創(chuàng)建于2015年8月20日、大小為53千字節(jié)的文件名為“6059WOPCT_sequence_listing”的序列表以計(jì)算機(jī)可讀形式與本說明書同時(shí)提交。該序列表是本說明書的一部分，并且全文以引用的方式并入本文。

技術(shù)領(lǐng)域

本公開涉及從新型蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)基因獲得的天然存在的重組核酸，該新型蘇云金芽孢桿菌基因編碼以針對(duì)昆蟲害蟲的殺蟲活性為特征的殺蟲多肽。本發(fā)明的組合物和方法利用所公開的核酸及其編碼的殺蟲多肽來防治植物害蟲。

背景技術(shù)：

昆蟲害蟲是造成全世界農(nóng)作物損失的主要因素。例如，行軍蟲取食、黑地蠶損害或者歐洲玉米螟損害可對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)商造成經(jīng)濟(jì)上的破壞。單單是歐洲玉米螟侵襲非甜質(zhì)玉米和甜玉米造成的昆蟲害蟲相關(guān)作物損失，一年的損害和防治費(fèi)用就達(dá)大約十億美元。

傳統(tǒng)上，影響昆蟲害蟲群體的主要方法是施用廣譜化學(xué)殺昆蟲劑。但是，消費(fèi)者和政府監(jiān)管者都日益關(guān)注與合成化學(xué)殺蟲劑的生產(chǎn)和使用相關(guān)的環(huán)境危害。由于這些關(guān)注，監(jiān)管者禁止或者限制了一些危害比較大的殺蟲劑的使用。因此，人們對(duì)于開發(fā)另外的殺蟲劑有很大的興趣。

使用微生物劑如真菌、細(xì)菌或者另一種昆蟲對(duì)具有農(nóng)業(yè)意義的昆蟲害蟲進(jìn)行生物防治，可提供具有環(huán)境友好性和商業(yè)吸引力的合成化學(xué)殺蟲劑替代方案。一般而言，生物殺蟲劑的使用造成的污染和環(huán)境危害的風(fēng)險(xiǎn)較低，并且生物殺蟲劑能提供比傳統(tǒng)廣譜化學(xué)殺昆蟲劑的特征性靶特異性更高的靶特異性。另外，生物殺蟲劑的生產(chǎn)成本往往較低，因此能提高眾多作物的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量。

已知芽孢桿菌屬(Bacillus)微生物的某些物種對(duì)于多種昆蟲害蟲具有殺蟲活性，這些昆蟲害蟲包括鱗翅目(Lepidoptera)、雙翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、半翅目(Hemiptera)等等。蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)(Bt)和日本金龜芽孢桿菌(Bacillus papilliae)是至今為止發(fā)現(xiàn)的最成功的生物防治劑的代表。幼蟲芽孢桿菌(B.larvae)、緩病芽孢桿菌(B.lentimorbus)、球形芽孢桿菌(B.sphaericus)的菌株(Harwook編輯，(1989)，Bacillus(普萊南出版社(Plenum Press))，306)和蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)的菌株(WO 96/10083)也被指出具有昆蟲病原性。殺蟲活性看起來集中在伴胞晶體蛋白包涵體中，但從芽孢桿菌的營養(yǎng)生長期也分離到殺蟲蛋白。有數(shù)種編碼這些殺蟲蛋白的基因已得到分離和表征(參見例如美國專利No.5,366,892和No.5,840,868)。

微生物殺昆蟲劑特別是那些從芽孢桿菌(Bacillus)菌株獲得的微生物殺昆蟲劑，在農(nóng)業(yè)上作為害蟲化學(xué)防治的替代方案已起到重要的作用。最近，農(nóng)業(yè)科學(xué)家通過對(duì)作物進(jìn)行遺傳工程改造以產(chǎn)生來自芽孢桿菌的殺蟲蛋白，開發(fā)出了抗蟲性增強(qiáng)的作物。例如，已對(duì)玉米和棉花作物進(jìn)行遺傳工程改造以產(chǎn)生從Bt的菌株分離的殺蟲蛋白(參見例如Aronson(2002)Cell Mol.Life Sci.59(3)：417-425；Schnepf等人(1998)Microbiol Mol Biol Rev.62(3)：775-806)。這些經(jīng)遺傳工程改造的作物目前在美國農(nóng)業(yè)中廣泛應(yīng)用，給農(nóng)場(chǎng)主提供了傳統(tǒng)昆蟲防治方法的環(huán)境友好的替代方案。另外，經(jīng)遺傳工程改造而含有殺蟲Cry毒素的馬鈴薯已被出售給美國農(nóng)場(chǎng)主。雖然這些經(jīng)遺傳工程改造的抗昆蟲作物已證明在商業(yè)上十分成功，但它們僅對(duì)較窄范圍的經(jīng)濟(jì)上重要的昆蟲害蟲具有抗性。

因此，仍然需要對(duì)昆蟲害蟲具有更大范圍的殺昆蟲活性的新Bt毒素，例如對(duì)更多種類的鱗翅目昆蟲具有活性的毒素。另外，仍然需要對(duì)多種昆蟲害蟲具有活性的生物殺蟲劑和需要具有改善的殺昆蟲活性的生物殺蟲劑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供用于影響昆蟲害蟲的組合物和方法。更具體而言，本發(fā)明的實(shí)施方案涉及利用編碼殺昆蟲肽的核苷酸序列來產(chǎn)生表達(dá)本發(fā)明實(shí)施方案的殺昆蟲多肽的轉(zhuǎn)化微生物和植物從而影響昆蟲的方法。在一些實(shí)施方案中，所述核苷酸序列編碼對(duì)至少一種屬于鱗翅目的昆蟲具有殺蟲作用的多肽。

本發(fā)明實(shí)施方案提供編碼對(duì)昆蟲害蟲具有殺蟲活性的多肽的核酸分子及其片段和變體(例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9)。獲自Bt的本發(fā)明實(shí)施方案的野生型(例如天然存在的)核苷酸序列編碼新型殺昆蟲肽。本發(fā)明實(shí)施方案還提供編碼生物活性(例如殺昆蟲)多肽的所公開的核苷酸序列的片段和變體。

本發(fā)明實(shí)施方案還提供由本發(fā)明實(shí)施方案的天然存在的或經(jīng)修飾的(例如經(jīng)誘變或經(jīng)操縱的)核酸所編碼的分離的殺蟲(例如殺昆蟲)多肽。具體舉例，本發(fā)明實(shí)施方案的殺蟲蛋白包括從經(jīng)誘變的核酸產(chǎn)生的全長蛋白質(zhì)和多肽的片段，所述經(jīng)誘變的核酸被設(shè)計(jì)用來將特定氨基酸序列引入本發(fā)明實(shí)施方案的多肽中。在特定實(shí)施方案中，所述多肽相對(duì)于衍生出它們的天然存在的多肽的活性具有增強(qiáng)的殺蟲活性。

本發(fā)明實(shí)施方案的核酸也可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的(例如轉(zhuǎn)化的)單子葉植物或雙子葉植物，所述植物的特征在于其基因組包含至少一個(gè)被穩(wěn)定摻入的核苷酸構(gòu)建體，所述核苷酸構(gòu)建體包含可操作地連接至驅(qū)動(dòng)所編碼的殺蟲多肽表達(dá)的啟動(dòng)子的本發(fā)明實(shí)施方案的編碼序列。因此，本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、植物組織、植物及其種子。

在一個(gè)特定實(shí)施方案中，可使用已被優(yōu)化以使在宿主植物中的表達(dá)提高的核酸來產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物。例如，可將本發(fā)明實(shí)施方案的殺蟲多肽之一進(jìn)行反翻譯，以產(chǎn)生包含為了在特定宿主中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的核酸，所述宿主例如是作物如玉米(Zea mays)植物。這種轉(zhuǎn)化的植物(例如雙子葉植物或者單子葉植物)表達(dá)編碼序列將導(dǎo)致產(chǎn)生殺蟲多肽并向植物賦予提高的抗蟲性。一些實(shí)施方案提供表達(dá)在用于影響各種昆蟲害蟲的方法中使用的殺蟲多肽的轉(zhuǎn)基因植物。

本發(fā)明實(shí)施方案還包括含有本發(fā)明實(shí)施方案的殺昆蟲多肽的殺蟲或殺昆蟲組合物，并可任選包含另外的殺昆蟲肽。本發(fā)明實(shí)施方案涵蓋將這種組合物應(yīng)用于昆蟲害蟲的環(huán)境以便影響昆蟲害蟲。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的實(shí)施方案涉及用于影響昆蟲害蟲尤其是植物害蟲的組合物和方法。更具體而言，本發(fā)明實(shí)施方案的分離核酸及其片段和變體包含編碼殺蟲多肽(例如蛋白質(zhì))的核苷酸序列。所公開的殺蟲蛋白對(duì)昆蟲害蟲具有生物活性(例如殺蟲活性)，所述昆蟲害蟲例如但不限于鱗翅目的昆蟲害蟲。

本發(fā)明實(shí)施方案的組合物包含編碼殺蟲多肽的分離核酸及其片段和變體、包含本發(fā)明實(shí)施方案的核苷酸序列的表達(dá)盒、分離的殺蟲蛋白以及殺蟲組合物。一些實(shí)施方案提供對(duì)鱗翅目昆蟲的殺昆蟲活性相對(duì)于相應(yīng)的野生型蛋白的殺蟲活性得到改善的經(jīng)修飾殺蟲多肽。本發(fā)明實(shí)施方案還提供用這些新型核酸轉(zhuǎn)化的植物和微生物，以及涉及將這種核酸、殺蟲組合物、轉(zhuǎn)化的生物體及其產(chǎn)物用于影響昆蟲害蟲的方法。

本發(fā)明實(shí)施方案的核酸和核苷酸序列可用于轉(zhuǎn)化任何生物體以產(chǎn)生所編碼的殺蟲蛋白。本發(fā)明提供涉及使用這種轉(zhuǎn)化的生物體來影響或防治植物害蟲的方法。本發(fā)明實(shí)施方案的核酸和核苷酸序列也可用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞器如葉綠體(McBride等人，(1995)Biotechnology 13：362-365；和Kota等人，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：1840-1845)。

本發(fā)明實(shí)施方案還涉及對(duì)編碼生物活性殺蟲蛋白的天然存在的編碼序列的片段和變體的鑒定。本發(fā)明實(shí)施方案的核苷酸序列可在用于影響害蟲特別是昆蟲害蟲(如鱗翅目害蟲)的方法中直接使用。因此，本發(fā)明實(shí)施方案提供不依賴使用傳統(tǒng)的合成化學(xué)殺昆蟲劑而影響昆蟲害蟲的新方法。本發(fā)明實(shí)施方案涉及對(duì)天然存在的可生物降解的殺蟲劑及編碼它們的基因的發(fā)現(xiàn)。

本發(fā)明實(shí)施方案還提供天然存在的編碼序列的片段和變體，所述天然存在的編碼序列也編碼生物活性(例如殺蟲)多肽。本發(fā)明實(shí)施方案的核酸涵蓋已被優(yōu)化以便由特定生物體的細(xì)胞表達(dá)的核酸或者核苷酸序列，例如已使用基于具有增強(qiáng)的殺蟲活性的多肽的氨基酸序列的植物優(yōu)選的密碼子進(jìn)行了反翻譯(即逆翻譯)的核酸序列。本發(fā)明實(shí)施方案還提供賦予本發(fā)明實(shí)施方案的多肽改善的或改變的性質(zhì)的突變。參見例如美國專利7,462,760。

在下面的描述中，以廣義方式使用到多個(gè)術(shù)語。提供了以下定義以便理解本發(fā)明實(shí)施方案。

單位、前綴和符號(hào)可以以其國際單位制(SI)接受的形式表示。除非另有規(guī)定，否則核酸以5′至3′的取向從左向右書寫；相應(yīng)地，氨基酸序列以氨基到羧基的取向從左向右書寫。數(shù)值范圍包括限定該范圍的數(shù)字。氨基酸在本文中可通過它們通常知道的三字母符號(hào)表示或通過IUPAC-IUB生化命名委員會(huì)(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推薦的單字母符號(hào)表示。同樣，核苷酸可通過它們通常接受的單字母密碼表示。以上定義的術(shù)語通過參考本說明書整體而得到更完全的定義。

本文所用的“核酸”包括指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，否則涵蓋在以下方面具有天然核苷酸的基本性質(zhì)的已知類似物(例如肽核酸)：其以與天然存在的核苷酸相似的方式雜交至單鏈核酸。

本文所用的術(shù)語“編碼”或“所編碼的”在指定的核酸的語境中使用時(shí)，意指該核酸包含指導(dǎo)核苷酸序列翻譯成指定蛋白質(zhì)所必需的信息。據(jù)以編碼蛋白質(zhì)的信息是通過使用密碼子來確定的。編碼蛋白的核酸可以包含在該核酸的翻譯區(qū)內(nèi)的非翻譯序列(例如內(nèi)含子)或可以缺少這種居間的非翻譯序列(例如，如在cDNA中)。

本文所用的指涉指定的多核苷酸或其所編碼的蛋白質(zhì)的“全長序列”，意指具有天然的(非合成的)內(nèi)源序列的整個(gè)核酸序列或者整個(gè)氨基酸序列。全長多核苷酸編碼指定蛋白質(zhì)的全長催化活性形式。

本文所用的術(shù)語“反義”在核苷酸序列的取向的語境中使用時(shí)，指雙鏈多核苷酸序列以反義鏈得以轉(zhuǎn)錄的取向可操作地連接至啟動(dòng)子。反義鏈與內(nèi)源轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物充分互補(bǔ)，使得內(nèi)源轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯常常被抑制。因此，在術(shù)語“反義”在特定核苷酸序列的語境中使用的情形中，這個(gè)術(shù)語指該參考轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的互補(bǔ)鏈。

術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。這些術(shù)語適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基為相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)類似物的氨基酸聚合物，并且適用于天然存在的氨基酸聚合物。

術(shù)語“殘基”或“氨基酸殘基”或“氨基酸”在本文中可互換使用，指摻入蛋白質(zhì)、多肽或肽(統(tǒng)稱“蛋白質(zhì)”)中的氨基酸。該氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另外進(jìn)行限制，否則可涵蓋可以以與天然存在的氨基酸類似的方式發(fā)揮功能的天然氨基酸的已知類似物。

本發(fā)明實(shí)施方案的多肽可以由本文公開的核酸產(chǎn)生，或者通過使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生。例如，本發(fā)明實(shí)施方案的蛋白質(zhì)可通過在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)本發(fā)明實(shí)施方案的重組核酸來產(chǎn)生，或者作為另一種選擇，通過離體(ex vivo)程序的組合來產(chǎn)生。

本文所用的術(shù)語“分離的”和“純化的”可互換使用，指這樣的核酸或多肽或它們的生物活性部分：實(shí)質(zhì)上或基本上不含通常在其天然存在的環(huán)境中存在的與該核酸或多肽相伴或者相互作用的組分。因此，分離的或純化的核酸或多肽，當(dāng)通過重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)實(shí)質(zhì)上不含其它細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或者當(dāng)通過化學(xué)法合成時(shí)實(shí)質(zhì)上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品。

“分離的”核酸通常不含在該核酸的來源生物體的基因組DNA中天然位于該核酸的旁側(cè)的序列(即位于該核酸的5′和3′末端的序列)(例如蛋白質(zhì)編碼序列)。例如，在各個(gè)實(shí)施方案中，分離的核酸可含有少于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在該核酸的來源細(xì)胞的基因組DNA中天然位于該核酸的旁側(cè)的核苷酸序列。

本文所用的術(shù)語“分離的”或者“純化的”在用來指本發(fā)明實(shí)施方案的多肽時(shí)，意指該分離的蛋白質(zhì)實(shí)質(zhì)上不含細(xì)胞物質(zhì)，并且包括具有小于約30％、20％、10％或5％(以干重計(jì))的污染性蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)制劑。當(dāng)本發(fā)明實(shí)施方案的蛋白質(zhì)或其生物活性部分用重組法生產(chǎn)時(shí)，培養(yǎng)基代表少于約30％、20％、10％或5％(以干重計(jì))的化學(xué)前體或者非目的蛋白質(zhì)的化學(xué)品。

“重組的”核酸分子(或DNA)在本文用來指處于重組細(xì)菌或植物宿主細(xì)胞中的核酸序列(或DNA)。在一些實(shí)施方案中，“分離的”或“重組的”核酸不含在該核酸的來源生物體的基因組DNA中天然位于該核酸旁側(cè)的序列(即位于該核酸的5′和3′端的序列)(優(yōu)選蛋白質(zhì)編碼序列)。出于本發(fā)明的目的，“分離的”或“重組的”在用來指核酸分子時(shí)排除分離的染色體。

如本文所用，“非基因組核酸序列”或“非基因組核酸分子”是指與天然或基因組核酸序列相比在核酸序列中具有一個(gè)或多個(gè)改變的核酸分子。在一些實(shí)施方案中，天然或基因組核酸分子的改變包括但不限于：因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而導(dǎo)致的核酸序列的改變；為在植物中表達(dá)而對(duì)核酸序列進(jìn)行的密碼子優(yōu)化；與天然或基因組序列相比，為了引入至少一個(gè)氨基酸置換、插入、缺失和/或添加而發(fā)生的核酸序列中的改變；一個(gè)或多個(gè)與基因組核酸序列相關(guān)聯(lián)的內(nèi)含子的移除；一個(gè)或多個(gè)異源內(nèi)含子的插入；一個(gè)或多個(gè)與基因組核酸序列相關(guān)聯(lián)的上游或下游調(diào)控區(qū)的缺失；一個(gè)或多個(gè)異源上游或下游調(diào)控區(qū)的插入；與基因組核酸序列相關(guān)聯(lián)的5′和/或3′非翻譯區(qū)的缺失；異源5′和/或3′非翻譯區(qū)的插入；以及多聚腺苷酸化位點(diǎn)的修飾。在一些實(shí)施方案中，所述非基因組核酸分子是cDNA。在一些實(shí)施方案中，所述非基因組核酸分子是合成核酸序列。

在本說明書通篇中，詞語“包含”及其語法變體應(yīng)被理解為暗示包括規(guī)定的元件、整數(shù)或步驟或者元件組、整數(shù)組或步驟組，但不排除任何其它元件、整數(shù)或步驟或者元件組、整數(shù)組或步驟組。

本文所用的術(shù)語“影響昆蟲害蟲”指在昆蟲發(fā)育的任何階段引起昆蟲取食、生長和/或行為方面的變化，包括但不限于：殺死昆蟲；延遲生長；阻礙繁殖能力；拒食活性等。

本文所用的術(shù)語“殺蟲活性”和“殺昆蟲活性”同義地用來指某生物體或物質(zhì)(例如蛋白質(zhì))的可以通過害蟲在取食和暴露達(dá)適宜時(shí)間長度后害蟲死亡率、害蟲體重減輕、害蟲排斥性和害蟲的其它行為和身體變化(但不限于通過這些方面)進(jìn)行測(cè)量的活性。因此，具有殺蟲活性的生物體或物質(zhì)不利地影響害蟲適合度的至少一個(gè)可測(cè)量參數(shù)。例如，“殺蟲蛋白”是本身或與其它蛋白質(zhì)組合表現(xiàn)殺蟲活性的蛋白質(zhì)。

如本文所用，術(shù)語“殺蟲有效量”意指某物質(zhì)或者生物體的當(dāng)在害蟲的環(huán)境中存在時(shí)具有殺蟲活性的量。對(duì)于每種物質(zhì)或者生物體，殺蟲有效量是針對(duì)在指定環(huán)境中受影響的每種害蟲憑經(jīng)驗(yàn)確定。類似地，當(dāng)害蟲是昆蟲害蟲時(shí)，“殺昆蟲有效量”可用來指“殺蟲有效量”。

本文所用的術(shù)語“重組工程改造的”或“工程改造的”意指基于對(duì)蛋白質(zhì)作用機(jī)制的了解和對(duì)被引入、缺失或置換的氨基酸的考慮，利用重組DNA技術(shù)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中引入(例如工程改造出)變化。

本文所用的術(shù)語“突變核苷酸序列”或“突變”或“經(jīng)誘變的核苷酸序列”意指這樣的核苷酸序列，其已被誘變或變更以含有一個(gè)或多個(gè)在相應(yīng)的野生型序列中不存在的核苷酸殘基(例如堿基對(duì))。這種誘變或變更由核酸殘基的一個(gè)或多個(gè)添加、缺失或置換或替代所組成。當(dāng)突變是通過添加、移除或替代蛋白水解位點(diǎn)的氨基酸作出時(shí)，這個(gè)添加、移除或替代可在蛋白水解位點(diǎn)基序內(nèi)或靠近蛋白水解位點(diǎn)基序，只要達(dá)到突變的目的(即，只要該位點(diǎn)處的蛋白水解被改變)。

突變核苷酸序列可編碼表現(xiàn)出改善的或降低的殺昆蟲活性的突變殺昆蟲毒素，或者編碼這樣的氨基酸序列，該氨基酸序列能賦予含有它的多肽的改善的或降低的殺昆蟲活性。本文所用的術(shù)語“突變體”或“突變”在蛋白質(zhì)、多肽或氨基酸序列的語境中是指這樣的序列，其已被誘變或變更以含有一個(gè)或多個(gè)在相應(yīng)的野生型序列中不存在的氨基酸殘基。這種誘變或變更由氨基酸殘基的一個(gè)或多個(gè)添加、缺失或置換或替代所組成。突變多肽表現(xiàn)出改善的或降低的殺昆蟲活性，或者代表這樣的氨基酸序列，該氨基酸序列能賦予含有它的多肽改善的殺昆蟲活性。因此，術(shù)語“突變體”或“突變”指突變核苷酸序列和所編碼的氨基酸中的任一者或二者。突變體可單獨(dú)使用，或者可與本發(fā)明實(shí)施方案的其它突變體或者與其它突變體以任何相容的組合進(jìn)行使用?！巴蛔兌嚯摹笨上喾吹乇憩F(xiàn)出殺昆蟲活性的降低。在不止一個(gè)突變被添加到特定核酸或蛋白質(zhì)的情形中，所述突變可同時(shí)添加或依序添加；如果是依序添加，所述突變可以按任何合適的順序添加。

本文所用的術(shù)語“改善的殺昆蟲活性”或“改善的殺蟲活性”指本發(fā)明實(shí)施方案的殺昆蟲多肽相對(duì)于其相應(yīng)的野生型蛋白質(zhì)的活性具有增強(qiáng)的殺昆蟲活性，和/或該殺昆蟲多肽對(duì)更廣范圍的昆蟲有效，和/或該殺昆蟲多肽對(duì)不易受野生型蛋白的毒性影響的昆蟲具有特異性。改善的或增強(qiáng)的殺蟲活性的發(fā)現(xiàn)，要求證明相對(duì)于野生型殺昆蟲多肽的針對(duì)同一昆蟲測(cè)定的殺蟲活性而言，對(duì)該昆蟲靶標(biāo)的殺蟲活性提高至少10％，或至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、100％、150％、200％或300％或更高的殺蟲活性的提高。

例如，如果相對(duì)于受野生型Bt毒素影響的昆蟲范圍而言，受該多肽影響的昆蟲范圍更廣或更窄，則就提供了改善的殺蟲或殺昆蟲活性。在需要多用途性的情況下，更寬的影響范圍可能是合乎需要的，而在例如有益昆蟲可能反而會(huì)被該毒素的使用或存在影響的情況下，更窄的影響范圍可能是合乎需要的。雖然本發(fā)明實(shí)施方案不受任何具體作用機(jī)制的約束，但也可通過多肽的一個(gè)或多個(gè)特性的改變而提供改善的殺蟲活性；例如，多肽在昆蟲腸道中的穩(wěn)定性或壽命可相對(duì)于相應(yīng)的野生型蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性或壽命得到提高。

本文所用的術(shù)語“毒素”指表現(xiàn)出殺蟲活性或殺昆蟲活性或改善的殺蟲活性或改善的殺昆蟲活性的多肽?！癇t”或“蘇云金芽孢桿菌”毒素旨在包括蘇云金芽孢桿菌各個(gè)菌株中存在的較廣類別的Cry毒素，包括諸如Cryls、Cry2s、或Cry3s之類的毒素在內(nèi)。

術(shù)語“蛋白水解位點(diǎn)”或者“切割位點(diǎn)”指這樣的氨基酸序列，其賦予對(duì)一類蛋白酶或某種特定蛋白酶的敏感性，使得含有該氨基酸序列的多肽被該類蛋白酶或該特定蛋白酶消化。蛋白水解位點(diǎn)據(jù)稱對(duì)能識(shí)別該位點(diǎn)的蛋白酶“敏感”。本領(lǐng)域認(rèn)識(shí)到，消化的效率會(huì)不同，而消化效率的降低可導(dǎo)致多肽在昆蟲腸道中的穩(wěn)定性或壽命提高。因此，蛋白水解位點(diǎn)可賦予對(duì)不止一種蛋白酶或一類蛋白酶的敏感性，但各種蛋白酶在該位點(diǎn)處的消化效率可不同。蛋白水解位點(diǎn)包括例如胰蛋白酶位點(diǎn)、胰凝乳蛋白酶位點(diǎn)和彈性蛋白酶位點(diǎn)。

研究已證實(shí)，鱗翅目的昆蟲腸道蛋白酶包括胰蛋白酶類、胰凝乳蛋白酶類和彈性蛋白酶類。參見例如Lenz等人，(1991)Arch.Insect Biochem.Physiol.16：201-212；以及Hedegus等人，(2003)Arch.Insect Biochem.Physiol.53：30-47。例如，在棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)幼蟲的中腸中發(fā)現(xiàn)了大約18種不同的胰蛋白酶類(參見Gatehouse等人，(1997)Insect Biochem.Mol.Biol.27：929-944)。已研究了這些蛋白酶優(yōu)選的蛋白水解底物位點(diǎn)。參見例如Peterson等人，(1995)Insect Biochem.Mol.Biol.25：765-774。

已試圖了解Bt毒素的作用機(jī)制和對(duì)毒素進(jìn)行工程改造使其具有改善的性質(zhì)。已證實(shí)昆蟲腸道蛋白酶可影響B(tài)t Cry蛋白對(duì)昆蟲的影響。一些蛋白酶會(huì)通過將Cry蛋白從“原毒素”形式加工成毒性形式或“毒素”而將它們活化。參見Oppert(1999)Arch.Insect Biochem.Phys.42：1-12；以及Carroll等人，(1997)J.Invertebrate Pathology 70：41-49。毒素的這種活化可包括從蛋白質(zhì)移除N末端肽和C末端肽，也可包括蛋白質(zhì)的內(nèi)部切割。其它蛋白酶可降解Cry蛋白。參見Oppert(出處同上)。

