本申請要求2014年10月16日提交的美國臨時申請62/064,994和2014年10月17日提交的62/065,017的權(quán)益，其各自通過引用整體并入本文。
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發(fā)明領域
本發(fā)明一般涉及昆蟲抑制蛋白的領域。本文公開了一類新型的表現(xiàn)出針對作物植物和種子的農(nóng)業(yè)上相關(guān)的害蟲的昆蟲抑制活性的工程化的蛋白。具體地，公開的這類工程化的抑制蛋白具有針對鱗翅目昆蟲害蟲的殺蟲活性。本文提供含有編碼一種或多種公開的工程化的抑制蛋白的多核苷酸構(gòu)建體的植物、植物部分以及種子。
發(fā)明背景
美洲棉鈴蟲(Helicoverpa zea)是主要農(nóng)作物(包括玉米、棉花和大豆)的重要鱗翅目害蟲。被稱為玉米穗蟲(CEW)、棉鈴蟲(CBW)和大豆莢蟲(SPW)的此多食性昆蟲物種特別難以用來自蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)(Bt)或其它細菌物種的殺蟲蛋白來控制。由于其能夠以許多不同作物為食物和目前缺乏高劑量的控制策略，美洲棉鈴蟲(H.zea)被認為處于對目前的昆蟲控制性狀形成抗性的風險中。因此，需要新的作用方式(MoA)以確保保護免遭美洲棉鈴蟲攝食損傷的轉(zhuǎn)基因植物的耐久性。
Cry1Da1蛋白是首先由Hofte,等人“Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of a new Lepidoptera-specific crystal protein gene from Bacillus thuringiensis.”Nucleic Acids Res.18(18)(1990):5545描述的鱗翅目活性蛋白。這種蛋白表現(xiàn)出對夜蛾(Spodoptera)物種(包括草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(草地貪夜蛾，F(xiàn)AW)，一類幾種作物(包括玉米、棉花和大豆)的害蟲)極好的殺蟲活性。然而，Cry1Da1表現(xiàn)出對各種其它主要鱗翅目害蟲，包括螟蛉(例如，棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)和美洲棉鈴蟲)、螟蟲(例如，歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)和西南玉米桿草螟(Diatraea grandiosella))和大豆尺蠖(大豆夜蛾(Pseudoplusia includens))的低到中等的活性。由于其窄的殺蟲譜和其無法提供針對一系列重要鱗翅目農(nóng)業(yè)害蟲(諸如CEW)的商業(yè)級保護，因此Cry1Da1殺蟲蛋白具有作為轉(zhuǎn)基因植物昆蟲控制性狀的有限價值。結(jié)果，目前沒有商業(yè)品種的抗蟲作物利用Cry1Da1作為植物結(jié)合殺蟲劑(plant-incorporated protectant)。
盡管其窄的殺蟲譜，Cry1Da1仍是一種令人關(guān)注的殺蟲蛋白，因為似乎Cry1Da1蛋白使用一種替代的MoA來控制某些鱗翅目害蟲。為此證據(jù)來自具有多個抗蟲集落的研究。例如，對Cry1Ac中毒有抗性的小菜蛾(Plutella xylostella)(小菜蛾(diamondback moth))和棉紅鈴蟲(Pectinophora gossypiella)(棉紅鈴蟲)的田間采集(field-derived)的集落保留對Cry1Da1蛋白的充分靈敏性(Tabashnik,等人.“Cross-Resistance of Pink Bollworm(Pectinophora gossypiella)to Bacillus thuringiensis toxins.”Appl.Environ.Microbiol.66(2000):4582-4584；Tabashnik,等人.“Cross-Resistance to Bacillus thuringiensis Toxin Cry1Ja in a Strain of Diamondback Moth Adapted to Artificial Diet.”J.Invert.Pathol.76:(2000):81-83.)。這些多條證據(jù)表明，Cry1Da1識別與由目前在轉(zhuǎn)基因作物中形成的鱗翅目活性蛋白識別的那些受體(包括Cry1Ac、Cry1Ab、Cry1A.105、Cry1Fa、Cry2Ae和Cry2Ab2)不同的鱗翅目中腸受體。鑒于這種明顯新型的MoA，優(yōu)化Cry1Da1樣蛋白以改善針對更廣譜的棉鈴蟲(Helicoverpa)物種的活性，同時保持或增加它們針對夜蛾的殺蟲活性將產(chǎn)生用于昆蟲抗性管理的高價值的植物結(jié)合殺蟲劑。
發(fā)明概述
在本發(fā)明中，已經(jīng)鑒定了TIC844和Cry1Da支架蛋白的幾種氨基酸序列變體表現(xiàn)出針對美洲棉鈴蟲顯著改善的活性(與Cry1Da1天然毒素相比較)同時保留極好的針對草地夜蛾(S.frugiperda)的活性。TIC844和Cry1Da的改良變體已被工程化以在作物(例如，玉米、大豆、棉花、甘蔗)中表達，并且鑒于Cry1Da明顯獨特的作用方式與抗美洲棉鈴蟲活性的工程化改善相結(jié)合提供在植物內(nèi)抗性管理和鱗翅目昆蟲害蟲控制的新型選擇。
本文所述的工程化的鱗翅目毒性蛋白(稱為“工程化的毒素蛋白”、“工程化的毒性蛋白”或“工程化的殺蟲蛋白”)是天然存在的蘇云金芽孢桿菌殺蟲毒素Cry1Da1(SEQ ID NO:2)或Cry1Da1的嵌合同源物TIC844(SEQ ID NO:14)的衍生物，TIC844包括Cry1Da1核心毒素但用Cry1Ab3原毒素替代天然Cry1Da1原毒素結(jié)構(gòu)域。與在SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14中的任一者中所示出的支架蛋白相比，本發(fā)明工程化的殺蟲蛋白各自含有至少一個氨基酸取代、一個氨基酸添加或一個氨基酸缺失。本發(fā)明工程化的殺蟲蛋白對美洲棉鈴蟲(玉米穗蟲、大豆莢蟲、棉鈴蟲)和草地夜蛾(草地貪夜蛾)物種的昆蟲特別有毒性。盡管支架蛋白TIC844(SEQ ID NO:14)和Cry1Da1(SEQ ID NO:2)對美洲棉鈴蟲顯示低毒性，但本發(fā)明工程化的殺蟲蛋白表現(xiàn)出令人驚訝的和意想不到的針對鱗翅目昆蟲害蟲(包括美洲棉鈴蟲)的改善的殺蟲活性和增強的殺蟲譜。
在某些實施方案中，本文公開了包含如在SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:42中的任一者中所示出的氨基酸序列或其昆蟲抑制片段的工程化的殺蟲蛋白。在某些實施方案中，工程化的殺蟲蛋白表現(xiàn)出針對鱗翅目的昆蟲物種的抑制活性。通過本發(fā)明的鱗翅目毒性蛋白抑制的目標鱗翅目害蟲物種至少包括草地貪夜蛾(草地夜蛾)、甜菜夜蛾(beet armyworm)(甜菜夜蛾(Spodoptera exigua))、花邊粘蟲(bertha armyworm)(蓓帶夜蛾(Mamestra configurata))、黑切根蟲(black cutworm)(球菜夜蛾(Agrotis ipsilon))、卷心菜尺蠖(cabbage looper)(粉紋夜蛾(Trichoplusia ni))、大豆尺蠖(黃豆銀紋夜蛾(Chrysodeixis includens))、黎豆夜蛾(velvetbean caterpillar)(黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis))、苜蓿綠夜蛾(green cloverworm)(苜蓿綠夜蛾(Hypena scabra))、煙草夜蛾(tobacco budworm)(煙草夜蛾(Heliothis virescens))、顆粒地老虎(粒膚地老虎(Agrotis subterranea))、行軍蟲(美洲粘蟲(Pseudaletia unipuncta))、西部切根蟲(西部灰地老虎(Agrotis orthogonia))、歐洲玉米螟蟲(歐洲玉米螟)、臍橙螟(navel orangeworm)(臍橙螟(Amyelois transitella))、玉米根網(wǎng)螟(玉米根草螟(Crambus caliginosellus))、野螟(sod webworm)(水稻切葉野螟(Herpetogramma licarsisalis))、向日葵同斑螟(sunflower moth)(向日葵同斑螟(Homoeosoma electellum))、小玉米莖螟蟲(南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus))、蘋果蠹蛾(codling moth)(蘋果小卷蛾(Cydia pomonella))、葡萄卷葉蛾(grape berry moth)(葡萄菜果蛾(Endopiza viteana))、東方果蛾(oriental fruit moth)(梨小食心蟲(Grapholita molesta))、向日葵芽蛾(sunflower bud moth)(向日葵芽蛾(Suleima helianthana))、小菜蛾(小菜蛾(Plutella xylostella))、棉紅鈴蟲(棉紅鈴蟲(Pectinophora gossypiella))、粉莖螟蟲(稻蛀莖夜蛾(Sesamia inferens))、舞毒蛾(gypsy moth)(舞毒蛾(Lymantria dispar))、棉葉蟲(棉葉波紋夜蛾(Alabama argillacea))、果樹卷葉蟲(果樹卷葉蛾(Archips argyrospila))、歐洲卷葉蟲(薔薇卷葉蛾(Archips rosana))、亞洲水稻螟蟲或稻桿螟蟲(二化螟(Chilo suppressalis))、水稻卷葉蟲(稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocis medinalis))、玉米根網(wǎng)螟(玉米根草螟(Crambus caliginosellus))、藍草網(wǎng)螟(早熟禾草螟(Crambus teterrellus))、西南部玉米螟蟲(西南玉米桿草螟(Diatraea grandiosella))、甘蔗螟蟲(小蔗螟(Diatraea saccharalis))、多刺螟蛉(棉斑實蛾(Earias insulana))、斑點螟蛉(翠紋金剛鉆(Earias vittella))、東半球棉鈴蟲(Old World cotton bollworm)(棉鈴蟲(Helicoverpa armigera))、玉米穗蟲、大豆莢蟲或棉鈴蟲(美洲棉鈴蟲)、野螟(水稻切葉野螟(Herpetogramma licarsisalis))、歐洲葡萄卷蛾(花翅卷蛾(Lobesia botrana))、柑橘潛葉蛾(桔潛葉蛾(Phyllocnistis citrella))、大菜粉蝶(large white butterfly)(大菜粉蝶(Pieris brassicae))、進口菜青蟲、或小菜粉蝶(small white butterfly)(小菜粉蝶(Pieris rapae))、煙草夜蛾、或斜紋夜蛾(cluster caterpillar)(斜紋夜蛾(Spodoptera litura))和番茄斑潛蠅(tomato leafminer)(番茄斑潛蠅(Tuta absoluta))。
