-αsdAb的氨基酸序列(SEQIDNO.47)如下所示：QVQLVESGGGPVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECELVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSDYCSWAQGTQGTLVTVSS用下劃線表示了三個(gè)CDR。發(fā)現(xiàn)的其他抗TNF-αsdAb包括以下序列，也用加下劃線表示CDR：TNF_2(SEQIDNO.48):QVQLVESGGGSVEAGRSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKEREGVATIDIDGQTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTAMYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTQVTVSSTNF_46(SEQIDNO.49):QVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKEREGVATIDIDGQTTHADSVKGRFTISRDNVKNTLSLQMNDLKPEDTAMYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTQVTVSSTNF_71(SEQIDNO.50):QVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKEREGVATIDIDGLTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTAMYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTQVTVSSTNF_21(SEQIDNO.51):QVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKEREGVATIDIDGQTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTAMYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTQVTVSSTNF_38(SEQIDNO.52):EVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKEREGVATIDIDGQTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTAMYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTQVTVSSTNF_18(SEQIDNO.53):EVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKEREGVATIDIDGLTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTAMYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTLVTVSSTNF_37(SEQIDNO.54):DVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKEREGVATIDIDGQTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTAMYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTLVTVSSTNF_66(SEQIDNO.55):HVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKEREGVATIDIDGLTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTAMYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTLVTVSSTNF_68(SEQIDNO.56):HVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKEREGVATIDIDGLATHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTAMYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTLVTVSSTNF_78(SEQIDNO.57):HVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADRKEREGVATIDIDGQTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTAMYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTQVTVSSTNF_67(SEQIDNO.58):HVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKVREGVATIDIDGQTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTAMYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTLVTVSSTNF_6(SEQIDNO.59):QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGFIDSFGVMAWFRQAPGKEREGVAAVYRRAGDTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDSAMYYCAARTYGSVSSWTGYKYWGQGTQVTVSSTNF_7(SEQIDNO.60):DVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGFIDSFGVMAWFRQTPGKEREGVAAVYRRAGDTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDSAMYYCAARTYGSVSSWTGYKYWGQGTQVTVSSTNF_13(SEQIDNO.61):DVQLVESGGGSVQVGGSLTLSCAVSGYTDSYGVMAWFRQAPGKEREGVASIYRNSGITYYPDSVKGRFTISRDNAKNTVLLQMNSLKPEDSATYYCAVRSFGSVSTWAGYVYWGQGTQVTVSSTNF_60(SEQIDNO.62):DVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGFIDSFGVMAWFRQAPGKEREGVAAVYRRAGDTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDSAMYYCAARTYGSVSSWTGYKYWGRGTQVTVSSTNF_73(SEQIDNO.63):DVQLVESGGGSVRAGGSLRLSCTASGDTSKSDCMAWFRQAPGKERERVGAIYTRNGYTHYADSVNGRFTISQDNAKNALYLQMSGLKPEDTAMYYCAARFRIYGQCVEDDDIDYWGQGTLVTVSSTNF_69(SEQIDNO.64):EVQLVESGGGSVLAGGSLRLSCVASGFTSRYNYMAWFRQAPGKEREGVATIGTASGSADYYGSVKDRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAARTYGTISLTPSDYRYWGQGTLVTVSSTNF_76(SEQIDNO.65):QVQVVEYGGGSVQAGETVRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHEWELVSNITTEGITSEASSSYADSVRGRFTIFDNAKNMVYLQMNSLKHEDTAVYYCAPDPYAYSTYREYCTWAQGTQGTLVTVSSTNF_62(SEQIDNO.66):QVQLVESGGGPVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECELVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSDYCSWAQGTQGTLVTVSSTNF_43(SEQIDNO.67):QVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECELVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGTQGTLVTVSSTNF_15(SEQIDNO.68):QVQPVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECELVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGAQGTLVTVSSTNF_11(SEQIDNO.69):QVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECELVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSDYCSWAQGTQGTQVTVSSTNF_17(SEQIDNO.70):QVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECELVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGTQGTQVTVSSTNF_63(SEQIDNO.71):QVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECELVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGTQGTLVTVSSTNF_20(SEQIDNO.72):HVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECELVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGTQGTQVTVSSTNF_58(SEQIDNO.73):EVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECELVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGTQGALVTVSSTNF_27(SEQIDNO.74):EVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECELVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGTQGTLVTVSSTNF_28(SEQIDNO.75):EVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECELVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSDYCSWAQGTQGTQVTVSSTNF_4(SEQIDNO.76):EVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECELVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGTQGTQVTVSSTNF_14(SEQIDNO.77):DVQLVESRGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECELVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGTQGTLVTVSSTNF_3(SEQIDNO.78):DVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHVCELVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSDYCSWAQGTQGTQVTVSSTNF_1(SEQIDNO.79):DVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGLECELVSTITTEGITSEASSYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSEYCTWAQGTQGTLVTVSSTNF_45(SEQIDNO.80):DVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECELVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGTQGTLVTVSSTNF_22(SEQIDNO.81):DVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECELVSTITTEGITSVASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGTQGTQVTVSS如下所述，測試幾種TNF-αsdAb的體外生長抑制。此外，本發(fā)明包括一種或多種針對本發(fā)明的抗TNF-αsdAb的一個(gè)或多個(gè)域的小鼠單克隆抗體。如上所述，小鼠單克隆抗體可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法產(chǎn)生。小鼠單克隆抗體可用于診斷測定，例如諸如ELISA等免疫測定，以測量患者血清中存在的抗TNF-αsdAb的量。RAF蛋白是絲氨酸/蘇氨酸特異性激酶家族，其充當(dāng)將細(xì)胞外信號傳遞至控制細(xì)胞生長、分化和存活的絲裂原活化蛋白激酶級聯(lián)的中樞中間體。BRAF是RAF家族的成員，其在生長因子誘導(dǎo)刺激下由Ras家族的成員激活?；钚訰as可以誘導(dǎo)cRaf和BRAF的異源二聚化，其可以解釋觀察到的響應(yīng)生長因子信號的細(xì)胞中cRaf和BRaf的協(xié)作性。BRAF基因中的激活突變存在于大百分比的人惡性黑色素瘤中和一定比例的結(jié)腸癌中。這些突變的絕大多數(shù)導(dǎo)致在BRAF的活化片段內(nèi)的殘基599處纈氨酸變?yōu)楣劝彼?。開發(fā)靶向野生型和突變的BRAF的抗BRAFsdAb，以破壞其在惡性細(xì)胞中的作用，例如參與到結(jié)腸癌和其他惡性腫瘤的細(xì)胞中的作用。使用本領(lǐng)域眾所周知的方法，使用重組人BRAF蛋白產(chǎn)生針對或可以結(jié)合BRAF表位的sdAb。此外，本發(fā)明包括一種或多種針對本發(fā)明的抗BRAFsdAb的一個(gè)或多個(gè)域的小鼠單克隆抗體。小鼠單克隆抗體可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法產(chǎn)生。小鼠單克隆抗體可用于診斷測定，例如，該抗體可用于諸如ELISA等免疫測定，以測量患者血清中存在的抗BRAFsdAb的量。實(shí)施例實(shí)施例1：抗STAT3VHH13(SEQIDNO.3)SDAB結(jié)合STAT3在該實(shí)施例中，使用基于Octet的無標(biāo)記結(jié)合測定法測量兩個(gè)VHH靶標(biāo)對STAT3的親和性。在此測定中使用抗STAT3VHH13(SEQIDNO:3)sdAb、抗KRAS(陰性對照)和GST-STAT3(16kDa的單價(jià)抗原，CreativeBioMart#STAT3-1476H)作為抗原探針。使用特別是針對疏水蛋白的氨基丙基硅烷(APS)浸液和讀取生物感受器，在PBS中以20μg/ml捕獲GST-STAT3蛋白。然后將探針浸在具有所示濃度的GST-STAT3蛋白、抗STAT3VHH13(SEQIDNO:3)sdAb或抗KRAS的孔中。測量抗原的結(jié)合速率(上板速率,onrate)。用具有1％BSA的水淬滅感受器。將探針浸入測定緩沖液(PBS)中并測量解離速率(下板速率，offrate)。如表1中所示，由所獲得的親和常數(shù)(KA)確定由抗原與抗原結(jié)合蛋白的解離的平衡常數(shù)(KD)表示的親和性，KD使用1：1全局?jǐn)M合分析Fortebio軟件。通過對R2值>0.95的曲線的KD值取平均值，確定親和性。省略250nM抗STAT3VHH13數(shù)據(jù)點(diǎn)，因?yàn)樗钱惓Ｖ?。確定了抗STAT3VHH13(SEQIDNO.3)sdAb的親和性為1.16×10-7。未確定抗KRASVHH的親和性。表1局部擬合分析，用突出值確定親和性為1.16x10‐7實(shí)施例2：免疫沉淀研究在人乳腺癌細(xì)胞中測定STAT3sdAb的特異性。在此實(shí)施例中，MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞生長至50％～70％的匯合度。然后將細(xì)胞在新鮮制備的冰冷的裂解緩沖液(20mMHEPES，pH7.9、400mMNaCl、0.1％NP-40、10％甘油、1mM釩酸鈉、1mM氟化鈉、1mM二硫蘇糖醇、1mL苯甲基磺酰氟、10μg/mL抑肽酶、10μg/mL亮肽素)中在冰上裂解45分鐘。然后離心裂解物，收集上清液，并使用改進(jìn)的Lowry方法(BioRad，Hercules，CA)測定蛋白質(zhì)濃度。將總蛋白(1mg)與1.5mg具有針對STAT3的sdAb、陽性對照(STAT3，cat#SC-482，SantaCruzBiotechnology，Dallas，TX)、或陰性對照(STAT-1，cat#9172，CellSignaling，Danvers，MA)的磁珠(Invitrogen)在4℃溫育1小時(shí)。然后洗滌珠。在最終洗滌后，加入60μl裂解緩沖液，對所得上清液進(jìn)行Western印跡分析。簡單來說，在10％聚丙烯酰胺凝膠上分離樣品并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將膜封閉，然后與適當(dāng)?shù)牡谝豢贵w和第二抗體溫育。用作陽性對照的抗STAT3抗體來自CellSignaling(Cat#4904，Danvers，MA)。使用來自SantaCruzBiotechnology(Dallas，TX)的ECL系統(tǒng)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。如圖3所示，用以不同量測試的全部sdAb免疫沉淀內(nèi)源性STAT3。M是含有標(biāo)記的標(biāo)記物泳道，泳道1含有從哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生和分離的STAT3VHH13(SEQIDNO:3)，泳道2含有從哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生和分離的STAT3VHH14(SEQIDNO:4)，泳道3含有從細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生和分離的STAT3VHH13(SEQIDNO:3)，泳道4含有從哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生和分離的STAT3VHH14(SEQIDNO:4)，泳道5是陽性STAT3抗體，使用STAT-1作為陰性對照的泳道6無條帶顯示。實(shí)施例3：抗STAT3細(xì)菌VHH13以高親和性結(jié)合到包含組成性激活STAT3的細(xì)胞系使用在人(PANC-1和DU145)和鼠(4T1)細(xì)胞系中組成性激活的STAT3測定細(xì)菌抗STAT3VHH13(SEQIDNO:3)的特異性。也用干擾素γ(INFγ)處理商業(yè)HeLa細(xì)胞以誘導(dǎo)磷酸化的STAT3。將PC-3STAT3無效細(xì)胞系用作陰性對照。使細(xì)胞生長至50％～70％的匯合度，然后如上所述在新鮮制備的冰冷的裂解緩沖液中在冰上裂解45分鐘。然后離心裂解物，收集上清液，并如上所述測定蛋白質(zhì)濃度。將總蛋白(1mg)與1.5mg的含有細(xì)菌抗STAT3VHH13(SEQIDNO:3)或陰性對照(KRAS，CreativeBiolabs，Shirley，NY)的磁珠(Invitrogen)在4℃溫育1小時(shí)。然后洗滌珠。在最終洗滌后，加入60μl裂解緩沖液，對所得上清液如實(shí)施例2所述進(jìn)行Western印跡分析。如圖4所示，在組成性激活的STAT3細(xì)胞系：PANC-1(泳道1)、DU145(泳道2)和4T1(泳道2)中內(nèi)源性STAT3被細(xì)菌VHH13STAT3(SEQIDNO:3)免疫沉淀。