對(duì)具有不同特異性的Cry毒素的氨基酸序列的比較揭示出五個(gè)高度保守的序列塊。在結(jié)構(gòu)上，毒素包含三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域，其從N末端到C末端為：參與孔形成的一簇七個(gè)α螺旋(稱為“結(jié)構(gòu)域1”)、參與細(xì)胞結(jié)合的三個(gè)反平行β片層(稱為“結(jié)構(gòu)域2”)和β夾層(beta sandwich)(稱為“結(jié)構(gòu)域3”)。這些結(jié)構(gòu)域的位置和性質(zhì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。參見例如Li等人，(1991)Nature，305：815-821和Morse等人，(2001)Structure，9：409-417。當(dāng)指涉特定結(jié)構(gòu)域如結(jié)構(gòu)域1時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解，該結(jié)構(gòu)域相對(duì)于特定序列的確切終點(diǎn)并不關(guān)鍵，只要該序列或其部分包括能提供至少某種歸因于該特定結(jié)構(gòu)域的功能的序列。因此，例如，當(dāng)指涉“結(jié)構(gòu)域1”時(shí)，意指特定序列包括一簇七個(gè)α螺旋，但就該簇而言所使用的或所指的序列的確切終點(diǎn)并不關(guān)鍵。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這種終點(diǎn)的確定和這類功能的評(píng)價(jià)。

為更好地表征和改善Bt毒素，研究了細(xì)菌Bt的各種菌株。發(fā)現(xiàn)從Bt菌株的培養(yǎng)物制備的晶體制品具有針對(duì)多種鱗翅目害蟲的殺蟲活性(參見例如實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1)。已作出努力以從選定的菌株鑒定編碼晶體蛋白的核苷酸序列，并且從這些細(xì)菌菌株分離出了本發(fā)明實(shí)施方案的野生型(即天然存在的)核酸，將其克隆進(jìn)表達(dá)載體中并轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌中。認(rèn)識(shí)到，取決于給定的制品的特性，有時(shí)需要進(jìn)行胰蛋白酶預(yù)處理以活化殺蟲蛋白才能展示出殺蟲活性。因此，應(yīng)當(dāng)理解，一些殺蟲蛋白需要蛋白酶消化(例如通過胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等)進(jìn)行活化，而其它蛋白質(zhì)不用進(jìn)行活化就具有生物活性(例如殺蟲活性)。

這種分子可通過例如美國專利7,462,760所描述的手段進(jìn)行變更。另外，可對(duì)核酸序列進(jìn)行工程改造以編碼含有額外的突變的多肽，所述額外的突變相對(duì)于天然存在的多肽的殺蟲活性賦予改善的或改變的殺蟲活性。這種經(jīng)工程改造的核酸的核苷酸序列包含野生型序列中不存在的突變。

本發(fā)明實(shí)施方案的突變多肽通常由包括以下步驟的過程制備：獲得編碼Cry家族多肽的核酸序列；基于考慮所提出的靶結(jié)構(gòu)域在該毒素作用模式中的功能，分析該多肽的結(jié)構(gòu)，以鑒定用于對(duì)相應(yīng)基因序列進(jìn)行誘變的特定“靶”位點(diǎn)；向該核酸序列中引入一個(gè)或多個(gè)突變，以在所編碼的多肽序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中產(chǎn)生所需的變化；以及測(cè)定所產(chǎn)生的多肽的殺蟲活性。

許多Bt殺昆蟲毒素由于它們的氨基酸序列和三級(jí)結(jié)構(gòu)的相似性而有不同程度的相關(guān)性，并且獲得Bt毒素的晶體結(jié)構(gòu)的手段是公知的。Cry3A和Cry3B多肽二者的示例性高分辨率晶體結(jié)構(gòu)解析可在文獻(xiàn)中獲得。Cry3A基因的已解出的結(jié)構(gòu)(Li等人，(1991)Nature 353：815-821)使人們把握了毒素的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。將已發(fā)表的Bt毒素的結(jié)構(gòu)分析與已報(bào)道的與特定結(jié)構(gòu)、基序等相關(guān)聯(lián)的功能結(jié)合起來考慮，發(fā)現(xiàn)該毒素的特定區(qū)域與該蛋白質(zhì)的特定功能和作用模式各分立步驟相關(guān)。例如，許多分離自Bt的毒素通常被描述為包括三種結(jié)構(gòu)域：參與孔形成的七螺旋束、參與受體結(jié)合的三片層結(jié)構(gòu)域以及β夾層模體(Li等人，(1991)Nature 305：815-821)。

如美國專利No.7,105,332和7,462,760中報(bào)道，可通過靶向位于Cry蛋白的結(jié)構(gòu)域1的α螺旋3和4之間的區(qū)域來改善該毒素的毒性。該理論以有關(guān)殺昆蟲毒素的大量知識(shí)為前提，這些知識(shí)包括：1)已報(bào)道Cry3A毒素的結(jié)構(gòu)域1的α螺旋4和5插入到易感昆蟲的中腸的襯細(xì)胞的脂質(zhì)雙層中(Gazit等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：12289-12294)；2)本發(fā)明人知道野生型蛋白的氨基酸序列內(nèi)胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶切割位點(diǎn)的位置；3)觀察到在通過胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶處理進(jìn)行體外活化后野生型蛋白對(duì)某些昆蟲的活性更高；以及4)有報(bào)道說從3′端消化毒素導(dǎo)致對(duì)昆蟲的毒性降低。

可在多個(gè)背景序列中產(chǎn)生和設(shè)置一系列突變，以產(chǎn)生具有增強(qiáng)的或改變的殺蟲活性的新型多肽。參見例如美國專利7,462,760。這些突變體包括但不限于：在位于結(jié)構(gòu)域1的螺旋3和4之間的區(qū)域中添加至少一個(gè)對(duì)蛋白酶更敏感的位點(diǎn)(例如胰蛋白酶切割位點(diǎn))；將野生型序列中的原始蛋白酶敏感位點(diǎn)用另一不同的蛋白酶敏感位點(diǎn)替代；在特定的位置中添加多個(gè)蛋白酶敏感位點(diǎn)；在蛋白酶敏感位點(diǎn)附近添加氨基酸殘基以變更多肽的折疊從而增強(qiáng)多肽在該蛋白酶敏感位點(diǎn)處的消化；以及添加突變以保護(hù)多肽免遭會(huì)使毒性降低的降解性消化(例如作出一系列突變，其中野生型氨基酸被纈氨酸替代，以保護(hù)多肽免遭消化)。各突變可單獨(dú)使用或以任何組合使用以提供本發(fā)明實(shí)施方案的多肽。

使用BLAST和PSI-BLAST在美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的非冗余數(shù)據(jù)庫(nr)中通過相似性搜索鑒定出了同源序列。同源蛋白由主要來自蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)的Cry毒素構(gòu)成。

作為額外的或備選的蛋白酶敏感位點(diǎn)的突變可對(duì)若干類蛋白酶敏感，如絲氨酸蛋白酶(其包括胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)或諸如彈性蛋白酶之類的酶。因此，可設(shè)計(jì)作為額外的或備選的蛋白酶敏感位點(diǎn)的突變，使得該位點(diǎn)容易被一系列蛋白酶如哺乳動(dòng)物蛋白酶或昆蟲蛋白酶識(shí)別和/或切割。也可將蛋白酶敏感位點(diǎn)設(shè)計(jì)成被已知在某種生物體中產(chǎn)生的特定類別的酶或者特定的酶切割，例如玉米穗蟲(Heliothis zea)產(chǎn)生的胰凝乳蛋白酶(Lenz等人，(1991)Arch.Insect Biochem.Physiol.16：201-212)。突變也可賦予對(duì)蛋白水解消化的抗性，例如對(duì)胰凝乳蛋白酶在該肽C末端處的消化的抗性。

在本發(fā)明實(shí)施方案的核酸所編碼的多肽的氨基酸序列中存在額外和/或備選的蛋白酶敏感位點(diǎn)，可改善該所編碼的多肽的殺蟲活性和/或特異性。因此，可將本發(fā)明實(shí)施方案的核苷酸序列進(jìn)行重組工程改造或操縱，以產(chǎn)生與未經(jīng)修飾的野生型毒素相比具有改善的或改變的殺昆蟲活性和/或特異性的多肽。另外，本文所公開的突變可被設(shè)置進(jìn)其它核苷酸序列或者與其它核苷酸序列聯(lián)用以提供改善的性質(zhì)。例如，可將容易被昆蟲胰凝乳蛋白酶(例如披肩粘蟲或者玉米穗蟲中存在的胰凝乳蛋白酶)切割的蛋白酶敏感位點(diǎn)(Hegedus等人，(2003)Arch.Insect Biochem.Physiol.53：30-47；以及Lenz等人，(1991)Arch.Insect Biochem.Physiol.16：201-212)置于Cry背景序列中，以提供對(duì)該序列的改善的毒性。這樣，本發(fā)明實(shí)施方案提供具有改善性質(zhì)的毒性多肽。

例如，經(jīng)誘變的Cry核苷酸序列可構(gòu)成包含額外密碼子的額外突變體，所述額外密碼子將第二胰蛋白酶敏感氨基酸序列(除天然存在的胰蛋白酶位點(diǎn)之外的)引入到所編碼的多肽中。本發(fā)明實(shí)施方案的備選的添加突變體包含這樣的額外密碼子，其被設(shè)計(jì)用來將至少一個(gè)額外的不同蛋白酶敏感位點(diǎn)引入多肽中，例如緊鄰天然存在的胰蛋白酶位點(diǎn)的5′或3′的胰凝乳蛋白酶敏感位點(diǎn)。作為另一種選擇，可產(chǎn)生置換突變體，其中該核酸的編碼天然存在的蛋白酶敏感位點(diǎn)的至少一個(gè)密碼子被破壞，而備選的密碼子被引入該核酸序列中以提供另一不同的(例如置換的)蛋白酶敏感位點(diǎn)。也可將替代突變體添加給Cry序列，其中所編碼多肽中存在的天然存在的胰蛋白酶切割位點(diǎn)被破壞而在它的位置引入胰凝乳蛋白酶或者彈性蛋白酶切割位點(diǎn)。

已認(rèn)識(shí)到，可使用編碼作為蛋白水解位點(diǎn)或推定的蛋白水解位點(diǎn)的氨基酸序列(例如諸如RR或者LKM之類的序列)的任何核苷酸序列，并且用來將任何這些切割位點(diǎn)引入變體多肽中的密碼子的確切種類可根據(jù)在特定植物物種中的使用(即表達(dá))而變。還認(rèn)識(shí)到，可將任何所公開的突變引入本發(fā)明實(shí)施方案的任何這樣的多核苷酸序列中，所述多核苷酸序列包含提供作為修飾靶標(biāo)的天然胰蛋白酶切割位點(diǎn)的氨基酸殘基的密碼子。因此，可將全長毒素或其片段的變體修飾成含有額外的或備選的切割位點(diǎn)，并且這些實(shí)施方案旨在被本文所公開的實(shí)施方案的范圍所涵蓋。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，可向本發(fā)明實(shí)施方案的序列加入任何有用的突變，只要所編碼的多肽保持殺蟲活性。因此，還可將序列進(jìn)行突變，使得所編碼的多肽對(duì)胰凝乳蛋白酶的蛋白水解消化具有抗性?？梢砸匀魏谓M合在特定位置中加入不止一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，并且可以給該毒素添加多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)或從該毒素移除多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)。因此，額外的突變可包含三個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，可在任何合適的多核苷酸序列中工程改造出多個(gè)突變；因此，全長序列或其片段都可被修飾成含有額外的或備選的切割位點(diǎn)以及修飾成能抵抗蛋白水解消化。這樣，本發(fā)明實(shí)施方案提供含有能改善殺蟲活性的突變的Cry毒素，以及用于使用其它Bt毒素影響害蟲的改善的組合物和方法。

突變可保護(hù)多肽免遭蛋白酶降解，例如通過從不同區(qū)域移除推定的蛋白水解位點(diǎn)(如推定的絲氨酸蛋白酶位點(diǎn)和彈性蛋白酶識(shí)別位點(diǎn))來保護(hù)?？梢瞥蜃兏@些推定位點(diǎn)中的一些或全部，使得在原始位點(diǎn)位置處的蛋白水解降低?？赏ㄟ^將突變多肽與野生型毒素進(jìn)行比較，或通過將在它們的氨基酸序列方面有差異的各個(gè)突變毒素進(jìn)行比較，來評(píng)估蛋白水解的變化。推定的蛋白水解位點(diǎn)和蛋白水解位點(diǎn)包括但不限于以下序列：RR，為胰蛋白酶切割位點(diǎn)；LKM，為胰凝乳蛋白酶位點(diǎn)；以及胰蛋白酶位點(diǎn)。這些位點(diǎn)可通過添加或缺失任何數(shù)目和種類的氨基酸殘基進(jìn)行變更，只要多肽的殺蟲活性得以提高。因而，由包含突變的核苷酸序列所編碼的多肽相對(duì)于天然或背景序列，將包含至少一個(gè)氨基酸變化或添加，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、35、38、40、45、47、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270或280個(gè)或更多個(gè)氨基酸變化或添加。也可通過截短天然的或全長的序列來改善多肽的殺蟲活性，如本領(lǐng)域已知的。

本發(fā)明實(shí)施方案的組合物包括編碼殺蟲多肽的核酸及其片段和變體。具體而言，本發(fā)明實(shí)施方案提供包含編碼SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的核苷酸序列的分離核酸分子或者編碼所述氨基酸序列的核苷酸序列，例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列，以及它們的片段和變體。

還值得關(guān)注的是編碼本發(fā)明實(shí)施方案的殺蟲蛋白的優(yōu)化的核苷酸序列。本文所用的短語“優(yōu)化的核苷酸序列”指經(jīng)優(yōu)化以在特定生物體例如植物中表達(dá)的核酸。可使用本領(lǐng)域已知的方法針對(duì)所關(guān)注的任何生物體制備優(yōu)化的核苷酸序列。參見例如，美國專利No.7,462,760，該專利描述了編碼所公開的殺蟲蛋白的優(yōu)化的核苷酸序列。在該示例中，核苷酸序列是這樣制備的：將蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行反翻譯，并改變核苷酸序列以包含玉蜀黍優(yōu)選的密碼子而仍編碼同一氨基酸序列。Murray等人，(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498對(duì)該程序作了更詳細(xì)的描述。優(yōu)化的核苷酸序列可用于提高殺蟲蛋白在植物中的表達(dá)，所述植物為例如禾本科(Gramineae，Poaceae)的單子葉植物，例如玉蜀黍或玉米植物。

本發(fā)明實(shí)施方案還提供由本發(fā)明實(shí)施方案的天然存在的或經(jīng)修飾的核酸編碼的分離的殺蟲(例如殺昆蟲)多肽。更具體而言，本發(fā)明實(shí)施方案提供由本文所述核酸(例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9所示的那些以及它們的片段和變體)編碼的包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的多肽。

在一些實(shí)施方案中，提供包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的多肽，以及它們的片段和變體。

在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明實(shí)施方案的殺蟲蛋白提供全長殺昆蟲多肽、全長殺昆蟲多肽的片段以及從被設(shè)計(jì)用來向本發(fā)明實(shí)施方案的多肽中引入特定氨基酸序列的由經(jīng)誘變的核酸產(chǎn)生的變體多肽。在特定實(shí)施方案中，被引入多肽中的氨基酸序列包含提供酶(如蛋白酶)的切割位點(diǎn)的序列。

本領(lǐng)域知道，Bt毒素的殺蟲活性通常是通過在昆蟲腸道中由各種蛋白酶對(duì)該肽進(jìn)行切割來活化。由于肽可能并不總是以十足的效率在昆蟲腸道中被切割，因此全長毒素的片段與全長毒素本身相比可能具有增強(qiáng)的殺蟲活性。因此，本發(fā)明實(shí)施方案的多肽中的一些包括全長殺昆蟲多肽的片段，并且所述多肽片段、變體和突變中的一些相對(duì)于衍生出它們的天然存在的殺昆蟲多肽的活性具有增強(qiáng)的殺蟲活性，特別是如果該天然存在的殺昆蟲多肽在進(jìn)行活性篩選之前不用蛋白酶進(jìn)行體外活化的話。因此，本申請(qǐng)涵蓋所述序列的截短版本或片段。

可將突變?cè)O(shè)置于任何背景序列中，包括這種截短的多肽，只要該多肽保持殺蟲活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用本領(lǐng)域已知的或本文別處描述的測(cè)定法，可容易地比較兩種或更多種蛋白質(zhì)的殺蟲活性。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施方案的多肽可通過表達(dá)本文公開的核酸來產(chǎn)生，或通過使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)來產(chǎn)生。

已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，殺蟲蛋白可以是低聚體，并且在分子量、殘基數(shù)目、組成肽、針對(duì)特定害蟲的活性以及其它特征方面會(huì)有不同。但是，通過本文給出的方法，可分離和表征對(duì)多種害蟲具有活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明實(shí)施方案的殺蟲蛋白可與其它Bt毒素或其它殺昆蟲蛋白組合使用，以增加昆蟲靶標(biāo)范圍。此外，本發(fā)明實(shí)施方案的殺蟲蛋白與其它Bt毒素或具有獨(dú)特性質(zhì)的其它殺昆蟲原理組合使用，對(duì)于防止和/或管理昆蟲抗性具有特別的實(shí)用性。其它殺昆蟲劑包括蛋白酶抑制劑(絲氨酸類型和半胱氨酸類型二者)、α-淀粉酶和過氧化物酶。

核苷酸和氨基酸序列以及它們所編碼的多肽的片段和變體也被本發(fā)明實(shí)施方案涵蓋。本文所用的術(shù)語“片段”指本發(fā)明實(shí)施方案的多核苷酸的核苷酸序列的一部分或多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可編碼保持天然的或相應(yīng)的全長蛋白質(zhì)的生物活性從而具有殺蟲活性的蛋白質(zhì)片段。因此，可公認(rèn)本發(fā)明實(shí)施方案的多核苷酸和氨基酸序列中的一些可正確地稱為片段和突變體二者。

應(yīng)當(dāng)理解，術(shù)語“片段”在用于指本發(fā)明實(shí)施方案的核酸序列時(shí)，也涵蓋可用作雜交探針的序列。這類核苷酸序列通常不編碼保持生物活性的片段蛋白質(zhì)。因此，核苷酸序列的片段長度可為至少約20個(gè)核苷酸、約50個(gè)核苷酸、約100個(gè)核苷酸并且最多至編碼本發(fā)明實(shí)施方案的蛋白質(zhì)的全長核苷酸序列。

編碼本發(fā)明實(shí)施方案的殺蟲蛋白的生物活性部分的本發(fā)明實(shí)施方案的核苷酸序列的片段，將編碼至少15、25、30、50、100、200、250或者300個(gè)連續(xù)氨基酸或者最多至本發(fā)明實(shí)施方案的殺蟲多肽中存在的氨基酸的總數(shù)(例如對(duì)于SEQ ID NO：2為751個(gè)氨基酸)。因此，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施方案還涵蓋這樣的多肽，其為本發(fā)明實(shí)施方案的示例性殺蟲蛋白的片段，且長度為至少15、25、30、50、100、200、250或300個(gè)連續(xù)氨基酸，或者最多至本發(fā)明實(shí)施方案的殺蟲多肽中存在的氨基酸總數(shù)(例如對(duì)于SEQ ID NO：2為751個(gè)氨基酸)。。本發(fā)明實(shí)施方案的可用作雜交探針或PCR引物的核苷酸序列的片段通常不需要編碼殺蟲蛋白的生物活性部分。因此，本發(fā)明實(shí)施方案的核酸的片段可編碼殺蟲蛋白的生物活性部分，或者它可以是可采用本文公開的方法用作雜交探針或PCR引物的片段。殺蟲蛋白的生物活性部分可如下制備：分離本發(fā)明實(shí)施方案的核苷酸序列其中之一的一部分，表達(dá)殺蟲蛋白的編碼部分(例如通過體外重組表達(dá))，并評(píng)估殺蟲蛋白的所編碼部分的活性。

屬于本發(fā)明實(shí)施方案的核苷酸序列的片段的核酸，包含至少16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、850、900或者950個(gè)核苷酸或者最多至本文公開的核苷酸序列中存在的核苷酸的數(shù)目(例如對(duì)于SEQ ID NO：1為2256個(gè)核苷酸)。特定的實(shí)施方案設(shè)想衍生自(例如產(chǎn)生自)本發(fā)明實(shí)施方案的第一核酸的片段，其中該片段編碼具有殺蟲活性的截短毒素。由本發(fā)明實(shí)施方案的多核苷酸片段編碼的截短多肽具有這樣的殺蟲活性：該殺蟲活性相對(duì)于由衍生出該片段的第一核酸所編碼的相應(yīng)全長多肽的活性相當(dāng)或得到改善?？深A(yù)想本發(fā)明實(shí)施方案的這種核酸片段可在天然的或相應(yīng)的全長編碼序列的3′端處截短。核酸片段也可同時(shí)在天然或相應(yīng)的全長編碼序列的5′和3′端這兩處截短。

術(shù)語“變體”在本文中用來指實(shí)質(zhì)上相似的序列。對(duì)于核苷酸序列而言，保守變體包括那些由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而編碼本發(fā)明實(shí)施方案的殺蟲多肽其中之一的氨基酸序列的序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將易于理解，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，存在大量本發(fā)明的編碼核苷酸序列。表1是提供每個(gè)氨基酸的同義密碼子的密碼子表。例如，密碼子AGA、AGG、CGA、CGC、CGG和CGU全部都編碼氨基酸精氨酸。因此，在本發(fā)明核酸中由某密碼子指定為精氨酸的每個(gè)位置處，該密碼子可變更為上述任何相應(yīng)的密碼子，而不變更所編碼的多肽。應(yīng)當(dāng)理解，RNA序列中的U對(duì)應(yīng)于DNA序列中的T。

表1

如適當(dāng)，可將核酸進(jìn)行優(yōu)化以提高其在宿主生物體中的表達(dá)。因此，如果該宿主生物體是植物，則可用植物優(yōu)選的密碼子合成出合成的核酸以改善表達(dá)。有關(guān)宿主優(yōu)選的密碼子用法的討論，參見例如Campbell和Gowri，(1990)Plant Physiol.92：1-11。例如，盡管本發(fā)明實(shí)施方案的核酸序列在單子葉植物物種和雙子葉植物物種兩者中都可表達(dá)，但可對(duì)序列進(jìn)行修飾以解決單子葉植物或雙子葉植物的特定密碼子偏好性和GC含量偏好性，因?yàn)檫@些偏好性已被證實(shí)是不同的(Murray等人，(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498)。因此，特定氨基酸的玉蜀黍優(yōu)選的密碼子可由來自玉蜀黍的已知基因序列得出。關(guān)于來自玉蜀黍植物的28種基因的玉蜀黍密碼子的用法在Murray等人(出處同上)的表4中列出。合成植物優(yōu)選的基因的方法是本領(lǐng)域現(xiàn)成的。參見例如美國專利No.5,380,831和5,436,391以及Murray等人，(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498以及Liu H等人，Mol Bio Rep 37：677-684，2010，其均以引用的方式并入本文。玉蜀黍(Zea maize)密碼子用法表也可見于kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝4577(可使用www前綴訪問)。表2示出了玉蜀黍最佳密碼子分析(修改自Liu H等人，Mol Bio Rep 37：677-684，2010)。

表2

使用卡方列聯(lián)檢驗(yàn)來比較密碼子用法以鑒定最佳密碼子。明顯更頻繁出現(xiàn)(P\0.01)的密碼子用星號(hào)指示。

大豆(Glycine max)密碼子用法表在表3中示出并且也可見于kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝3847&aa＝1&style＝N(可使用www前綴訪問)。

表3

技術(shù)人員還將理解，可通過核酸序列的突變引入變化，從而引起所編碼的多肽的氨基酸序列的變化，而不變更蛋白質(zhì)的生物活性。因此，可通過將一個(gè)或多個(gè)核苷酸置換、添加和/或缺失引入本文所公開的相應(yīng)核酸序列中來形成變體核酸分子，使得一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、添加或缺失被引入所編碼的蛋白質(zhì)中?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，比如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變來引入突變。此類變體核酸序列也被本發(fā)明涵蓋。

諸如這些的天然存在的等位基因變體可用熟知的分子生物學(xué)技術(shù)(例如本文述及的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和雜交技術(shù))進(jìn)行鑒定。

在一些實(shí)施方案中，編碼SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的多肽的多核苷酸是非基因組核酸序列。

變體核苷酸序列也包括通過合成衍生的核苷酸序列，如那些例如通過使用定點(diǎn)誘變產(chǎn)生但仍編碼本發(fā)明實(shí)施方案的殺蟲蛋白(如突變毒素)的核苷酸序列。通常，本發(fā)明實(shí)施方案的特定核苷酸序列的變體將與該特定核苷酸序列具有至少約70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，這通過本文別處描述的序列比對(duì)程序使用默認(rèn)參數(shù)測(cè)定。本發(fā)明實(shí)施方案的核苷酸序列的變體可與該序列相差少至1-15個(gè)核苷酸、少至1-10個(gè)如6-10個(gè)、少至5個(gè)、少至4個(gè)、3個(gè)、2個(gè)或甚至1個(gè)核苷酸。

本發(fā)明實(shí)施方案的特定核苷酸序列(即示例性的核苷酸序列)的變體，也可通過比較由變體核苷酸序列所編碼的多肽與由參考核苷酸序列所編碼的多肽之間的序列同一性百分比來進(jìn)行評(píng)價(jià)。因此，例如，公開了編碼與SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的多肽具有給定的序列同一性百分比的多肽的分離核酸。任何兩條多肽之間的序列同一性百分比可用本文別處描述的序列比對(duì)程序使用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行計(jì)算。在本發(fā)明實(shí)施方案的任何給定的一對(duì)多核苷酸是通過比較它們編碼的兩條多肽所共有的序列同一性百分比來進(jìn)行評(píng)價(jià)的情況中，這兩條所編碼的多肽之間的序列同一性百分比為至少約40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％，通常至少約75％、80％、85％，至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％，或者至少約98％、99％或更高的序列同一性。