本文還公開了編碼工程化的殺蟲蛋白或其殺蟲片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地連接到異源啟動子，并且工程化的殺蟲蛋白包含如在SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:42中的任一者中所示出的氨基酸序列。
在另一個實施方案中，本文公開了編碼工程化的殺蟲蛋白的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含任選地在嚴格條件下與如SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:41中的任一者中所示出的多核苷酸序列的反向互補序列雜交的核苷酸序列；或編碼包含如在SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:42中的任一者中所示出的氨基酸序列的工程化的殺蟲蛋白。
本文還提供包含如在SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:41中的任一者中所示出的多核苷酸的宿主細胞，其中所述宿主細胞選自由細菌宿主細胞或植物宿主細胞組成的組。涵蓋的細菌宿主細胞包括選自由以下組成的組的細菌宿主細胞：土壤農(nóng)桿菌(Agrobacterium)、根瘤菌(Rhizobium)、芽孢桿菌(Bacillus)、短芽孢桿菌(Brevibacillus)、埃希氏桿菌(Escherichia)、假單胞菌(Pseudomonas)、克雷伯氏菌(Klebsiella)和歐文氏菌(Erwinia)，其中所述芽孢桿菌物種是蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)或蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)，所述短芽孢桿菌是側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacillus laterosperous)，并且所述埃希氏桿菌是大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)。此外，預期是植物宿主細胞包括單子葉植物或雙子葉植物。
在又一個實施方案中，本文提供了包含工程化的殺蟲蛋白的昆蟲抑制組合物，所述工程化的殺蟲蛋白包含如在SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:42中的任一者中所示出的氨基酸序列或其昆蟲抑制片段?？梢灶A期，此昆蟲抑制組合物還可以包含至少一種與工程化的殺蟲蛋白不同的昆蟲抑制劑。預期的昆蟲抑制劑包括昆蟲抑制蛋白、昆蟲抑制dsRNA分子和昆蟲抑制化學物質(zhì)?？梢灶A期的是，至少一種其它殺蟲劑可以表現(xiàn)出針對一種或多種鱗翅目、鞘翅目、半翅目、同翅目或纓翅目的害蟲物種的活性。
本文還公開了包含昆蟲抑制有效量的工程化的殺蟲蛋白的種子，所述工程化的殺蟲蛋白包含如在SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:42中的任一者中所示出的氨基酸序列；或SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:41中的任一者中所示出的多核苷酸。
在另一個實施方案中本文還公開了一種用于控制鱗翅目害蟲的方法，所述方法包括使鱗翅目害蟲與抑制量的工程化的殺蟲蛋白接觸。
在又一個實施方案中，本文公開了包含工程化的殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因植物細胞、植物或植物部分。還提供了用于控制鱗翅目害蟲的方法，所述方法包括使害蟲暴露于包含工程化的殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因植物細胞、植物或植物部分。還預期了得自包含工程化的殺蟲蛋白的植物細胞、植物或植物部分的商品產(chǎn)品，其中所述產(chǎn)品包含可檢測的量的工程化的殺蟲蛋白。預期的商品產(chǎn)品包括植物生物質(zhì)、油、粕、動物飼料、面粉、薄片、麩皮、棉絨、殼和加工的種子。
本文所公開的另一種方法是生產(chǎn)包含工程化的殺蟲蛋白的種子的方法，所述方法包括：種植至少一種包含工程化的殺蟲蛋白的種子；從所述種子生長植物；和從植物收獲種子，其中所述收獲的種子包含工程化的殺蟲蛋白。
本申請公開的又一種方法是抑制鱗翅目害蟲攝食作物植物的方法，所述方法包括通過一個或多個氨基酸殘基的取代來修飾SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14的一個或多個氨基酸殘基以產(chǎn)生修飾的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14；和在所述作物植物的組織內(nèi)、在組織表面上或在組織附近制備可獲得的鱗翅目抑制量的修飾的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14；其中SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14修飾的氨基酸殘基選自由以下組成的組：282位處的絲氨酸被賴氨酸或纈氨酸取代、316位處的酪氨酸被絲氨酸取代、368位處的異亮氨酸被脯氨酸或精氨酸取代、374位處的絲氨酸被精氨酸取代、375位處的天冬酰胺被組氨酸取代、以及432位處的異亮氨酸被亮氨酸取代。
還提供了編碼本發(fā)明的工程化的殺蟲蛋白的重組多核苷酸分子。預期的重組多核苷酸分子包含選自由SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:41組成的組的多核苷酸序列；和任選地編碼不同于工程化的殺蟲蛋白的昆蟲抑制劑的多核苷酸序列。
本申請公開的另一種方法是增加支架蛋白的鱗翅目活性并增強鱗翅目抑制譜的方法，所述方法包括通過氨基酸殘基的取代來修飾SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14的一個或多個氨基酸殘基以產(chǎn)生工程化的殺蟲蛋白；其中SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14修飾的氨基酸殘基選自由以下組成的組：282位處的絲氨酸被賴氨酸或纈氨酸取代、316位處的酪氨酸被絲氨酸取代、368位處的異亮氨酸被脯氨酸或精氨酸取代、374位處的絲氨酸被精氨酸取代、375位處的天冬酰胺被組氨酸取代、以及432位處的異亮氨酸被亮氨酸取代。在該方法的某些實施方案中，工程化的殺蟲蛋白相對于支架蛋白在美洲棉鈴蟲致死率方面具有至少8倍增加。
本發(fā)明的其它實施方案、特征和優(yōu)點將從以下詳細描述、實施例和權(quán)利要求書中而顯而易見。
附圖簡述
圖1示出了針對兩個不同的美洲棉鈴蟲(CEW)集落Union City和Benzon，支架蛋白TIC844(SEQ ID NO:14)與工程化的殺蟲蛋白TIC844_8(SEQ ID NO:26)相比的MIC50值。
序列簡述
SEQ ID NO:1是編碼Cry1Da1蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:2是Cry1Da1蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是編碼Cry1Da1_3蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:4是Cry1Da1_3蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5是編碼Cry1Da1_4蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:6是Cry1Da1_4蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7是編碼Cry1Da1_5蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:8是Cry1Da1_5蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9是編碼Cry1Da1_6蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:10是Cry1Da1_6蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11是編碼Cry1Da1_7蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:12是Cry1Da1_7蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13是編碼TIC844蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