此外，細(xì)菌VHH13STAT3(SEQIDNO:3)結(jié)合到HeLa裂解物中的磷酸化-STAT3(泳道3)。對于PANC-1KRAS(泳道3)和PC-3(陰性對照，泳道6)沒有觀察到條帶。實(shí)施例4：MDA-MB-231癌細(xì)胞系中抗STAT3sdAb的細(xì)胞毒性研究在此實(shí)施例中，使用人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231測定抗STAT3sdAb的抗增殖作用。對于實(shí)驗(yàn)，MDA-MB-231細(xì)胞生長至它們達(dá)到90％的匯合度。此時(shí)，洗滌細(xì)胞，胰蛋白酶消化，并使用Coulter計(jì)數(shù)器(Beckman，Brea，CA)計(jì)數(shù)。使用3-[4,5-二甲基噻唑基]-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)測定法進(jìn)行增殖研究。為此，如制造商(RocheDiagnosticsCorporation，Indianapolis，IN)所指示將細(xì)胞以5×103/孔的密度接種在96孔板中。使細(xì)胞貼壁24小時(shí)，然后以適當(dāng)?shù)臐舛?即，0μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、10.0μg/ml、或100μg/ml)加入sdAb。在第3天計(jì)數(shù)細(xì)胞。對于5天處理的細(xì)胞，在第3天更換含有sdAb的新鮮培養(yǎng)基。在終止時(shí)，如制造商所指示，將10μl的MTT試劑(0.5mg/mL)加入各孔。在4小時(shí)的溫育期后，加入100μl溶解溶液，并將板置于培養(yǎng)箱中過夜。使用Biotek讀板器(Winooski，VT)在570nm波長讀取所有的板。使用GraphPadInStat3(GraphPadSoftware，Inc.，LaJolla，CA)分析所有數(shù)據(jù)。使用單向ANOVA將處理組與載劑對照組進(jìn)行比較。如果觀察到顯著性差異(p<0.05)，則進(jìn)行Tukey-Kramer多重比較檢驗(yàn)。如下表2～5所示，基于MTT實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌VHH13抗STAT3(SEQIDNO.3)sdAb在處理后3天和5天有效抑制細(xì)胞生長。表2在MDA-MB-231細(xì)胞中用抗STAT3sdAb處理3天后的平均吸光度(570nM)±S.E.處理對照0.5μg/ml1.0μg/ml10.0μg/ml100μg/mlp-值*H.VHH130.444±0.0300.504±0.0430.545±0.0600.603±0.0250.272±0.0110.001H.VHH140.404±0.0110.485±0.0400.402±0.0170.588±0.0200.416±0.0300.002B.VHH130.550±0.0360.685±0.0180.716±0.0230.355±0.0330.059±0.001<0.0001B.VHH140.593±0.0140.666±0.0220.644±0.0450.456±0.0480.255±0.005<0.0001*單向方差分析(ANOVA)；Tukey-Kramer多重比較測試表3處理3天后抗STAT3sdAb處理對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響*單向方差分析(ANOVA)；Tukey-Kramer多重比較測試表4在MDA-MB-231細(xì)胞中用抗STAT3sdAb處理5天后的平均吸光度(570nM)±S.E.處理對照0.5μg/ml1.0μg/ml10.0μg/ml100μg/mlp-值*H.VHH131.100±0.0880.955±0.0130.963±0.0180.832±0.0280.721±0.0250.0012H.VHH140.983±0.0230.890±0.0210.935±0.0370.804±0.0150.797±0.0100.0007B.VHH130.804±0.0460.761±0.0550.653±0.0240.506±0.0300.083±0.005<0.0001B.VHH140.677±0.0150.733±0.0380.794±0.0230.640±0.0110.549±0.023<0.0001*單向方差分析(ANOVA)；Tukey-Kramer多重比較測試表5處理5天后抗STAT3sdAb處理對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響處理μg/ml％抑制p-值*H.VHH130.513.2NS1.012.5NS10.024.4P<0.01100.034.5P<0.001H.VHH140.59.5NS1.04.9NS10.018.2P<0.001100.018.9P<0.001B.VHH130.55.4NS1.018.8NS10.037.1P<0.001100.089.7P<0.001B.VHH140.50NS1.00NS10.05.5NS100.018.9P<0.05*單向方差分析(ANOVA)；Tukey-Kramer多重比較測試實(shí)施例5：人乳腺癌(MDA-MB-231)和胰腺癌(PANC-1)細(xì)胞系中抗STAT3sdAb的細(xì)胞毒性研究在此實(shí)施例中，使用人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和胰腺癌細(xì)胞系PANC-1測定抗STAT3VHH13(SEQIDNO.3)和VHH14(SEQIDNO.4)sdAb的抗增殖作用。對于實(shí)驗(yàn)，MDA-MB-231細(xì)胞和PANC-1細(xì)胞生長至它們達(dá)到90％的匯合度。此時(shí)，洗滌細(xì)胞，胰蛋白酶消化，并使用Coulter計(jì)數(shù)器(Beckman，Brea，CA)計(jì)數(shù)。使用上述MTT測定法進(jìn)行增殖研究。對于5天處理的細(xì)胞，在第3天更換含有抗STAT3sdAb的新鮮培養(yǎng)基。使用GraphPadInStat3分析所有數(shù)據(jù)。使用單向ANOVA將處理組與載劑對照組進(jìn)行比較。如果觀察到顯著性差異(p<0.05)，則進(jìn)行Tukey-Kramer多重比較檢驗(yàn)。如下表6～13所示，基于MTT實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)VHH13(SEQIDNO.3)和VHH14(SEQIDNO.4)在MDA-MB-231和PANC-1腫瘤細(xì)胞中均抑制細(xì)胞生長。表6在MDA-MB-231細(xì)胞中用sdAb處理3天后的平均吸光度(570nM)±SE*單向方差分析(ANOVA)；Tukey-Kramer多重比較測試表7在MDA-MB-231細(xì)胞中用抗STAT3sdAb處理5天后的平均吸光度(570nM)±S.E.*單向方差分析(ANOVA)；Tukey-Kramer多重比較測試表8在PANC-1細(xì)胞中用抗STAT3sdAb處理3天后的平均吸光度(570nM)±S.E.*單向方差分析(ANOVA)；Tukey-Kramer多重比較測試表9在PANC-1細(xì)胞中用抗STAT3sdAb處理5天后的平均吸光度(570nM)±S.E.*單向方差分析(ANOVA)；Tukey-Kramer多重比較測試表10抗STAT3sdAb處理對處理3天后的MDA-MB-231細(xì)胞增殖的平均生長抑制a.單向方差分析(ANOVA)；b.測試后＝Tukey-Kramer多重比較測試表11抗STAT3sdAb處理對處理5天后的MDA-MB-231細(xì)胞增殖的平均生長抑制a.單向方差分析(ANOVA)；b.測試后＝Tukey-Kramer多重比較測試表12抗STAT3sdAb處理對處理3天后的PANC-1細(xì)胞增殖的平均生長抑制處理實(shí)驗(yàn)P-值a10.0μg/mlP-值b100μg/mlP-值bB.VHH131P＜0.000142.9P＜0.00159.4P＜0.0012P＝0.0363.5P＜0.0587.5P＜0.013P＜0.000151.9P＜0.00183.8P＜0.001總體平均抑制率％52.876.9H.VHH131P＝0.00530.8P＜0.0552.5P＜0.012P＝0.00216.0ns52.7P＜0.013P＝0.1116.5ns34.8ns總體平均抑制率％21.146.7H.VHH141P＝0.4223.0ns32.4ns2P＝0.0316.9ns30.2P＜0.053P＝0.1310.1ns29.2ns總體平均抑制率％16.730.6a.單向方差分析(ANOVA)；b.測試后＝Tukey-Kramer多重比較測試表13抗STAT3sdAb處理對處理5天后的PANC-1細(xì)胞增殖的平均生長抑制處理實(shí)驗(yàn)P-值a10.0μg/mlP-值b100μg/mlP-值bB.VHH131P＝0.000437.0P＜0.0164.6P＜0.0012P＝0.000448.0P＜0.0187.4P＜0.0013P＜0.000154.9P＜0.00185.4P＜0.001總體平均抑制率％46.679.1H.VHH131P＝0.0322.8ns42.6P＜0.052P＝0.0125.2ns49.2P＜0.013P＝0.0627.7ns48.9ns總體平均抑制率％25.246.9H.VHH141P＝0.0826.8ns14.8ns2P＝0.00223.2P＜0.0122.9P＜0.013P＝0.0231.5P＜0.0536.8P＜0.05總體平均抑制率％27.224.8a.單向方差分析(ANOVA)；b.測試后＝Tukey-Kramer多重比較測試實(shí)施例6：在人乳腺癌和人前列腺癌細(xì)胞系中STAT3sdAb的抗增殖作用在人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和人前列腺癌細(xì)胞系DU145中測定STAT3VHH13(SEQIDNO.3)sdAb的抗增殖作用。對于實(shí)驗(yàn)，癌細(xì)胞生長至它們達(dá)到90％的匯合度。此時(shí)，洗滌細(xì)胞，胰蛋白酶消化，并使用Coulter計(jì)數(shù)器(Beckman，Brea，CA)計(jì)數(shù)。使用上述MTT測定法進(jìn)行增殖研究。將抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO.3)sdAb對MDA-MB-231細(xì)胞的抗增殖性質(zhì)與其對DU145細(xì)胞的作用進(jìn)行比較。如表14所示，用50.0μg/ml和100μg/ml的抗STAT3(SEQIDNO：3)sdAb處理的MDA-MB-231細(xì)胞分別顯示出29.6和91.2的平均生長抑制率。在DU145細(xì)胞中，如表15所示觀察到類似的生長抑制率(對于50.0μg/ml和100μg/ml分別為31.2％和92.1％)。表14抗STAT3細(xì)菌VHH13sdAb對MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的抗增殖作用*單向方差分析(ANOVA)；Tukey-Kramer多重比較測試表15抗STAT3細(xì)菌VHH13sdAb對DU145前列腺癌細(xì)胞的抗增殖作用*單向方差分析(ANOVA)；Tukey-Kramer多重比較測試實(shí)施例7：STAT3VHH13(SEQIDNO.3)sdAb對人癌細(xì)胞系的抗增殖效應(yīng)為了測試STAT3VHH13(SEQIDNO.3)sdAb的抗增殖作用，如表16所示，使用人癌細(xì)胞系：MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7、BT474、和DU145。全部人癌細(xì)胞系獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，VA)。將細(xì)胞系在含有10％胎牛血清、2mML-谷氨酰胺和1％抗生素-抗真菌溶液(10單位/mL青霉素、10μg/mL鏈霉素和25μg/mL兩性霉素B)的RPMI1640培養(yǎng)基(MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7、BT474)或MEM-E(DU145)中維持并培養(yǎng)。將細(xì)胞保持在37℃，5％CO2的潮濕環(huán)境中。細(xì)胞培養(yǎng)供應(yīng)獲自LifeTechnologies，Inc.，(GrandIsland，NY)。MTT試劑購自SigmaAldrich(St.Louis，MO)。對于實(shí)驗(yàn)，癌細(xì)胞生長至它們達(dá)到90％的匯合度。此時(shí)，洗滌細(xì)胞，胰蛋白酶消化，并使用Coulter計(jì)數(shù)器(Beckman，Brea，CA)計(jì)數(shù)。使用上述MTT測定法進(jìn)行增殖研究。評估抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb對表示各種分類的五種乳腺癌細(xì)胞(表34)的抗增殖性質(zhì)。如表17所示，全部細(xì)胞系在處理后72小時(shí)顯示顯著的生長抑制。對于全部細(xì)胞系，在100μg/ml和200μg/ml的劑量下觀察到最大的生長抑制率。在所測試的細(xì)胞系中生長的半最大抑制濃度(IC50)為：對于MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7、和BT474細(xì)胞系分別為10.1±2.4、12.36±1.5、14.8±1.6、和25.2±14.7。這些數(shù)據(jù)表明，與雌激素/孕酮陽性細(xì)胞系(即MCF-7)或HER2擴(kuò)增的細(xì)胞系(即，BT474)相比，三陰性乳腺癌細(xì)胞系需要最低濃度的VHH13(SEQIDNO：3)sdAb以實(shí)現(xiàn)IC50。表16乳腺癌細(xì)胞系特征細(xì)胞系疾病免疫譜分類MDA-MB-231腺癌ER-，PR-，HER2-基；低密度MDA-MB-468腺癌ER-，PR-，Her2-基MDA-MB-453轉(zhuǎn)移性癌ER，PR，HER2-未分類BT474導(dǎo)管癌Her2擴(kuò)增管腔BMCF-7腺癌ER+，PR+，HER2+管腔A表17通過抗STAT3VHH13(SEQIDNO.3)sdAb抑制乳腺癌細(xì)胞系還在人前列腺癌細(xì)胞系DU145中評估了抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb的作用，如表18所示?？筍TAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb在所測試的所有癌細(xì)胞中顯示劑量依賴性生長抑制。表18抗STAT3VHH13sdAb對前列腺癌細(xì)胞系的影響處理(mg/ml)平均Abs抑制％p-值DU14500.771DU1450.390.9060DU1450.781.0230DU1451.560.9670DU1453.130.7830DU1456.250.7700DU14512.50.56027.4P<0.05DU145250.35953.5P<0.001DU145500.16179.1P<0.001DU1451000.03995.0P<0.001DU1452000.03995.0P<0.001實(shí)施例8：BALB/C小鼠中抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)的最大耐受劑量在此實(shí)施例中，使用人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231在試驗(yàn)動物中測定抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb的耐受性。對于實(shí)驗(yàn)，將總共9只BALB/C裸雌性小鼠(6～7周齡)根據(jù)體重分成三組(表19)。小鼠(n＝3)接受載劑(PBS)或250μg/kg或500μg/kg體重/天的抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb五天。在研究期間，死亡率/發(fā)病率每日進(jìn)行兩次。在研究的第1天、第4天和第6天以及在研究終止的當(dāng)天(第13天)記錄體重。與載劑對照小鼠相比，通過體重測量和小鼠行為評價(jià)毒性。在完成處理階段后，再跟蹤動物一周以觀察任何體重異常和/或處理后的一般健康狀況。表19最大耐受劑量研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組#小鼠處理劑量途徑頻率13PBS載劑---IP5天23細(xì)菌VHH13250μg/kgb.w.IP5天33細(xì)菌VHH13500μg/kgb.w.IP5天如表20所示，各組之間體重沒有顯著性差異，并且抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb在任一給藥水平上與任何藥物相關(guān)的死亡無關(guān)。此外，與對照小鼠相比，在用抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb處理的動物中沒有觀察到行為改變。表20平均體重±S.E分組隨機(jī)化第1天第4天第6天第13天載劑17.1±0.0617.1±0.0717.8±0.1218.1±0.0918.8±0.20250μg/kg17.1±0.0617.2±0.0317.2±0.1517.5±0.1518.1±0.21500μg/kg17.1±0.1717.1±0.0917.8±0.1818.0±0.2018.5±0.18p-值*>0.99990.520.050.070.11*單向方差分析(ANOVA)；Tukey-Kramer多重比較測試實(shí)施例9：在裸BALB/C小鼠異種移植和人乳腺癌和人胰腺癌細(xì)胞中的細(xì)菌抗STAT3VHH13(SEQIDNO:3)的活性在此實(shí)施例中，使用人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231在小鼠中評估抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb的活性。簡單來說，使用：MDA-MB-231人乳腺癌異種移植模型和PANC-1人胰腺癌異種移植模型評估抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb的活性。給藥方案如下：第1組(n＝6；PBS；IP)，每日一次持續(xù)14天[QD×14]；組2(n-12；500μg/kgbw；IP)，每日一次持續(xù)14天[QD×14]。藥物施用后5天為觀察期。人乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231和PANC-1)得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(Manassas，VA)。MDA-MB-231細(xì)胞在補(bǔ)充有10％FBS(AtlantaBiologicals，F(xiàn)loweryBranch，GA)和青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺(LifeTechnologies，GrandIsland，NY)的MEM(LifeTechnologies，GrandIsland，NY)中生長。PANC-1細(xì)胞在補(bǔ)充有10％FBS和青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)基(LifeTechnologies，GrandIsland，NY)中生長。所有細(xì)胞在37℃，5％CO2的存在下在培養(yǎng)箱中生長。4～5周齡的無胸腺裸Foxnlnu雄性小鼠購自HarlanLaboratories(Indianapolis，IN)。將動物隔離一周，每籠養(yǎng)5只小鼠，具有12小時(shí)光暗周期和50％的相對濕度。向動物隨意提供飲用水和飲食。將所有動物安置在無病原體條件下，并根據(jù)IIT研究所動物使用和護(hù)理委員會進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對于MDA-MB-231異種移植物研究，將100μL終體積的MEM培養(yǎng)基中的細(xì)胞(4×106)皮下注射到小鼠的右側(cè)腹。對于PANC-1異種移植研究，將100μL終體積的RPMI培養(yǎng)基中的細(xì)胞(5×106)皮下注射到小鼠的右側(cè)腹。一旦腫瘤可觸摸，就開始兩種模型的腫瘤測量。此后，每周測量腫瘤兩次。當(dāng)腫瘤達(dá)到75mm3～175mm3的范圍大小時(shí)，對動物進(jìn)行隨機(jī)化，使用分層隨機(jī)取樣算法對對照組(n＝6)和處理組(n＝12)進(jìn)行隨機(jī)化。