如本文所用，術(shù)語“變體蛋白”涵蓋通過如下手段而衍生自天然蛋白質(zhì)的多肽：在天然蛋白質(zhì)的N末端和/或C末端缺失(所謂的截短)或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸；在天然蛋白質(zhì)中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸；或者在該天然蛋白質(zhì)中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸。因此，術(shù)語“變體蛋白”涵蓋天然蛋白質(zhì)的這樣的生物活性片段：其包含足夠數(shù)量的連續(xù)氨基酸殘基以保持天然蛋白質(zhì)的生物活性，即具有殺蟲活性。這種殺蟲活性相對(duì)于天然蛋白質(zhì)可以是不同的或改善的，或者其可以是未改變的，只要?dú)⑾x活性得以保持即可。

本發(fā)明實(shí)施方案所涵蓋的變體蛋白具有生物活性，即它們繼續(xù)具有天然蛋白質(zhì)的所需生物活性，即本文所述的殺蟲活性。這類變體可例如由遺傳多態(tài)性或由人類操縱而得到。本發(fā)明實(shí)施方案的天然殺蟲蛋白的生物活性變體將與天然蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有至少約60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，這通過用本文別處描述的序列比對(duì)程序使用默認(rèn)參數(shù)測(cè)定。本發(fā)明實(shí)施方案的蛋白質(zhì)的生物活性變體可與該蛋白質(zhì)相差少至1-15個(gè)氨基酸殘基，少至1-10個(gè)如6-10個(gè)、少至5個(gè)、少至4個(gè)、3個(gè)、2個(gè)或甚至1個(gè)氨基酸殘基。

在一些實(shí)施方案中，殺昆蟲多肽與SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更高的序列同一性。

在一些實(shí)施方案中，殺昆蟲多肽與SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更高的序列同一性。

在一些實(shí)施方案中，殺昆蟲多肽與SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更高的序列同一性。

在一些實(shí)施方案中，殺昆蟲多肽與SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更高的序列同一性。

在一些實(shí)施方案中，殺昆蟲多肽與SEQ ID NO：10的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更高的序列同一性。

在一些實(shí)施方案中，多肽具有修飾的物理性質(zhì)。如本文所用，術(shù)語“物理性質(zhì)”是指適用于描述蛋白的物理化學(xué)特性的任何參數(shù)。如本文所用，“所關(guān)注的物理性質(zhì)”和“所關(guān)注的性質(zhì)”可互換使用，是指正研究和/或修飾的蛋白的物理性質(zhì)。物理性質(zhì)的示例包括但不限于蛋白表面上的凈表面電荷和電荷分布、蛋白表面上的凈疏水性和疏水殘基分布、表面電荷密度、表面疏水性密度、表面可電離基團(tuán)的總數(shù)、表面張力、蛋白大小及其在溶液中的分布、熔融溫度、熱容和第二維里系數(shù)。物理性質(zhì)的示例還包括但不限于溶解度、折疊性、穩(wěn)定性和消化性。在一些實(shí)施方案中，多肽增強(qiáng)了蛋白水解片段在昆蟲腸道中的消化性。由模擬胃液來消化的模型是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(Fuchs，R.L.和J.D.Astwood.Food Technology 50：83-88，1996；Astwood，J.D.等人，Nature Biotechnology14：1269-1273，1996；Fu TJ等人，J.Agric Food Chem.50：7154-7160，2002)。

本發(fā)明實(shí)施方案還涵蓋轉(zhuǎn)化了本發(fā)明實(shí)施方案的至少一種核酸的微生物、轉(zhuǎn)化了包含該核酸的表達(dá)盒的微生物或者轉(zhuǎn)化了包含該表達(dá)盒的載體的微生物。在一些實(shí)施方案中，該微生物是在植物上繁殖的微生物。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及封裝的(encapsulated)殺蟲蛋白，其包含能夠表達(dá)至少一種本發(fā)明實(shí)施方案的殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)化微生物。

本發(fā)明實(shí)施方案提供包含本發(fā)明實(shí)施方案的轉(zhuǎn)化微生物的殺蟲組合物。在此類實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化微生物通常以殺蟲有效量與合適的載體一起存在于殺蟲組合物中。本發(fā)明實(shí)施方案還涵蓋這樣的殺蟲組合物，其以殺昆蟲有效量?jī)H包含本發(fā)明實(shí)施方案的分離的蛋白質(zhì)或包含本發(fā)明實(shí)施方案的分離的蛋白質(zhì)與本發(fā)明實(shí)施方案的轉(zhuǎn)化微生物和/或本發(fā)明實(shí)施方案的封裝殺蟲蛋白的組合，以及包含合適的載體。

本發(fā)明實(shí)施方案還提供通過使用本發(fā)明實(shí)施方案的殺蟲蛋白與至少一種其它或“第二”殺蟲蛋白的組合來增加昆蟲靶標(biāo)范圍的方法。本領(lǐng)域已知的任何殺蟲蛋白都可用于本發(fā)明實(shí)施方案的方法中。這種殺蟲蛋白包括但不限于Bt毒素、蛋白酶抑制劑、α-淀粉酶和過氧化物酶。

本發(fā)明實(shí)施方案還涵蓋包含至少一種本發(fā)明實(shí)施方案的核苷酸序列的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)基因植物。在一些實(shí)施方案中，該植物穩(wěn)定轉(zhuǎn)化有這樣的核苷酸構(gòu)建體：該構(gòu)建體包含可操作地連接至能驅(qū)動(dòng)植物細(xì)胞中的表達(dá)的啟動(dòng)子的至少一種本發(fā)明實(shí)施方案的核苷酸序列。如本文所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)化植物”和“轉(zhuǎn)基因植物”是指在其基因組中包含異源多核苷酸的植物。通常，異源多核苷酸穩(wěn)定整合于轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)化植物的基因組中，使得該多核苷酸被傳遞到后續(xù)各代。異源多核苷酸可單獨(dú)整合進(jìn)基因組中，或者作為重組表達(dá)盒的一部分整合進(jìn)基因組中。

應(yīng)理解，如本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”包括任何其基因型已因異源核酸的存在而被變更的細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，包括那些最初以此方式變更的轉(zhuǎn)基因以及那些通過從最初的轉(zhuǎn)基因進(jìn)行有性雜交或無性繁殖而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因在內(nèi)。如本文所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”不涵蓋通過常規(guī)植物育種方法或通過自然發(fā)生事件(如隨機(jī)異花受精、非重組病毒感染、非重組細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或自發(fā)突變)進(jìn)行的基因組(染色體或染色體外)變更。

本文所用的術(shù)語“植物”包括指整個(gè)植株、植物器官(例如葉、莖、根等)、種子、植物細(xì)胞和它們的子代。轉(zhuǎn)基因植物的部分落入本發(fā)明實(shí)施方案的范圍內(nèi)，包括例如植物細(xì)胞、植物原生質(zhì)體、可從中再生出植株的植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、植物塊(clump)、以及在植物或諸如胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果實(shí)、果仁、穗、穗軸、果殼、稈、根、根尖、花粉囊等的植物部分中完整的植物細(xì)胞，它們起源于之前轉(zhuǎn)化有本發(fā)明實(shí)施方案的DNA分子的轉(zhuǎn)基因植物或其后代并因此至少部分地由轉(zhuǎn)基因細(xì)胞組成?？捎糜诒景l(fā)明實(shí)施方案的方法中的植物的類別通常與適于轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等植物的類別一樣寬泛，包括單子葉植物和雙子葉植物兩者在內(nèi)。

雖然本發(fā)明實(shí)施方案并不依賴于特定的生物機(jī)制來提高植物對(duì)植物害蟲的抗性，但本發(fā)明實(shí)施方案的核苷酸序列在植物中的表達(dá)可導(dǎo)致本發(fā)明實(shí)施方案的殺蟲蛋白的產(chǎn)生和植物對(duì)植物害蟲的抗性的提高。本發(fā)明實(shí)施方案的植物可在農(nóng)業(yè)中在用于影響昆蟲害蟲的方法中使用。某些實(shí)施方案提供可在用于影響植物的昆蟲害蟲(如鱗翅目害蟲)的方法中使用的轉(zhuǎn)化作物(例如玉蜀黍植物)。

“受試植物或植物細(xì)胞”是其中已針對(duì)目的基因進(jìn)行了遺傳變更(如轉(zhuǎn)化)的植物或植物細(xì)胞，或者是從經(jīng)如此變更的植物或細(xì)胞遺傳下來并包含該變更的植物或植物細(xì)胞?！皩?duì)照”或“對(duì)照植物”或“對(duì)照植物細(xì)胞”提供用于測(cè)量受試植物或植物細(xì)胞的表型變化的參考點(diǎn)。

對(duì)照植物或植物細(xì)胞可包括例如：(a)野生型植物或細(xì)胞，即具有與用于進(jìn)行遺傳變更的起始材料相同的基因型的植物或細(xì)胞，該遺傳變更會(huì)得到受試植物或細(xì)胞；(b)具有與起始材料相同的基因型但已用無效構(gòu)建體(即，用對(duì)目的性狀不具有已知效果的構(gòu)建體，諸如包含標(biāo)記基因的構(gòu)建體)轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞；(c)為受試植物或植物細(xì)胞的子代中的非轉(zhuǎn)化分離子的植物或植物細(xì)胞；(d)在遺傳上與受試植物或植物細(xì)胞相同但不暴露于會(huì)誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)的條件或刺激因素的植物或植物細(xì)胞；或者(e)處于目的基因不被表達(dá)的條件下的受試植物或植物細(xì)胞本身。

本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)容易認(rèn)識(shí)到，分子生物學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)展如位點(diǎn)特異性誘變和隨機(jī)誘變、聚合酶鏈反應(yīng)方法和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，可提供適用于對(duì)具有農(nóng)業(yè)意義的蛋白質(zhì)的氨基酸序列和相應(yīng)遺傳序列二者進(jìn)行變更或工程改造的廣泛工具和方案集合。

因此，本發(fā)明實(shí)施方案的蛋白質(zhì)可通過各種方式(包括氨基酸置換、缺失、截短和插入)進(jìn)行變更。這類操縱的方法是本領(lǐng)域公知的。例如，可通過向合成的核酸(例如DNA分子)中引入突變來制備殺蟲蛋白的氨基酸序列變體。誘變和核酸變更的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，可使用寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變技術(shù)來引入所設(shè)計(jì)的變化。參見例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel等人，(1987)Methods in Enzymol.154：367-382；美國專利No.4,873,192；Walker和Gaastra編輯，(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company，New York)；以及其中引用的參考文獻(xiàn)。

可對(duì)本發(fā)明實(shí)施方案的經(jīng)誘變的核苷酸序列進(jìn)行修飾，以改變所編碼的多肽的一級(jí)序列中存在的約1、2、3、4、5、6、8、10、12個(gè)或更多個(gè)氨基酸。作為另一種選擇，可對(duì)天然序列引入甚至更多的變化，使得所編碼的蛋白質(zhì)與相應(yīng)的野生型蛋白質(zhì)相比可具有至少約1％或2％或約3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％或甚至約13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％、21％、22％、23％、24％或25％、30％、35％或40％或更多的密碼子被變更或以別的方式被修飾。以同樣的方式，所編碼的蛋白質(zhì)與相應(yīng)的野生型蛋白質(zhì)相比可具有至少約1％或2％或約3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％或甚至約13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％、21％、22％、23％、24％或25％、30％、35％或40％或更多的額外的密碼子。應(yīng)理解，本發(fā)明實(shí)施方案的經(jīng)誘變的核苷酸序列旨在涵蓋具有殺蟲活性(例如通過對(duì)歐洲玉米螟幼蟲的拒食性質(zhì)所確定的改善的殺蟲活性)的生物功能性等同肽，這種序列可由于已知在核酸序列以及因而其所編碼的蛋白質(zhì)內(nèi)天然存在的密碼子冗余性和功能等同性而產(chǎn)生。

本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，氨基酸添加和/或置換通常是基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對(duì)形似性，如它們的疏水性、電荷、大小等?？紤]前述各個(gè)特征的示例性的氨基酸置換組是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括：精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。

有關(guān)不會(huì)影響目的蛋白質(zhì)的生物活性的適當(dāng)氨基酸置換的指導(dǎo)可在以下文獻(xiàn)所述的模型中找到：Dayhoff等人，(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)，將該文獻(xiàn)以引用方式并入本文?？勺鞒霰Ｊ刂脫Q，如將一個(gè)氨基酸用另一具有相似性質(zhì)的氨基酸進(jìn)行交換。

因此，本發(fā)明實(shí)施方案的基因和核苷酸序列包括天然存在的序列和突變形式二者。同樣，本發(fā)明實(shí)施方案的蛋白質(zhì)涵蓋天然存在的蛋白質(zhì)和其變型形式(例如截短多肽)及修飾形式(例如突變)。這種變體將繼續(xù)具有所需的殺蟲活性。顯然，要在編碼該變體的核苷酸序列中作出的突變必須不將該序列置于閱讀框外，并且通常不會(huì)生成可能會(huì)產(chǎn)生二級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)。參見EP專利申請(qǐng)公開No.75,444。

不期望本文所涵蓋的蛋白質(zhì)序列的缺失、插入和置換會(huì)造成該蛋白質(zhì)特性的根本變化。然而，當(dāng)在進(jìn)行置換、缺失或插入之前難以預(yù)測(cè)置換、缺失或插入的確切效應(yīng)時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道將通過常規(guī)的篩選測(cè)定法(如昆蟲取食測(cè)定法)來評(píng)價(jià)該效應(yīng)。參見例如，Marrone等人，(1985)J.Econ.Entomol.78：290-293以及Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83：2480-2485，所述文獻(xiàn)以引用方式并入本文。

變體核苷酸序列和蛋白質(zhì)還涵蓋衍生自誘變和引起重組的程序(如DNA改組)的序列和蛋白質(zhì)。用這種程序，可操縱一個(gè)或多個(gè)不同的編碼序列以產(chǎn)生具有所需性質(zhì)的新的殺蟲蛋白。以此方式，從一組相關(guān)的多核苷酸序列產(chǎn)生重組多核苷酸的文庫，所述相關(guān)的多核苷酸序列包含具有實(shí)質(zhì)的序列同一性且可以在體外或體內(nèi)同源重組的序列區(qū)域。例如，使用該方法，可將本發(fā)明實(shí)施方案的核苷酸序列的全長編碼序列、編碼目的結(jié)構(gòu)域的序列基序或者任何片段在本發(fā)明實(shí)施方案的核苷酸序列與其它已知Cry核苷酸序列的相應(yīng)部分之間進(jìn)行改組(shuffle)，以獲得編碼具有改善的所關(guān)注性質(zhì)的蛋白質(zhì)的新基因。

所關(guān)注性質(zhì)包括但不限于每單位殺蟲蛋白的殺蟲活性、蛋白穩(wěn)定性以及對(duì)非靶標(biāo)物種，具體來講人類、牲畜和表達(dá)本發(fā)明實(shí)施方案的殺蟲多肽的植物和微生物的毒性。本發(fā)明實(shí)施方案不受具體的改組策略的局限，只要至少一種本發(fā)明實(shí)施方案的核苷酸序列或其部分涉及這個(gè)改組策略。改組可僅涉及本文公開的核苷酸序列，或者可另外涉及本領(lǐng)域已知的其它核苷酸序列的改組。DNA改組的策略是本領(lǐng)域已知的。參見例如Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature 370：389-391；Crameri等人，(1997)Nature Biotech 15：436-438；Moore等人，(1997)J.Mol.Biol.272：336-347；Zhang等人，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-4509；Crameri等人，(1998)Nature 391：288-291；以及美國專利No.5,605,793和5,837,458。

本發(fā)明實(shí)施方案的核苷酸序列也可用于從其它生物體，特別是其它細(xì)菌，更特別是其它芽孢桿菌屬菌株分離相應(yīng)的序列。以此方式，諸如PCR、雜交等之類的方法可以用來基于這類序列與本文所述序列的序列同源性從而鑒定這類序列。本發(fā)明實(shí)施方案涵蓋了基于序列與本文所述的完整序列或其片段的序列同一性而選擇的序列。這類序列包括為所公開的序列的直系同源物的序列。術(shù)語“直系同源物”指衍生自共同祖先基因并且由于物種形成而存在于不同物種中的基因。當(dāng)其核苷酸序列和/或其所編碼的蛋白質(zhì)序列如本文其它地方所定義的那樣具有實(shí)質(zhì)性的同一性時(shí)，存在于不同物種中的基因被認(rèn)為是直系同源物。直系同源物的功能在各種物種中常常是高度保守的。

在PCR方法中，可設(shè)計(jì)寡核苷酸引物用于PCR反應(yīng)，以從提取自任何所關(guān)注生物體的cDNA或基因組DNA擴(kuò)增相應(yīng)的DNA序列。用于設(shè)計(jì)PCR引物和PCR克隆的方法是本領(lǐng)域公知的，并且公開于以下文獻(xiàn)中：Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)，下文稱“Sambrook”。另參見Innis等人編輯，(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Academic Press，New York)；Innis和Gelfand編輯，(1995)PCR Strategies(Academic Press，New York)；以及Innis和Gelfand編輯，(1999)PCR Methods Manual(Academic Press，New York)。已知的PCR方法包括但不限于利用成對(duì)引物、巢式引物、單一特異引物、簡(jiǎn)并引物、基因特異性引物、載體特異性引物、部分錯(cuò)配引物等的方法。

在雜交技術(shù)中，將已知的核苷酸序列的全部或一部分用作探針，該探針與來自所選生物體的一組克隆的基因組DNA片段或cDNA片段(即基因組或cDNA文庫)中存在的其它對(duì)應(yīng)核苷酸序列選擇性雜交。該雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，并且可用可檢測(cè)基團(tuán)如32P或任何其它可檢測(cè)標(biāo)記物標(biāo)記。因此，例如，雜交用探針可通過對(duì)基于本發(fā)明實(shí)施方案的序列的合成寡核苷酸進(jìn)行標(biāo)記來制備。用于制備雜交用探針和用于構(gòu)建cDNA文庫和基因組文庫的方法是本領(lǐng)域公知的，在“Sambrook”中有公開。

例如，本文所公開的整個(gè)序列，或其一個(gè)或多個(gè)部分可用作能夠與相應(yīng)的序列和信使RNA特異性雜交的探針。為實(shí)現(xiàn)在各種條件下的特異性雜交，這種探針包括對(duì)本發(fā)明實(shí)施方案的序列而言是獨(dú)特的并且長度通常為至少約10個(gè)或20個(gè)核苷酸的序列。這種探針可用于通過PCR從選定的生物體擴(kuò)增相應(yīng)的Cry序列。這項(xiàng)技術(shù)可用于從所需生物體分離另外的編碼序列，或者用作診斷測(cè)定法以確定編碼序列在生物體中的存在。雜交技術(shù)包括對(duì)平板接種的(plated)DNA文庫(噬菌斑或菌落；參見例如，Sambrook)的雜交篩選。

這類序列的雜交可以在嚴(yán)格條件下進(jìn)行。本文所用的術(shù)語“嚴(yán)格條件”或“嚴(yán)格雜交條件”指探針與其靶序列雜交的程度將比它與其它序列雜交的程度可檢測(cè)地更高(例如，比背景高至少2倍、5倍或者10倍)的條件。嚴(yán)格條件是序列依賴性的，在不同的情況中將會(huì)不同。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格性，可以鑒定與探針100％互補(bǔ)的靶序列(同源探測(cè))?；蛘?，可以調(diào)節(jié)嚴(yán)格性條件以允許序列中的一些錯(cuò)配，從而檢測(cè)到較低程度的相似性(異源探測(cè))。通常，探針的長度小于約1000或500個(gè)核苷酸。

通常，嚴(yán)格條件將為其中鹽濃度低于約1.5M鈉離子，通常為約0.01至1.0M鈉離子濃度(或其它鹽)，pH為7.0至8.3，對(duì)短探針(例如，10至50個(gè)核苷酸)而言溫度為至少約30℃，對(duì)長探針(例如超過50個(gè)核苷酸)而言溫度為至少約60℃的那些條件。嚴(yán)格條件還可以通過添加去穩(wěn)定劑如甲酰胺來實(shí)現(xiàn)。示例性的低嚴(yán)格條件包括用30-35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液在37℃下雜交并在1倍至2倍SSC(20倍SSC＝3.0M NaCI/0.3M檸檬酸三鈉)中在50-55℃下洗滌。示例性的中等嚴(yán)格條件包括在40-45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中在37℃下雜交并在0.5倍至1倍SSC中在55-60℃下洗滌。示例性的高嚴(yán)格條件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中在37℃下雜交并最后在0.1倍SSC中在60-65℃下洗滌至少約20分鐘。任選地，洗滌緩沖液可以包含約0.1％至約1％SDS。雜交的持續(xù)時(shí)間通常小于約24小時(shí)，往往為約4至約12小時(shí)。

特異性通常決定于雜交后的洗滌，關(guān)鍵因素為最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度。對(duì)于DNA-DNA雜交體，T_m(熱熔點(diǎn))可以根據(jù)Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284的方程：T_m＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L進(jìn)行估計(jì)；其中M為單價(jià)陽離子的摩爾濃度，％GC為DNA中鳥嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form為雜交溶液中甲酰胺的百分比，L為雜交體的長度(單位為堿基對(duì))。T_m為50％的互補(bǔ)靶序列與完全匹配的探針雜交時(shí)的溫度(在確定的離子強(qiáng)度和pH下)。洗滌通常至少進(jìn)行至達(dá)到平衡和獲得低的雜交背景水平為止，例如2小時(shí)、1小時(shí)或30分鐘。

對(duì)于每1％錯(cuò)配，T_m下降約1℃；因此，可以調(diào)節(jié)T_m、雜交和/或洗滌條件以與具有所需同一性的序列雜交。例如，如果尋求具有≥90％同一性的序列，則T_m可降低10℃。通常，將嚴(yán)格條件選擇為比特定序列及其互補(bǔ)序列在確定的離子強(qiáng)度和pH下的T_m低約5℃。然而，極嚴(yán)格條件可以利用比T_m低1、2、3或4℃下的雜交和/或洗滌；中等嚴(yán)格條件可以利用比T_m低6、7、8、9或10℃下的雜交和/或洗滌；低嚴(yán)格條件可以利用比T_m低11、12、13、14、15或20℃下的雜交和/或洗滌。

利用所述公式，雜交和洗滌組成以及所需的T_m，普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，雜交和/或洗滌溶液的嚴(yán)格性的變化固有地得到了描述。如果所需的錯(cuò)配程度導(dǎo)致T_m低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，則可增加SSC濃度以使得可使用較高的溫度。有關(guān)核酸雜交的詳盡指導(dǎo)見于Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章(Elsevier，New York)；以及Ausubel等人編輯，(1995)Current Protocols in Molecular Biology，第2章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)。另參見“Sambrook”。因此，本發(fā)明實(shí)施方案涵蓋編碼本發(fā)明實(shí)施方案的Cry蛋白并在嚴(yán)格條件下與本文公開的Cry序列或與其片段雜交的分離的序列。

如下術(shù)語用來描述兩條或更多條核酸或多核苷酸之間的序列關(guān)系：(a)“參考序列”、(b)“比較窗口”、(c)“序列同一性”、(d)“序列同一性百分比”和(e)“實(shí)質(zhì)上相同”。

(a)本文所用的“參考序列”是用作序列比較的基礎(chǔ)的確定的序列。

參考序列可以是指定序列的子集或者全部；例如，作為全長cDNA或基因序列的區(qū)段，或者完整的cDNA或基因序列。

(b)本文所用的“比較窗口”是指多核苷酸序列的連續(xù)的且指定的區(qū)段，其中該比較窗口中的多核苷酸序列相比于參考序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便兩條序列進(jìn)行最佳比對(duì)。通常，比較窗口長度為至少20個(gè)連續(xù)的核苷酸，任選可為30、40、50、100個(gè)或更長。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，為避免由于在多核苷酸序列中加入空位所致的與參考序列的高度相似性，通常引入空位罰分并從匹配數(shù)扣除空位罰分。

將序列比對(duì)以作比較的方法是本領(lǐng)域熟知的。因此，任何兩條序列之間的序列同一性百分比的確定可使用數(shù)學(xué)算法來完成。此類數(shù)學(xué)算法的非限制性示例是Myers和Miller(1988)CABIOS 4：11-17的算法；Smith等人，(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部比對(duì)算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的全局比對(duì)算法；Pearson和Lipman，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448的搜索-局部比對(duì)方法；Karlin和Altschul，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264的算法，如在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中改良的。

可利用這些數(shù)學(xué)算法的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)進(jìn)行序列的比較以確定序列同一性。此類執(zhí)行序包括、但不限于：PC/Gene程序(可獲自加利福尼亞州山景城的Intelligenetics公司(Mountain View，California))中的CLUSTAL；GCG Wisconsin Genetics Software版本10(可得自美國加利福尼亞州圣地亞哥斯克蘭頓路9685號(hào)的Accelrys有限公司(Accelrys Inc.，9685Scranton Road，San Diego，California，USA))中的ALIGN程序(版本2.0)和GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用這些程序的比對(duì)可以使用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行。以下文獻(xiàn)對(duì)CLUSTAL程序進(jìn)行了詳細(xì)描述：Higgins等人，(1988)Gene 73：237-244(1988)；Higgins等人，(1989)CABIOS 5：151-153；Corpet等人，(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90；Huang等人，(1992)CABIOS 8：155-65；以及Pearson等人，(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-331。ALIGN程序基于Myers和Miller(1988年)(出處同上)的算法。當(dāng)比較氨基酸序列時(shí)，ALIGN程序可使用PAM120加權(quán)殘基表、空位長度罰分12和空位罰分4。Altschul et al(1990)J.Mol.Biol.215：403(Altschul等人，1990年，《分子生物學(xué)雜志》，第215卷，第403頁)的BLAST程序基于上文中Karlin和Altschul(1990)(出處同上)的算法。BLAST核苷酸搜索可用BLASTN程序、score(得分)＝100、wordlength(字長)＝12來進(jìn)行，以獲得與編碼本發(fā)明實(shí)施方案的蛋白質(zhì)的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質(zhì)搜索可用BLASTN程序、score(得分)＝50、wordlength(字長)＝3來進(jìn)行，以獲得與本發(fā)明實(shí)施方案的蛋白質(zhì)或多肽同源的氨基酸序列。為了出于比較目的獲得帶空位的比對(duì)結(jié)果，可以使用如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389中所述的Gapped BLAST(在BLAST 2.0中)。作為另外一種選擇，PSI-BLAST(在BLAST 2.0中)可以用來執(zhí)行檢測(cè)分子之間遠(yuǎn)源關(guān)系的迭代搜索。參見Altschul等人，(1997)(Altschul等人，1997年)，出處同上。當(dāng)采用BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST時(shí)，可以使用各個(gè)程序的默認(rèn)參數(shù)(例如BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白質(zhì))。參見美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)網(wǎng)站(www.ncbi.nlm.nih.gov)。還可以以人工方式通過檢查來進(jìn)行比對(duì)。