:14是TIC844蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:15是編碼TIC844_2蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:16是TIC844_2蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17是編碼TIC844_4蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:18是TIC844_4蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19是編碼TIC844_5蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:20是TIC844_5蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21是編碼TIC844_6蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:22是TIC844_6蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:23是編碼TIC844_7蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:24是TIC844_7蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:25是編碼TIC844_8蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO:26是TIC844_8蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:27是設計用于在植物中表達Cry1Da1蛋白的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:28是Cry1Da1蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:29是設計用于在植物中表達Cry1Da1_2.nno蛋白的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:30是Cry1Da1_2.nno蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:31是設計用于在植物中表達Cry1Da1_3.nno蛋白的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:32是Cry1Da1_3.nno蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:33是設計用于在植物中表達Cry1Da1_4.nno蛋白的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:34是Cry1Da1_4.nno蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:35是設計用于在植物中表達Cry1Da1_5.nno蛋白的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:36是Cry1Da1_5.nno蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:37是設計用于在植物中表達Cry1Da1_6.nno蛋白的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:38是Cry1Da1_6.nno蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:39是設計用于在植物中表達Cry1Da1_7.nno蛋白的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:40是Cry1Da1_7.nno蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:41是設計用于在植物中表達TIC844_9.nno蛋白的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:42是TIC844_9.nno蛋白毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:43是設計用于在植物中表達TIC844_11.nno蛋白的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:44是TIC844_11.nno蛋白毒素的氨基酸序列。
發(fā)明詳述
本文提供了相對于其它先前已知的鱗翅目殺蟲蛋白表現(xiàn)出令人驚訝的更高水平的針對鱗翅目物種的毒性活性和更寬的殺蟲譜的工程化的殺蟲蛋白。這些工程化的殺蟲蛋白得自用作各種氨基酸修飾的模板的殺蟲支架蛋白。此類殺蟲支架蛋白的實例包括但不限于Cry1Da1和TIC844(Cry1Da1的同源物)。TIC844包含Cry1Da1核心毒素(即，結(jié)構(gòu)域I、II和III)，但利用Cry1Ab3原毒素結(jié)構(gòu)域以確保在蘇云金芽孢桿菌(Bt)中良好表達。當使用天然Cry1Da1原毒素結(jié)構(gòu)域時，Cry1Da1在Bt中的表達較差。然而，如在本申請中表明，當天然原毒素結(jié)構(gòu)域被去除并且Cry1Da1核心毒素編碼區(qū)段與編碼Cry1Ab3原毒素結(jié)構(gòu)域的區(qū)段同框融合時，Cry1Da1核心毒素的表達在Bt的無晶體(acrystalliferous)菌株中顯著改善。值得注意的是，支架蛋白TIC844(SEQ ID NO:14)和Cry1Da1(SEQ ID NO:2)不表現(xiàn)出在工程化的殺蟲蛋白中觀察到的商業(yè)上有用的鱗翅目抑制譜和改善的鱗翅目抑制活性。
本文公開的工程化的殺蟲蛋白通過氨基酸修飾相關(guān)，使得修飾的蛋白表現(xiàn)出相對于母體支架蛋白TIC844或Cry1Da1增強的鱗翅目抑制譜和/或改善的鱗翅目抑制活性。短語“活性更強”、“改善的活性”、“增強的特異性”、“增加的毒性效力”、“增加的毒性”、“改善的鱗翅目抑制活性”、“更大的鱗翅目抑制活性”和“增強的鱗翅目抑菌譜”是指針對鱗翅目昆蟲而言工程化的殺蟲蛋白的活性與支架蛋白(TIC844或Cry1Da1)的活性的比較，其中歸因于工程化的殺蟲蛋白的活性比歸因于支架蛋白的活性更大。在某些實施方案中，當與支架TIC844或Cry1Da1蛋白的活性相比時，本文提供的工程化的殺蟲蛋白表現(xiàn)出增強的鱗翅目抑制譜和/或改善的或更大的鱗翅目抑制活性，其中鱗翅目害蟲物種包括但不限于美洲棉鈴蟲和草地夜蛾。
如本文所用，術(shù)語和短語“活性的”或“活性”；“殺蟲的活性”或“殺蟲的”；或“殺蟲劑的活性”，“昆蟲抑制性”，“殺蟲劑的”或“昆蟲抑制量”是指毒性劑(諸如殺蟲蛋白)在抑制(抑制生長、攝食、繁殖或活力)、阻止(阻止生長、攝食、繁殖或活力)、控制(控制害蟲侵擾、控制害蟲在含有有效量的公開的工程化的殺蟲蛋白的特定作物上的攝食活動)或殺死害蟲(導致發(fā)病率、死亡率或減少繁殖力)的功效。類似地，“鱗翅目抑制量”是指毒性劑(諸如殺蟲蛋白)導致鱗翅目活力、鱗翅目生長、鱗翅目發(fā)育、鱗翅目繁殖、鱗翅目攝食行為、鱗翅目交配行為的任何可測量的抑制和/或?qū)Ρ击[翅目攝食的植物的不利影響的任何可測量的減少的量。這些術(shù)語旨在包括向害蟲提供殺蟲有效量的毒性劑的結(jié)果，其中將害蟲暴露于毒性劑導致發(fā)病率、死亡率、減少的繁殖力或發(fā)育遲緩。這些術(shù)語還包括由于在植物中或在植物上提供殺蟲有效量的毒性劑而引起害蟲對植物、植物組織、植物部分、種子、植物細胞，或?qū)χ参锟梢陨L的特定地理位置的排斥。通常，殺蟲活性是指毒性劑有效抑制生長、發(fā)育、活力、攝食行為、交配行為、繁殖力，或特定目標害蟲(包括但不限于鱗翅目昆蟲)的由攝食該蛋白、蛋白區(qū)段、蛋白部分或多核苷酸的昆蟲引起的不利影響的任何可測量的降低的能力。毒性劑可通過植物來產(chǎn)生，或者可以應用到植物或其中植物所位于的位置內(nèi)的環(huán)境中。
當毒劑提供于目標害蟲的飲食中被害蟲攝取時，殺蟲劑有效量的毒性劑顯示出殺蟲活性。毒性劑可以是殺蟲蛋白或一種或多種本領域已知的化學劑。殺蟲或殺昆蟲化學劑和殺蟲或殺昆蟲蛋白劑可以單獨使用或彼此組合使用?；瘜W劑包括但不限于在目標害蟲中靶向特定基因用于抑制的dsRNA分子、有機氯化物、有機磷酸酯、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯、新煙堿類和瑞諾烷(ryanoid)。殺蟲或殺昆蟲蛋白劑包括本申請中所述的工程化的殺蟲蛋白，以及包括靶向鱗翅目害蟲物種的那些其它蛋白質(zhì)毒性劑，以及用于控制其它植物害蟲的蛋白質(zhì)毒素(諸如用于控制鞘翅目、半翅目和同翅目物種的本領域可獲得的Cry蛋白質(zhì))。
術(shù)語“區(qū)段”或“片段”在本文中用于描述比描述工程化的殺蟲蛋白的完整氨基酸或核酸序列短的連續(xù)的氨基酸或核酸序列。
意圖是，提及害蟲(特別是作物植物的害蟲)意指作物植物的昆蟲害蟲，特別是通過公開的工程化的殺蟲蛋白控制的那些鱗翅目昆蟲害蟲。然而，當靶向這些害蟲的毒性劑共定位或與公開的工程化的殺蟲蛋白一起存在時，提及害蟲還可包括植物的鞘翅目、半翅目和同翅目昆蟲害蟲，以及線蟲和真菌。