隨機(jī)化后的第二天開始處理(抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb)或載劑(PBS)。處理是良好耐受的并且與藥物相關(guān)的死亡無關(guān)。沒有觀察到顯著的體重?fù)p失。對于MDA-MB-231異種移植研究，對照組和處理組的隨機(jī)化平均(±SE)腫瘤大小分別為：103.01±11.89和102.61±9.60。對于組1和組2，隨機(jī)化的平均體重(±SE)分別為：32.08±0.76和30.27±0.75。表21顯示了整個(gè)研究的平均體重(±SE)。表21平均體重±S.E.處理第1天第6天第9天第12天第16天第20天載劑31.0±0.8332.1±0.7631.9±0.6632.1±0.6832.0±0.7132.5±0.88抗STAT3VHH1329.2±0.7130.3±0.7530.4±0.7929.9±0.7230.6±0.7430.6±0.77p-值*0.160.180.27.090.280.17*雙尾T檢驗(yàn)在給藥的第14天，對照組的平均腫瘤大小(±SE)為179.11±19.39，而處理組為118.86±15.94。對于組1和組2，終止時(shí)的平均體重(±SE)分別為：31.98±0.71和30.55±0.74。表22總結(jié)了整個(gè)研究的腫瘤體積(±SE)。處理組中平均腫瘤生長抑制率％為33.64％。腫瘤倍增時(shí)間如下：組1：44.27天；組2：61.06天。圖5示出了MDA-MB-231異種移植模型中抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb的生長抑制?？筍TAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb顯示顯著的生長抑制(p＝0.047)。因此，抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb在MDA-MB-231人乳腺癌模型系統(tǒng)中具有化學(xué)治療活性。表22MDA-MB-231異種移植模型的個(gè)體腫瘤測量(mm3)對于PANC-1異種移植研究，隨機(jī)化平均(±SE)腫瘤大小在對照組中為107.01±4.54，在處理組中為110.58±6.18。對于組1和組2，隨機(jī)化的平均體重(±SE)分別為：29.0±0.81和28.5±0.70。對于組1和組2，終止時(shí)的平均體重(±SE)分別為31.2±0.99和30.1±0.75。表23總結(jié)了整個(gè)研究的平均體重(±SE)。在給藥的第14天，對照組的平均腫瘤大小(±SE)為287.30±33.94，而處理組為318.74±29.76。表24總結(jié)了整個(gè)研究的腫瘤體積(±SE)。表23平均體重±S.E.處理2/192/242/273/23/63/10載劑對照31.0±0.8332.1±0.7631.9±0.6632.1±0.6832.0±0.7132.5±0.88抗STAT329.2±0.7130.3±0.7530.4±0.7929.9±0.7230.6±0.7430.6±0.77腫瘤倍增時(shí)間如下：組1：22.44天；組23.02天?？筍TAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb在PANC-1人胰腺癌模型系統(tǒng)中沒有顯示出顯著的生長抑制。表24PANC-1異種移植模型的個(gè)體腫瘤測量(mm3)實(shí)施例10：MDA-MB-231異種移植研究在此實(shí)施例中，進(jìn)一步評估了抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb在MDA-MB-231人乳腺異種移植模型中的效果。給藥方案如下：組1(n＝4；PBS；IP)，每日兩次持續(xù)14天[BID×14]；組2(n＝4；1mg/kgbw；IP)，每日兩次持續(xù)14天[BID×14]；組3(n＝4；2mg/kgbw；IP)，每日兩次持續(xù)14天[BID×14]；組4(n＝4；2mg/kgbw；IP)，每日一次持續(xù)14天[QD×14]。施用后7天為觀察期。人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和無胸腺裸Foxn1nu雌性小鼠如上所述。將100μL終體積的MEM培養(yǎng)基中的MDA-MB-231細(xì)胞以5×106的密度皮下注射到小鼠的右側(cè)腹。一旦腫瘤可觸摸，就開始腫瘤測量。此后，每周測量腫瘤兩次。當(dāng)腫瘤達(dá)到55mm3～150mm3的范圍大小時(shí)，使用分層隨機(jī)取樣算法對動物進(jìn)行隨機(jī)化。隨機(jī)化后的第二天開始處理(抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb)或載劑(PBS)。對于組1、2、3和4，隨機(jī)化平均(±SE)腫瘤大小分別為：92.08±13.24、82.38±5.17、77.47±7.17、和104.71±14.64。如表25所示，對于組1、2、3和4，隨機(jī)化的平均體重(±SE)分別為：23.65±0.72、23.45±0.66、23.10±0.20、和22.45±1.25。如表26所示，在給藥的第14天，對照組的平均腫瘤大小為221.51±57.32，而對于處理組2、3和4，分別為67.12±10.66、58.27±22.54、和131.44±22.86。在終止時(shí)(第42天)，對于組1、2、3和4，平均腫瘤大小(±S.E.)分別為：255.42±65.46、55.98±6.94、41.15±13.21、和145.51±52.32。對于組1、2、3和4，終止時(shí)的平均體重(±SE)分別為：24.80±0.49、23.25±1.20、24.00±0.32、和23.2±1.46。對于組1、2、3和4，最大平均凈重量減輕(日)％分別為：0.7(36)、1.5(23)、1.8(36)、和2.2(29)。同樣如表26所示，對于組2、3和4，處理組中的平均生長抑制分別為78.3、75.2、和55.9。腫瘤倍增時(shí)間為：組1：20.56天；組2：34.54天；組3：30.07天；組4：27.17天。組2、3和4分別具有13.99天、9.52天、和6.61天的生長延遲。處理組的處理/對照值％為：組2：-33.75(腫瘤停滯)；組：-54.4(腫瘤消退)；組4：10.28(腫瘤抑制)。圖6示出了在MDA-MB-231異種移植模型中抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb的生長抑制?？筍TAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb的施用與組2(p＝0.02)[1mg/kg；BID×14]和組3(p＝0.02)[2mg/kg；BID×14]的顯著生長抑制相關(guān)。此外，四分之三的腫瘤顯示顯著的消退。基于這些數(shù)據(jù)，得出結(jié)論，抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb在MDA-MB-231人乳腺癌模型系統(tǒng)中具有化學(xué)治療活性。表25平均體重±S.E.表26MDA-MB-231異種移植模型的個(gè)體腫瘤測量(mm3)實(shí)施例11：抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)SDAB對三種人癌癥異種移植模型的效果在此實(shí)施例中，在MDA-MB-231人乳腺癌、PANC-1胰腺癌、和DU145前列腺癌異種移植物模型中評估抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb。無胸腺裸Foxn1nu小鼠、MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞、PANC-1胰腺癌和DU145前列腺癌細(xì)胞系如上所述。在研究的第1天，小鼠的體重為17g～19g(34只雌性)和21g～23g(16只雄性)。使用早期(4～10)傳代中的細(xì)胞來植入小鼠中，并在對數(shù)期生長期間收獲。將終體積為100μL的培養(yǎng)基中的MDA-MB-231(5×106)、DU145(5×106)、和PANC-1(1.5x106)皮下注射到小鼠的右側(cè)腹。一旦腫瘤可觸及，就開始腫瘤測量。此后，每周測量腫瘤兩次。當(dāng)腫瘤達(dá)到74mm3～120mm3(MDA-MB-231)、89mm3～146mm3(DU145)、或60mm3～160mm3(PANC-1)的范圍大小時(shí)，使用分層隨機(jī)取樣算法對動物進(jìn)行隨機(jī)化。隨機(jī)化后第二天(被稱為第1天)開始處理(含抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb，此處也被稱為SBT-100)或載劑(PBS)?？筍TAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb作為預(yù)配制溶液以0.651mg/ml的濃度提供，并儲存在-20℃直到準(zhǔn)備使用。將儲備溶液在無菌PBS(pH7.6)中稀釋，以10mL/kg的給藥體積提供5mg/kg。每7天制備工作溶液，等分到7個(gè)小瓶中并在4℃下儲存。在處理的每一天，僅將所需的小瓶拿到室溫。根據(jù)下一劑量的需要，將所有剩余的sdAb材料保持在4℃。在第8天，棄去任何剩余的sdAb材料，并制備新的批次。根據(jù)表27所示的方案，對兩組(對照和SBT-100)小鼠/腫瘤模型進(jìn)行給藥。給藥方案如下：組1(n＝4；PBS)，每日兩次持續(xù)14天[BID×14]；組2(n＝4；SBT-100，5mg/kgbw)，每日兩次持續(xù)14天[BID×14]。載劑(PBSpH7.6)和SBT100腹腔內(nèi)施用(i.p.)，每日兩次，相隔6小時(shí)，持續(xù)14天。根據(jù)個(gè)體動物重量進(jìn)行給藥。在施用后的7天為恢復(fù)期。表27異種移植研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)StudyLogStudyDirector動物研究管理軟件(SanFrancisco，CA)用于隨機(jī)化動物，收集數(shù)據(jù)(例如給藥、體重、腫瘤測量、臨床觀察)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。