除非另外指明，否則本文提供的序列同一性/相似性值是指使用采用以下參數(shù)的GAP版本10或其任何等同程序獲得的值：核苷酸序列的％同一性和％相似性采用GAP權(quán)重50和長度權(quán)重3以及nwsgapdna.cmp評(píng)分矩陣；氨基酸序列的％同一性和％相似性采用GAP權(quán)重8和長度權(quán)重2以及BLOSUM62評(píng)分矩陣。本文所用術(shù)語的“等同程序”指任何這樣的序列比較程序，其對(duì)于任何兩個(gè)所考慮的序列，相比于由GAP版本10所產(chǎn)生的相應(yīng)比對(duì)，能產(chǎn)生出具有相同的核苷酸或氨基酸殘基匹配和相同的序列同一性百分比的比對(duì)。

GAP利用Needleman和Wunsch(1970)(出處同上)的算法來尋找兩個(gè)完整序列的能使匹配數(shù)最大而使空位數(shù)最小的比對(duì)。GAP考慮所有可能的比對(duì)和空位位置，并產(chǎn)生具有最大數(shù)目的匹配堿基和最少的空位的比對(duì)。它使得可以提供以匹配堿基數(shù)為單位的空位產(chǎn)生罰分和空位延伸罰分。GAP對(duì)于其插入的每個(gè)空位，必須利用匹配的空位產(chǎn)生罰分?jǐn)?shù)。如果選擇大于零的空位延伸罰分，GAP對(duì)于每個(gè)插入的空位必須另外利用空位長度乘以空位延伸罰分。對(duì)于蛋白質(zhì)序列，GCG威斯康星遺傳學(xué)軟件包(GCG Wisconsin Genetics Software Package)的版本10中的默認(rèn)空位產(chǎn)生罰分值和空位延伸罰分值分別為8和2。對(duì)于核苷酸序列，默認(rèn)空位產(chǎn)生罰分為50，而默認(rèn)空位延伸罰分為3。空位產(chǎn)生罰分和空位延伸罰分可以以選自0至200的整數(shù)來表示。因此，例如，空位產(chǎn)生罰分和空位延伸罰分可以為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。

GAP給出該家族中的具有最佳比對(duì)的一個(gè)成員?？赡艽嬖谶@個(gè)家族的許多成員，但其它成員沒有更好的品質(zhì)。GAP顯示用于比對(duì)的四個(gè)優(yōu)值因素：品質(zhì)、比率、同一性和相似性。品質(zhì)是為了將序列進(jìn)行比對(duì)而最大化的指標(biāo)(metric)。比率是品質(zhì)除以較短片段中的堿基數(shù)。同一性百分比是實(shí)際匹配的符號(hào)的百分比。相似性百分比是相似的符號(hào)的百分比。將相應(yīng)于空位的符號(hào)忽略。當(dāng)一對(duì)符號(hào)的評(píng)分矩陣值大于或等于0.50(相似性閾值)時(shí)，評(píng)定為相似性。GCG Wisconsin Genetics Software Package的版本10中使用的評(píng)分矩陣為BLOSUM62(參見Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。

(c)在兩條核酸或多肽序列的情形中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”是指在指定的比較窗口范圍為獲得最大對(duì)應(yīng)而比對(duì)時(shí)這兩條序列中相同的殘基。當(dāng)序列同一性百分比針對(duì)蛋白使用時(shí)，認(rèn)識(shí)到不相同的殘基位置往往差別在于保守氨基酸置換，其中氨基酸殘基由具有相似化學(xué)性質(zhì)(例如電荷或疏水性)的其它氨基酸殘基置換，因此不會(huì)改變分子的功能性質(zhì)。當(dāng)序列差別在于保守置換，則可以上調(diào)序列同一性百分比以校正置換的保守性質(zhì)。差別在于這種保守置換的序列被稱為具有“序列相似性”或“相似性”。作出這個(gè)調(diào)整的手段是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。通常，這涉及將保守置換評(píng)定為部分錯(cuò)配而不是完全錯(cuò)配，從而增加序列同一性百分比。因此，例如，如果相同的氨基酸給予1分，非保守置換給予0分，則保守置換給予0至1之間的分?jǐn)?shù)。保守置換的評(píng)分是例如在程序PC/GENE(美國加利福尼亞州山景城(Mountain View，California)的Intelligenetics公司)中所執(zhí)行那樣進(jìn)行計(jì)算。

(d)本文所用的“序列同一性百分比”意指通過在比較窗口范圍內(nèi)比較兩個(gè)最佳比對(duì)的序列所確定的值，其中與參考序列(不包含添加或缺失)相比，多核苷酸序列在比較窗口中的部分可包含添加或缺失(即空位)，以便最佳比對(duì)兩個(gè)序列。通過以下方式計(jì)算所述百分比：確定在兩個(gè)序列中出現(xiàn)相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)目以得到匹配的位置的數(shù)目，將匹配的位置的數(shù)目除以比較窗口中位置的總數(shù)目，然后將結(jié)果乘以100以得到序列同一性百分比。

(e)(i)多核苷酸序列的“實(shí)質(zhì)上相同”這個(gè)術(shù)語意指在使用所描述的比對(duì)程序之一采用標(biāo)準(zhǔn)的參數(shù)與參考序列進(jìn)行比較時(shí)，多核苷酸包含具有至少70％、80％、90％或95％或更高的序列同一性的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，可通過考慮密碼子簡(jiǎn)并性、氨基酸相似性、閱讀框定位等等適當(dāng)調(diào)整這些值以確定由兩條核苷酸序列所編碼的蛋白質(zhì)的相應(yīng)同一性。出于這些目的，氨基酸序列實(shí)質(zhì)上相同通常意指序列同一性為至少60％、70％、80％、90％或95％或更高的序列同一性。

核苷酸序列實(shí)質(zhì)上相同的另一種指示是兩個(gè)分子在嚴(yán)格條件下是否彼此雜交。通常，將嚴(yán)格條件選擇為比特定序列在確定的離子強(qiáng)度和pH下的T_m低約5℃。但是，嚴(yán)格條件涵蓋在比T_m低約1℃至約20℃的范圍內(nèi)的溫度，取決于本文另外限定的所需嚴(yán)格程度。在嚴(yán)格條件下不互相雜交的核酸，如果它們編碼的多肽是實(shí)質(zhì)上相同的，則它們?nèi)允菍?shí)質(zhì)上相同的。例如，當(dāng)利用遺傳密碼所允許的最大密碼子簡(jiǎn)并性產(chǎn)生一個(gè)核酸拷貝時(shí)，這可能會(huì)發(fā)生。兩條核酸序列實(shí)質(zhì)上相同的一個(gè)指示是，由第一核酸編碼的多肽與由第二核酸編碼的多肽發(fā)生免疫交叉反應(yīng)。

(e)(ii)在肽的情形中，術(shù)語“實(shí)質(zhì)上相同”指肽包含這樣的序列，在指定比較窗口上該序列與參考序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％或更高的序列同一性。出于這些目的的最佳比對(duì)可用Needleman和Wunsch(1970)(出處同上)的全局比對(duì)算法來進(jìn)行。兩條肽序列實(shí)質(zhì)上相同的指示是，一種肽可與針對(duì)第二種肽產(chǎn)生的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。因而，例如，如果某種肽與第二種肽差別僅在于保守置換的話，則這兩種肽實(shí)質(zhì)上相同?！皩?shí)質(zhì)上相似的”肽共有如上所述的序列，例外的是不相同的殘基位置差別可能在于保守氨基酸變化。

本文中術(shù)語“核苷酸構(gòu)建體”的使用無意于將所述實(shí)施方案局限于包含DNA的核苷酸構(gòu)建體。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，核苷酸構(gòu)建體，特別是由核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的組合構(gòu)成的多核苷酸和寡核苷酸，也可應(yīng)用于本文公開的方法中。所述實(shí)施方案的核苷酸構(gòu)建體、核酸和核苷酸序列另外涵蓋這類構(gòu)建體、分子和序列的所有互補(bǔ)形式。此外，所述實(shí)施方案的核苷酸構(gòu)建體、核苷酸分子和核苷酸序列涵蓋可在本發(fā)明實(shí)施方案的方法中采用以轉(zhuǎn)化植物的所有核苷酸構(gòu)建體、分子和序列，包括但不限于那些由脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸以及它們的組合所構(gòu)成的核苷酸構(gòu)建體、分子和序列。這種脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸既包括天然存在的分子，也包括合成的類似物。本發(fā)明實(shí)施方案的核苷酸構(gòu)建體、核酸和核苷酸序列還涵蓋所有形式的核苷酸構(gòu)建體，包括但不限于單鏈形式、雙鏈形式、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、莖-環(huán)結(jié)構(gòu)等。

另一個(gè)實(shí)施方案例涉及轉(zhuǎn)化的生物體，如選自植物和昆蟲細(xì)胞、細(xì)菌、酵母、桿狀病毒、原生動(dòng)物、線蟲和藻類的生物體。該轉(zhuǎn)化的生物體包含：本發(fā)明實(shí)施方案的DNA分子、含所述DNA分子的表達(dá)盒或者含所述表達(dá)盒的載體，它們可穩(wěn)定摻入到轉(zhuǎn)化的生物體的基因組中。

所述實(shí)施方案的序列在DNA構(gòu)建體中提供以用于在所關(guān)注生物體中表達(dá)。該構(gòu)建體將包括可操作地連接至本發(fā)明實(shí)施方案的序列的5′和3′調(diào)控序列。本文所用的術(shù)語“可操作地連接”指啟動(dòng)子與第二序列之間的功能性連接，其中啟動(dòng)子序列起始并介導(dǎo)與第二序列對(duì)應(yīng)的DNA序列的轉(zhuǎn)錄。一般來講，可操作地連接意指被連接的核酸序列是連續(xù)的，并且如果有必要連接兩個(gè)蛋白編碼區(qū)的話，是連續(xù)的且在相同的閱讀框內(nèi)。該構(gòu)建體可另外含有至少一個(gè)待共轉(zhuǎn)化到該生物體中的額外基因?；蛘?，所述額外基因可在多個(gè)DNA構(gòu)建體上提供。

這種DNA構(gòu)建體提供有多個(gè)限制性位點(diǎn)，以使Cry毒素序列的插入處于調(diào)控區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控之下。DNA構(gòu)建體可另外含有選擇性標(biāo)記基因。

該DNA構(gòu)建體在5′至3′轉(zhuǎn)錄方向上將包含：轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)(即，啟動(dòng)子)、本發(fā)明實(shí)施方案的DNA序列、和在充當(dāng)宿主的生物體中具有功能的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)(即終止區(qū))。所述轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(即啟動(dòng)子)相對(duì)于宿主生物體和/或相對(duì)于本發(fā)明實(shí)施方案的序列可以是天然的、類似的、外來的或者異源的。另外，該啟動(dòng)子可以是天然序列或另選地是合成序列。如本文所用的術(shù)語“外來的”表示啟動(dòng)子在引入該啟動(dòng)子的天然生物體中不存在。如果啟動(dòng)子相對(duì)于本發(fā)明實(shí)施方案的序列是“外來的”或者“異源的”，則意指該啟動(dòng)子不是可操作地連接的本發(fā)明實(shí)施方案的序列的天然或天然存在的啟動(dòng)子。本文所用的嵌合基因包含可操作地連接至轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的編碼序列，該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)對(duì)于該編碼序列是異源的。如果啟動(dòng)子是天然或自然的序列，則可操作地連接的序列的表達(dá)相比野生型表達(dá)被變更，這導(dǎo)致表型變更。

終止區(qū)可以是對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始區(qū)而言是天然的，可以對(duì)于可操作地連接的目的DNA序列而言是天然的，可以對(duì)于植物宿主而言是天然的，或者可以衍自另一來源(即對(duì)于該啟動(dòng)子、目的序列、植物宿主或者它們的任何組合而言是外來的或異源的)。

易得的終止區(qū)可獲自根瘤農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)的Ti質(zhì)粒，比如章魚堿合酶和胭脂堿合酶終止區(qū)。另參見Guerineau等人，(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot，(1991)Cell 64：671-674；Callis等人，(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen等人，(1990)Plant Cell 2：1261-1272；Munroe等人，(1990)Gene 91：151-158；Ballas等人，(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903；以及Joshi等人，(1987)Nucleic AcidRes.15：9627-9639。

如適當(dāng)，可將核酸進(jìn)行優(yōu)化以提高其在宿主生物體中的表達(dá)。因此，如果該宿主生物體是植物，則可用植物優(yōu)選的密碼子合成出合成的核酸以改善表達(dá)。有關(guān)宿主優(yōu)選的密碼子用法的討論，參見例如Campbell和Gowri，(1990)Plant Physiol.92：1-11。例如，盡管本發(fā)明實(shí)施方案的核酸序列在單子葉植物物種和雙子葉植物物種兩者中都可表達(dá)，但可對(duì)序列進(jìn)行修飾以解決單子葉植物或雙子葉植物的特定密碼子偏好性和GC含量偏好性，因?yàn)檫@些偏好性已被證實(shí)是不同的(Murray等人，(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498)。因此，特定氨基酸的玉蜀黍優(yōu)選的密碼子可由來自玉蜀黍的已知基因序列得出。關(guān)于來自玉蜀黍植物的28個(gè)基因的玉蜀黍密碼子用法在Murray等人(出處同上)的表4中列出。合成植物優(yōu)選的基因的方法是本領(lǐng)域現(xiàn)成的。參見例如美國專利No.5,380,831和No.5,436,391，以及Murray et al.(1989)Nucleic Acids Res.18：455-498(Murray等人，1989年，《核酸研究》，第18卷，第455-498頁)，將其以引用方式并入本文。

已知有另外的序列修飾能增強(qiáng)細(xì)胞宿主中的基因表達(dá)。這些包括消除以下序列：編碼假多聚腺苷酸化信號(hào)、外顯子-內(nèi)含子剪接位點(diǎn)信號(hào)的序列、轉(zhuǎn)座子樣重復(fù)序列以及其它得到充分表征的可能對(duì)基因表達(dá)有害的序列?？蓪⑿蛄械腉C含量調(diào)節(jié)至給定細(xì)胞宿主的平均水平，這通過參考在宿主細(xì)胞中表達(dá)的已知基因計(jì)算得到。如本文所用的術(shù)語“宿主細(xì)胞”指含有載體并支持該表達(dá)載體的復(fù)制和/或表達(dá)的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞如大腸桿菌(E.coli)或者真核細(xì)胞如酵母、昆蟲、兩棲動(dòng)物或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞，或者單子葉或者雙子葉植物細(xì)胞。單子葉植物宿主細(xì)胞的一個(gè)示例是玉蜀黍宿主細(xì)胞。當(dāng)可能時(shí)，修飾序列以避免可預(yù)見的發(fā)夾二級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)。

表達(dá)盒可以另外含有5′前導(dǎo)序列。此類前導(dǎo)序列可以起到增強(qiáng)翻譯的作用。翻譯前導(dǎo)序列是本領(lǐng)域已知的，包括：小核糖核酸病毒前導(dǎo)序列，例如EMCV前導(dǎo)序列(腦心肌炎5′非編碼區(qū))(Elroy-Stein等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6126-6130)；馬鈴薯Y病毒前導(dǎo)序列，例如TEV前導(dǎo)序列(煙草蝕紋病毒)(Gallie等人，(1995)Gene 165(2)：233-238)；MDMV前導(dǎo)序列(玉米矮花葉病毒)；人免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BiP)(Macejak等人，(1991)Nature 353：90-94)；來自苜?；ㄈ~病毒的外殼蛋白mRNA(AMV RNA 4)的非翻譯前導(dǎo)序列(Jobling等人，(1987)Nature 325：622-625)；煙草花葉病毒前導(dǎo)序列(TMV)(Gallie等人(1989)，載于：Molecular Biology of RNA，Cech編輯(Liss，New York)，第237-256頁)；以及玉米褪綠斑駁病毒前導(dǎo)序列(MCMV)(Lommel等人，(1991)Virology 81：382-385)。另參見Della-Cioppa等人，(1987)Plant Physiol.84：965-968。

在制備表達(dá)盒時(shí)，可對(duì)多個(gè)DNA片段進(jìn)行操縱，以提供處于正確取向的DNA序列，且適當(dāng)時(shí)提供處于正確的閱讀框內(nèi)的DNA序列。為此目的，可應(yīng)用銜接子或接頭將DNA片段連接在一起，或者可涉及其它的操縱以提供易得的限制性位點(diǎn)、移除多余的DNA、移除限制性位點(diǎn)等。出于這個(gè)目的，可能涉及體外誘變、引物修復(fù)、限制性酶切、退火、再置換(例如轉(zhuǎn)換和顛換)。

有多種啟動(dòng)子可用于本發(fā)明實(shí)施方案的實(shí)踐中?？筛鶕?jù)期望的結(jié)果來選擇啟動(dòng)子?？蓪⒑怂崤c組成型啟動(dòng)子、組織優(yōu)選的啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或其它啟動(dòng)子進(jìn)行組合，以在宿主生物體中表達(dá)。適用于植物宿主細(xì)胞的組成型啟動(dòng)子包括例如WO 99/43838和美國專利No.6,072,050中公開的Rsyn7啟動(dòng)子和其它組成型啟動(dòng)子的核心啟動(dòng)子；核心CaMV 35S啟動(dòng)子(Odell等人，(1985)Nature 313：810-812)；水稻肌動(dòng)蛋白(McElroy等人，(1990)Plant Cell 2：163-171)；遍在蛋白(Christensen等人，(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632，以及Christensen等人，(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等人，(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等人，(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS啟動(dòng)子(美國專利No.5,659,026)，等等。其它的組成型啟動(dòng)子包括例如以下各個(gè)美國專利中論述的那些：No.5,608,149、5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；和6,177,611。

取決于所需的結(jié)果，從誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)基因可能是有利的。對(duì)于調(diào)控本發(fā)明實(shí)施方案的核苷酸序列在植物中的表達(dá)特別有意義的是損傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。這種損傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可響應(yīng)于由昆蟲取食所引起的損害，包括馬鈴薯蛋白酶抑制劑(pin II)基因(Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopath.28：425-449；Duan等人，(1996)Nature Biotechnology 14：494-498)；wun1和wun2，美國專利No.5,428,148；win1和win2(Stanford等人，(1989)Mol.Gen.Genet.215：200-208)；系統(tǒng)素(McGurl等人，(1992)Science 225：1570-1573)；WIPl(Rohmeier等人，(1993)Plant Mol.Biol.22：783-792；Eckelkamp等人，(1993)FEBS Letters 323：73-76)；MPI基因(Corderok等人，(1994)Plant J.6(2)：141-150)；等等，將這些專利和文獻(xiàn)以引用方式并入本文。

另外，病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可在所述實(shí)施方案的方法和核苷酸構(gòu)建體中使用。這種病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括那些來自致病相關(guān)蛋白(PR蛋白)的在被病原體感染后被誘導(dǎo)的啟動(dòng)子；例如，PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶等。參見例如Redolfi等人，(1983)Neth.J.Plant Pathol.89：245-254；Uknes等人，(1992)Plant Cell 4：645-656；以及Van Loon，(1985)Plant Mol.Virol.4：111-116。還可參見WO 99/43819，該專利以引用的方式并入本文。

在病原體感染位點(diǎn)處或附近局部表達(dá)的啟動(dòng)子值得關(guān)注。參見例如，Marineau等人，(1987)Plant Mol.Biol.9：335-342；Matton等人，(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions 2：325-331；Somsisch等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：2427-2430；Somsisch等人，(1988)Mol.Gen.Genet.2：93-98；以及Yang(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：14972-14977。還可參見Chen等人，(1996)Plant J.10：955-966；Zhang等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：2507-2511；Warner等人，(1993)Plant J.3：191-201；Siebertz等人，(1989)Plant Cell 1：961-968；美國專利No.5,750,386(線蟲誘導(dǎo)型)；以及其中引用的參考文獻(xiàn)。特別值得關(guān)注的是玉蜀黍PRms基因的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其表達(dá)由病原體串珠鐮刀菌(Fusarium moniliforme)誘導(dǎo)(參見例如，Cordero等人，(1992)Physiol.Mol.Plant Path.41：189-200)。

可通過施加外源化學(xué)調(diào)節(jié)劑將化學(xué)調(diào)控啟動(dòng)子用于調(diào)節(jié)基因在植物中的表達(dá)。取決于目標(biāo)，啟動(dòng)子可以是化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其中施用化學(xué)物質(zhì)可誘導(dǎo)基因表達(dá)，或者是化學(xué)阻抑型啟動(dòng)子，其中施用化學(xué)物質(zhì)可抑制基因表達(dá)。化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于玉蜀黍In2-2啟動(dòng)子(其通過苯磺酰胺除草劑安全劑活化)、玉蜀黍GST啟動(dòng)子(其通過用作芽前除草劑的疏水性親電化合物活化)和煙草PR-1a啟動(dòng)子(其通過水楊酸活化)。其它所關(guān)注的化學(xué)調(diào)控啟動(dòng)子包括甾類化合物響應(yīng)性啟動(dòng)子(參見例如，糖皮質(zhì)類固醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，載于Schena等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10421-10425以及McNellis等人，(1998)Plant J.14(2)：247-257)以及四環(huán)素誘導(dǎo)型和四環(huán)素阻抑型啟動(dòng)子(參見例如Gatz等人，(1991)Mol.Gen.Genet.227：229-237以及美國專利No.5,814,618和5,789,156)，這些文獻(xiàn)和專利以引用方式并入本文。

組織優(yōu)選的啟動(dòng)子可用來使增強(qiáng)的殺蟲蛋白表達(dá)靶向于特定的植物組織內(nèi)。組織優(yōu)選的啟動(dòng)子包括以下文獻(xiàn)中討論的那些啟動(dòng)子：Yamamoto等人，(1997)Plant J.12(2)255-265；Kawamata等人，(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803；Hansen等人，(1997)Mol.Gen Genet.254(3)：337-343；Russell等人，(1997)Transgenic Res.6(2)：157-168；Rinehart等人，(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1341；Van Camp等人，(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535；Canevascini等人，(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524；Yamamoto等人，(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20：181-196；Orozco等人，(1993)Plant Mol Biol.23(6)：1129-1138；Matsuoka等人，(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590；以及Guevara-Garcia等人，(1993)Plant J.4(3)：495-505。如有必要，可對(duì)此類啟動(dòng)子進(jìn)行修飾，以便弱化表達(dá)。

葉優(yōu)選的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的。參見例如Yamamoto等人，(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kwon等人，(1994)Plant Physiol.105：357-67；Yamamoto等人，(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Gotor等人，(1993)Plant J.3：509-18；Orozco等人，(1993)Plant Mol.Biol.23(6)：1129-1138；以及Matsuoka等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590。

根優(yōu)選的啟動(dòng)子或者根特異性啟動(dòng)子是已知的，并且可選自許多可從文獻(xiàn)得到的啟動(dòng)子，或者從各種相容的物種從頭(de novo)分離。參見例如，Hire等人，(1992)Plant Mol.Biol.20(2)：207-218(大豆根特異性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner(1991)Plant Cell 3(10)：1051-1061(法國菜豆的GRP 1.8基因中的根特異性控制元件)；Sanger等人，(1990)Plant Mol.Biol.14(3)：433-443(根瘤農(nóng)桿菌的甘露氨酸合酶(MAS)基因的根特異性啟動(dòng)子)；以及Miao等人，(1991)Plant Cell 3(1)：11-22(編碼胞液型谷氨酰胺合成酶(GS)的全長cDNA克隆，該酶在大豆的根和根瘤中表達(dá))。還可參見Bogusz等人，(1990)Plant Cell 2(7)：633-641，其中描述了從來自固氮非豆科植物榆科山黃麻(Parasponia andersonii)和相關(guān)的非固氮非豆科植物雞屎藤山麻黃(Trema tomentosa)的血紅蛋白基因分離的兩種根特異性啟動(dòng)子。將這些基因的啟動(dòng)子連接至β-葡糖醛酸酶報(bào)道基因并引入非豆科植物煙草(Nicotiana tabacum)和豆科植物百脈根(Lotus corniculatus)二者中，在這兩種情況中根特異性啟動(dòng)子活性得以保持。Leach和Aoyagi(1991)描述了他們對(duì)毛根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)的高表達(dá)rolC和rolD根誘導(dǎo)基因的啟動(dòng)子的分析結(jié)果(參見Plant Science(Limerick)79(1)：69-76)。他們得出結(jié)論認(rèn)為，增強(qiáng)子和組織優(yōu)選的DNA決定子在那些啟動(dòng)子中是分離的。Teeri等人，(1989)使用與lacZ的基因融合證實(shí)，編碼章魚堿合酶的農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)T-DNA基因在根尖表皮中特別活躍，且TR2′基因在完整植物中是根特異性的并通過葉組織中的創(chuàng)傷刺激，這是用于殺昆蟲或殺幼蟲基因的特別理想的特性組合(參見EMBO J.8(2)：343-350)。與nptlI(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II)融合的TR1′基因顯示了相似的特性。另外的根優(yōu)選的啟動(dòng)子包括VfENOD-GRP3基因啟動(dòng)子(Kuster等人，(1995)Plant Mol.Biol.29(4)：759-772)；以及rolB啟動(dòng)子(Capana等人，(1994)Plant Mol.Biol.25(4)：681-691)。另參見以下美國專利：No.5,837,876；5,750,386；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5,110,732；和5,023,179。