公開的工程化的殺蟲蛋白表現(xiàn)出對來自鱗翅目昆蟲物種的昆蟲害蟲(包括成蟲、蛹、幼蟲和卵)的殺蟲活性。鱗翅目的昆蟲包括但不限于行軍蟲、切根蟲、尺蠖和夜蛾科的食夜蛾，例如，草地貪夜蛾(草地夜蛾)、甜菜夜蛾(甜菜夜蛾)、花邊粘蟲(蓓帶夜蛾)、黑切根蟲(球菜夜蛾)、卷心菜尺蠖(粉紋夜蛾)、大豆尺蠖(大豆夜蛾)、黎豆夜蛾(黎豆夜蛾)、苜蓿綠夜蛾(苜蓿綠夜蛾)、煙草夜蛾(煙草夜蛾)、顆粒地老虎(粒膚地老虎)、行軍蟲(美洲粘蟲)、西部切根蟲(西部灰地老虎)；來自螟蛾科的螟蟲、箱蛾幼蟲(casebearers)、網(wǎng)螟、錐形蟲(coneworms)、菜青蟲(cabbageworms)和骨化蟲(skeletonizers)，例如，歐洲玉米螟蟲(歐洲玉米螟)、臍橙螟(臍橙螟)、玉米根網(wǎng)螟(玉米根草螟)、野螟(水稻切葉野螟)、向日葵同斑螟(向日葵同斑螟)、小玉米莖螟蟲(南美玉米苗斑螟)；卷葉蟲、芽蟲(budworms)、種蟲(seed worms)和卷蛾科的果蠕蟲，例如，蘋果蠹蛾(蘋果小卷蛾)、葡萄卷葉蛾(葡萄菜果蛾)、東方果蛾(梨小食心蟲)、向日葵芽蛾(向日葵芽蛾)；和許多其它經(jīng)濟上重要的鱗翅目，例如，小菜蛾(小菜蛾)、棉紅鈴蟲(棉紅鈴蟲)和舞毒蛾(舞毒蛾)。鱗翅目的其它昆蟲害蟲包括(例如)棉葉波紋夜蛾(棉葉蟲)、果樹卷葉蛾(果樹卷葉蟲)、薔薇卷葉蛾(歐洲卷葉蟲)和其它黃卷蛾種類、二化螟(亞洲水稻螟蟲或稻桿螟蟲)、稻縱卷葉螟(水稻卷葉蟲)、玉米根草螟(玉米根網(wǎng)螟)、早熟禾草螟(藍草網(wǎng)螟)、西南玉米桿草螟(西南部玉米螟蟲)、小蔗螟(甘蔗螟蟲)、棉斑實蛾(spiny bollworm)、翠紋金剛鉆(spotted bollworm)、棉鈴蟲(American bollworm)、美洲棉鈴蟲(玉米穗蟲或棉鈴蟲)、煙草夜蛾(煙草夜蛾)、水稻切葉野螟(野螟)、花翅卷蛾(歐洲葡萄卷蛾)、桔潛葉蛾(柑橘潛葉蛾)、大菜粉蝶(大菜粉蝶)、小菜粉蝶(進口菜青蟲或小菜粉蝶)、小菜蛾(小菜蛾)、甜菜夜蛾(甜菜夜蛾)、斜紋夜蛾(煙草夜蛾、斜紋夜蛾)和番茄斑潛蠅(番茄斑潛蠅)。
在本申請中，提及“分離的DNA分子”或等效術(shù)語或短語，旨在意指該DNA分子是單獨存在或與其它組合物組合，但不在其天然環(huán)境內(nèi)的DNA分子。例如，在生物體的基因組的DNA內(nèi)天然發(fā)現(xiàn)的核酸元件諸如編碼序列、內(nèi)含子序列、非翻譯前導序列、啟動子序列、轉(zhuǎn)錄終止序列等，只要元件位于生物體的基因組內(nèi)并且在其天然發(fā)現(xiàn)的基因組內(nèi)的位置處，就不被認為是“分離的”。然而，這些元件中的每一個，以及這些元件的子部分，在本公開的范圍內(nèi)將是“分離的”，只要該元件不在生物體的基因組內(nèi)并且在其天然發(fā)現(xiàn)的基因組內(nèi)的位置處。類似地，編碼殺蟲蛋白或該蛋白的任何天然存在的殺蟲變體的核苷酸序列將是分離的核苷酸序列，只要該核苷酸序列不是位于天然發(fā)現(xiàn)編碼該蛋白質(zhì)的序列的細菌DNA內(nèi)。編碼天然存在的殺昆蟲蛋白的氨基酸序列的合成的核苷酸序列將被認為是為了本公開的目的而分離。為了本公開的目的，任何轉(zhuǎn)基因核苷酸序列，即，插入植物或細菌的細胞的基因組中，或存在于染色體外載體的DNA的核苷酸序列，將被認為是分離的核苷酸序列，無論該序列是否存在于用于轉(zhuǎn)化細胞的質(zhì)?；蝾愃平Y(jié)構(gòu)內(nèi)，在植物或細菌的基因組內(nèi)，或以可檢測的量存在于得自該植物或細菌的組織、子代、生物樣品或商品產(chǎn)品中。
如實施例中進一步所述，重復多輪工程化、測試和選擇超過兩千(2000)種TIC844和Cry1Da1的氨基酸序列變體導致某些氨基酸殘基的鑒定，所述殘基可被取代、插入或從給定的支架蛋白刪除以產(chǎn)生相比于基線支架蛋白TIC844或Cry1Da1的譜和活性表現(xiàn)出擴大的鱗翅目抑制譜和/或改善的鱗翅目抑制活性(即，毒性更強；需要較少的殺蟲蛋白以獲得相同的死亡率水平)的工程化的殺蟲蛋白。這些重復多輪工程化、測試和選擇也導致不改變蛋白質(zhì)的昆蟲抑制譜或活性的TIC844和Cry1Da1支架蛋白中的中性氨基酸殘基取代、插入或缺失的鑒定。本文鑒定了TIC844和Cry1Da1支架中可被修飾以產(chǎn)生相對于TIC844或Cry1Da1增強的鱗翅目抑制譜和/或改善的鱗翅目抑制活性的特定氨基酸殘基。在某些實施方案中，相比于SEQ ID NO:14(TIC844)或SEQ ID NO:2(Cry1Da1)的支架蛋白，本文提供的工程化的殺蟲蛋白可表現(xiàn)出針對鱗翅目害蟲物種的約八倍或更大的鱗翅目抑制活性。
這些重復多輪中的“工程化”包括鑒定支架蛋白中的相關(guān)殘基以修飾來生成修飾的測試蛋白，和克隆并表達所得到的修飾的測試蛋白。支架蛋白的原子結(jié)構(gòu)用于引導和補充選擇氨基酸殘基進行修飾用于工程化的半隨機方法。這些重復多輪中的“測試”包括比較修飾的測試蛋白的鱗翅目物種活性與其母體支架蛋白。這些重復多輪中的“選擇”包括鑒定具有改善的活性(改良變體)和被工程化以生成這些改善的變體(這些改良變體在本文中稱為“工程化的殺蟲蛋白”)的相關(guān)殘基的修飾的測試蛋白。
測試和選擇工程化的殺蟲蛋白的方法的實例包括在受控的測定條件下向昆蟲害蟲施用相同量的經(jīng)修飾的測試蛋白和支架蛋白(TIC844或Cry1Da1)并測量和比較修飾的測試蛋白和支架蛋白的效力。用于測試和選擇工程化的殺蟲蛋白的另一種方法包括確定在受控的測定條件下(即，獲得劑量反應曲線)引起相同的昆蟲群體響應的經(jīng)修飾的測試蛋白和支架蛋白(TIC844或Cry1Da1)的蛋白劑量(例如，飲食中的蛋白質(zhì)濃度)。用于比較的統(tǒng)計學上穩(wěn)健的劑量響應值是殺死50％的測試群體所需的半數(shù)致死濃度(LC50)或抑制50％蛻皮所需的中值濃度的蛻皮抑制濃度(“MIC50”)。
在某些實施方案中，本文所述的工程化的殺蟲蛋白包括TIC844(SEQ ID NO:14)或Cry1Da1(SEQ ID NO:2)的下面相對位置的至少一個氨基酸修飾：282位處的絲氨酸被賴氨酸或纈氨酸取代、316位處的酪氨酸被絲氨酸取代、368位處的異亮氨酸被脯氨酸或精氨酸取代、374位處的絲氨酸被精氨酸取代、375位處的天冬酰胺被組氨酸取代、以及432位處的異亮氨酸被亮氨酸取代。工程化的殺蟲蛋白還可以包括相同的工程化的殺蟲蛋白序列內(nèi)的至少兩個、三個、四個或更多個這些氨基酸取代或缺失。
包括這些氨基酸修飾的工程化的殺蟲蛋白包括如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:44中所述的蛋白及其昆蟲抑制片段。這些工程化的殺蟲蛋白中的每一個具有約132k-道爾頓的測量質(zhì)量。殺蟲支架蛋白TIC844和Cry1Da1和由其衍生的工程化的殺蟲蛋白的單獨特征列于表1。
表1.TIC844、Cry1Da1和工程化的殺蟲蛋白的特征。
本文所述的工程化的殺蟲蛋白的片段可以呈截短形式，其中一個或多個氨基酸從N-末端、C-末端、蛋白質(zhì)的中間或其組合刪除，而不損失昆蟲抑制活性。這些片段應保留母體工程化的殺蟲蛋白的昆蟲抑制活性。
類似于工程化的殺蟲蛋白的蛋白質(zhì)可以通過使用本領域已知的各種基于計算機的算法進行互相比較來鑒定。例如，與工程化的殺蟲蛋白有關(guān)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列同一性可以使用Clustal W比對使用如下這些缺省參數(shù)進行分析：權(quán)重矩陣：blosum，缺口開放罰分：10.0，缺口延伸罰分：0.05，親水性缺口：開，親水性殘基：GPSNDQERK，殘基特異性缺口罰分：開(Thompson等人(1994)Nucleic Acids Research,22:4673-4680)。百分比氨基酸同一性通過100％乘以(氨基酸同一性/主題蛋白質(zhì)的長度)的乘積進一步計算。其它比對算法也是本領域可獲得的，并且提供與使用Clustal W比對獲得的那些結(jié)果類似的結(jié)果。
如在本申請的實施例中進一步描述的，設計編碼支架蛋白和工程化的殺蟲蛋白的合成或人工序列用于在植物中使用。設計用于在植物中使用的示例性的合成的核苷酸序列在SEQ ID NO:27(Cry1Da1.nno)、SEQ ID NO:29(Cry1Da1_2.nno)、SEQ ID NO:31(Cry1Da1_3.nno)、SEQ ID NO:33(Cry1Da1_4.nno)、SEQ ID NO:35(Cry1Da1_5.nno)、SEQ ID NO:37(Cry1Da1_6.nno)、SEQ ID NO:39(Cry1Da1_7.nno)、SEQ ID NO:41(TIC844_9.nno)和SEQ ID NO:43(TIC844_11.nno)中描述。
構(gòu)建含有這些合成或人工核苷酸序列的表達盒和載體，并根據(jù)轉(zhuǎn)化方法和本領域已知的技術(shù)引入到玉米、棉花和大豆植物細胞。轉(zhuǎn)化的細胞再生為觀察到表達工程化的殺蟲蛋白或支架蛋白的轉(zhuǎn)化的植物。為了測試殺蟲活性，使用從轉(zhuǎn)化的植物獲得的植物葉盤在鱗翅目害蟲幼蟲的存在下進行生物測定。
預期編碼工程化的殺蟲蛋白的重組核酸分子組合物。例如，工程化的殺蟲蛋白可以用重組DNA構(gòu)建體來表達，其中具有編碼工程化的殺蟲蛋白的ORF的多核苷酸分子可操作地連接到基因表達元件(諸如啟動子)和用于在該構(gòu)建體之意的系統(tǒng)中表達所必需的任何其它調(diào)控元件。非限制性實例包括可操作地連接到合成的工程化的殺蟲蛋白編碼序列用于在植物中表達工程化的殺蟲蛋白的植物功能性啟動子，或可操作地連接到工程化的殺蟲蛋白編碼序列用于在Bt細菌或其它芽孢桿菌物種中表達蛋白質(zhì)的Bt功能性啟動子。其它元件可以可操作地連接到工程化的殺蟲蛋白編碼序列，包括但不限于增強子、內(nèi)含子、非翻譯前導序列、編碼的蛋白質(zhì)固定化標簽(HIS-標簽)、易位肽(即，質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽、信號肽)、翻譯后修飾酶的多肽序列、核糖體結(jié)合位點和RNAi靶位點。本文提供的示例性重組多核苷酸分子包括但不限于可操作地連接到諸如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:43的多核苷酸的異源啟動子，所述多核苷酸編碼具有如SEQ ID NO:4(Cry1Da1_3)、SEQ ID NO:6(Cry1Da1_4)、SEQ ID NO:8(Cry1Da1_5)、SEQ ID NO:10(Cry1Da1_6)、SEQ ID NO:12(Cry1Da1_7)、SEQ ID NO:16(TIC844_2)、SEQ ID NO:18(TIC844_4)、SEQ ID NO:20(TIC844_5)、SEQ ID NO:22(TIC844_6)、SEQ ID NO:24(TIC844_7)、SEQ ID NO:26(TIC844_8)、SEQ ID NO:32(Cry1Da1_3.nno)、SEQ ID NO:34(Cry1Da1_4.nno)、SEQ ID NO:36(Cry1Da1_5.nno)、SEQ ID NO:38(Cry1Da1_6.nno)、SEQ ID NO:40(Cry1Da1_7.nno)和SEQ ID NO:44(TIC844_11.nno)中所示的氨基酸序列的多肽或蛋白質(zhì)。異源啟動子還可以可操作地連接到編碼質(zhì)粒靶向工程化的殺蟲蛋白和非靶向工程化的殺蟲蛋白的合成的DNA編碼序列?？梢灶A期的是編碼本文公開的工程化的殺蟲蛋白的重組核酸分子的密碼子可以被同義密碼子取代(在本領域中稱為沉默取代)。