在MDA-MB-231腫瘤異種移植模型中，在接種后第23天將動物隨機(jī)化，組1和組2的平均(±SE)腫瘤大小分別為77.98±21.58和84.71±5.56。對于組1和組2，隨機(jī)化時(shí)的平均體重(±SE)分別為：20.04±0.62和23.7±1.84。表28總結(jié)了整個(gè)研究的平均體重(±SE)。在給藥的最后一天(第14天)，對照組的平均腫瘤大小(±SE)為168.28±51.57，而對于對于SBT-100處理的小鼠為83.81±22.65。表29總結(jié)了整個(gè)研究的腫瘤體積(±SE)。在終止時(shí)(第28天)，對于組1和組2，平均腫瘤大小(±SE)分別為：270.49±112.35和91.72±33.17。對于組1和組2，終止時(shí)的平均體重(±SE)分別為：25.36±1.07和24.25±1.68。在研究結(jié)束時(shí)，SBT-100處理組中的平均腫瘤生長抑制為85.8％(p＝0.006)。圖7示出了平均腫瘤體積。對于組1和組2，腫瘤倍增時(shí)間分別為25.78天和111.6天。組2的處理/對照％為13.35(腫瘤抑制)。表28MDA-MB-231中小鼠的平均體重表29MDA-MB-231的腫瘤體積在DU145腫瘤異種移植模型中，在接種后第17天對動物進(jìn)行隨機(jī)化，對于組1和組2，平均(±SE)腫瘤大小分別為：111.87±20.53和111.23±25.16。對于組1和組2，隨機(jī)化的平均體重(±SE)分別為：29.10±1.94和30.68±1.56。表30總結(jié)了整個(gè)研究的平均體重(±SE)。在給藥的最后一天(第14天)，對照組的平均腫瘤大小(±SE)為621.81±276.25，而SBT-100處理的小鼠的平均腫瘤大小(±SE)為364.14±51.64。表31總結(jié)了整個(gè)研究的腫瘤體積(±SE)。在終止時(shí)(第28天)，對于組1和組2，平均腫瘤大小(±S.E)分別為：819.42±351.88和601.83±131.51。對于組1和組2，終止時(shí)的平均體重(±SE)分別為：29.20±2.33和29.60±1.04。在研究結(jié)束時(shí)，SBT-100處理組中的平均腫瘤生長抑制率為26.6％(p＝0.29)。圖8示出了平均腫瘤體積。對于組1和組2，腫瘤倍增時(shí)間分別為14.57天和18.19天。組2的處理/對照％為74.8。表30DU145中的小鼠平均體重表31DU145的腫瘤體積在PANC-1腫瘤異種移植模型中，在接種后第22天對動物進(jìn)行隨機(jī)化，對于組1和組2，平均(±SE)腫瘤大小分別為：78.74±40.21和93.84±36.31。對于組1和組2，隨機(jī)化的平均體重(±SE)分別為：22.50±1.47和24.23±1.63。表32總結(jié)了整個(gè)研究的平均體重(±SE)。在給藥的最后一天(第14天)，對照組的平均腫瘤大小(±SE)為204.95±178.90，而SBT-100處理的小鼠的平均腫瘤大小(±SE)為159.03±28.01。表33總結(jié)了整個(gè)研究的腫瘤體積(±SE)。在終止時(shí)(第28天)，對于組1和組2，平均腫瘤大小(±S.E)分別為：284.77±288.88和203.02±30.34。對于組1和組2，終止時(shí)的平均體重(±SE)分別為：27.38±1.07和26.23±1.19。在研究結(jié)束時(shí)，SBT-100處理組中的平均腫瘤生長抑制率為41.78％(p＝0.35)。圖9示出了平均腫瘤體積。對于組1和組2，腫瘤倍增時(shí)間分別為18.51天和35.70天。組2的處理/對照％為52.79。表32PANC-1中的小鼠平均體重表33PANC-1的腫瘤體積實(shí)施例12：抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)SDAB在ER+/PR+(MCF-7)人乳腺癌異種移植模型中的效果此實(shí)施例證明了在裸鼠中的MCF-7人乳腺癌異種移植模型中的抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb的效果。12周齡的雌性無胸腺裸鼠(Crl:NU(Ncr)-Foxn1nu，CharlesRiver)，在研究的第1天體重(BW)范圍為23.0g～30.1g。如上所述喂養(yǎng)和飼養(yǎng)動物。如上所述獲得并培養(yǎng)MCF-7人乳腺癌細(xì)胞，并用于小鼠異種移植。在腫瘤細(xì)胞植入的前三天，使用滅菌的套管針將雌激素小丸(0.36mg雌二醇，60天釋放，InnovativeResearchofAmerica，Sarasota，F(xiàn)L)皮下植入每只試驗(yàn)動物的肩胛骨之間。在對數(shù)期生長期間收獲用于植入的腫瘤細(xì)胞，并以1×108個(gè)細(xì)胞/mL的濃度重懸于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。在植入當(dāng)天，每只試驗(yàn)小鼠接受在右側(cè)皮下植入的1×107個(gè)MCF-7細(xì)胞(0.1mL細(xì)胞懸浮液)，并且監(jiān)測腫瘤生長至平均大小接近100mm3～150mm3的目標(biāo)范圍。21天后，將其指定為研究的第1天，將動物分成兩組，每組由各腫瘤體積范圍為108mm3～144mm3的四只小鼠組成，組平均腫瘤體積為117mm3～123mm3?？筍TAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb提供為在1mL等分試樣中濃度0.41867mg/ml的預(yù)配制的即用給藥溶液，并儲存在-20℃直到使用。將0.41867mg/mL溶液以在23.88mL/kg的給藥體積中提供1mg/kg劑量。在處理的每一天，僅將需要的抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb的小瓶解凍至室溫。將所有剩余劑量的懸浮液保持在4℃，待下一次給藥的需要。根據(jù)表34中所示的方案對兩組無胸腺裸小鼠進(jìn)行給藥。每天三次腹膜內(nèi)(i.p.)施用全部載劑(對照)和抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb劑量，間隔6小時(shí)，持續(xù)14天，其中在第1天遞送兩個(gè)劑量，在第15天早上遞送一個(gè)劑量(tid×14，第一天2個(gè)劑量)。載劑和抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb的給藥體積為0.478mL/20克體重(23.88mL/kg)，并按比例調(diào)整至每只動物的體重。組1接受載劑并作為腫瘤移植和進(jìn)展的基準(zhǔn)組以及對照。組2給予1mg/kg的抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb。表34研究的方案設(shè)計(jì)每周測量腫瘤兩次，當(dāng)其腫瘤達(dá)到預(yù)定終點(diǎn)體積(1000mm3)或在研究結(jié)束第39天時(shí)(無論哪個(gè)先到)，對每只動物實(shí)施安樂死。當(dāng)腫瘤達(dá)到終點(diǎn)體積時(shí)，將動物記錄為對于腫瘤進(jìn)展(TP)的安樂死，其具有安樂死的日期。通過下式計(jì)算每只小鼠的終點(diǎn)時(shí)間(TTE)：其中TTE以天表示，終點(diǎn)體積以mm3表示，b是截距，m是通過對數(shù)轉(zhuǎn)化的腫瘤生長數(shù)據(jù)集的線性回歸獲得的線的斜率。該數(shù)據(jù)集包括超過分析中使用的終點(diǎn)體積的第一次觀察以及緊接在達(dá)到該終點(diǎn)體積之前的三個(gè)連續(xù)觀察。計(jì)算的TTE通常小于TP日期(動物對于腫瘤大小實(shí)施安樂死的日期)。未達(dá)到終點(diǎn)體積的動物被分配等于研究的最后一天的TTE值(D39)。被分類為死于處理相關(guān)(TR)原因的任何動物被分配等于死亡日的TTE值。被分類為死于非處理相關(guān)(NTR)原因的任何動物被排除在TTE的計(jì)算之外。從腫瘤生長延遲(TGD)測定處理效果，其被定義為與對照組相比，處理組以天數(shù)增加中值TTE：TGD＝T–C相對于對照組，中值TTE的增加百分比為其中：T＝處理組的中值TTE，和C＝指定對照組的中值TTE。每組中的處理效果可以通過中值腫瘤體積MTV(n)指示，MTV(n)被定義為研究最后一天(D39)的腫瘤未達(dá)到終點(diǎn)體積的剩余動物數(shù)(n)中的中值腫瘤體積。處理效果還可以根據(jù)在研究期間觀察到的消退反應(yīng)的發(fā)生率和量級來確定。處理可引起動物中腫瘤的部分消退(PR)或完全消退(CR)。在PR反應(yīng)中，在研究過程中三次連續(xù)測量的腫瘤體積為其D1體積的50％或更小，并且對于這三次測量中的一次或多次，等于或大于13.5mm3。在CR反應(yīng)中，在研究過程中三次連續(xù)測量的腫瘤體積小于13.5mm3。在研究結(jié)束時(shí)將具有CR反應(yīng)的任何動物另外分類為無腫瘤的存活者(TFS)。在前五天每天對動物進(jìn)行稱重，然后在研究的剩余部分中每周兩次進(jìn)行稱重。經(jīng)常觀察小鼠的健康和任何不良處理相關(guān)的TR副作用的明顯跡象，并記錄值得注意的臨床觀察。根據(jù)方案監(jiān)測個(gè)體體重減輕，對于體重減輕一次測量超過30％或?qū)τ谌螠y量超過25％的任何動物，實(shí)施作為TR死亡的安樂死。如果組平均體重恢復(fù)，則可以在該組中恢復(fù)給藥，但是以較低劑量或較低頻率方案給藥?？山邮艿亩拘员欢x為在研究期間小于20％的組平均BW損失，并且在10個(gè)處理的動物中不超過一個(gè)TR死亡，或10％。任何導(dǎo)致更大毒性的給藥方案被認(rèn)為高于最大耐受劑量(MTD)。如果死亡歸因于臨床體征和/或尸檢所證明的處理副作用，則死亡被分類為TR，或者如果由于給藥期期間的未知原因或在最后一劑的14天內(nèi)，死亡被歸類為TR。如果有證據(jù)表明死亡與腫瘤模型相關(guān)，而不是與處理相關(guān)，死亡被歸類為NTR。NTR死亡進(jìn)一步分為NTRa(由于事故或人為錯(cuò)誤)，NTRm(由于通過侵入或轉(zhuǎn)移的尸檢證實(shí)的腫瘤擴(kuò)散)和NTRu(由于未知原因)。使用用于Windows的Prism6.07(GraphPad)進(jìn)行圖形分析。