“種子優(yōu)選的”啟動(dòng)子包括“種子特異性”啟動(dòng)子(這種啟動(dòng)子在種子發(fā)育期間活躍，例如種子貯藏蛋白的啟動(dòng)子)和“種子萌發(fā)”啟動(dòng)子(這種啟動(dòng)子在種子萌發(fā)期間活躍)。參見Thompson等人，(1989)BioEssays 10：108，該文獻(xiàn)以引用方式并入本文。這類種子優(yōu)選的啟動(dòng)子包括但不限于Cim1(細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)信息)；cZ19B1(玉蜀黍19kDa玉米醇溶蛋白)；和milps(肌醇-1-磷酸合酶)(參見美國專利No.6,225,529，將該文獻(xiàn)以引用方式并入本文)。γ-玉米醇溶蛋白和Glob-1是胚乳特異性啟動(dòng)子。對(duì)于雙子葉植物而言，種子特異性啟動(dòng)子包括但不限于菜豆β-菜豆蛋白基因啟動(dòng)子、油菜籽蛋白(napin)基因啟動(dòng)子、β-伴球蛋白基因啟動(dòng)子、大豆凝集素基因啟動(dòng)子、十字花科蛋白基因啟動(dòng)子等。對(duì)于單子葉植物，種子特異性啟動(dòng)子包括但不限于玉蜀黍15kDa玉米醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27kDa玉米醇溶蛋白、g-玉米醇溶蛋白、waxy、shrunken 1、shrunken 2、球蛋白1等。還可參見WO 00/12733，其中公開了來自endl和end2基因的種子優(yōu)選的啟動(dòng)子；該專利以引用方式并入本文。在特定組織中具有“偏好”表達(dá)的啟動(dòng)子在該組織中表達(dá)的程度高于在至少一種其它植物組織中表達(dá)的程度。一些組織優(yōu)選的啟動(dòng)子幾乎專門在特定組織中表達(dá)。

如果需要低水平表達(dá)，則要使用弱啟動(dòng)子。一般來講，如本文所用的術(shù)語“弱啟動(dòng)子”指驅(qū)動(dòng)編碼序列以低水平表達(dá)的啟動(dòng)子。所謂“低水平表達(dá)”意指處于約1/1000個(gè)轉(zhuǎn)錄物至約1/100,000個(gè)轉(zhuǎn)錄物至約1/500,000個(gè)轉(zhuǎn)錄物的水平。作為另一種選擇，認(rèn)識(shí)到術(shù)語“弱啟動(dòng)子”還涵蓋僅在少數(shù)細(xì)胞中而不在其它細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)表達(dá)從而造成總表達(dá)水平較低的啟動(dòng)子。如啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)不可接受的高水平表達(dá)，則可缺失或者修飾啟動(dòng)子序列的一些部分以降低表達(dá)水平。

這種弱組成型啟動(dòng)子包括例如Rsyn7啟動(dòng)子的核心啟動(dòng)子(WO 99/43838和美國專利No.6,072,050)、核心35S CaMV啟動(dòng)子等。其它組成型啟動(dòng)子包括例如以下美國專利中描述的那些啟動(dòng)子：No.5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；和6,177,611，這些專利以引用方式并入本文。

一般來講，表達(dá)盒將包含用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇性標(biāo)記基因。選擇性標(biāo)記基因用于選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織。標(biāo)記基因包括編碼抗生素抗性的基因，諸如那些編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(NEO)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)的基因，以及賦予對(duì)除草化合物的抗性的基因，所述除草化合物為例如草銨膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)。合適的選擇性標(biāo)記基因的另外示例包括但不限于：編碼對(duì)以下抗生素的抗性的基因：氯霉素(Herrera Estrella等人，(1983)EMBO J.2：987-992)；甲氨喋呤(Herrera Estrella等人，(1983)Nature 303：209-213；以及Meijer等人，(1991)Plant Mol.Biol.16：807-820)；鏈霉素(Jones等人，(1987)Mol.Gen.Genet.210：86-91)；壯觀霉素(Bretagne-Sagnard等人，(1996)Transgenic Res.5：131-137)；博來霉素(Hille等人，(1990)Plant Mol.Biol.7：171-176)；磺酰胺(Guerineau等人，(1990)Plant Mol.Biol.15：127-136)；溴苯腈(Stalker等人，(1988)Science 242：419-423)；草甘膦(Shaw等人，(1986)Science 233：478-481；以及美國專利No.7,709,702和7,462,481)；草丁膦(DeBlock等人，(1987)EMBO J.6：2513-2518)。主要參見：Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511；Christopherson等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6314-6318；Yao等人，(1992)Cell 71：63-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6：2419-2422；Barkley等人，(1980)，載于：The Operon，第177-220頁；Hu等人，(1987)Cell 48：555-566；Brown等人，(1987)Cell 49：603-612；Figge等人，(1988)Cell 52：713-722；Deuschle等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5400-5404；Fuerst等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2549-2553；Deuschle等人，(1990)Science 248：480-483；Gossen(1993)德國海德爾堡大學(xué)(University of Heidelberg)博士論文；Reines等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1917-1921；Labow等人，(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-3356；Zambretti等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3952-3956；Baim等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5072-5076；Wyborski等人，(1991)Nucleic Acids Res.19：4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10：143-162；Degenkolb等人，(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：1591-1595；Kleinschnidt等人，(1988)Biochemistry 27：1094-1104；Bonin(1993)德國海德爾堡大學(xué)(University of Heidelberg)博士論文；Gossen等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551；Oliva等人，(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36：913-919；Hlavka等人(1985)Handbook of Experimental Pharmacology(《實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)手冊(cè)》)，第78卷(Springer-Verlag，Berlin)；以及Gill等人，(1988)Nature 334：721-724。這些公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。

以上選擇性標(biāo)記基因的列表并不意指是限制性的。任何選擇性標(biāo)記基因都可用于本發(fā)明實(shí)施方案。

本發(fā)明實(shí)施方案的方法涉及將多肽或多核苷酸引入植物中?！耙搿币庠谥敢远嗪塑账峄蛘叨嚯男蛄羞M(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)部的方式將多核苷酸或者多肽呈送到植物。本發(fā)明實(shí)施方案的方法不依賴于將多核苷酸或多肽引入植物中的具體方法，只要多核苷酸或多肽可進(jìn)入植物的至少一個(gè)細(xì)胞的內(nèi)部即可。用于將多核苷酸或多肽引入植物中的方法是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法、瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法和病毒介導(dǎo)的方法。

“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化”意指被引入植物中的核苷酸構(gòu)建體整合進(jìn)植物的基因組中，并能夠由其后代繼承。“瞬時(shí)轉(zhuǎn)化”意指將多核苷酸引入植物中但它沒有整合進(jìn)植物的基因組中，或者將多肽引入植物中。

轉(zhuǎn)化方案以及將核苷酸序列引入植物中的方案，可以根據(jù)轉(zhuǎn)化所靶向的植物或者植物細(xì)胞的類型(即單子葉植物或者雙子葉植物)變動(dòng)。將核苷酸序列引入植物細(xì)胞中并隨后插入植物基因組中的合適方法包括：微量注射法(Crossway等人，(1986)Biotechniques 4：320-334)、電穿孔(Riggs等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(美國專利No.5,563,055和5,981,840)、直接基因轉(zhuǎn)移(Paszkowski等人，(1984)EMBO J.3：2717-2722)以及彈道粒子加速(參見例如美國專利No.4,945,050；5,879,918；5,886,244；和5,932,782；Tomes等人，(1995)，載于Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods，Gamborg和Phillips編輯(Springer-Verlag，Berlin)；以及McCabe等人，(1988)Biotechnology 6：923-926)；以及Lecl轉(zhuǎn)化(WO 00/28058)。對(duì)于馬鈴薯轉(zhuǎn)化，參見Tu等人，(1998)Plant Molecular Biology 37：829-838；以及Chong等人，(2000)Transgenic Research 9：71-78。另外的轉(zhuǎn)化程序可見于Weissinger等人，(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；Sanford等人，(1987)Particulate Science and Technology 5：27-37(洋蔥)；Christou等人，(1988)Plant Physiol.87：671-674(大豆)；McCabe等人，(1988)Bio/Technology 6：923-926(大豆)；Finer和McMullen，(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P：175-182(大豆)；Singh等人，(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(大豆)；Datta等人，(1990)Biotechnology 8：736-740(水稻)；Klein等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(玉蜀黍)；Klein等人，(1988)Biotechnology 6：559-563(玉蜀黍)；美國專利No.5,240,855；5,322,783和5,324,646；Klein等人，(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉蜀黍)；Fromm等人，(1990)Biotechnology 8：833-839(玉蜀黍)；Hooykaas-Van Slogteren等人，(1984)Nature(London)311：763-764；美國專利No.5,736,369(谷類)；Bytebier等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(百合科)；De Wet等人，(1985)，載于The Experimental Manipulation of Ovule Tissues，Chapman等人編輯(Longman，New York)，第197-209頁)(花粉)；Kaeppler等人，(1990)Plant Cell Reports 9：415-418，以及Kaeppler等人，(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(頸須介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)；D′Halluin等人，(1992)Plant Cell 4：1495-1505(電穿孔)；Li等人，(1993)Plant Cell Reports 12：250-255以及Christou和Ford，(1995)Annals of Botany 75：407-413(水稻)；Osjoda等人，(1996)Nature Biotechnology 14：745-750(玉蜀黍，通過根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens))；將所有這些文獻(xiàn)和專利以引用方式并入本文。

在具體的實(shí)施方案中，所述實(shí)施方案的序列可用多種瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法提供給植物。這類瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法包括但不限于直接向植物中引入Cry毒素蛋白或其變體和片段，或者向植物中引入Cry毒素轉(zhuǎn)錄物。這類方法包括(例如)顯微注射法或粒子轟擊法。參見例如Crossway等人，(1986)Mol Gen.Genet.202：179-185；Nomura等人，(1986)Plant Sci.44：53-58；Hepler等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：2176-2180以及Hush等人，(1994)The Journal of Cell Science 107：775-784；所有這些文獻(xiàn)以引用方式并入本文。作為另一種選擇，可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)將Cry毒素多核苷酸瞬時(shí)轉(zhuǎn)化到植物中。此類技術(shù)包括利用病毒載體系統(tǒng)，和將多核苷酸以避免DNA隨后釋放的方式沉淀。因此，從粒子結(jié)合的DNA可發(fā)生轉(zhuǎn)錄，但其釋放出來而整合進(jìn)基因組中的頻率則大大降低。此類方法包括使用包被有聚乙基亞胺(PEI；Sigma#P3143)的粒子。

用于在植物基因組中特定位置處靶向插入多核苷酸的方法是本領(lǐng)域已知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，在期望的基因組位置處插入多核苷酸是使用位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的。參見例如WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，這些專利全部以引用方式并入本文。簡(jiǎn)而言之，可將本發(fā)明實(shí)施方案的多核苷酸包含在轉(zhuǎn)移盒中，該轉(zhuǎn)移盒旁側(cè)是兩個(gè)不相同的重組位點(diǎn)。將轉(zhuǎn)移盒引入植物中，該植物基因組中穩(wěn)定摻入有靶位點(diǎn)，其中所述靶位點(diǎn)旁側(cè)是兩個(gè)與該轉(zhuǎn)移盒的所述位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的不相同重組位點(diǎn)。提供適當(dāng)?shù)闹亟M酶，將轉(zhuǎn)移盒整合在該靶位點(diǎn)處。目的多核苷酸因此被整合在植物基因組中的特定染色體位置處。

可依據(jù)常規(guī)方式將已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培育成植株。參見例如，McCormick等人，(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。然后可栽培這些植株并用同一轉(zhuǎn)化株系或不同的株系進(jìn)行授粉，并鑒定出具有所需表型特征的組成型或者誘導(dǎo)型表達(dá)的所得雜交種。可以培育兩代或更多代以確保穩(wěn)定保持和遺傳所需表型特性的表達(dá)，然后收獲種子以確保已經(jīng)實(shí)現(xiàn)所需表型特征的表達(dá)。

本發(fā)明實(shí)施方案的核苷酸序列可通過使植物與病毒或者病毒核酸接觸而提供給植物。通常，這種方法涉及將目的核苷酸構(gòu)建體摻入病毒DNA或RNA分子內(nèi)。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明實(shí)施方案的重組蛋白可最初作為病毒聚蛋白的一部分來合成，其以后可通過體內(nèi)或體外蛋白水解加工而產(chǎn)生所需的殺蟲蛋白。還認(rèn)識(shí)到，這種包含本發(fā)明實(shí)施方案的殺蟲蛋白的氨基酸序列的至少一部分的病毒聚蛋白可具有所需的殺蟲活性。這種病毒聚蛋白及其編碼核苷酸序列為本發(fā)明實(shí)施方案所涵蓋。用于給植物提供核苷酸構(gòu)建體并在植物中產(chǎn)生所編碼的蛋白質(zhì)的方法(涉及病毒DNA或RNA分子)是本領(lǐng)域已知的。參見例如美國專利No.5,889,191；5,889,190；5,866,785；5,589,367；和5,316,931；這些專利以引用方式并入本文。

所述實(shí)施方案還涉及所述實(shí)施方案的轉(zhuǎn)化植物的植物繁殖材料，包括但不限于種子、塊莖、球莖、鱗莖、葉、以及根和苗的插條。

本發(fā)明實(shí)施方案可用于轉(zhuǎn)化任何植物物種，包括但不限于單子葉植物和雙子葉植物。所關(guān)注的植物的示例包括但不限于玉米(Zea mays)、蕓苔屬物種(Brassica sp.)(例如甘藍(lán)型油菜(B.napus)、蕪菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea))，特別是可用作種子油來源的那些蕓苔屬物種；苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、黑麥(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、粟(例如珍珠粟(Pennisetum glaucum)、黃米(Panicum miliaceum)、谷子(Setaria italica)、龍爪稷(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、紅花(Carthamus tinctorius)、小麥(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、煙草Nicotiana tabacum)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(海島棉(Gossypium barbadense)、陸地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Coffea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠蘿(Ananas comosus)、柑橘(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、鱷梨(Persea americana)、無花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄欖(Olea europaea)、木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳洲堅(jiān)果(Macadamia integrifolia)、杏樹(Prunus amygdalus)、糖用甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麥、大麥、蔬菜、觀賞植物和針葉樹。

蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)、萵苣(例如Lactuca sativa)、青豆(Phaseolus vulgaris)、利馬豆(Phaseolus limensis)、豌豆(香豌豆屬(Lathyrus)物種)和黃瓜屬(Cucumis)的成員比如黃瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。觀賞植物包括杜鵑(杜鵑花屬(Rhododendron)物種)、八仙花(Macrophylla hydrangea)、朱槿(Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(薔薇屬(Rosa)物種)、郁金香(郁金香屬(Tulipa)物種)、水仙(水仙屬(Narcissus)物種)、矮牽牛(Petunia hybrida)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、一品紅(Euphorbia pulcherrima)和菊花。可應(yīng)用于實(shí)踐所述實(shí)施方案的針葉樹包括例如松樹，如火炬松(Pinus taeda)、沼澤松(Pinus elliotii)、美國黃松(Pinus ponderosa)、黑松(Pinus contorta)和蒙特利松(Pinus radiata)；花旗松(Pseudotsuga menziesii)；西鐵杉(Tsuga canadensis)；北美云杉(Picea glauca)；紅杉(Sequoia sempervirens)；樅樹(true firs)諸如銀樅(Abies amabilis)和膠樅(Abies balsamea)；以及雪松諸如西方紅雪松(Thuja plicata)和阿拉斯加黃雪松(Chamaecyparis nootkatensis)。本發(fā)明實(shí)施方案的植物包括作物植物，包括但不限于：玉米、苜蓿、向日葵、蕓苔屬物種(Brassica spp.)、大豆、棉花、紅花、花生、高粱、小麥、粟、煙草屬植物、甘蔗等。

草坪草包括但不限于：一年生早熟禾(Poa annua)；一年生黑麥草(Lolium multiflorum)；加拿大藍(lán)草(Poa compressa)；紫羊茅(Festuca rubra)；細(xì)弱剪股穎(Agrostis tenuis)；匍匐翦股穎(Agrostis palustris)；光穗冰草(Agropyron desertorum)；扁穗冰草(Agropyron cristatum)；硬羊茅(Festuca longifolia)；肯塔基藍(lán)草(Poa pratensis)；果園草(Dactylis glomerata)；多年生黑麥草(Lolium perenne)；紫羊茅(Festuca rubra)；紅頂草(Agrostis alba)；粗莖藍(lán)草(Poa trivialis)；羊茅(Festuca ovina)；無芒雀麥草(Bromnus inermis)；高羊茅(Festuca arundinacea)；梯牧草(Phleum pratense)；絨毛剪股穎(Agrostis canina)；堿茅(Puccinellia distans)；西方冰草(Agropyron smithii)；百慕達(dá)草(Cynodon spp.)；圣奧古斯丁草(Stenotaphrum secundatum)；結(jié)縷草(Zoysia spp.)；美洲雀稗(Paspalum notatum)；地毯草(Axonopus affinis)；百足草(Eremochloa ophiuroides)；狼尾草(Pennisetum clandesinum)；海濱雀稗(Paspalum vaginatum)；藍(lán)格蘭馬草(Bouteloua gracilis)；野牛草(Buchloe dactyloids)；垂穗草(Bouteloua curtipendula)。

所關(guān)注的植物包括谷物植物(提供所關(guān)注的種子)、油籽植物和豆科植物。所關(guān)注的種子包括谷物種子，如玉米、小麥、大麥、水稻、高粱、黑麥、粟等。油籽植物包括棉花、大豆、紅花、向日葵、蕓苔屬植物、玉蜀黍、苜蓿、棕櫚、椰子、亞麻、蓖麻、橄欖等。豆科植物包括豆類和豌豆。豆類包括瓜爾豆、槐豆、胡蘆巴、大豆、四季豆、豇豆、綠豆、利馬豆、蠶豆、小扁豆、鷹嘴豆等。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明實(shí)施方案的核酸序列可與目的多核苷酸序列的任何組合進(jìn)行堆疊(stack)，以產(chǎn)生具有所需表型的植物。例如，本發(fā)明實(shí)施方案的多核苷酸可與任何其它編碼具有殺蟲和/或殺昆蟲活性的多肽的多核苷酸進(jìn)行堆疊，所述多肽例如其它Bt毒蛋白(描述于美國專利No.5,366,892；5,747,450；5,736,514；5,723,756；5,593,881；以及Geiser等人(1986)Gene 48：109)、五鄰體蛋白(pentin)(描述于美國專利No.5,981,722)等。所產(chǎn)生的組合還可包括目的多核苷酸中的任何一者的多個(gè)拷貝。本發(fā)明實(shí)施方案的多核苷酸也可與任何其它基因或者基因組合進(jìn)行堆疊，以產(chǎn)生具有多種所需的性狀組合的植物，所述性狀包括但不限于動(dòng)物飼料所需的性狀如高油基因(例如美國專利No.6,232,529)；平衡的氨基酸(例如hordothionins(美國專利No.5,990,389；5,885,801；5,885,802；和5,703,049)；大麥高賴氨酸(Williamson等人，(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106；和WO 98/20122)以及高甲硫氨酸蛋白(Pedersen等人，(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara等人，(1988)Gene 71：359；和Musumura等人，(1989)Plant Mol.Biol.12：123))；消化性提高(例如經(jīng)修飾的貯藏蛋白(美國專利6,858,778)；和硫氧還蛋白(美國專利No.7,009,087)；將這些文獻(xiàn)和專利的公開內(nèi)容以引用方式并入本文。

本發(fā)明實(shí)施方案的多核苷酸也可與疾病或者抗除草劑性所需的性狀進(jìn)行堆疊(例如伏馬毒素脫毒基因(美國專利No.5,792,931)；無毒性和疾病抗性基因(Jones等人，(1994)Science 266：789；Martin等人，(1993)Science 262：1432；以及Mindrinos等人，(1994)Cell 78：1089)；導(dǎo)致抗除草劑性的乙酰乳酸合酶(ALS)突變體，例如S4和/或Hra突變；谷氨酰胺合酶的抑制劑例如草丁膦或basta(例如，bar基因)；以及草甘膦抗性(EPSPS基因和GAT基因，如美國專利No.7,709,702和7,462,481中所公開；以及加工或過程產(chǎn)物所需的性狀，如高油(例如美國專利No.6,232,529)；改性油(例如脂肪酸去飽和酶基因(美國專利No.5,952,544；WO 94/11516))；改性淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGP酶)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脫支酶(SDBE))；以及聚合物或者生物塑料(例如美國專利No.5,602,321；β-酮基硫解酶、聚羥基丁酸合酶和乙酰乙酰基-CoA還原酶(Schubert細(xì)菌，(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)有利于聚羥基鏈烷酸酯(PHA)的表達(dá))，以上公開內(nèi)容以引用方式并入本文。還可以將本發(fā)明實(shí)施方案的多核苷酸與提供諸如雄性不育(例如參見美國專利No.5.583,210)、莖稈強(qiáng)度、開花時(shí)間之類的農(nóng)學(xué)性狀或者諸如細(xì)胞周期調(diào)控或基因靶向(例如WO 99/61619；WO 00/17364；WO 99/25821)之類的轉(zhuǎn)化技術(shù)性狀的多核苷酸組合，以上公開內(nèi)容以引用方式并入本文。

在一些實(shí)施方案中，堆疊的性狀可為已取得監(jiān)管批準(zhǔn)的性狀或事件，包括但不限于表4A-F中的事件。

表4A Glvcine max L.大豆

表4A續(xù)表Glycine maxL.大豆

表4B Triticum aestivum小麥

表4C Zea mays L.玉蜀黍

表4C續(xù)表Zea mays L.玉蜀黍

表4C續(xù)表Zea mays L.玉蜀黍

表4C續(xù)表Zea mays L.玉蜀黍

表4C續(xù)表Zea mays L.玉蜀黍

表4C續(xù)表Zea mays L.玉蜀黍

表4D Oryza sativa水稻

表4E Helianthus annuus向日葵

表4F Medicago sativa苜蓿

其它監(jiān)管批準(zhǔn)的事件是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并且可見于環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心(cera-gmc.org/？action＝gm_crop_database，可使用www前綴對(duì)其進(jìn)行訪問)和國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織(International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications)(isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp，可使用www前綴對(duì)其進(jìn)行訪問)。

這些堆疊的組合可通過任何方法來產(chǎn)生，包括但不限于通過任何常規(guī)方法或方法或遺傳轉(zhuǎn)化來對(duì)植物進(jìn)行雜交育種。如果性狀是通過遺傳轉(zhuǎn)化植株來堆疊，則目的多核苷酸序列可在任何時(shí)間以任何順序進(jìn)行組合。例如，可將包含一種或多種期望性狀的轉(zhuǎn)基因植物用作靶標(biāo)，通過后續(xù)的轉(zhuǎn)化引入更多性狀。可以用共轉(zhuǎn)化方案將性狀與目的多核苷酸同時(shí)引入，所述目的多核苷酸由轉(zhuǎn)化盒的任何組合提供。例如，如果將要引入兩條序列，則可將該兩條序列包含在單獨(dú)的轉(zhuǎn)化盒中(反式)或包含在同一轉(zhuǎn)化盒中(順式)。可通過相同啟動(dòng)子或不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)所述序列表達(dá)。在某些情況下，可期望引入會(huì)抑制目的多核苷酸的表達(dá)的轉(zhuǎn)化盒。這可以與其它抑制盒或過表達(dá)盒的任何組合進(jìn)行組合以在植物中生成所需的性狀組合。還認(rèn)識(shí)到，可使用位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)在所需的基因組位置處堆疊多核苷酸序列。參見例如WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，這些專利全部以引用方式并入本文。

本發(fā)明實(shí)施方案的組合物可用于以多種方式保護(hù)植物、種子和植物產(chǎn)物。例如，所述組合物可用于涉及通過選自噴霧、噴粉、廣播或者種子涂覆的程序?qū)⒂行Я康臍⑾x組合物置于害蟲的環(huán)境中的方法中。

在植物繁殖材料(果實(shí)、塊莖、鱗莖、球莖、谷物、種子)，但尤其是種子，作為商品出售之前，其通常用保護(hù)劑包衣進(jìn)行處理，所述保護(hù)劑包衣包含除草劑、殺昆蟲劑、殺真菌劑、殺細(xì)菌劑、殺線蟲劑、殺軟體動(dòng)物劑或這些制劑中的幾種的混合物，如果需要的話還進(jìn)一步加上制劑領(lǐng)域常用的載體、表面活性劑或促施用助劑，以提供對(duì)由抗細(xì)菌、真菌或動(dòng)物害蟲造成的損害的保護(hù)。為了處理種子，可通過如下方法將保護(hù)劑包衣施用至種子：用液體制劑浸漬塊莖或谷粒，或用組合的濕或干制劑對(duì)種子進(jìn)行涂覆。另外，在特殊的情況中，其它施用至植物的方法也是可能的，例如針對(duì)芽或果實(shí)進(jìn)行的處理。

包含編碼本發(fā)明實(shí)施方案的殺蟲蛋白的核苷酸序列的本發(fā)明實(shí)施方案的植物種子，可用包含種子處理化合物的種子保護(hù)劑包衣進(jìn)行處理，所述種子處理化合物例如克菌丹、萎銹靈、福美雙、methalaxyl、甲基嘧啶磷以及其它常用于種子處理的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含本發(fā)明實(shí)施方案的殺蟲組合物的種子保護(hù)劑包衣單獨(dú)使用或者與常用于種子處理的種子保護(hù)劑包衣之一組合使用。

認(rèn)識(shí)到，可用編碼殺蟲蛋白的基因來轉(zhuǎn)化昆蟲病原生物體。這種生物體包括桿狀病毒、真菌、原生動(dòng)物、細(xì)菌和線蟲。

可通過合適的載體將編碼本發(fā)明實(shí)施方案的殺蟲蛋白的基因引入到微生物宿主中，并將所述宿主施放到環(huán)境或者植物或者動(dòng)物。在將核酸插入細(xì)胞中的語境中的術(shù)語“引入”，意指“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”，包括指涉核酸摻入真核或原核細(xì)胞中，其中該核酸可摻入細(xì)胞的基因組(例如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)中、轉(zhuǎn)化成自主復(fù)制或者瞬時(shí)表達(dá)(例如轉(zhuǎn)染的mRNA)。