包含工程化的殺蟲蛋白編碼序列的重組DNA分子或構(gòu)建體還可包含編碼一種或多種毒性劑的DNA區(qū)域，所述毒性劑(一種與工程化的殺蟲蛋白、昆蟲抑制性dsRNA分子或輔助蛋白不同的蛋白)可被配置為與編碼工程化的殺蟲蛋白的DNA序列同時表達或共表達。輔助蛋白包括但不限于輔因子、酶、結(jié)合伴侶，或發(fā)揮功能以助于昆蟲抑制劑的有效性(例如通過幫助其表達、影響其在植物中的穩(wěn)定性、優(yōu)化低聚的自由能、增強其毒性并增加其活性譜)的其它試劑。例如，輔助蛋白可促進一種或多種昆蟲抑制劑的攝取，或增強毒性劑的毒性作用。
重組DNA分子或構(gòu)建體可被組裝，使得所有蛋白質(zhì)或dsRNA分子由一個啟動子表達，或每個蛋白或dsRNA分子處于單獨的啟動子控制或其一些組合下。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以由多基因表達系統(tǒng)中表達，其中工程化的殺蟲蛋白由還含有其它開放閱讀框和啟動子的共同的核苷酸區(qū)段表達，這取決于所選的表達系統(tǒng)的類型。例如，細菌多基因表達系統(tǒng)可利用單個啟動子從單個操縱子內(nèi)驅(qū)動多重連接/串聯(lián)開放閱讀框的表達(即，多順反子表達)。在另一實例中，植物多基因表達系統(tǒng)可利用多個未連接的表達盒，每個表達不同蛋白質(zhì)或其它毒性劑諸如一種或多種dsRNA分子。
包含工程化的殺蟲蛋白編碼序列的重組核酸分子或重組DNA構(gòu)建體可通過例如質(zhì)粒、桿狀病毒、合成染色體、病毒顆粒、粘粒、噬菌粒、噬菌體或病毒載體的載體遞送到宿主細胞中。此類載體可以用來實現(xiàn)在宿主細胞中工程化的殺蟲蛋白編碼序列的穩(wěn)定的或瞬時的表達，或編碼的多肽的隨后表達。包含工程化的殺蟲蛋白序列編碼序列且被引入到宿主細胞中的外源重組多核苷酸或重組DNA構(gòu)建體在本文中被稱為“轉(zhuǎn)基因”。
本文提供包含編碼工程化的殺蟲蛋白的任何一種或多種的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因細菌、轉(zhuǎn)基因植物細胞、轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因植物部分。術(shù)語“細菌細胞”或“細菌”可包括但不限于土壤農(nóng)桿菌、芽孢桿菌、埃希氏桿菌、沙門氏菌、假單胞菌或根瘤菌細胞。術(shù)語“植物細胞”或“植物”可以包括但不限于雙子葉植物細胞或單子葉植物細胞。預期的植物和植物細胞包括但不限于苜蓿、香蕉、大麥、豆類、花椰菜、卷心菜、甘藍、胡蘿卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鷹嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三葉草、棉花、葫蘆、黃瓜、花旗松、茄子、桉樹、亞麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭菜、萵苣、火炬松、小米、甜瓜、堅果、燕麥、橄欖、洋蔥、觀賞植物、棕櫚、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松樹、馬鈴薯、楊樹、南瓜、輻射松、蘿卜、油菜籽、水稻、砧木、黑麥、紅花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、香楓、甘薯、柳枝稷、茶、煙草、番茄、黑小麥、草坪草、西瓜及小麥植物細胞或植物。在某些實施方案中，提供了從轉(zhuǎn)基因植物細胞再生的轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因植物部分。在某些實施方案中，轉(zhuǎn)基因植物可以從轉(zhuǎn)基因種子通過切割、折斷、研磨或以其它方式從該植物分離所述部分來獲得。在某些實施方案中，植物部分可以是種子、圓莢、葉、花、莖、根或其任何部分，或轉(zhuǎn)基因植物部分的不可再生部分。如在此上下文中使用的，轉(zhuǎn)基因植物部分的“不可再生”部分是不能被誘導以形成完整植物的部分或不能被誘導以形成能夠有性和/或無性繁殖的完整植物的部分。在某些實施方案中，植物部分的不可再生部分是轉(zhuǎn)基因種子、圓莢、葉、花、莖或根的一部分。
提供制備包含鱗翅目抑制量的工程化的殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因植物的方法。此類植物可通過將編碼本申請?zhí)峁┑墓こ袒臍⑾x蛋白的多核苷酸引入植物細胞，并選擇得自表達昆蟲或鱗翅目抑制量的工程化的殺蟲蛋白的所述植物細胞的植物來制備。植物可以通過再生從植物細胞、種子、花粉或分生組織轉(zhuǎn)化技術(shù)衍生。轉(zhuǎn)化植物的方法在本領域是已知的。
表達工程化的殺蟲蛋白的植物可以通過表達其它殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因事件和/或表達其它轉(zhuǎn)基因性狀如其它昆蟲控制性狀、除草劑耐受性基因、賦予產(chǎn)量或脅迫耐性性狀的基因等進行育種來雜交，或者此類特征可以組合在單個向量中，使得特征全部相關(guān)。
本申請還公開加工的植物產(chǎn)品，其中所述加工的產(chǎn)品包含可檢測的量的工程化的殺蟲蛋白、其昆蟲抑制區(qū)段或片段、或其任何特征部分。在某些實施方案中，加工的產(chǎn)品選自由植物部分、植物生物質(zhì)、油、粕、糖、動物飼料、面粉、薄片、麩皮、棉絨、殼、加工的種子和種子組成的組。在某些實施方案中，加工的產(chǎn)品是不可再生的。植物產(chǎn)品可以包含得自轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物部分的商品或其它商業(yè)產(chǎn)品，其中商品或其它產(chǎn)品可以通過商業(yè)通過檢測核苷酸片段或表達的RNA或蛋白質(zhì)進行跟蹤，所述RNA或蛋白質(zhì)編碼或包含工程化的殺蟲蛋白的區(qū)別部分。
本申請還公開了用工程化的殺蟲蛋白控制作物植物的昆蟲(特別是鱗翅目)侵擾的方法。此類方法可包括種植包含昆蟲或鱗翅目抑制量的工程化的殺蟲蛋白的植物。在某些實施方案中，此類方法還可包括以下任何一種或多種：(i)向植物或產(chǎn)生植物的種子施加包含或編碼工程化的殺蟲蛋白的任何組合物；和(ii)用編碼工程化的殺蟲蛋白的多核苷酸轉(zhuǎn)化植物或產(chǎn)生植物的植物細胞。一般地，預期的是工程化的殺蟲蛋白可以組合物提供、以微生物提供、或者以賦予針對鱗翅目昆蟲的昆蟲抑制活性的轉(zhuǎn)基因植物提供。
在某些實施方案中，工程化的殺蟲蛋白是通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化以在適于表達的條件下表達工程化的殺蟲蛋白的重組芽孢桿菌或任何其它重組細菌細胞制備的昆蟲抑制組合物的殺蟲活性成分。此類組合物可以通過使表達/產(chǎn)生工程化的殺蟲蛋白的此類重組細胞的培養(yǎng)物干燥、凍干、均質(zhì)化、提取、過濾、離心、沉淀或濃縮來制備。此類方法可導致芽孢桿菌或其它昆蟲病原細菌細胞提取物、細胞懸液、細胞勻漿、細胞裂解物、細胞上清液、細胞濾液或細胞沉淀。通過獲得如此生產(chǎn)的工程化的殺蟲蛋白，包含工程化的殺蟲蛋白的組合物可包括細菌細胞、細菌孢子和伴孢包涵體，并且可以配制用于各種用途，包括作為農(nóng)業(yè)昆蟲抑制噴霧產(chǎn)品或作為飲食生物測定中的昆蟲抑制制劑。
在一個實施方案中，為了降低形成抗性的可能性，包含工程化的殺蟲蛋白的昆蟲抑制組合物或轉(zhuǎn)基因植物還可包含至少一種表現(xiàn)出針對相同的鱗翅目昆蟲物種的昆蟲抑制活性但與工程化的殺蟲蛋白不同的另外的毒性劑。此類組合物的可能的另外的毒性劑包括昆蟲抑制蛋白和昆蟲抑制dsRNA分子。使用此類核糖核苷酸序列控制昆蟲害蟲的一個實例描述于Baum等人(美國專利公布2006/0021087 A1)。