由于樣本量小，不采用統(tǒng)計(jì)學(xué)。構(gòu)建散點(diǎn)圖以顯示各組小鼠的TTE值；該圖顯示NTR死亡，將其從所有其他數(shù)字中排除。將個(gè)體動物、組中值和平均腫瘤體積作為時(shí)間的函數(shù)作圖。當(dāng)動物由于腫瘤大小或TR死亡而退出研究時(shí)，包括其最終記錄的腫瘤體積和用于計(jì)算隨后時(shí)間點(diǎn)的中值體積的數(shù)據(jù)。構(gòu)建Kaplan-Meier圖以顯示研究中保留的每組中的動物相對于時(shí)間的百分比。在同一組中兩次TR死亡發(fā)生后，腫瘤生長曲線被截?cái)?。在研究過程中的從第1天的組平均BW變化被繪制為變化百分比±SEM。在退出研究的組中，超過一半可評價(jià)小鼠后，腫瘤生長和BW變化曲線被截?cái)?。圖10示出了研究中的平均腫瘤體積。表35提供了小鼠的平均BW損失、TR和NTR死亡。觀察時(shí)記錄臨床體征，如表36～38所示。研究期間沒有發(fā)生TR死亡。每組中有一只動物的體重?fù)p失是可變的、嚴(yán)重的，并且由雌激素效應(yīng)引起。兩組中均出現(xiàn)包括體重減輕、增大的子宮角、和膀胱晶體的臨床觀察，并且也歸因于雌激素的影響。雌激素毒性導(dǎo)致每組中兩個(gè)非處理相關(guān)的死亡。在該研究中評估的處理是可接受地耐受的。表35反應(yīng)總結(jié)因?yàn)閷φ战M四只小鼠中的兩只以及處理組四只小鼠中的兩只死于雌激素毒性，所以不能確定統(tǒng)計(jì)結(jié)論。利用可獲得的數(shù)據(jù)，當(dāng)與對照組相比時(shí)，處理組中的腫瘤生長中值和平均腫瘤體積降低。該差異在處理的14天期間存在，但也在研究的第25天存在。對照組經(jīng)過25天達(dá)到1000mm3的腫瘤體積，而處理組經(jīng)過36天達(dá)到1000mm3的腫瘤體積。這表明抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb在體內(nèi)減慢MCF-7腫瘤的生長。在整個(gè)研究中，對照組和處理組保持相似的重量。這表明抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb在重量減輕方面沒有引起毒性。實(shí)施例13：在異種移植小鼠中用抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)SDAB處理人HER2+(BT474)乳腺癌在此實(shí)施例中，在CB.17SCID小鼠中的BT474人乳腺腫瘤異種移植物中測定抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb的效果。對于兩組8～12周齡在側(cè)腹中含有1mm3BT474腫瘤片段的異種移植物的CB.17SCID小鼠，當(dāng)腫瘤達(dá)到100mm3～150mm3的平均大小時(shí)，根據(jù)表39中所示的方案進(jìn)行處理。根據(jù)表34中所示的方案對兩組無胸腺裸小鼠進(jìn)行給藥。將所有載劑(PBS對照)和抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb(表39中顯示為SB-01)每天三次腹膜內(nèi)(i.p.)施用，間隔6小時(shí)，持續(xù)14天，其中在第1天遞送兩個(gè)劑量(tid×14，第一天2個(gè)劑量)。載劑和抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb的給藥體積為0.478mL/20克體重(23.88mL/kg)，并按比例調(diào)整至每只動物的體重。組1接受載劑并作為腫瘤移植和進(jìn)展的基準(zhǔn)組以及對照。組2給予1mg/kg的抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb。表39研究方案在研究的前14天期間，處理組接受抗STAT3BVHH13，對照組僅接受載劑。如表40所示，在此期間，處理組在整個(gè)研究期間保持和增加體重，而對照組在整個(gè)研究中具有降低的重量。這表明，就體重減輕而言，處理組沒有經(jīng)歷來自抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb的毒性。兩組平均腫瘤體積和中值腫瘤體積相似，并且在研究的第15天完全相同。在研究的第59天，兩組達(dá)到700mm3的腫瘤體積。這表明當(dāng)與對照組相比時(shí)，抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb在體內(nèi)不減少BT474腫瘤的生長。圖11示出了組平均腫瘤體積。表40BT474反應(yīng)總結(jié)#-對照組實(shí)施例14：產(chǎn)生針對抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)SDAB的小鼠單克隆抗體在此實(shí)施例中，產(chǎn)生針對本發(fā)明的sdAb的小鼠單克隆抗體。使用的動物是8～10周齡的BALB/c雌性小鼠。使用水溶性佐劑(CBL)。所使用的HAT和HT來自Sigma-Aldrich。使用抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb來免疫三只小鼠并制備雜交瘤細(xì)胞系。將小鼠用水溶性佐劑免疫三次。在一只小鼠中，血清滴度達(dá)到1/51200。處死小鼠，通過將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系Sp2/0融合來制備雜交瘤細(xì)胞系。通過有限稀釋將融合的細(xì)胞接種到96孔板中。在HAT存在下培養(yǎng)融合細(xì)胞，測試651個(gè)單克隆。在651個(gè)單克隆中，鑒定了27個(gè)陽性克隆，其特異性結(jié)合抗STAT3細(xì)菌VHH13(SEQIDNO:3)sdAb抗原。實(shí)施例15：KRAS(G12D)單域抗體對PANC-1人胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性本實(shí)施例使用人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1證明了抗KRAS(G12D)(SEQIDNO:2)sdAb的抗增殖作用。對于實(shí)驗(yàn)，PANC-1細(xì)胞生長直到它們達(dá)到90％的匯合度。此時(shí)，使用如上所述的MTT測定進(jìn)行增殖研究。在處理后3天，抗KRAS(G12D)(SEQIDNO:2)sdAB對PANC-1細(xì)胞的抗增殖性質(zhì)示于表41中。用50.0μg/ml和100μg/ml抗KRAS(G12D)(SEQIDNO:2)sdAb處理的PANC-1細(xì)胞分別顯示出19.9和37.7的平均生長抑制率。表41抗KRAS(G12D)(SEQIDNO:2)sdAb對PANC-1癌細(xì)胞的抗增殖作用平均值A(chǔ)bs±SE抑制％對照0.281±0.01750μg/ml0.225±0.00619.9100μg/ml0.175±0.01637.7因此，抗KRAS(G12D)(SEQIDNO:2)sdAb在PANC-1人胰腺癌細(xì)胞中顯示劑量依賴性生長抑制。實(shí)施例16：TNF-αSDAB的體外生長抑制本實(shí)施例說明了開發(fā)測定TNF-α濃度和評估抑制TNF-α功能的方法。在U937人肺淋巴母細(xì)胞系中顯示可測量的活性調(diào)節(jié)所需的TNF-α的濃度通過使用Promega的Cell發(fā)光細(xì)胞活力測定對表示代謝活性細(xì)胞存在的ATP的存在進(jìn)行定量評估。將U937細(xì)胞接種在干凈的聚苯乙烯96孔微量培養(yǎng)板(96孔平底板，Cat.#3997)中，總體積為90μL/孔。在37℃，5％CO2和95％空氣的潮濕培養(yǎng)箱中溫育24小時(shí)后，將5μL20×的在生長培養(yǎng)基中系列稀釋的TNF-α以兩次重復(fù)加入每個(gè)孔中(10μL劑量反應(yīng)，最高濃度20ng/mL)。另外，將5μL20×在生長培養(yǎng)基中稀釋的星形孢菌素以兩次重復(fù)添加到每個(gè)孔中(濃度1nM)。在測試劑存在下培養(yǎng)24小時(shí)后，通過對存在的ATP進(jìn)行定量，評估在U937細(xì)胞系中對TNF-α活性顯示可測量的調(diào)節(jié)所需的化合物濃度。相對于未處理的對照孔計(jì)算細(xì)胞生長百分比。所有測試在每個(gè)濃度水平重復(fù)進(jìn)行兩次。使用Prism6.05通過使用以下四個(gè)參數(shù)對數(shù)式的曲線擬合數(shù)據(jù)來估計(jì)測試劑的EC50值：其中，Top是對照吸光度的最大％，Bottom是在最高試劑濃度下相對于對照吸光度的最?。?，Y是對照吸光度％，X是試劑濃度，IC50是與對照細(xì)胞相比，以50％抑制細(xì)胞生長的試劑濃度，n是曲線的斜率。圖12和13證明TNF-α對U937細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。TNF-α對U937的IC50為95.10pg/ml。TNF-α曲線顯示劑量滴定殺傷效應(yīng)。圖14證明了TNF-α對U937的細(xì)胞毒性被三種不同的抗TNF-αVHH抑制。當(dāng)將抗TNF-αVHH62(SEQIDNO:47)sdAb、抗TNF-αVHH66(SEQIDNO:45)sdAb和抗TNF-αVHH69(SEQIDNO:46)sdAb與恒定劑量的TNF-α溫育時(shí)，在EC50時(shí)，所有三種抗TNF-αVHH均抑制TNF-α對U937的殺傷。抗TNF-αVHH62(SEQIDNO:47)sdAb的IC50為約713.6μg/ml。抗TNF-αVHH69(SEQIDNO:46)sdAb的IC50大于208.055μg/ml。不能測定抗TNF-αVHH66(SEQIDNO:45)sdAb的IC50，因?yàn)槠鋸募s1×102μg/ml～1×102μg/ml的抗TNF-αVHH66(SEQIDNO:45)sdAb完全抑制TNF-α細(xì)胞毒性。在抗TNF-αVHH66(SEQIDNO:45)sdAb的濃度范圍內(nèi)，U937細(xì)胞生長增加，因此完全抑制TNF-α活性。盡管已經(jīng)參照某些優(yōu)選實(shí)施方式相當(dāng)詳細(xì)地描述了本發(fā)明，但是其他實(shí)施方式是可能的。