可選擇已知會(huì)占領(lǐng)一種或者多種所關(guān)注作物的“植物圈”(葉面、葉圈、根際和/或根面)的微生物宿主。選擇這些微生物以便能夠在特定環(huán)境中成功地與野生型微生物競(jìng)爭(zhēng)，提供表達(dá)殺蟲蛋白的基因的穩(wěn)定維持和表達(dá)，并且理想地提供改善的對(duì)該殺蟲劑的保護(hù)使其不受環(huán)境降解和失活。

這種微生物包括細(xì)菌、藻類和真菌。特別要關(guān)注的是微生物：例如細(xì)菌，如假單胞菌屬(Pseudomonas)、歐文氏菌屬(Erwinia)、沙雷氏菌屬(Serratia)、克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、根瘤菌屬(Rhizobium)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、甲基菌屬(Methylius)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter)、固氮菌屬(Azotobacter)、明串珠菌屬(Leuconostoc)和產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)；真菌，尤其是酵母如酵母菌屬(Saccharomyces)、隱球菌屬(Cryptococcus)、克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)、擲孢酵母屬(Sporobolomyces)、紅酵母屬(Rhodotorula)和短梗霉屬(Aureobasidium)。特別值得關(guān)注的是諸如以下的植物圈細(xì)菌物種：丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)、熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)、木醋桿菌(Acetobacter xylinum)、農(nóng)桿菌(Agrobacteria)、球形紅假單胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)、野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium melioti)、富營養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligenes entrophus)、木質(zhì)棍狀桿菌(Clavibacter xyli)和維涅蘭德固氮菌(Azotobacter vinelandii)，以及諸如以下的植物圈酵母物種：深紅酵母(Rhodotorula rubra)、粘紅酵母(R.glutinis)、海濱紅酵母(R.marina)、橙黃紅酵母(R.aurantiaca)、淺白色隱球酵母(Cryptococcus albidus)、流散隱球酵母(C.diffluens)、羅倫隱球酵母(C.laurentii)、羅斯酵母(Saccharomyces rosei)、S.pretoriensis、釀酒酵母(S.cerevisiae)、粉紅擲孢酵母(Sporobolomyces roseus)、香氣擲孢酵母(S.odorus)、Kluyveromyces veronae和茁芽短梗霉(Aureobasidium pollulans)。特別要關(guān)注的是有色素微生物。

有多種方式可用來將表達(dá)殺蟲蛋白的基因引入處于容許該基因的穩(wěn)定維持和表達(dá)的條件下的微生物宿主中。例如，可構(gòu)建出這樣的表達(dá)盒，其包括目的核苷酸構(gòu)建體及為了該核苷酸構(gòu)建體的表達(dá)該核苷酸構(gòu)建體可操作地連接的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控信號(hào)、與宿主生物體中的序列同源的核苷酸序列(據(jù)此將發(fā)生整合)和/或在宿主中具有功能的復(fù)制系統(tǒng)(據(jù)此將發(fā)生整合或穩(wěn)定維持)。

轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控信號(hào)包括但不限于啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、操縱子、活化子、增強(qiáng)子、其它調(diào)控元件、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子、終止信號(hào)等。參見例如，美國專利No.5,039,523和No.4,853,331；EPO 0480762A2；Sambrook；Maniatis等人(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約冷泉港(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York))；Davis等人編輯，(1980)Advanced Bacterial Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory Press)以及其中引用的參考文獻(xiàn)。

如果含殺蟲蛋白的細(xì)胞要被進(jìn)行處理以延長當(dāng)將經(jīng)處理的細(xì)胞施用于靶標(biāo)害蟲的環(huán)境時(shí)殺蟲蛋白在細(xì)胞中的活性，則合適的宿主細(xì)胞可包括原核生物或者真核生物，通常限于那些不會(huì)產(chǎn)生對(duì)高等生物體(如哺乳動(dòng)物)有毒的物質(zhì)的細(xì)胞。但是，如果毒素不穩(wěn)定或者施用水平足夠低以避免對(duì)哺乳動(dòng)物宿主的毒性的任何可能性，則可以使用會(huì)產(chǎn)生對(duì)高等生物體有毒的物質(zhì)的生物體。作為宿主，特別要關(guān)注的將是原核生物和低等真核生物如真菌。示例性的革蘭氏陰性和革蘭氏陽性原核生物包括腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，例如埃希氏菌屬(Escherichia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、志賀氏菌屬(Shigella)、沙門氏菌屬(Salmonella)和變形桿菌屬(Proteus)；芽胞桿菌科(Bacillaceae)；根瘤菌科(Rhizobiaceae)，例如根瘤菌屬(Rhizobium)；螺菌科(Spirillaceae)，例如發(fā)光桿菌屬(photobacterium)、發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)、沙雷氏菌(Serratia)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、弧菌屬(Vibrio)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、螺菌屬(Spirillum)；乳桿菌科(Lactobacillaceae)；假單胞菌科(Pseudomonadaceae)，例如假單胞菌屬(Pseudomonas)和醋桿菌屬(Acetobacter)；固氮菌科(Azotobacteraceae)硝化桿菌科(Nitrobacteraceae)。真核生物之中為真菌，例如藻狀菌綱(Phycomycetes)和子囊菌綱(Ascomycetes)，其包括酵母諸如酵母屬(Saccharomyces)和裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)；以及擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)酵母，例如紅酵母屬(Rhodotorula)、出芽短梗霉(Aureobasidium)、擲孢酵母屬(Sporobolomyces)等等。

在為了殺蟲蛋白生產(chǎn)目的而選擇宿主細(xì)胞時(shí)特別要關(guān)注的特征包括殺蟲蛋白基因向宿主中引入的便利性、表達(dá)系統(tǒng)的可獲得性、表達(dá)的效率、蛋白質(zhì)在宿主中的穩(wěn)定性以及輔助遺傳能力的存在。對(duì)于作為殺蟲劑微膠囊使用要關(guān)注的特征包括殺蟲劑的保護(hù)質(zhì)量，如厚細(xì)胞壁、色素沉著以及包涵體的胞內(nèi)包裝或形成；葉親和力；哺乳動(dòng)物毒性的缺乏；對(duì)害蟲取食的吸引力；在不對(duì)毒素造成損害的情況下殺滅和固定的容易性；等。其它考慮因素包括配制和操作容易性、經(jīng)濟(jì)性、貯存穩(wěn)定性等。

特別值得關(guān)注的宿主生物體包括酵母，如紅酵母屬(Rhodotorula spp.)物種、短梗霉屬(Aureobasidium spp.)物種、酵母屬(Saccharomyces spp.)物種(如釀酒酵母(S.cerevisiae))、擲孢酵母屬(Sporobolomyces spp.)物種、葉面生物如假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)物種(如銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)、熒光假單胞菌(P.fluorescens))、歐文氏菌屬(Erwinia spp.)物種和黃桿菌屬(Flavobacterium spp.)物種和其它此類生物體，包括Bt、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等。

可將編碼本發(fā)明實(shí)施方案的殺蟲蛋白的基因引入植物上繁殖的微生物(體表寄生菌)中，以將殺蟲蛋白遞送到潛在的靶標(biāo)害蟲。體表寄生菌例如可以是革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細(xì)菌。

根定殖細(xì)菌可通過例如本領(lǐng)域已知的方法從所關(guān)注的植物分離。具體而言，定殖于根的蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)菌株可從植物的根分離(參見例如，Handelsman等人，(1991)Appl.Environ.Microbiol.56：713-718)?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法將編碼本發(fā)明實(shí)施方案的殺蟲蛋白的基因引入根定殖蠟狀芽孢桿菌中。

可通過電轉(zhuǎn)化手段將編碼殺蟲蛋白的基因例如引入到根定殖芽孢桿菌中。具體而言，可將編碼殺蟲蛋白的基因克隆到穿梭載體如pHT3101中(Lerecius等人，(1989)FEMS Microbiol.Letts.60：211-218)。含有特定殺蟲蛋白基因的編碼序列的穿梭載體pHT3101可例如通過電穿孔手段轉(zhuǎn)化到根定殖芽孢桿菌中(Lerecius等人，(1989)FEMS Microbiol.Letts.6 0：211-218)。

可設(shè)計(jì)表達(dá)系統(tǒng)，使得殺蟲蛋白被分泌到革蘭氏陰性細(xì)菌(如大腸桿菌)的細(xì)胞質(zhì)之外。分泌殺蟲蛋白的好處是：(1)避免所表達(dá)的殺蟲蛋白的潛在細(xì)胞毒性作用；和(2)改善殺蟲蛋白的純化效率，包括但不限于提高每體積細(xì)胞培養(yǎng)液的蛋白質(zhì)回收和純化效率和降低每單位蛋白質(zhì)的回收和純化時(shí)間和/或成本。

可例如通過將適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌信號(hào)肽與殺蟲蛋白的氨基末端融合，使殺蟲蛋白在大腸桿菌中分泌。由大腸桿菌識(shí)別的信號(hào)肽可存在于已知在大腸桿菌中分泌的蛋白質(zhì)，例如OmpA蛋白(Ghrayeb等人(1984)EMBO J，(《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》)3：2437-2442)。OmpA是大腸桿菌外膜的主要蛋白質(zhì)，因此它的信號(hào)肽被認(rèn)為在易位過程中有效。另外，在加工前不需要對(duì)OmpA信號(hào)肽進(jìn)行修飾，而其它信號(hào)肽例如脂蛋白信號(hào)肽則需要(Duffaud等人，(1987)Meth.Enzymol.153：492)。

可在細(xì)菌宿主中發(fā)酵本發(fā)明實(shí)施方案的殺蟲蛋白，并且將所得的細(xì)菌加工并以與Bt菌株已被用作殺昆蟲噴霧劑相同的方式用作微生物噴霧劑。在殺蟲蛋白從芽孢桿菌分泌的情況中，用本領(lǐng)域已知的程序?qū)⒎置谛盘?hào)移除或者突變。這種突變和/或缺失能防止殺蟲蛋白在發(fā)酵過程中分泌到生長培養(yǎng)基中。殺蟲蛋白保持在細(xì)胞內(nèi)，然后將細(xì)胞進(jìn)行加工以得到封裝的殺蟲蛋白。任何合適的微生物都可用于這個(gè)目的。已用假單胞菌屬將Bt毒素表達(dá)為封裝蛋白，并且將所得的細(xì)胞進(jìn)行加工并作為殺昆蟲劑噴施(Gaertner等人，(1993)，載于：Advanced Engineered Pesticides，Kim編輯)。

作為另一個(gè)選擇，通過將異源基因引入細(xì)胞宿主中來產(chǎn)生殺蟲蛋白。異源基因的表達(dá)直接或間接導(dǎo)致該殺蟲劑的胞內(nèi)產(chǎn)生和維持。然后將這些細(xì)胞在當(dāng)將細(xì)胞施用于靶標(biāo)害蟲的環(huán)境時(shí)能延長該產(chǎn)生的毒素在細(xì)胞中的活性的條件下進(jìn)行處理。所得的產(chǎn)物保持該毒素的毒性。然后可按照常規(guī)技術(shù)配制這些天然封裝的殺蟲蛋白以便施用于靶標(biāo)害蟲的寄生環(huán)境，例如土壤、水和植物的葉。參見例如EP0192319以及其中引用的參考文獻(xiàn)。

在本發(fā)明實(shí)施方案中，可將轉(zhuǎn)化的微生物(其包括完整生物體、細(xì)胞、孢子、殺蟲蛋白、殺蟲組分、害蟲影響組分、突變體、活的或者死的細(xì)胞和細(xì)胞組分，包括活的或者死的細(xì)胞和細(xì)胞組分的混合物在內(nèi)，并包括破碎的細(xì)胞和細(xì)胞組分在內(nèi))或者分離的殺蟲蛋白可與可接受的載體一起配制成例如以下殺蟲組合物：懸浮液、溶液、乳液、撒粉、可分散顆粒或丸、可潤濕粉末以及可乳化濃縮物、氣溶膠或噴霧劑、浸漬顆粒、助劑、可涂覆糊劑、膠體還有例如在聚合物物質(zhì)中的封裝物。這種配制的組合物可通過諸如將包含該多肽的細(xì)胞的培養(yǎng)物進(jìn)行干燥、凍干、均化、提取、過濾、離心、沉淀或者濃縮的常規(guī)手段進(jìn)行制備。

以上所公開的這類組合物可通過加入以下物質(zhì)來獲得：表面活性劑、惰性載體、防腐劑、保濕劑、取食刺激劑、引誘劑、封裝劑、粘合劑、乳化劑、染料、紫外保護(hù)劑、緩沖劑、助流劑或肥料、微量營養(yǎng)物供體或其它能影響植物生長的制劑?？蓪ǖ幌抻诔輨?、殺昆蟲劑、殺真菌劑、殺細(xì)菌劑、殺線蟲劑、殺軟體動(dòng)物劑、殺螨劑、植物生長調(diào)節(jié)劑、收獲助劑和肥料的一種或多種農(nóng)業(yè)化學(xué)品與常用于配制領(lǐng)域的載體、表面活性劑或助劑或者其他組分進(jìn)行組合，以便于產(chǎn)品操作和施用于特定的靶標(biāo)害蟲。合適的載體和助劑可以是固體或液體，并對(duì)應(yīng)于通常用于配制技術(shù)的物質(zhì)，例如天然或再生的礦物質(zhì)、溶劑、分散劑、潤濕劑、增粘劑、粘合劑或肥料。本發(fā)明實(shí)施方案的活性成分通常以組合物的形式施用，并且可以施用于待處理的作物區(qū)、植物或者種子。例如，本發(fā)明實(shí)施方案的組合物可以在糧倉或者青貯塔(silo)等中施用于在準(zhǔn)備貯藏時(shí)或者在貯藏過程中的谷物。本發(fā)明實(shí)施方案的組合物可以與其它化合物同時(shí)或者相繼施用。施用含有至少一種通過本發(fā)明實(shí)施方案的細(xì)菌菌株產(chǎn)生的殺蟲蛋白的本發(fā)明實(shí)施方案的活性成分或者本發(fā)明實(shí)施方案的農(nóng)業(yè)化學(xué)組合物的方法，包括但不限于施用于葉子、涂覆種子和施用于土壤。施用次數(shù)和施用速率取決于相應(yīng)害蟲所侵染的強(qiáng)度。

合適的表面活性劑包括但不限于陰離子化合物如例如金屬的羧酸鹽；長鏈脂肪酸的羧酸鹽；N-?；“彼猁}；磷酸與脂肪醇乙氧基化物的單酯或二酯或者這類酯的鹽；脂肪醇硫酸鹽如十二烷基硫酸鈉、十八烷基硫酸鈉或十六烷基硫酸鈉；乙氧基化脂肪醇硫酸鹽；乙氧基化烷基苯酚硫酸鹽；木質(zhì)素磺酸鹽；石油磺酸鹽；烷基芳基磺酸鹽如烷基苯磺酸鹽或低級(jí)烷基萘磺酸鹽，例如丁基萘磺酸鹽；磺化的萘-甲醛縮合物的鹽；磺化的苯酚-甲醛縮合物的鹽；更復(fù)雜的磺酸鹽如酰胺磺酸鹽，例如油酸和N-甲基?；撬岬幕腔s合產(chǎn)物；或者二烷基磺基琥珀酸鹽，例如琥珀酸二辛酯的磺酸鈉。非離子劑包括脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪酸酰胺或者脂肪烷基或烯基取代的酚與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物，多元醇醚的脂肪酸酯例如脫水山梨糖醇脂肪酸酯，這種酯類與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯，環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的嵌段共聚物，炔二醇如2，4，7，9-四乙基-5-癸炔-4，7-二醇，或者乙氧基化的炔二醇。陽離子表面活性劑的示例包括例如脂族單胺、二胺或聚胺如乙酸鹽、環(huán)烷酸鹽或者油酸鹽；或者含氧胺如聚氧乙烯烷基胺的氧化胺；通過羧酸與二胺或聚胺的縮合制備的酰胺連接的胺；或者季銨鹽。

惰性材料的示例包括但不限于無機(jī)礦物質(zhì)如高嶺土、頁硅酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽或者植物材料如軟木、粉末玉米穗軸、花生殼、稻殼和胡桃殼。

本發(fā)明實(shí)施方案的組合物可以為適于直接施用的形式，或者作為初級(jí)組合物的濃縮物，在施用前需要用適量的水或者其它稀釋劑稀釋。殺蟲濃度將隨具體配方的性質(zhì)而異，具體而言，取決于它是濃縮物還是直接施用。組合物含有1至98％的固體或液體惰性載體和0至50％或0.1至50％的表面活性劑。這些組合物將以商業(yè)產(chǎn)品的標(biāo)示比率施用，例如當(dāng)為干燥形式時(shí)約0.01磅至5.0磅每英畝，當(dāng)為液體形式時(shí)約0.01品脫至10品脫每英畝。

在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明實(shí)施方案的組合物以及轉(zhuǎn)化的微生物和殺蟲蛋白可在配制前先進(jìn)行處理，以延長當(dāng)施用于靶標(biāo)害蟲的環(huán)境時(shí)的殺蟲活性，只要該預(yù)處理對(duì)殺蟲活性無害。這種處理可通過化學(xué)和/或物理手段進(jìn)行，只要該處理不會(huì)有害地影響組合物的性質(zhì)。化學(xué)試劑的示例包括但不限于鹵化劑；醛類如甲醛和戊二醛；抗感染劑如氯化苯甲烴銨；醇類如異丙醇和乙醇；以及組織固定劑如Bouin固定劑和Helly固定劑(參見例如，Humason(1967)Animal Tissue Techniques(《動(dòng)物組織技術(shù)》)(W.H.Freeman and Co.))。

在其它實(shí)施方案中，可能有利的是用蛋白酶例如胰蛋白酶處理Cry毒素多肽以活化該蛋白質(zhì)，然后再將本發(fā)明實(shí)施方案的殺蟲蛋白組合物施用于靶標(biāo)害蟲的環(huán)境。通過絲氨酸蛋白酶活化原毒素的方法是本領(lǐng)域熟知的。參見例如Cooksey(1968)Biochem.J.6：445-454以及Carroll和Ellar(1989)Biochem.J.261：99-105，將這些文獻(xiàn)的教導(dǎo)內(nèi)容以引用方式并入本文。例如，合適的活化方案包括但不限于將待活化的多肽例如經(jīng)純化的新型Cry多肽(例如，具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列)和胰蛋白酶以1/100的蛋白質(zhì)/胰蛋白酶重量比在20nM NaHCO₃(pH 8)中混合并使樣品在36℃下煮解3小時(shí)。

組合物(包括本發(fā)明實(shí)施方案的轉(zhuǎn)化微生物和殺蟲蛋白)可通過例如以下方式施用于昆蟲害蟲的環(huán)境：噴霧、霧化、撒粉、分散、涂覆或者傾倒、引入土壤中或者引到土壤上、引入灌溉水中、在害蟲已開始出現(xiàn)時(shí)或者在害蟲出現(xiàn)前進(jìn)行種子處理或者一般施用或者撒粉作為保護(hù)措施。例如，可將本發(fā)明實(shí)施方案的殺蟲蛋白和/或轉(zhuǎn)化微生物與谷物混合以在貯藏過程中保護(hù)谷物。通常重要的是在植物生長的早期階段獲得對(duì)害蟲的良好防治，因?yàn)檫@是植物可能受到最嚴(yán)重?fù)p害的時(shí)期。本發(fā)明實(shí)施方案的組合物可便利地含有另一殺昆蟲劑，如果認(rèn)為這有必要的話。在一個(gè)實(shí)施方案中，在種植時(shí)將組合物直接施用于土壤，施用的形式為載體與芽孢桿菌菌株或者本發(fā)明實(shí)施方案的轉(zhuǎn)化微生物的死細(xì)胞的組合物的顆粒形式。另一個(gè)實(shí)施方案是包含農(nóng)業(yè)化學(xué)品例如除草劑、殺昆蟲劑、肥料、惰性載體與芽孢桿菌菌株或者本發(fā)明實(shí)施方案的轉(zhuǎn)化微生物的死細(xì)胞的組合物的顆粒形式。

本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，并不是所有的化合物都對(duì)所有的害蟲同等有效。本發(fā)明實(shí)施方案的化合物顯示出對(duì)昆蟲害蟲的活性，這些昆蟲害蟲可包括經(jīng)濟(jì)上重要的農(nóng)藝害蟲、森林害蟲、溫室害蟲、苗圃害蟲、觀賞植物害蟲、食物和纖維害蟲、公共衛(wèi)生和動(dòng)物衛(wèi)生害蟲、家庭和商業(yè)設(shè)施害蟲、居室害蟲和倉儲(chǔ)害蟲。昆蟲害蟲包括選自以下各目的昆蟲：鞘翅目、雙翅目、膜翅目、鱗翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、纓尾目、革翅目、等翅目、虱目、蚤目、毛翅目等，特別是鞘翅目和鱗翅目。

鱗翅目(Lepidoptera)昆蟲包括(但不限于)：夜蛾科(Noctuidae)中的行軍蟲、地老虎、尺蠖和棉鈴蟲，小地老虎(Agrotis ipsilon Hufnagel)(黑地老虎)；灰地老虎(A.orthogonia Morrison)(西部地老虎)；A.segetum Denis &Schiffermüller(黃地老虎)；粒膚地老虎(A.subterranea Fabricius)(粒膚地蠶)；葉波紋須蛾(Alabama argillacea Hübner)(棉葉蟲)；黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis Hübner)(黎豆毛蟲)；粗皮夜蛾(Athetis mindara Barnes and McDunnough)(粗皮地蠶)；棉斑實(shí)蛾(Earias insulana Boisduval)(多刺螟蛉(spiny bollworm))；翠紋金剛鉆(E.vittella Fabricius)(斑點(diǎn)螟蛉(spotted bollworm))；Egira(Xylomyges)curialis Grote(柑橘地老虎)；暗緣地老虎(Euxoa messoria Harris)(darksided cutworm)；蕃茄夜蛾(Helicoverpa armigera Hübner)(美洲螟蛉(American bollworm))；谷實(shí)夜蛾(H.zea Boddie)(玉米穗蟲(corn earworm)或棉鈴蟲(cotton bollworm))；煙芽夜蛾(Heliothis virescens Fabricius)(煙草蚜蟲(tobacco budworm))；苜蓿綠葉蛾(Hypena scabra Fabricius)(green cloverworm)；Mamestra configurata Walker(披肩粘蟲)；甘藍(lán)夜蛾(M.brassicae Linnaeus)(cabbage moth)；斑馬紋夜蛾(Melanchra picta Harris)(zebra caterpillar)；普通夜盜蛾(Pseudaletia unipuncta Haworth)(行軍蟲)；大豆夜蛾(Pseudoplusia includens Walker)(大豆尺蠖)；Richia albicosta Smith(西部豆夜蛾)；草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda JE Smith)(秋粘蟲)；S.exigua Hübner(甜菜夜蛾)；斜紋貪夜蛾(S.litura Fabricius)(斜紋夜蛾、茶蟲)；Trichoplusia ni Hübner(卷心菜尺蠖)；來自螟蛾科(Pyralidae)和草螟科(Crambidae)的鉆蛀蟲、鞘蛾、結(jié)網(wǎng)毛蟲、松果梢斑螟和雕葉蟲，如Achroia grisella Fabricius(小蠟螟)；臍橙螟蛾(Amyelois transitella Walker)(naval orangeworm)；地中海粉螟蛾Anagasta kuehniella Zeller)(Mediterranean flour moth)；粉斑螟蛾(Cadra cautella Walker)(杏仁蛾)；粉紅禾草螟(Chilo partellus Swinhoe)(斑點(diǎn)蛀莖蟲(spotted stalk borer))；二化螟(C.suppressalis Walker)(條紋蛀莖蟲/稻鉆心蟲(striped stem/rice borer))；C.terrenellus Pagenstecher(甘蔗莖鉆心蟲)；外米綴蛾(Corcyra cephalonica Stainton)(米蛾(rice moth))；玉米根草螟(Crambus caliginosellus Clemens)(corn root webworm)；早熟禾草螟(C.teterrellus Zincken)(禾螟)；稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocis medinalis Guenée)(稻卷葉蟲(rice leaf roller))；葡萄野螟(Desmia funeralis Hübner)(葡萄卷葉蟲(grape leaffolder))；甜瓜絹野螟(Diaphania hyalinata Linnaeus)(甜瓜野螟)；黃瓜絹野螟(D.nitidalis Stoll)(泡菜蟲)；Diatraea grandiosella Dyar(西南玉米螟)，D.saccharalis Fabricius(甘蔗鉆心蟲)；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus Zeller)(小玉米莖鉆心蟲(lesser cornstalk borer))；墨西哥稻螟(Eoreuma loftini Dyar)(Mexican rice borer)；煙草粉螟(Ephestia elutella Hübner)(煙草(可可)飛蛾)；大蠟螟(Galleria mellonella Linnaeus)(greater wax moth)；甘蔗卷葉蛾(Hedylepta accepta Butler)(甘蔗卷葉蟲)；水稻切葉野螟(Herpetogramma licarsisalis Walker)(草地螟)；向日葵同斑螟(Homoeosoma electellum Hulst)(向日葵螟)；草地螟(Loxostege sticticalis Linnaeus)(甜菜網(wǎng)螟)；豇豆莢螟(Maruca testulalis Geyer)(豆莢螟)；茶樹螟(Orthaga thyrisalis Walker)(tea tree web moth)；玉米螟(Ostrinia nubilalis Hübner)(歐洲玉米螟(European corn borer))；印度谷螟(Plodia interpunctella Hübner)(印度谷蛾(Indian meal moth))；Scirpophaga incertulas Walker(三化螟)；芹菜網(wǎng)螟(Udea rubigalis Guenée)(芹菜葉蟲(celery leaftier))；和卷葉蛾科(Tortricidae)的卷葉蟲、蚜蟲、種實(shí)蟲以及果實(shí)蟲，西部黑頭長翅卷蛾(Tortricidae Acleris gloverana Walsingham)(Western blackheaded budworm)；東部黑頭長翅卷蛾(A.variana Fernald)(Eastern blackheaded budworm)；棉褐帶卷葉蛾(Adoxophyes orana Fischer von )(summer fruit tortrix moth)；黃卷蛾屬(Archips)物種，包括果樹黃卷蛾(A.argyrospila Walker)(果樹卷葉蟲(fruit tree leaf roller))和歐洲卷葉蛾(A.rosana Linnaeus)(European leaf roller)；帶卷蛾屬物種(Argyrotaenia spp.)；Bonagota salubricola Meyrick(巴西蘋果卷葉蛾)；色卷蛾屬物種(Choristoneura spp.)；Cochylis hospes Walsingham(條紋向日葵螟)；榛小卷蛾(Cydia latiferreana Walsingham)(filbertworm)；蘋果蠹蛾(C.pomonella Linnaeus)(蘋果小卷蛾)；萄果實(shí)蛀蟲(Endopiza viteana Clemens)(葡萄漿果蛾)；女貞細(xì)卷蛾(Eupoecilia ambiguella Hübner)(葡萄蛾)；梨小食心蟲(Grapholita molesta Busck)(梨小食心蟲)；葡萄花翅小卷蛾(Lobesia botrana Denis&Schiffermüller)(歐洲葡萄蛾)；雜色卷葉蛾(Platynota flavedana Clemens)(variegated leafroller)；荷蘭石竹小卷蛾(P.stultana Walsingham)(雜食卷葉蛾)；蘋白小卷蛾(Spilonota ocellana Denis&Schiffermüller)(蘋果芽小卷葉蛾)；和向日葵芽蛾(Suleima helianthana Riley)(sunflower bud moth)。