用于控制鱗翅目害蟲的此類一種或多種另外的多肽可選自由昆蟲抑制蛋白組成的組，諸如但不限于Cry1A(美國專利No.5,880,275)、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A.105、Cry1Ae、Cry1B(美國專利公布No.10/525,318)、Cry1C(美國專利No.6,033,874)、Cry1D、Cry1E、Cry1F和Cry1A/F嵌合體(美國專利No.7,070,982；6,962,705；和6,713,063)、Cry1G、Cry1H、Cry1I、Cry1J、Cry1K、Cry1L、Cry2A、Cry2Ab(美國專利No.7,064,249)、Cry2Ae、Cry4B、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry15、Cry43A、Cry43B、Cry51Aa1、ET66、TIC400、TIC800、TIC834、TIC1415、Vip3A、VIP3Ab、VIP3B、AXMI-001、AXMI-002、AXMI-030、AXMI-035和AXMI-045(美國專利公布2013-0117884 A1)、AXMI-52、AXMI-58、AXMI-88、AXMI-97、AXMI-102、AXMI-112、AXMI-117、AXMI-100(美國專利公布2013-0310543 A1)、AXMI-115、AXMI-113、AXMI-005(美國專利公布2013-0104259 A1)、AXMI-134(美國專利公布2013-0167264A1)、AXMI-150(美國專利公布2010-0160231 A1)、AXMI-184(美國專利公布2010-0004176 A1)、AXMI-196、AXMI-204、AXMI-207、AXMI-209(美國專利公布2011-0030096 A1)、AXMI-218、AXMI-220(美國專利公布2014-0245491 A1)、AXMI-221z、AXMI-222z、AXMI-223z、AXMI-224z、AXMI-225z(美國專利公布2014-0196175 A1)、AXMI-238(美國專利公布2014-0033363 A1)、AXMI-270(美國專利公布2014-0223598 A1)、AXMI-345(美國專利公布2014-0373195 A1)、DIG-3(美國專利公布2013-0219570 A1)、DIG-5(美國專利公布2010-0317569 A1)、DIG-11(美國專利公布2010-0319093 A1)、AfIP-1A及其衍生物(美國專利公布2014-0033361 A1)、AfIP-1B及其衍生物(美國專利公布2014-0033361 A1)、PIP-1APIP-1B(美國專利公布2014-0007292 A1)、PSEEN3174(美國專利公布2014-0007292 A1)、AECFG-592740(美國專利公布2014-0007292 A1)、Pput_1063(美國專利公布2014-0007292 A1)、Pput_1064(美國專利公布2014-0007292 A1)、GS-135及其衍生物(美國專利公布2012-0233726 A1)、GS153及其衍生物(美國專利公布2012-0192310 A1)、GS154及其衍生物(美國專利公布2012-0192310 A1)、GS155及其衍生物(美國專利公布2012-0192310 A1)、如在美國專利公布2012-0167259 A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如在美國專利公布2012-0047606 A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如在美國專利公布2011-0154536 A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如在美國專利公布2011-0112013 A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如在美國專利公布2010-0192256 A1中所述的SEQ ID NO:2和4及其衍生物、如在美國專利公布2010-0077507 A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如在美國專利公布2010-0077508 A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如在美國專利公布2009-0313721 A1中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如在美國專利公布2010-0269221 A1中所述的SEQ ID NO:2或4及其衍生物、如在美國專利No.7,772,465(B2)中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如在WO2014/008054 A2中所述的CF161_0085及其衍生物、如在美國專利公布US2008-0172762 A1、US2011-0055968 A1和US2012-0117690 A1中所述的鱗翅目毒性蛋白及其衍生物；如在US7510878(B2)中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如在美國專利No.7812129(B1)中所述的SEQ ID NO:2及其衍生物等。
在其它實施方案中，昆蟲抑制組合物或轉(zhuǎn)基因植物還可包含至少一種表現(xiàn)出針對不受本發(fā)明的工程化的殺蟲蛋白抑制的昆蟲害蟲(諸如鞘翅目、半翅目和同翅目害蟲)的昆蟲抑制活性的另外的毒性劑，以擴大獲得的昆蟲抑制譜。
用于控制鞘翅目害蟲的此類另外的毒性劑可以選自由諸如但不限于以下的昆蟲抑制蛋白組成的組：Cry3Bb(美國專利No.6,501,009)、Cry1C變體、Cry3A變體、Cry3、Cry3B、Cry34/35、5307、AXMI134(美國專利公布2013-0167264 A1)AXMI-184(美國專利公布2010-0004176 A1)、AXMI-205(美國專利公布2014-0298538 A1)、axmi207(美國專利公布2013-0303440 A1)、AXMI-218、AXMI-220(美國專利公布20140245491A1)、AXMI-221z、AXMI-223z(美國專利公布2014-0196175 A1)、AXMI-279(美國專利公布2014-0223599 A1)、AXMI-R1及其變體(美國專利公布2010-0197592 A1、TIC407、TIC417、TIC431、TIC807、TIC853、TIC901、TIC1201、TIC3131、DIG-10(美國專利公布2010-0319092 A1)、eHIPs(美國專利申請公布No.2010/0017914)、IP3及其變體(美國專利公布2012-0210462 A1)和v-Hexatoxin-Hv1a(美國專利申請公布US2014-0366227 A1)。
用于控制鞘翅目害蟲的此類另外的毒性劑可以選自由諸如但不限于以下的半翅目活性蛋白組成的組：TIC1415(US專利公布2013-0097735 A1)、TIC807(美國專利No.8609936)、TIC834(美國專利公布2013-0269060 A1)、AXMI-036(美國專利公布2010-0137216 A1)和AXMI-171(美國專利公布2013-0055469 A1)。用于控制鞘翅目、鱗翅目和半翅目昆蟲害蟲的另外的多肽可以在由Neil Crickmore維護的蘇云金芽孢桿菌毒素命名網(wǎng)站找到(以btnomenclature.info在萬維網(wǎng)上)。
可以使用本領域普通技術(shù)人員已知的方法諸如聚合酶鏈反應(PCR)、熱擴增和雜交來鑒定工程化的殺蟲蛋白編碼序列和與工程化的殺蟲蛋白具有相當大的百分比同一性的序列。例如，工程化的殺蟲蛋白可用于產(chǎn)生特異性結(jié)合相關(guān)蛋白的抗體，并且可用于篩選和發(fā)現(xiàn)密切相關(guān)的其它蛋白。
此外，編碼工程化的殺蟲蛋白的核苷酸序列可以用作探針和引物用于使用熱循環(huán)或等溫擴增和雜交方法來篩選以鑒定類別的其它成員。例如，得自如SEQ ID NO:3中所示的序列的寡核苷酸可用來確定來源于商品產(chǎn)品的脫氧核糖核酸樣本中的工程化的殺蟲轉(zhuǎn)基因的存在或不存在。鑒于使用寡核苷酸的某些核酸檢測方法的靈敏度，預期得自如SEQ ID NO:3中的任一者中所示出的序列的寡核苷酸可用于檢測源自合并來源的商品產(chǎn)品中各自的工程化的殺蟲蛋白，僅商品產(chǎn)品的一部分得自含有SEQ ID NO:3中任一者的轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將從以下實施例和權(quán)利要求書中而顯而易見。
實施例
鑒于上述情況，本領域技術(shù)人員應當理解的是，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以在公開的具體方面作出改變，并且仍然獲得相似或類似的結(jié)果。因此，本文公開的具體結(jié)構(gòu)和功能細節(jié)不應被解釋為限制性的。應當理解的是，本文引用的每個參考文獻的全部公開內(nèi)容在本申請的公開范圍內(nèi)并入。
實施例1
修飾的測試蛋白的設計和用于昆蟲生物測定測試的樣品制備
本實施例說明了鑒定支架蛋白中的相關(guān)氨基酸殘基以修飾生成修飾的測試蛋白，以及克隆和表達所得到的修飾的測試蛋白所采用的方法。
以分層方法采用幾種分子工程技術(shù)以構(gòu)建具有相比于Cry1Da1和TIC844(Cry1Da1的同源物)的支架蛋白增強的鱗翅目抑制譜和/或改善的鱗翅目抑制活性的Cry1Da1改良變體。第一層或首輪設計主要是假設驅(qū)動。第二和第三層是統(tǒng)計學驅(qū)動的設計輪。例如，在第二層設計中，將統(tǒng)計學上無害的突變與推定的有益突變相結(jié)合，產(chǎn)生滿足定義的統(tǒng)計學標準的雙重突變。在第三層設計中，使用多種統(tǒng)計方法對以前測試中的所有數(shù)據(jù)進行了分析。選擇僅在一種以上統(tǒng)計學方法中顯示統(tǒng)計學上顯著改善的突變?yōu)樽罱K的突變庫。在這一層設計的變體包含一個或兩個以前確認為陽性的變異體陽性突變。因此，與第一和第二層相比，第三層設計顯著豐富了活性變體。如后續(xù)實施例所示，三層設計策略的使用鑒定了單一和協(xié)同突變，相對于TIC844和Cry1Da1支架，某些改良變體針對CEW的活性顯著改善。
用于產(chǎn)生修飾的測試蛋白的方法包括但不限于半隨機修飾、TIC844/Cry1Da1與其它天然蘇云金芽孢桿菌(Bt)蛋白比對變異的定向修飾，以及結(jié)構(gòu)/功能輔助設計。利用分子工程技術(shù)的實例包括以下：
受體結(jié)合。鱗翅目害蟲(特別是棉鈴蟲(CEW，美洲棉鈴蟲))對Cry1Da1/TIC844改良變體的易感性可以歸因于不同的靶向腸受體。用于改善與腸受體結(jié)合從而增加毒性的設計包括：(1)將結(jié)構(gòu)域II的頂端環(huán)中的每個位置突變?yōu)樗邪被犷愋?；?2)使結(jié)構(gòu)域II的頂端環(huán)的所有可能組合與來自其它Cry1Da1同源物(例如，Cry1Db1、Cry1Dc1)和CEW活性的三結(jié)構(gòu)域毒素(例如，Cry1Bb1、Cry1Ja1和Cry2Ab2)的那些交換。