例如，本方法公開的步驟不旨在是限制性的，也不旨在表示每個(gè)步驟對于本方法必須是必要的，而僅是示例性步驟。因此，所附權(quán)利要求的范圍不應(yīng)當(dāng)限于本公開中包含的優(yōu)選實(shí)施方式的描述。本文引用的所有參考文獻(xiàn)以其整體通過引用并入本文。SEQUENCELISTING<110>S·辛格<120>針對細(xì)胞內(nèi)抗原的單域抗體<130>7304-51293-4PCT<150>US62/067908<151>2014-10-23<150>US62/148656<151>2015-04-16<150>US62/188353<151>2015-07-02<150>US62/210795<151>2015-08-27<160>81<170>PatentInversion3.5<210>1<211>372<212>DNA<213>人工序列<220><223>駱駝<400>1gaggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcagactggagggtctctgagactc60tcctgtgcagtttctggaaatatcggcagcagctactgcatgggctggttccgccaggct120ccagggaagaagcgcgaggcggtcgcacgtattgtacgtgatggtgccactggctacgca180gactacgtgaagggccgattcaccatctcccgagacagcgccaagaacactctgtatctg240caaatgaacaggctgatacctgaggacactgccatctactactgtgcggcagacctgccc300ccaggttgtttgactcaggcgatttggaattttggttatcggggccagggaaccctggtc360accgtctcctca372<210>2<211>124<212>PRT<213>人工序列<220><223>駱駝<400>2GluValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlySerValGlnThrGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaValSerGlyAsnIleGlySerSerTyr202530CysMetGlyTrpPheArgGlnAlaProGlyLysLysArgGluAlaVal354045AlaArgIleValArgAspGlyAlaThrGlyTyrAlaAspTyrValLys505560GlyArgPheThrIleSerArgAspSerAlaLysAsnThrLeuTyrLeu65707580GlnMetAsnArgLeuIleProGluAspThrAlaIleTyrTyrCysAla859095AlaAspLeuProProGlyCysLeuThrGlnAlaIleTrpAsnPheGly100105110TyrArgGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>3<211>127<212>PRT<213>人工序列<220><223>駱駝<400>3HisValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlySerValGlnAlaGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyAlaAsnGlyGlyArgSer202530CysMetGlyTrpPheArgGlnValProGlyLysGluArgGluGlyVal354045SerGlyIleSerThrGlyGlyLeuIleThrTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerGlnAspAsnThrLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuLysProGluAspThrAlaMetTyrTyrCys859095AlaThrSerArgPheAspCysTyrArgGlySerTrpPheAsnArgTyr100105110MetTyrAsnSerTrpGlyGlnGlyThrGlnValThrValSerSer115120125<210>4<211>126<212>PRT<213>人工序列<220><223>駱駝<400>4GlnValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlySerValGlnAlaGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysValAlaSerThrTyrThrGlyCysMetGly202530TrpPheArgGlnAlaProGlyLysGluArgGluGlyValAlaAlaLeu354045SerSerArgGlyPheAlaGlyHisTyrThrAspSerValLysGlyArg505560PheSerIleSerArgAspTyrValLysAsnAlaValTyrLeuGlnMet65707580AsnThrValLysProGluAspAlaAlaMetTyrTyrCysAlaAlaArg859095GluGlyTrpGluCysGlyGluThrTrpLeuAspArgThrAlaGlyGly100105110HisThrTyrTrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSer115120125<210>5<211>126<212>PRT<213>人工序列<220><223>駱駝<400>5AspValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlySerValGlnAlaGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysValAlaSerThrTyrThrGlyCysMetGly202530TrpPheArgGlnAlaProGlyLysGluArgGluGlyValAlaAlaLeu354045SerSerArgGlyPheAlaGlyHisTyrThrAspSerValLysGlyArg505560PheSerIleSerArgAspTyrValLysAsnAlaValTyrLeuGlnMet65707580AsnThrValLysProGluAspAlaAlaMetTyrTyrCysAlaAlaArg859095GluGlyTrpGluCysGlyGluThrTrpLeuAspArgThrAlaGlyGly100105110HisThrTyrTrpGlyGlnGlyThrGlnValThrValSerSer115120125<210>6<211>126<212>PRT<213>人工序列<220><223>駱駝<400>6AspValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlySerValGlnAlaGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysValAlaSerThrTyrThrGlyCysMetGly202530TrpPheArgGlnAlaProGlyLysGluArgGluGlyValAlaAlaLeu354045SerSerArgGlyPheAlaGlyHisTyrThrAspSerValLysGlyArg505560PheSerIleSerArgAspTyrValLysAsnAlaValTyrLeuGlnMet65707580AsnThrValLysProGluAspAlaAlaMetTyrTyrCysAlaAlaArg859095GluGlyTrpGluCysGlyGluThrTrpLeuAspArgThrAlaGlyGly100105110HisThrTyrTrpGlyGlnGlyThrGlnValThrValSerSer115120125<210>7<211>126<212>PRT<213>人工序列<220><223>駱駝<400>7HisValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlySerValGlnAlaGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysValAlaSerThrTyrThrGlyCysMetGly202530TrpPheArgGlnAlaProGlyLysGluArgGluGlyValAlaAlaLeu354045SerSerArgGlyPheAlaGlyHisTyrThrAspSerValLysGlyArg505560PheSerIleSerArgAspTyrValLysAsnAlaValTyrLeuGlnMet65707580AsnThrValLysProGluAspAlaAlaMetTyrTyrCysAlaAlaArg859095GluGlyTrpGluCysGlyGluThrTrpLeuAspArgThrAlaGlyGly100105110HisThrTyrTrpGlyGlnGlyThrGlnValThrValSerSer115120125<210>8<211>126<212>PRT<213>人工序列<220><223>駱駝<400>8GlnValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlySerValGlnAlaGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysValAlaSerThrTyrThrGlyCysMetGly202530TrpPheArgGlnAlaProGlyLysGluArgGluGlyValAlaAlaLeu354045SerSerArgGlyPheAlaGlyHisTyrThrAspSerValLysGlyArg505560PheSerIleSerArgAspTyrValLysAsnAlaValTyrLeuGlnMet65707580AsnThrValLysProGluAspAlaAlaMetTyrTyrCysAlaAlaArg859095GluGlyTrpGluCysGlyGluThrTrpLeuAspArgThrAlaGlyGly100105110HisThrTyrTrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSer11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