鱗翅目中選擇的其它農(nóng)藝學(xué)害蟲包括但不限于秋星尺蠖(Alsophila pometaria Harris)(秋尺蠖)；桃枝麥蛾(Anarsia lineatella Zeller)(桃條麥蛾)；犀額蛾(Anisota senatoria J.E.Smith)(orange striped oakworm)；柞蠶(Antheraea pernyi Guérin-Méneville)(柞蠶)；家蠶(Bombyx mori Linnaeus)(蠶)；棉潛蛾(Bucculatrix thurberiella Busck)(cotton leafperforator)；苜蓿黃蝶(Colias eurytheme Boisduval)(alfalfa caterpillar)；Datana integerrimaGrote&Robinson(胡桃毛蟲)；Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov(西伯利亞絲蛾)，Ennomos subsignaria Hübner(榆樹尺蠖)；菩提尺蠖(Erannis tiliaria Harris)(椴木尺蠖)；甘蔗芽蛾(Erechthias flavistriata Walsingham)(甘蔗芽蛾)；黃毒蛾(Euproctis chrysorrhoea Linnaeus)(棕尾毒蛾)；黑擬蛉蛾(Harrisina americana Guérin-Méneville)(葡萄葉食蟲)；Heliothis subflexa Guenée；Hemileuca oliviae Cockrell(牧場(chǎng)毛蟲)；美國白蛾(Hyphantria cunea Drury)(fall webworm)；番茄蠹蛾(Keiferia lycopersicella Walsingham)(番茄蠹蛾)；二尾蛺蝶(Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst)(Eastern hemlock looper)；西部鐵杉尺蠖(L.fiscellaria lugubrosa Hulst)(Western hemlock looper)；Leucoma salicis Linnaeus(柳毒蛾)；Lymantria dispar Linnaeus(舞毒蛾)；天幕毛蟲屬物種(Malacosoma spp.)；番茄天蛾(Manduca quinquemaculata Haworth)(五斑天蛾、番茄天蛾)；煙草天蛾(M.sexta Haworth)(番茄天蛾、煙草天蛾)；冬尺蠖(Operophtera brumata Linnaeus)(松白條尺蠖蛾)；古毒蛾屬物種(Orgyia spp.)；春尺蠖(Paleacrita vernata Peck)(spring cankerworm)；大鳳蝶(Papilio cresphontes Cramer)(大黃帶鳳蝶、橙鳳蝶)；加州槲蛾(Phryganidia californica Packard)(California oakworm)；柑橘潛葉蛾(Phyllocnistis citrella Stainton)(citrus leafminer)；斑幕潛葉蛾(Phyllonorycter blancardella Fabricius)(spotted tentiform leafminer)；大菜粉蝶(Pieris brassicae Linnaeus)(large white butterfly)；小菜粉蝶(P.rapae Linnaeus)(菜白蛾)；暗脈菜粉蝶(P.napi Linnaeus)(green veined whitebutterfly)；洋薊羽蛾(Platyptilia carduidactyla Riley)(artichoke plume moth)；Plutella xylostella Linnaeus(小菜蛾)；Pectinophora gossypiella Saunders(棉紅鈴蟲)；紋白蝶Boisduval&Leconte(南部菜青蟲)；Sabulodes aegrotata Guenée(雜食尺蠖)；紅疣天社蛾(Schizura concinna J.E.Smith)(red humped caterpillar)；麥蛾(Sitotroga cerealella Olivier)(Angoumois grain moth)；Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller(松樹列隊(duì)毛蟲)；結(jié)網(wǎng)衣蛾(Tineola bisselliella Hummel)(webbing clothesmoth)；番茄斑潛蠅(Tuta aboluta Meyrick)(tomato leafminer)和蘋果巢蛾(Yponomeuta padella Linnaeus)(ermine moth)。

值得關(guān)注的是鞘翅目的幼蟲和成體，其包括來自長角象鼻蟲科(Anthribidae)、豆象科(Bruchidae)和象甲科(Curculionidae)的象鼻蟲，包括但不限于：棉鈴象甲(Anthonomus grandis Boheman)(棉籽象鼻蟲)；向日葵莖象甲(Cylindrocopturus adspersus LeConte)(sunflower stem weevi)；蔗根非耳象(Diaprepes abbreviatus Linnaeus)(Diaprepes root weevi)；三葉草葉象(Hypera punctata Fabricius)(clover leaf weevi)；Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel(稻水象甲)；西印度蔗象甲(Metamasius hemipterus hemipterus Linnaeus)(West Indian cane weevi)；絲光蔗象甲(M.hemipterus sericeus Olivier)(silky cane weevi)；Sitophilus granarius Linnaeus(谷象)；S.oryzae Linnaeus(米象)；紅色葵花籽象甲(Smicronyx fulvus LeConte)(red sunflflower seed weevi)；灰色葵花籽象甲(S.sordidus LeConte)(gray sunflower seed weevi)；Sphenophorus maidisChittenden(玉米象蟲)；新幾內(nèi)亞蔗象甲(Rhabdoscelus obscurus Boisduval)(New Guinea sugarcane weevi)；葉甲科(Chrysomelidae)的跳甲、守瓜、根蟲、葉甲、馬鈴薯甲蟲和潛葉蟲，包括但不限于：荒地玉米跳甲(Chaetocnema ectypa Horn)(desert corn flea beetle)；玉米銅色跳甲(C.pulicaria Melsheimer)(玉米跳甲(corn flea beetle))Colaspis brunnea Fabricius(葡萄肖葉甲)；Diabrotica barberiSmith&Lawrence(北方玉米根蟲)；黃瓜十一星葉甲(D.undecimpunctata howardi Barber)(南方玉米根蟲(southern corn rootworm))；玉米根螢葉甲(D.virgifera virgifera LeConte)(西部玉米根蟲)；科羅拉多州馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsa decemlineata Say)(科羅拉多馬鈴薯甲蟲)；黑角負(fù)泥蟲(Oulema melanopus Linnaeus)(禾谷葉甲(cereal leaf beetle))；十字花科跳甲(Phyllotreta cruciferae Goeze)(玉米跳甲)；Zygogramma exclamationis Fabricius(向日葵甲蟲)；來自瓢甲科(Coccinellidae)的甲蟲，包括但不限于：Epilachna varivestis Mulsant(墨西哥豆瓢蟲)；來自金龜子科(Scarabaeidae)的金龜子和其它甲蟲，包括但不限于：牧草金龜(Antitrogus parvulus Britton)(Childers cane grub)；北方圓頭犀金龜(Cyclocephala borealis Arrow)(northern masked chafer，蠐螬)；南方圓頭犀金龜(C.immaculata Olivier)(southern masked chafer，蠐螬)；白毛革鱗鰓金龜(Dermolepida albohirtum Waterhouse)(Greyback cane beetle)；甘蔗犀金龜(Euetheola humilis rugiceps LeConte)(sugarcane beetle)；Lepidiota frenchi Blackburn(法國蔗蚧螬)；胡蘿卜金龜(Tomarus gibbosus De Geer)(carrot beetle)；T.subtropicus Blatchley(甘蔗蠐螬)；Phyllophaga crinita Burmeister(白蠐螬)；P.latifrons LeConte(六月鰓金龜)；Popillia japonica Newman(日本金龜子)；Rhizotrogus majalis Razoumowsky(歐洲金龜子)；來自皮蠹科(Dermestidae)的地毯圓皮蠹(carpet beetle)；來自以下各科屬的線蟲：叩頭蟲科(Elateridae)、偽金針蟲屬(Eleodes spp.)，紋叩甲屬(Melanotus spp.)，包括M.communis Gyllenhal(線蟲)；寬胸叩頭蟲屬物種(Conoderus spp.)；丘胸叩甲屬物種(Limonius spp.)；細(xì)胸叩甲屬物種(Agriotes spp.)；旱地金針蟲屬物種(Ctenicera spp.)；Aeolus屬物種；來自小蠹蟲科(Scolytidae)的樹皮甲蟲(bark beetle)；來自擬步甲科(Tenebrionidae)的甲蟲；來自天?？?Cerambycidae)科的甲蟲，例如但不限于Migdolus fryanus Westwood(長角甲蟲)；和來自吉丁蟲科(Buprestidae)的甲蟲，包括但不限于Aphanisticus cochinchinae seminulum Obenberger(潛葉吉丁蟲)。

雙翅目(Diptera)的成體和未成熟體是值得關(guān)注的，包括潛葉蟲Agromyza parvicornis Loew(玉米斑潛葉蟲)；搖蚊，包括但不限于：高粱癭蚊(Contarinia sorghicola Coquillett(高粱搖蚊(sorghum midge))；黑森癭蚊(Mayetiola destructor Say)(黑森蠅(Hessian fly))；向日葵籽搖蚊(Neolasioptera murtfeldtiana Felt)(sunflower seed midge))；麥紅吸漿蟲(Sitodiplosis mosellana Géhin)(小麥搖蚊)；果實(shí)蠅(實(shí)蠅科(Tephritidae))、黑麥稈蠅(Oscinella frit Linnaeus)(眼蠅)；蛆，包括但不限于：地種蠅屬(Delia spp.)物種，包括灰地種蠅(Delia platura Meigen)(種蠅)；麥種蠅(D.coarctata Fallen)(麥稈蠅)；夏廁蠅(Fannia canicularis Linnaeus)、小舍蠅(F.femoralis Stein)(lesser house flies)；美洲麥桿蠅(Meromyza americana Fitch)(麥稈蠅)；舍蠅(Musca domestica Linnaeus)(家蠅類)；廄螫蠅(Stomoxys calcitrans Linnaeus)(廄蠅類)；面蠅、角蠅、麗蠅、金蠅屬物種(Chrysomya spp.)；伏蠅屬物種(Phormia spp.)；和其它家蠅(muscoid fly)害蟲、馬蠅類虻屬物種(Tabanus spp.)；膚蠅類胃蠅屬物種(Gastrophilus spp.)；狂蠅屬物種(Oestrus spp.)；牛蠅類皮蠅屬物種(Hypoderma spp.)；鹿蠅類斑虻屬物種(Chrysops spp.)；綿羊虱蠅(Melophagus ovinus Linnaeus)(虱蠅類)；和其它短角亞目(Brachycera)、蚊類伊蚊屬物種(Aedes spp.)；按蚊屬物種(Anopheles spp.)；庫蚊屬物種(Culex spp.)；黑蠅類原蚋屬物種(Prosimulium spp.)；蚋屬物種(Simulium spp.)；鋏蠓、白蛉、尖眼蕈蚊(sciarid)和其它長角亞目(Nematocera)。

作為所關(guān)注的昆蟲，包括半翅目的那些昆蟲，例如、但不限于以下科：球蚜科(Adelgidae)、粉虱科(Aleyrodidae)、蚜科(Aphididae)、鏈蚧科(Asterolecaniidae)、沫蟬科(Cercopidae)、葉蟬科(Cicadellidae)、蟬科(Cicadidae)、菱飛虱科(Cixiidae)、軟介殼蟲科(Coccidae)、緣蝽科(Coreidae)、胭蚧科(Dactylopiidae)、飛虱科(Delphacidae)、盾蚧科(Diaspididae)、氈蚧科(Eriococcidae)、蛾蠟蟬科(Flatidae)、蠟蟬科(Fulgoridae)、圓飛虱科(Issidae)、長蝽科(Lygaeidae)、碩蚧科(Margarodidae)、角蟬科(Membracidae)、盲蝽科(Miridae)、旌介殼蟲科(Ortheziidae)、蝽科(Pentatomidae)、刺葵介殼蟲科(Phoenicococcidae)、根瘤蚜科(Phylloxeridae)、粉蚧科(Pseudococcidae)、木虱科(Psyllidae)、紅蝽科(Pyrrhocoridae)和網(wǎng)蝽科(Tingidae)。

來自半翅目的農(nóng)學(xué)上重要的成員包括但不限于：喜綠蝽(Acrosternum hilare Say)(稻綠蝽)；豌豆蚜(Acyrthisiphon pisum Harris)(豆長管蚜)；球蚜屬(Adelgesspp.)(球蚜)；苜蓿褐盲蝽(Adelphocoris rapidus Say)(rapid plant bug)；Anasa tristis De Geer(南瓜緣蝽)；花生蚜(Aphis craccivora Koch)(黑豆蚜)；A.fabae Scopoli(黑豆蚜)；棉蚜(A.gossypu Glover)(棉蚜、瓜蚜)；玉米根蚜(A.maidiradicis Forbes)(corn root aphid)；蘋果黃蚜(A.pomi De Geer)(蘋果蚜)；繡線菊蚜(A.spiraecola Patch)(卷葉蚜)；印尼輪盾介殼蟲(Aulacaspis tegalensis Zehntner)(sugarcane scale)；Aulacorthum solani Kaltenbach(茄無網(wǎng)長管蚜)；Bemisia tabaci Gennadius(煙粉虱，甘薯粉虱)；B.argentifolii Bellows&Perring(銀葉粉虱)；美洲谷長蝽(Blissus leucopterus leucopterus Say)(高粱長蝽)；負(fù)子蝽屬物種(Blostomatidae spp.)；甘藍(lán)短棒蚜(Brevicoryne brassicae Linnaeus)(甘藍(lán)蚜)；梨木虱(Cacopsylla pyricola Foerster)(梨黃木虱)；馬鈴薯衣殼蝽(Calocoris norvegicus Gmelin)(potato capsid bug)；Chaetosiphon fragaefolii Cockerell(草莓蚜)；臭蟲科屬物種(Cimicidae spp.)；緣蝽屬物種(Coreidae spp.)；方翅網(wǎng)蝽(Corythuca gossypii Fabricius)(棉花網(wǎng)蝽)；Cyrtopeltis modesta Distant(番茄蝽)；煙草小盲蝽(C.notatus Distant)(suckfly)；沫蟬(Deois flavopicta)(spittlebug)；Dialeurodes citri Ashmead(柑桔白粉虱)；皂莢蝽(Diaphnocoris chlorionis Say)(honeylocust plant bug)；Diuraphis noxia Kurdjumov/Mordvilko(俄羅斯小麥蚜)；竹禾盾介殼蟲(Duplachionaspis divergens Green)(armored scale)；玫瑰蘋果蚜(Dysaphis plantaginea Paaserini)(rosy apple aphid)；棉蝽(Dysdercus suturellus Herrich-)(污棉蟲)；甘蔗灰粉蚧(Dysmicoccus boninsis Kuwana)(gray sugarcane mealybug)；蠶豆微葉蟬(Empoasca fabae Harris)(馬鈴薯小綠葉蟬)；Eriosoma lanigerum Hausmann(蘋果綿蚜)；Erythroneoura spp.(葡萄小葉蟬)；Eumetopina flavipes Muir(島嶼甘蔗飛虱)；扁盾蝽屬物種(Eurygaster spp.)；褐臭椿(Euschistus servus Say)(brown stink bug)；一斑臭蝽(E.variolarius Palisot de Beauvois)(one-spotted stink bug)；長蝽屬物種(Graptostethus spp.)(長蝽科復(fù)合體(complex of seed bugs))；和Hyalopterus pruni Geoffroy(桃大尾蚜)；Icerya purchasi Maskell(吹綿介殼蟲)；Labopidicola allii Knight(洋蔥蝽)；Laodelphax striatellus Fallen(灰飛虱)；Leptoglossus corculus Say(松葉根蝽)；Leptodictya tabida Herrich-Schaeffer(sugarcane lace bug)；Lipaphis erysimi Kaltenbach(蘿卜蚜)；長綠盲蝽(Lygocoris pabulinus Linnaeus)(common green capsid)；Lygus lineolaris Palisot de Beauvois(牧草盲蝽)；L.HesperusKnight(西部牧草盲蝽)；牧草盲蝽(L.pratensis Linnaeus)(common meadow bug)；長毛草盲蝽(L.rugulipennis Poppius)(歐洲牧草盲蝽)；Macrosiphum euphorbiae Thomas(馬鈴薯蚜)；翠菊葉蟬(Macrosteles quadrilineatus Forbes)(二點(diǎn)葉蟬)；Magicicada septendecim Linnaeus(周期蟬)；Mahanarva fimbriolata(甘蔗沫蟬)；高粱蚜(Melanaphis sacchari Zehntner)(sugarcane aphid)；粉蚧(Melanaspis glomerata Green)(black scale)；麥無網(wǎng)長管蚜(Metopolophium dirhodum Walker)(rose grain aphid)；煙蚜(Myzus persicae Sulzer)(桃蚜)；Nasonovia ribisnigri Mosley(萵苣蚜)；黑尾葉蟬(Nephotettix cinticeps Uhler)(青葉蟬)；二條黑尾葉蟬(N.nigropictus)(黑尾葉蟬)；稻綠蝽(Nezara viridula Linnaeus)(南部稻綠蝽)；Nilaparvata lugens(褐飛虱)；擬麥長蝽(Nysius ericae Schilling)(false chinch bug)茶黃薊馬(Nysius raphanus Howard)(假麥長蝽)；稻蝽(Oebalus pugnax Fabricius)(稻褐蝽)；Oncopeltus fasciatus Dallas(大馬利筋長蝽)；Orthops campestris Linnaeus；癭綿蚜屬物種(Pemphigusspp.)(根蚜和癭蚜)；Peregrinus maidis Ashmead(玉米飛虱)；甘蔗扁角飛虱(Perkinsiella saccharicida Kirkaldy)(sugarcane delphacid)；長山核桃根瘤蚜(Phylloxera devastatrix Pergande)(美洲山核桃根瘤蚜)；桔臀紋粉蚧(Planococcus citri Risso)(柑桔粉蚧)；蘋盲蝽(Plesiocoris rugicollis Fallen)(apple capsid)；四線盲蝽(Poecilocapsus lineatus Fabricius)(four-lined plant bug)；Pseudatomoscelis seriatus Reuter(棉盲蝽)；粉蚧屬物種(Pseudococcusspp.)(其它粉蚧復(fù)合體)；棉草介殼蟲(Pulvinaria elongata Newstead(棉草介殼蟲)；蔗短足蠟蟬(Pyrilla perpusilla Walker)(sugarcane leafhopper)；紅蝽屬物種(Pyrrhocoridae spp.)；梨園蚧(Quadraspidiotus perniciosus Comstock)(圣約瑟蟲)；獵蝽屬物種(Reduviidae spp.)；玉米縊管蚜(Rhopalosiphum maidis Fitch)(玉米葉蚜)；R.padi Linnaeus(禾谷縊管蚜)；甘蔗紅粉蚧(Saccharicoccus sacchari Cockerell)(pink sugarcane mealybug)；Schizaphis graminum Rondani(麥二叉蚜)；Sipha flava Forbes(yellow sugarcane aphid)；Sitobion avenae Fabricius(麥長管蚜)；Sogatella furcifera Horvath(白背飛虱)；稻條背飛虱(Sogatodes oryzicola Muir)(稻飛虱)；Spanagonicus albofasciatus Reuter(白斑盲蝽)；斑點(diǎn)苜蓿蚜(Therioaphis maculata Buckton)(苜蓿斑蚜)；谷蛾屬物種(Tinidae spp.)；Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe(桔二叉蚜)；和T.citricida Kirkaldy(褐色橘蚜)；Trialeurodes abutiloneus(紋翅粉虱)和T.vaporariorum Westwood(溫室白粉虱)；Trioza diospyri Ashmead(柿木虱)；以及Typhlocyba pomaria McAtee(白色蘋果葉蟬)。

另外，包括蜱螨目(Acari)(螨類)的成體和幼蟲，諸如Aceria tosichella Keifer(小麥卷葉螨)蘋果全爪螨(Panonychus ulmi Koch)(蘋果紅蜘蛛)；麥巖螨(Petrobia latens Müller)(褐色小麥螨)；班氏細(xì)螨(Steneotarsonemus bancrofti Michael)(甘蔗細(xì)螨)；葉螨科(Tetranychidae)的葉螨和紅螨，Oligonychus grypus Baker&Pritchard、O.indicus Hirst(甘蔗葉螨(sugarcane leaf mite))、O.pratensis Banks(草地小爪螨)、O.stickneyi McGregor(甘蔗葉螨)；Tetranychus urticae Koch(二斑葉螨)；邁葉螨(T.mcdanieli McGregor)(McDaniel mite)；T.cinnabarinus Boisduval(紅蜘蛛螨)；T.turkestani Ugarov&Nikolski(草莓蛛螨)、細(xì)須螨科(Tenuipalpidae)的葡萄短須螨類、Brevipalpus lewisi McGregor(柑橘紅蜘蛛)；癭螨科(Eriophyidae)中的銹螨和芽蜱以及其它食葉螨和對(duì)人類和動(dòng)物健康重要的螨，即表皮螨科(Epidermoptidae)的塵螨、蠕形螨科(Demodicidae)的蠕形螨、食甜螨科(Glycyphagidae)的谷螨，硬蜱科(Ixodidae)的蜱類。黑腳硬蜱(Ixodes scapularis Say)(鹿蜱)；全環(huán)硬蜱(I.holocyclus Neumann)(澳洲寄生蜱(Australian paralysis tick))；變異革蜱(Dermacentor variabilis Say)(美洲犬蜱)；美洲鈍眼蜱(Amblyomma americanum Linnaeus)(孤星蜱)；以及癢螨科(Psoroptidae)、蒲螨科(Pyemotidae)和疥螨科(Sarcoptidae)的癢螨和疥螨。

纓尾目(Thysanura)的昆蟲害蟲是值得關(guān)注的，諸如Lepisma saccharina Linnaeus(蠹蟲)；家衣魚(Thermobia domestica Packard)(小灶衣魚(firebrat))。

另外的節(jié)肢動(dòng)物害蟲包括：蜘蛛目(Araneae)的蜘蛛諸如Loxosceles reclusa Gertsch&Mulaik(棕色隱士蛛)；和紅斑寇蛛(Latrodectus mactans Fabricius)(黑寡婦蜘蛛(black widow spider))；和蚰蜓目(Scutigeromorpha)的多足類諸如Scutigera coleoptrata Linnaeus(蚰蜒)。此外，等翅目(Isoptera)的昆蟲害蟲是值得關(guān)注的，包括白蟻科(termitidae)的那些昆蟲害蟲，例如但不限于Cylindrotermes nordenskioeldi Holmgren和Pseudacanthotermes militaris Hagen(甘蔗白蟻)。纓翅目(Thysanoptera)的昆蟲也是值得關(guān)注的，包括但不限于薊馬類，例如Stenchaetothrips minutus van Deventer(甘蔗薊馬)。

可在昆蟲害蟲的早期發(fā)育階段(例如作為幼蟲或者其它發(fā)育未完全的形式)對(duì)昆蟲害蟲測(cè)試本發(fā)明實(shí)施方案的組合物的殺蟲活性?？蓪⒗ハx在完全黑暗中在約20℃至約30℃和約30％至約70％相對(duì)濕度下飼養(yǎng)?？扇缫韵挛墨I(xiàn)中所述進(jìn)行生物測(cè)定：Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83(6)：2480-2485。飼養(yǎng)昆蟲幼蟲和進(jìn)行生物測(cè)定法的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。

有多種生物測(cè)定技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。一般程序包括將實(shí)驗(yàn)化合物或者生物體添加到密閉容器中的食物源。然后在取食和暴露適當(dāng)?shù)囊欢螘r(shí)間后，通過(但不限于)死亡率變化、體重減輕、吸引、排斥和其它行為和身體的變化來測(cè)量殺蟲活性。本文所述的生物測(cè)定可用于幼蟲階段或者成蟲階段的任何取食昆蟲害蟲。

以下實(shí)施例以舉例說明的方式給出，而非限制本發(fā)明。除非上下文另外明確規(guī)定，如本文所用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該”包括多個(gè)指代物。因此，例如，提及“一個(gè)細(xì)胞”包括多個(gè)此類細(xì)胞，并且提及“該蛋白”包括提及一種或多種蛋白以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同物，等等。除非另外明確指明，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。

說明書中提到的所有公布和專利申請(qǐng)指示了本發(fā)明適合的本領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。所有公布和專利申請(qǐng)以引用方式并入本文，如同每個(gè)單獨(dú)的公布或?qū)＠暾?qǐng)被具體地和獨(dú)立地指出以引用方式并入本文一樣。

雖然為了清楚理解的目的已通過例證和示例的方式詳細(xì)地描述的前述發(fā)明，但一些變化和修改可在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)實(shí)施。

實(shí)驗(yàn)

實(shí)施例1——基因鑒定和大腸桿菌(E.coli)表達(dá)

編碼SEQ ID NO：4的殺昆蟲蛋白的基因可獲自命名為UZ348的蘇云金芽孢桿菌菌株。使選定的Bt菌株在30mL的培養(yǎng)基中以250rpm振蕩生長16小時(shí)。使用得自Macherey-Nagel的試劑盒(Catalog#740521)從細(xì)胞收集分離的DNA。然后使用Illumina HiSeq2500對(duì)DNA進(jìn)行測(cè)序、裝配和注釋。接著選擇目的基因。