基于比對的方法。Cry1Da1與其它同源物(例如，Cry1Db1和Cry1Dc1)的比對用來鑒定變異區(qū)域。作為比對的結(jié)果，鑒定了一百五十(150)個位置和二百九十五(295)個獨特的單突變。這些位置位于整個三個結(jié)構(gòu)域。四(4)個氨基酸內(nèi)的位置彼此被分組在一起。只有來自同一親本序列的突變才被提名為每組位置，呈現(xiàn)出一百三十二(132)個獨特的變體。
表面誘變方法。編碼支架蛋白的結(jié)構(gòu)域II和III中的表面位置的多核苷酸通過掃描進行誘變。將氨基酸殘基修飾為丙氨酸，其中丙氨酸尚未存在于支架蛋白中。在天然殘基為賴氨酸的表面位置，除了丙氨酸突變之外還引入精氨酸突變。賴氨酸對精氨酸突變的合理性是基于以下觀察：鱗翅目活性毒素傾向于具有非常少的賴氨酸和許多精氨酸，因此假設將結(jié)構(gòu)域II和III中的表面賴氨酸位置改變?yōu)榫彼釋⒃黾有揎椀臏y試蛋白的鱗翅目活性。
蛋白水解事件的變化。蛋白水解過程被假設為鱗翅目昆蟲腸中三結(jié)構(gòu)域毒素活性的重要方面。為了測試這一點，進行了幾組突變可能改變?nèi)魏蔚鞍姿馇懈?。潛在的切割位點位于N-末端以及結(jié)構(gòu)域III和原毒素之間。突變位置包括從N-末端到螺旋4的開始以及從結(jié)構(gòu)域III的C-末端到～40個氨基酸的原毒素的預測環(huán)區(qū)。通常，假定甘氨酸殘基通過蛋白水解位點識別或通過增加蛋白質(zhì)柔性來促進蛋白水解，從而使其更易于蛋白水解切割。此外，胰蛋白酶和糜蛋白酶是兩種蛋白酶，被廣泛接受為鱗翅目中腸中的活力蛋白酶。賴氨酸殘基為胰蛋白酶提供了識別位點，并且酪氨酸殘基為糜蛋白酶提供了識別位點。因此，潛在切割位點中的所選突變位置突變?yōu)楦拾彼帷①嚢彼峄蚶野彼帷?/p>
來自其它CEW活性毒素的潛在的熱點突變。分析了大量蛋白質(zhì)(包括嵌合體、片段和天然序列)對CEW的活性和活性數(shù)據(jù)的缺失。通過對該數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析獲得的信息用于鑒定潛在的具體突變或突變位置，這些突變或位置可能增加所得修飾的測試蛋白中的CEW活性。
使用本領域已知的方法將上述分子工程方法所得到的經(jīng)修飾的測試蛋白克隆到孢子形成特異性表達啟動子下游的重組Bt質(zhì)粒表達載體中并轉(zhuǎn)化到無晶體Bt宿主細胞。
實施例2
在針對鱗翅目害蟲的飲食生物測定中測試修飾的測試蛋白
本實施例說明了由實施例1中描述的工程實踐產(chǎn)生的修飾的測試蛋白的測試。
從實施例1中描述的工程實踐中，產(chǎn)生了約二千五百(2,500)種重組Bt菌株，其表達超過二千三百(2,300)種不同的修飾的測試蛋白。這些修飾的測試蛋白在Bt中表達并測定對各種鱗翅目物種的毒性。用新生幼蟲(孵化后<24小時)對各種鱗翅目物種進行攝食測定，所述物種包括玉米穗蟲(CEW，美洲棉鈴蟲)和草地貪夜蛾(FAW，草地夜蛾)。用于CEW測試的昆蟲卵從兩個不同的實驗室集落獲得：Benson Research,Carlisle,PA和Monsanto Company,Union City,TN。所有表達的修飾的測試蛋白在CEW上進行測試，并且除了進行另外的生物測定以確認CEW活性之外，還在FAW上測試了與其母體支架蛋白相比表現(xiàn)出針對CEW的改善的活性的一些修飾的測試蛋白。
用于生物測定和評估昆蟲死亡率和發(fā)育遲緩的各種方案是本領域已知的。使用方法的變型，例如在PCT專利申請公開No.WO 2012/139004和美國專利No.7,927,598中描述的方法。
實施例3
表現(xiàn)出改善的CEW活性的修飾的測試蛋白
本實施例說明了與多輪測試中的支架TIC844或Cry1Da1蛋白的活性相比，增強的鱗翅目抑制譜和/或一些修飾的測試蛋白的改善或更大的鱗翅目抑制活性的發(fā)現(xiàn)。
由實施例1所述的工程實踐生成并且在實施例2所述的昆蟲生物測定中測試的經(jīng)修飾的測試蛋白在重復輪中進行測試，其中將經(jīng)修飾的測試蛋白的鱗翅目物種活性與其各自的母體支架蛋白(即，TIC844或Cry1Da1)進行比較。在第一輪中，三百七十(370)種不同的修飾的測試蛋白在飲食生物測定中表現(xiàn)出相對于TIC844或Cry1Da1針對CEW的毒性增加。在每種這些飲食生物測定中，在受控的單劑量測定條件下，將相同量的蛋白質(zhì)(修飾的測試蛋白或支架蛋白)提供給CEW。通過測量和比較觀察到的每種修飾的測試蛋白生物測定的死亡率和發(fā)育遲緩與觀察到的母體支架蛋白生物測定的死亡率和發(fā)育遲緩，來測定修飾的測試蛋白和支架蛋白的效力。
當與單劑量測定篩選中的支架蛋白相比時，顯示出針對CEW的毒性增加的三百七十(370)個修飾的測試蛋白中，其中約一百八十(180)個在FAW生物測定中進一步測試，與其支架蛋白母體相比，確定這些修飾的測試蛋白是否維持或表現(xiàn)出增加的FAW活性。這些修飾的測試蛋白中約四十(40)至五十(50)種表現(xiàn)出與其母體支架蛋白相似或更好的FAW活性。還在另外的CEW生物測定中對這些進一步篩選的修飾的測試蛋白進行測試以確認CEW活性。這些輪次選擇和測試修飾的測試蛋白(其表現(xiàn)出改善的CEW活性，同時保持或改善FAW活性)導致改良變體(本文稱為“工程化的殺蟲蛋白”)的最終列表。表2鑒定了這些工程化的殺蟲蛋白和每種工程化的殺蟲蛋白中的氨基酸突變。表2還顯示了支架和工程化的殺蟲蛋白針對CEW和FAW的活性(殺蟲活性以LC50值(在固定的暴露持續(xù)時間內(nèi)殺死50％昆蟲群體所需的毒素濃度。LC50值越低，毒性越大)和MIC50值(在固定的暴露持續(xù)時間內(nèi)抑制50％的幼蟲蛻皮成特定齡期所需的濃度)說明)。該表顯示工程化的殺蟲蛋白具有改善的CEW活性，同時保持或改善FAW活性。
表2.支架蛋白和工程化的殺蟲蛋白的氨基酸突變和活性數(shù)據(jù)。
*使用標準IUPAC氨基酸代碼鑒定氨基酸突變。參見IUPAC-IU B生物化學命名聯(lián)合委員會。Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides.Eur.J.Biochem.138:9-37(1984)。第一個氨基酸序列縮寫表示給定支架蛋白中的原始氨基酸，該數(shù)字表示氨基酸的位置，第二個氨基酸序列縮寫表示在改良的變體蛋白中置于該位置的氨基酸。
**Cry1Da1的核心毒素與TIC844的核心毒素相同。
進一步說明增強的鱗翅目抑制譜和改善的工程化的殺蟲蛋白的鱗翅目抑制活性，工程化的殺蟲蛋白TIC844_8相對于其母體支架蛋白的致死率如圖1所示。圖1的柱狀圖說明了與支架蛋白TIC844相比，TIC844_8針對兩種不同的CEW集落Union City和Benzon的MIC50值。圖1所示的生物測定結(jié)果從蔗糖梯度純化的生物測定制備方法計算。用蔗糖梯度純化制備與蛋白質(zhì)的伴孢晶體制劑相反的蛋白質(zhì)，這些二次生物測定的原因是確保TIC844_8的改善的活性持續(xù)進行更廣泛的純化。此外，測試Union City集落以確認在Benzon集落上觀察到的改善的活性。如圖1所示，TIC844_8的三個殘基的突變(S282V_Y316S_I368P)相對于TIC844對于Union City集落CEW致死率提高了8倍，并且相對于TIC844對于Benzon集落CEW致死率提高了50倍。
甚至進一步證明工程化的殺蟲蛋白的增強的鱗翅目抑制譜和改善的鱗翅目抑制活性，來自針對廣譜鱗翅目昆蟲物種進行的飲食生物測定研究中的TIC844和TIC844_8的昆蟲活性概況示于表3中。在表3的生物測定研究中測試的昆蟲包括黑切根蟲(BCW，球菜夜蛾)、玉米穗蟲(CEW，美洲棉鈴蟲)、草地貪夜蛾(FAW，草地夜蛾)、南部行軍蟲(SAW，亞熱帶粘蟲(Spodoptera eridiania))、卷心菜尺蠖(CLW，粉紋夜蛾)、歐洲玉米螟蟲(ECB，歐洲玉米螟)、西南部玉米螟蟲(SWC，西南玉米桿草螟)、煙草夜蛾(TBW，煙草夜蛾)、黎豆夜蛾(VBC，黎豆夜蛾)、大豆尺蠖(SBL，大豆尺蠖(Chrysodeixis includes))和甘蔗螟蟲(SCB，小蔗螟)。此表3顯示了與母體支架蛋白TIC844相比TIC844_8的增強的鱗翅目抑制譜，特別是對CEW和VBC具有改善的活性。
表3.TIC844和TIC844_8的昆蟲活性譜。
*針對指示的昆蟲物種有活性。
表4中進一步證實了工程化的殺蟲蛋白的增強的鱗翅目抑制譜，其描繪了來自飲食生物測定研究的某些工程化的殺蟲蛋白的昆蟲活性概況。在表4的生物測定研究中測試的昆蟲包括東半球棉鈴蟲(CBW，棉鈴蟲)、煙草切根蟲(TCW，斜紋夜蛾)、甜菜夜蛾(BAW，甜菜夜蛾)、棉紅鈴蟲(PBW，棉紅鈴蟲)、粉莖螟蟲(PSB，稻蛀莖夜蛾)和斑點螟蛉(SBW，翠紋金剛鉆(Earias vitella))。表4中所示的結(jié)果顯示了與支架蛋白Cry1Da1相比，列出的工程化的殺蟲蛋白的鱗翅目抑制譜增強，特別是針對CBW、PBW(Cry1Ac抗性)、PBW(田間收集)和SBW具有改善的活性。
表4.Cry1Da1和工程化的殺蟲蛋白的昆蟲活性概況比較。
+針對指示的昆蟲物種有活性。
實施例4
合成編碼工程化的殺蟲蛋白的基因和用于在植物中表達的支架蛋白
本實施例說明編碼工程化的殺蟲蛋白的多核苷酸和用于在植物中表達的支架蛋白的合成。
根據(jù)美國專利No.5,500,365中通常描述的方法設計和合成編碼用于在植物中表達的支架蛋白和工程化的殺蟲蛋白的核苷酸序列，避免某些無效問題序列諸如ATTTA和富含A/T的植物多聚腺苷酸化序列，同時保留原始支架或工程化的殺蟲蛋白的氨基酸序列。用于在植物中表達的編碼工程化的殺蟲蛋白和支架蛋白的這些基因的核苷酸序列列于下表5中。
表5.設計用于在編碼支架和工程化的殺蟲蛋白的植物中使用的多核苷酸序列。
**變體名稱“A2”表示與用于克隆目的的天然序列相比在氨基酸位置2處將丙氨酸殘基插入植物表達載體中。
實施例5
用于在植物中表達工程化的殺蟲蛋白的表達盒
本實施例說明了包含設計用于植物中的編碼支架和工程化的殺蟲蛋白的多核苷酸序列的表達盒的構(gòu)建。
用表5中提供的用于植物表達設計的編碼支架和工程化的殺蟲蛋白的多核苷酸序列構(gòu)建多種植物表達盒。此類表達盒可用于植物原生質(zhì)體中的瞬時表達或植物細胞的轉(zhuǎn)化。關(guān)于蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的最終放置設計典型的表達盒。以一種允許蛋白質(zhì)翻譯并保留在胞質(zhì)溶膠中的方式設計一組表達盒。另外一組表達盒被設計成具有與毒素蛋白連接的轉(zhuǎn)運肽，以允許靶向細胞的細胞器諸如葉綠體或質(zhì)體。所有表達盒被設計為在5’端開始具有啟動子，其可以由多個啟動子元件、增強子元件或本領域普通技術(shù)人員已知的其它表達元件組成，可操作地連接以增強轉(zhuǎn)基因的表達。啟動子序列通常與一個或多個前導序列3’連續(xù)地連接至啟動子。內(nèi)含子序列通常提供3’到前導序列以改善轉(zhuǎn)基因的表達。毒素或轉(zhuǎn)運肽的編碼序列和毒素的編碼序列通常位于可操作地連接的啟動子、前導序列和內(nèi)含子構(gòu)型的3’。編碼序列的3’通常提供3’UTR序列，以促進轉(zhuǎn)錄終止并提供對所得轉(zhuǎn)錄物的多聚腺苷酸化重要的序列。上述所有元素可操作地連接并順序排列，通常具有提供用于構(gòu)建表達盒的另外的序列。
實施例6
含有支架或工程化的殺蟲蛋白表達盒的轉(zhuǎn)化載體
本實施例說明將支架或工程化的殺蟲蛋白摻入植物組織中。
用于產(chǎn)生表達編碼支架蛋白或工程化的殺蟲蛋白的核酸片段的轉(zhuǎn)基因植物的方法可以利用本領域熟知的方法的變型進行。通常，該方法包括用含有可操作地連接到編碼一個或多個工程化的殺蟲蛋白或支架蛋白的編碼區(qū)的啟動子的DNA片段轉(zhuǎn)化合適的宿主細胞。此類編碼區(qū)通?？刹僮鞯剡B接到轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，由此啟動子能夠驅(qū)動細胞中編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄，并因此提供細胞在體內(nèi)產(chǎn)生多肽的能力。用于轉(zhuǎn)化此類細胞的載體、質(zhì)粒、粘粒和DNA片段通常包含天然或合成來源的操縱子、基因或基因衍生的序列，特別是編碼所公開的工程化的殺蟲蛋白的那些。這些DNA構(gòu)建體還可包括諸如啟動子、增強子、多接頭或其它能夠?qū)μ囟康幕蚓哂姓{(diào)節(jié)活性的基因序列的結(jié)構(gòu)。測試所得轉(zhuǎn)基因植物、植物部分和植物細胞的編碼的蛋白的表達和生物活性。
可以修飾以獲得表達鱗翅目活性蛋白的轉(zhuǎn)基因植物的方法的實例包括描述例如Cry1A蛋白(美國專利號5,880,275)、Cry1B(美國專利申請?zhí)?0/525318)、Cry1C(美國專利號6,033,874)、Cry1A/F嵌合體(美國專利號7,070,982；6,962,705和6,713,063)和Cry2Ab蛋白(美國專利號7,064,249)的那些。
實施例7
穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的玉米中工程化的殺蟲蛋白的鱗翅目活性
本實施例說明了當在玉米植物中表達時，由工程化的殺蟲蛋白針對鱗翅目害蟲表現(xiàn)出抑制活性，并且作為對相應昆蟲害蟲的飲食提供。
使用含有實施例6中所述的表達盒的載體產(chǎn)生表達Cry1Da1和Cry1Da1_7.nno蛋白的R0轉(zhuǎn)基因玉米植物。將F1轉(zhuǎn)基因玉米植物從通過未轉(zhuǎn)化的具有來自R0轉(zhuǎn)化體的花粉的野生型商業(yè)種質(zhì)植物的授粉穗產(chǎn)生的種子生長。
通過本領域已知的方法誘導轉(zhuǎn)化的細胞形成植物。使用植物葉盤的生物測定與美國專利號8,344,207中所述的類似進行。使用未轉(zhuǎn)化的植物獲得陰性對照組織。評估來自每個二元載體的多重轉(zhuǎn)化事件，并將結(jié)果列表。
在F1和R0中表達Cry1Da1和Cry1Da1_7.nno蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米植物的殺蟲活性，除針對在田間的F1中表達Cry1Da1和Cry1Da1_7.nno蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米植物的活性外在表6中提供。具體來說，表6顯示了當針對CEW、FAW和SWC測試時，相比于母體支架蛋白Cry1Da1的Cry1Da1_7.nno的鱗翅目活性概況。從表6可以看出，與Cry1Da1不同，Cry1Da1_7.nno顯示了在R0和F1生物測定和F1田間測試中針對CEW和FAW的活性。
表6.在玉米植物中表達的Cry1Da1和Cry1Da1_7.nno的昆蟲活性概況。
+針對昆蟲物種有活性；-針對昆蟲物種無活性；NT未測試
實施例8
在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的棉花中工程化的殺蟲蛋白的鱗翅目活性
本實施例說明了當在棉花植株中表達時由工程化的殺蟲蛋白針對鱗翅目害蟲表現(xiàn)的抑制活性，并且作為對相應昆蟲害蟲的飲食提供。
使用含有實施例6中所述的表達盒的載體產(chǎn)生表達Cry1Da1_7.nno和TIC844_11.nno蛋白的棉花植物。通過本領域已知的方法誘導轉(zhuǎn)化的細胞形成植物。棉花葉組織用于實施例7所述的生物測定中，并針對CBW、FAW、煙草夜蛾(TBW，煙草夜蛾)和SBL進行測試。表7顯示了在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的R0代棉花中針對這些鱗翅目物種觀察到的活性。從表7可以看出，Cry1Da1_7.nno和TIC844_11.nno在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的R0代棉花中顯示針對兩種或更多種鱗翅目害蟲物種的活性。
表7.在R0代棉花中表達的Cry1Da1_7.nno和TIC844_11.nno的生物測定活性概況。
+針對昆蟲物種有活性；-針對昆蟲物種無活性。
選擇的轉(zhuǎn)化事件用于產(chǎn)生R1植物。測定表達Cry1Da1_7.nno的R1植物對CBW、FAW和SBL的抗性。葉、棉蕾和圓莢組織用于生物測定，除了在防蟲網(wǎng)室(screenhouse)中進行的田間測試外。表8顯示了在這些測試中觀察到的活性。如表8所示，Cry1Da1_7.nno在生物測定和田間測試中顯示針對CBW、FAW和SBL的活性。
表8.在R1代棉花中表達的Cry1Da1_7.nno的昆蟲活性概況。
+針對昆蟲物種有活性；-針對昆蟲物種無活性。
實施例9
穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的大豆中工程化的殺蟲蛋白的鱗翅目活性
本實施例說明了當在大豆植物中表達時，工程化的殺蟲蛋白針對鱗翅目害蟲表現(xiàn)的抑制活性，并且作為對相應昆蟲害蟲的飲食提供。
使用含有實施例6中所述的表達盒的載體產(chǎn)生表達Cry1Da1_7.nno、TIC844_9.nno和TIC844_11.nno蛋白的大豆植物。收獲葉組織，并用于如實施例7所述的生物測定中，或者可選地，使用凍干組織用于昆蟲飲食用于生物測定。針對各種鱗翅目物種進行生物測定，包括SAW、SBL和大豆蠕蟲(SPW，美洲棉鈴蟲)。表9顯示了在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的R0代大豆中針對這些鱗翅目害蟲觀察到的活性。從表9可以看出，Cry1Da1_7.nno和TIC844_11.nno顯示出針對SPW、SAW和SBL的活性。TIC844_9.nno(TIC844加上用于克隆的加成丙氨酸)沒有顯示出針對SPW的活性。
表9.在R0代大豆中表達的Cry1Da1_7.nno、TIC844_9.nno和TIC844_11.nno的生物測定活性概況。
+針對昆蟲物種有活性；-針對昆蟲物種無活性。
選擇的轉(zhuǎn)化事件用于產(chǎn)生R1植物。測定表達Cry1Da1_7.nno的R1植物對SAW、SBL、SPW和黎豆夜蛾(VBC，黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis))的抗性。從R1代植物收獲葉組織并用于攝食生物測定。表10顯示了在這些測試中觀察到的活性。如表10所示，Cry1Da1_7.nno顯示了針對SPW、SAW和SBL的活性。
表10.在R1代大豆中表達的Cry1Da1_7.nno的生物測定活性概況。
+針對昆蟲物種有活性；-針對昆蟲物種無活性。
表11顯示了在具有表達Cry1Da1_7.nno的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的R1代大豆植物的防蟲網(wǎng)室中進行的田間測試的結(jié)果。用于在防蟲網(wǎng)室中侵染植物的物種包括黑色行軍蟲(Black armyworm)(BLAW，考斯夜蛾(Spodoptera cosmioides))、豆根夜蛾(Bean shoot moth)(BSM，Crocidosema aporema)、南美豆蟲(South American podworm)(SAPW，大豆莢蟲(Helicoverpa gelotopoeon))、向日葵尺蠖(SFL，薄荷灰夜蛾(Rachiplusia nu))和VBC。表11顯示了在這些測試中觀察到的活性。如表11所示，Cry1Da1_7.nno顯示針對BLAW、SAPW和SFL的活性。
表11.在防蟲網(wǎng)室田間測試中測試的R1代大豆中表達的Cry1Da1_7.nno的活性概況。
+針對昆蟲物種有活性；-針對昆蟲物種無活性。
鑒于本公開內(nèi)容，本文公開和要求保護的所有組合物和方法可以在沒有過多實驗的情況下制備和執(zhí)行。雖然已經(jīng)根據(jù)上述說明性實施方案描述了本發(fā)明的組合物和方法，但是對于本領域技術(shù)人員顯而易見的是，變型、變化、修飾和改變可以應用于組合物、方法和本文描述的方法的步驟或步驟的順序，而不脫離本發(fā)明的真實概念、精神和范圍。更具體地，顯而易見的是，化學和生理相關(guān)的某些試劑可以代替本文所述的試劑，同時可獲得相同或相似的結(jié)果。對于本領域技術(shù)人員顯而易見的所有此類類似替代和修改被認為在由所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明的精神、范圍和概念之內(nèi)。