合成SEQ ID NO：4的殺昆蟲多肽的編碼序列SEQ ID NO：3，以及SEQ ID NO：4的變體的編碼序列(包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9)并克隆到pET28a載體中并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21細(xì)胞(Invitrogen)中。使大規(guī)模1.0L培養(yǎng)物生長直至O.D.600nm～0.8，然后用異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)1mM誘導(dǎo)培養(yǎng)物并使其在16℃下生長16小時(shí)。用添加有0.02％溶菌酶(w/v)和0.1％Tween-20以及1片完全蛋白酶抑制劑(Roch)的50mL的500mM NaCl/20mM Tris/5mM咪唑/pH 7.9裂解細(xì)胞沉淀物。在裂解之后，對(duì)溶液進(jìn)行超聲波處理并將溶胞產(chǎn)物在25,000rpm下離心30分鐘。使包含可溶性蛋白級(jí)份的上清液過濾通過0.45u真空過濾器并然后添加1ml的Talon(Clontech)漿液，接著在旋轉(zhuǎn)器上以100rpm溫育1小時(shí)以進(jìn)行結(jié)合。然后將溶胞產(chǎn)物添加到柱上并用20ml的50mmM NaCl/20mM Tris/5mM咪唑/pH 7.9分離和洗滌結(jié)合的蛋白質(zhì)，接著用1.5ml的50mmM NaCl/20mM Tris/500mM咪唑/pH 7.9進(jìn)行洗脫。然后將經(jīng)純化的蛋白質(zhì)透析到50mM碳酸鈉緩沖液(pH10)中。在體外取食測(cè)定法中，將殺昆蟲活性的經(jīng)純化蛋白質(zhì)施加于鱗翅目平板上。

實(shí)施例2——用部分純化蛋白進(jìn)行的鱗翅目測(cè)定

進(jìn)行殺昆蟲活性生物測(cè)定篩選以評(píng)估殺昆蟲蛋白對(duì)多種鱗翅目物種的作用：歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、玉米穗蟲(Helicoverpa zea)、黑地蠶(Agrotis ipsilon)、秋夜蛾(Spodoptera frugiperda)、大豆尺蠖(Pseudoplusia includens)和黎豆毛蟲(Anticarsia gemmatalis)。

對(duì)96孔板裝置中包含經(jīng)純化蛋白質(zhì)的人工飼料進(jìn)行鱗翅目取食測(cè)定。然后將經(jīng)純化的蛋白質(zhì)(25ul)添加到人工飼料中。每孔放入2到5只新生幼蟲，隨意飼喂取食5天。對(duì)于諸如發(fā)育遲緩和/或死亡的幼蟲反應(yīng)，結(jié)果表示為陽性。如果幼蟲與飼喂只加入上述緩沖液的食物的陰性對(duì)照相似，則結(jié)果表示為陰性。在歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、玉米穗蟲(Helicoverpa zea)、黑地蠶(Agrotis ipsilon)、秋夜蛾(Spodoptera frugiperda)、大豆尺蠖(Pseudoplusia includens)和黎豆毛蟲(Anticarsia gemmatalis)上對(duì)每種經(jīng)純化蛋白質(zhì)以單一濃度進(jìn)行初步生物測(cè)定篩選。昆蟲測(cè)定按以下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分：3＝100％死亡率；2＝嚴(yán)重發(fā)育遲緩；1＝發(fā)育遲緩；和0＝無活性。

SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的殺昆蟲多肽的初步殺昆蟲測(cè)定結(jié)果示于表5中。

表5

對(duì)SEQ ID NO：6的殺昆蟲多肽而言，在初步生物測(cè)定之后還針對(duì)CEW和FAW測(cè)定一系列濃度的相應(yīng)經(jīng)純化蛋白質(zhì)樣品。

對(duì)SEQ ID NO：6的殺昆蟲多肽而言，計(jì)算了SEQ ID NO：6的蛋白質(zhì)的一系列濃度和50％死亡率(LC50)或50％個(gè)體受抑制(IC50)的濃度。SEQ ID NO：6的殺昆蟲多肽的LC50/IC50結(jié)果示于表6中。

表6

實(shí)施例3——秋粘蟲(FAW)的CrylF抗性品系中殺昆蟲多肽的交互抗性

利用對(duì)鱗翅目昆蟲的標(biāo)準(zhǔn)化飼料摻入生物測(cè)定來評(píng)估SEQ ID NO：6對(duì)FAW幼蟲的影響。將蛋白質(zhì)與鱗翅目特定的人工飼料組合，以形成生物測(cè)定飼料?；诜秶褜y(cè)定結(jié)果，對(duì)易感性和CrylF-抗性FAW品系兩者的測(cè)試濃度在2倍稀釋液中為0.156-40ppm。使用96孔板對(duì)所有濃度處理加上緩沖液檢測(cè)中的每一者進(jìn)行4次平行測(cè)定，并且每種濃度在各個(gè)平板中占8個(gè)孔。將一個(gè)新生FAW置入包含生物測(cè)定飼料和殺昆蟲蛋白的平板的各個(gè)孔中。在各個(gè)生物測(cè)定開始之后，將所有平板于26.7±1℃下孵育4天?；诟怕试治?，使用基于死亡的死亡率數(shù)據(jù)計(jì)算50％致死濃度(LC50)。對(duì)死亡率和嚴(yán)重發(fā)育遲緩的計(jì)數(shù)進(jìn)行評(píng)分并合并為對(duì)50％個(gè)體受抑制(IC50)進(jìn)行計(jì)算的總響應(yīng)?；诘鞍踪|(zhì)對(duì)易感和抗性FAW品系的LC/IC50來計(jì)算抗性比(RR)。

RR＝抗性品系的LC或IC50/易感品系的LC或IC50

表7示出Cry1F抗性的FAW品系對(duì)SEQ ID NO：6沒有交互抗性(RR＝0.4，基于IC50)。

表7

SS＝易感品系

Res＝抗性品系

實(shí)施例4——農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉蜀黍轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植物的再生

為用多核苷酸序列(例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3)進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉蜀黍轉(zhuǎn)化，可使用Zhao的方法(美國專利5,981,840和PCT專利公布WO98/32326；將所述專利的內(nèi)容以引用方式并入本文)。簡(jiǎn)單而言，從玉蜀黍分離不成熟胚，并使胚與農(nóng)桿菌懸浮液在該細(xì)菌能夠?qū)⒍舅睾塑账嵝蛄?例如，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3)轉(zhuǎn)移到至少一個(gè)未成熟胚的至少一個(gè)細(xì)胞的條件下進(jìn)行接觸(步驟1：感染步驟)。在這個(gè)步驟中，可將未成熟胚浸入農(nóng)桿菌懸浮液中以引發(fā)接種。將胚與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一段時(shí)間(步驟2：共培養(yǎng)步驟)。在該感染步驟之后，可將未成熟胚在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。在這個(gè)共培養(yǎng)期之后，設(shè)想到任選的“靜息”步驟。在這個(gè)靜息步驟中，將胚在至少一種已知能抑制農(nóng)桿菌生長的抗生素的存在下進(jìn)行溫育，不添加植物轉(zhuǎn)化子的選擇劑(步驟3：靜息步驟)?？蓪⑽闯墒炫咴诤锌股氐珶o選擇劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，為了消除農(nóng)桿菌以及為了受感染細(xì)胞的靜息階段。接著，將經(jīng)接種的胚在含有選擇劑的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，回收生長出的轉(zhuǎn)化愈傷組織(步驟4：選擇步驟)。將未成熟胚在固體培養(yǎng)基上與選擇劑一起進(jìn)行培養(yǎng)，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇性生長。然后將愈傷組織再生成植株(步驟5：再生步驟)，并可將在選擇性培養(yǎng)基上生長的愈傷組織在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)以再生出植株。

實(shí)施例5——大豆胚的轉(zhuǎn)化

如下所述，用含有可操作地連接至合適的啟動(dòng)子的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3毒素核苷酸序列的質(zhì)粒對(duì)大豆胚進(jìn)行轟擊。為了誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，從適當(dāng)?shù)拇蠖乖耘喾N的經(jīng)表面滅菌的未成熟種子解剖出長3-5mm的子葉，然后將其在適當(dāng)?shù)沫傊囵B(yǎng)基上于26℃在光照或黑暗中培養(yǎng)六至十個(gè)星期。然后切取產(chǎn)生次級(jí)胚的體細(xì)胞胚并置于合適的液體培養(yǎng)基中。在反復(fù)選擇作為早期球狀階段的胚繁殖的體細(xì)胞胚的簇之后，如下所述維持懸浮物。

大豆胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物可在旋轉(zhuǎn)振蕩器上在150rpm、26℃下維持在35mL液體培養(yǎng)基中，以熒光燈按16∶8小時(shí)白日/黑夜時(shí)間表進(jìn)行維持。每隔兩周，通過將大約35mg的組織接種到35mL的液體培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)物進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

可然后通過粒子槍轟擊方法(Klein等人，(1987)Nature(倫敦)327：70-73，美國專利No.4,945,050)轉(zhuǎn)化大豆胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物?？墒褂肈u Pont Biolistic PDSl000/HE儀器(氦改型)進(jìn)行這些轉(zhuǎn)化。

可用于促進(jìn)大豆轉(zhuǎn)化的選擇性標(biāo)記基因包括但不限于：來自花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子(Odell等人，(1985)Nature 313：810-812)、來自質(zhì)粒pJR225(來自大腸桿菌；Gritz等人，(1983)Gene 25：179-188)的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和來自根瘤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒的T-DNA的胭脂堿合酶基因的3′區(qū)。包含可操作地連接至合適的啟動(dòng)子的毒素核苷酸序列(例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3)的表達(dá)盒可作為限制性片段分離。然后可將這個(gè)片段插入攜帶標(biāo)記基因的載體的獨(dú)特限制性位點(diǎn)中。

向50μL的60mg/mL 1μm金粒子懸浮液加入(按順序)：5μL DNA(1μg/μL)、20μL亞精胺(0.1M)和50μL CaCl2(2.5M)。然后將粒子制備物攪動(dòng)三分鐘，在微量離心機(jī)中離心10秒，移除上清液。然后將DNA包被的粒子在400μL 70％乙醇中洗滌一次并再懸浮于40μL無水乙醇中?？蓪NA/粒子懸浮液超聲處理三次，每次1秒。然后將五微升DNA包被的金粒子加載至每個(gè)巨載體盤上。

將大約300-400mg的兩周齡懸浮培養(yǎng)物置于空的60×15mm培養(yǎng)皿中，用移液管將殘余液體從組織移除。對(duì)于每次轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，通常轟擊大約5-10個(gè)組織平板。將膜破裂壓力設(shè)定為1100psi，將室抽至28英寸汞柱的真空。將組織距離阻滯屏(retaining screen)大約3.5英寸放置，轟擊三次。轟擊后，可將組織一分為二并放回進(jìn)液體中，如上所述進(jìn)行培養(yǎng)。

轟擊后五至七天，可將液體培養(yǎng)基與新鮮培養(yǎng)基交換，轟擊后七至十二天與含有50mg/mL潮霉素的新鮮培養(yǎng)基交換。該選擇培養(yǎng)基可每周更換。轟擊后七至八周，可觀察到綠色的轉(zhuǎn)化組織從未轉(zhuǎn)化的壞死的胚發(fā)生簇長出來。移出分離的綠色組織并接種進(jìn)單獨(dú)的燒瓶中以產(chǎn)生新的、無性繁殖的、轉(zhuǎn)化的胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物。可將每一新株系當(dāng)作獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件。然后可將這些懸浮物傳代培養(yǎng)，并作為未成熟胚簇維持或者通過使各單獨(dú)體細(xì)胞胚成熟和發(fā)芽而再生成完整植株。

序列表

<110> PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL, INC.

ABAD, ANDRE R.

CROW, ANDREW CARL

POLAND, BRAD

SHI, XIAOMEI

WOLFE, THOMAS CHAD

<120> 具有廣譜活性的殺昆蟲多肽和其用途

<130> 6059-WO-PCT

<150> US 62/064848

<151> 2014-10-16

<160> 10

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 2256

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MP589FL的變體

<400> 1

atggagggaa ataatctaaa tcaatgcata ccttacaatt gtttaagtaa tcctaaggac 60

ataatattag gtgatgaaag gctagaaact ggtaatactg tagcagacat taccttaggg 120

attgtcaatc tattgttttc tgagtttgtt cctggtggag gctttatact aggattactg 180

gatttaatat gggggtctat aggtcgttcc caatgggatc tatttctgga acagattgaa 240

caattgatta agcaaagaat agaagaattt gctaggaatc aggcaatttc aagattggag 300

gggctaagcg atctttataa gacctatgct agagcgttta gcgattggga ggcagatccg 360

actaatccag cattaaggga agaaatgcgt atacaattta atgacatgaa tagtgctatc 420

ataacggctc tcccactttt tagagttcaa aattatgaag ttgctctttt atctgtttat 480

gttcaagctg caaacttaca tttatctatt ttaagagatg tttcagtctt tggagaaaga 540

tggggatatg atacagcaac tatcaataat cgctatagtg acttaactag ccttattcat 600

gtttatacta atcattgtgt ggatacgtat aatcagggat taaggcgttt ggaaggtcgt 660

tttcttaccg attggattgt atataatcgt ttccgaagac aattaacaat ttcagtatta 720

gatattgttg cattttttcc aaattatgat attcgaacat atccaattca aacagctact 780

cagctaacga gggaaatcta tctggattta ccttttatta atgaaaatct ttctcctgca 840

gcaagctatc cctcattctc agatgctgaa agtgctataa tcaggagtcc tcatttagtg 900

gactttttaa atagcttcac tatttataca gatagtcttg ctcgatattt atattgggga 960

gggcatcggg tgaattttac ccgttcagga gttactactt ttatacaatc accactatat 1020

ggaagggaag gaaatgcaga gcgttctgta attatttcgg catcatctag cgtaccaata 1080

tttagaacac tttcatatgt tactggcctt gacaatgcaa atcctgtagc tggaattgaa 1140

ggagtggaat tccaaaatac tataagtaga agtatctatc gtaaaagtgg tccaattgat 1200

tcttttaatg aattaccacc tcaagatgcc agtgtatctc cttcaattgg gtatagtcac 1260

cgtttatgtc atgccacatt tttagaacgg attagtggac caagaattgc aggtgtcgtt 1320

ttttcctgga cacatcgtag tgctagccct actaatgaag taagttcatc tagaattaca 1380

caaattccat gggtaaaggc gcatactctt gcgtctggtg cctccgttat taaagggcct 1440

ggatttacag gtggagatat actaactagg aataccttag gcgaactggg gactttaaga 1500

gtaacttttg caggaagatt atcacaaagt tattatatac gtttccgtta tgcttccgta 1560

gctaatagga gtggtatatt tagctattca cagccaactt catatggaat ttcctttcca 1620

aaaactatgg atgcagatga atcattaaca tctcgttcat ttgcacttgc tacacttgct 1680

acaccgctaa cctttagaag gcaagaagaa ttaaatctac aaataccatc aggtacttat 1740

atagatcgaa ttgagtttgt tccagtcgat gaaaccttta caacagaatc tgatctggat 1800

agagcacaac aggcggtgaa tgcgctgttt acttcttcca atcaaatcgg cttaaaaaca 1860

gatgtgacgg attatcatat tgatcaagta tccaatttag tggattgttt atcggatgaa 1920

ttttgtctgg atgaaaagcg agaattgtcc gagaaagtca aacatgcgaa gcgactcagt 1980

gatgagcgga atttacttca agatccaaac tttagaggaa tcaatagaca accagaccgt 2040

ggttggagag gaagtacaga tattaccatc caaggaggag atgacgtatt caaagagaat 2100

tacgttacac taccaggtac ctttgatgag tgctatccaa cgtatttata tcaaaaaata 2160

gatgagtcga aattaaaagc ctatacccgt taccaattaa gagggtatat cgaagatagt 2220

caagacttag aaatctattt aattcgctac aattga 2256

<210> 2

<211> 751

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MP589FL aa的變體

<400> 2

Met Glu Gly Asn Asn Leu Asn Gln Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu Ser

1 5 10 15

Asn Pro Lys Asp Ile Ile Leu Gly Asp Glu Arg Leu Glu Thr Gly Asn

20 25 30

Thr Val Ala Asp Ile Thr Leu Gly Ile Val Asn Leu Leu Phe Ser Glu

35 40 45

Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Ile Leu Gly Leu Leu Asp Leu Ile Trp

50 55 60

Gly Ser Ile Gly Arg Ser Gln Trp Asp Leu Phe Leu Glu Gln Ile Glu

65 70 75 80

Gln Leu Ile Lys Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Ile

85 90 95

Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asp Leu Tyr Lys Thr Tyr Ala Arg Ala

100 105 110

Phe Ser Asp Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu Glu

115 120 125

Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Ile Ile Thr Ala Leu

130 135 140

Pro Leu Phe Arg Val Gln Asn Tyr Glu Val Ala Leu Leu Ser Val Tyr

145 150 155 160

Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Ile Leu Arg Asp Val Ser Val

165 170 175

Phe Gly Glu Arg Trp Gly Tyr Asp Thr Ala Thr Ile Asn Asn Arg Tyr

180 185 190

Ser Asp Leu Thr Ser Leu Ile His Val Tyr Thr Asn His Cys Val Asp

195 200 205

Thr Tyr Asn Gln Gly Leu Arg Arg Leu Glu Gly Arg Phe Leu Thr Asp

210 215 220

Trp Ile Val Tyr Asn Arg Phe Arg Arg Gln Leu Thr Ile Ser Val Leu

225 230 235 240

Asp Ile Val Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Ile Arg Thr Tyr Pro Ile

245 250 255

Gln Thr Ala Thr Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Leu Asp Leu Pro Phe

260 265 270

Ile Asn Glu Asn Leu Ser Pro Ala Ala Ser Tyr Pro Ser Phe Ser Asp

275 280 285

Ala Glu Ser Ala Ile Ile Arg Ser Pro His Leu Val Asp Phe Leu Asn

290 295 300

Ser Phe Thr Ile Tyr Thr Asp Ser Leu Ala Arg Tyr Leu Tyr Trp Gly

305 310 315 320

Gly His Arg Val Asn Phe Thr Arg Ser Gly Val Thr Thr Phe Ile Gln

325 330 335

Ser Pro Leu Tyr Gly Arg Glu Gly Asn Ala Glu Arg Ser Val Ile Ile

340 345 350

Ser Ala Ser Ser Ser Val Pro Ile Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Val Thr

355 360 365

Gly Leu Asp Asn Ala Asn Pro Val Ala Gly Ile Glu Gly Val Glu Phe

370 375 380

Gln Asn Thr Ile Ser Arg Ser Ile Tyr Arg Lys Ser Gly Pro Ile Asp

385 390 395 400

Ser Phe Asn Glu Leu Pro Pro Gln Asp Ala Ser Val Ser Pro Ser Ile

405 410 415

Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His Ala Thr Phe Leu Glu Arg Ile Ser

420 425 430

Gly Pro Arg Ile Ala Gly Val Val Phe Ser Trp Thr His Arg Ser Ala

435 440 445

Ser Pro Thr Asn Glu Val Ser Ser Ser Arg Ile Thr Gln Ile Pro Trp

450 455 460

Val Lys Ala His Thr Leu Ala Ser Gly Ala Ser Val Ile Lys Gly Pro

465 470 475 480

Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Thr Arg Asn Thr Leu Gly Glu Leu

485 490 495

Gly Thr Leu Arg Val Thr Phe Ala Gly Arg Leu Ser Gln Ser Tyr Tyr

500 505 510

Ile Arg Phe Arg Tyr Ala Ser Val Ala Asn Arg Ser Gly Ile Phe Ser

515 520 525

Tyr Ser Gln Pro Thr Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Pro Lys Thr Met Asp

530 535 540

Ala Asp Glu Ser Leu Thr Ser Arg Ser Phe Ala Leu Ala Thr Leu Ala

545 550 555 560

Thr Pro Leu Thr Phe Arg Arg Gln Glu Glu Leu Asn Leu Gln Ile Pro

565 570 575

Ser Gly Thr Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Phe Val Pro Val Asp Glu Thr

580 585 590

Phe Thr Thr Glu Ser Asp Leu Asp Arg Ala Gln Gln Ala Val Asn Ala

595 600 605

Leu Phe Thr Ser Ser Asn Gln Ile Gly Leu Lys Thr Asp Val Thr Asp

610 615 620

Tyr His Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Asp Cys Leu Ser Asp Glu

625 630 635 640

Phe Cys Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Ser Glu Lys Val Lys His Ala

645 650 655

Lys Arg Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asn Phe Arg

660 665 670

Gly Ile Asn Arg Gln Pro Asp Arg Gly Trp Arg Gly Ser Thr Asp Ile

675 680 685

Thr Ile Gln Gly Gly Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val Thr Leu

690 695 700

Pro Gly Thr Phe Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln Lys Ile

705 710 715 720

Asp Glu Ser Lys Leu Lys Ala Tyr Thr Arg Tyr Gln Leu Arg Gly Tyr

725 730 735

Ile Glu Asp Ser Gln Asp Leu Glu Ile Tyr Leu Ile Arg Tyr Asn

740 745 750

<210> 3

<211> 3492

<212> DNA

<213> 蘇云金芽孢桿菌

<400> 3

atggagggaa ataatctaaa tcaatgcata ccttacaatt gtttaagtaa tcctaaggac 60

ataatattag gtgatgaaag gctagaaact ggtaatactg tagcagacat taccttaggg 120

attgtcaatc tattgttttc tgagtttgtt cctggtggag gctttatact aggattactg 180

gatttaatat gggggtctat aggtcgttcc caatgggatc tatttctgga acagattgaa 240

caattgatta agcaaagaat agaagaattt gctaggaatc aggcaatttc aagattggag 300

gggctaagcg atctttataa gacctatgct agagcgttta gcgattggga ggcagatccg 360

actaatccag cattaaggga agaaatgcgt atacaattta atgacatgaa tagtgctatc 420

ataacggctc tcccactttt tagagttcaa aattatgaag ttgctctttt atctgtttat 480

gttcaagctg caaacttaca tttatctatt ttaagagatg tttcagtctt tggagaaaga 540

tggggatatg atacagcaac tatcaataat cgctatagtg acttaactag ccttattcat 600

gtttatacta atcattgtgt ggatacgtat aatcagggat taaggcgttt ggaaggtcgt 660

tttcttaccg attggattgt atataatcgt ttccgaagac aattaacaat ttcagtatta 720

gatattgttg cattttttcc aaattatgat attcgaacat atccaattca aacagctact 780

cagctaacga gggaaatcta tctggattta ccttttatta atgaaaatct ttctcctgca 840

gcaagctatc cctcattctc agatgctgaa agtgctataa tcaggagtcc tcatttagtg 900

gactttttaa atagcttcac tatttataca gatagtcttg ctcgatattt atattgggga 960

gggcatcggg tgaattttac ccgttcagga gttactactt ttatacaatc accactatat 1020

ggaagggaag gaaatgcaga gcgttctgta attatttcgg catcatctag cgtaccaata 1080

tttagaacac tttcatatgt tactggcctt gacaatgcaa atcctgtagc tggaattgaa 1140

ggagtggaat tccaaaatac tataagtaga agtatctatc gtaaaagtgg tccaattgat 1200

tcttttaatg aattaccacc tcaagatgcc agtgtatctc cttcaattgg gtatagtcac 1260

cgtttatgtc atgccacatt tttagaacgg attagtggac caagaattgc aggtgtcgtt 1320

ttttcctgga cacatcgtag tgctagccct actaatgaag taagttcatc tagaattaca 1380

caaattccat gggtaaaggc gcatactctt gcgtctggtg cctccgttat taaagggcct 1440

ggatttacag gtggagatat actaactagg aataccttag gcgaactggg gactttaaga 1500

gtaacttttg caggaagatt atcacaaagt tattatatac gtttccgtta tgcttccgta 1560

gctaatagga gtggtatatt tagctattca cagccaactt catatggaat ttcctttcca 1620

aaaactatgg atgcagatga atcattaaca tctcgttcat ttgcacttgc tacacttgct 1680

acaccgctaa cctttagaag gcaagaagaa ttaaatctac aaataccatc aggtacttat 1740

atagatcgaa ttgagtttgt tccagtcgat gaaaccttta caacagaatc tgatctggat 1800

agagcacaac aggcggtgaa tgcgctgttt acttcttcca atcaaatcgg cttaaaaaca 1860

gatgtgacgg attatcatat tgatcaagta tccaatttag tggattgttt atcggatgaa 1920

ttttgtctgg atgaaaagcg agaattgtcc gagaaagtca aacatgcgaa gcgactcagt 1980

gatgagcgga atttacttca agatccaaac tttagaggaa tcaatagaca accagaccgt 2040

ggttggagag gaagtacaga tattaccatc caaggaggag atgacgtatt caaagagaat 2100

tacgttacac taccaggtac ctttgatgag tgctatccaa cgtatttata tcaaaaaata 2160

gatgagtcga aattaaaagc ctatacccgt tatcaattaa gagggtatat cggggatagt 2220

caagacttag aaatctattt aattcgttac aatgcaaaac acgaaatagt aaatgtacca 2280

ggtacaggga gtttatggac tctttctgta gaaaattcaa ttggaccttg tggagaaccg 2340

aatcgatgcg cgccacacct tgaatggaat cctaatctag agtgttcttg cagagaaggg 2400

gaaaaatgtg cccatcattc ccatcatttc tccttggaca ttgatgttgg atgtacagac 2460

ttaaatgagg acttaggtgt atgggcgata ttcaagatta agacgcaaga tggccatgca 2520

agactaggaa atctagagtt tctcgaagag aaaccactat taggggaagc actagctcgt 2580

gtgaaaagag cggagaagaa atggagagac aaacgcgaaa aattggaatg ggaaacaaat 2640

attgtttata aagaggcaaa agaatctgta gatgctttat ttgtgaactc tcaatatgat 2700

agattacaag cggatacgaa tatcgcgatg attcatgcgg cagataaacg cgttcataga 2760

attagagaag cataccttcc agaattatct gtaattccgg gtgtaaatgc gggcattttc 2820

gaagaattag agggacgcat tttcacagcc tactctctat atgatgcgag aaatgtcatt 2880

aaaaatggcg atttcaataa tggtttattg tgctggaact tgaaagggca tgtagatgta 2940

gaagaacaaa acaaccatcg ttcagtcctt gttgtcccgg aatgggaagc agaggtgtcc 3000

caagaagttc gtgtctgtcc aggtcgtggc tatatccttc gtgttacagc gtacaaagag 3060

ggatatggag agggctgcgt aaccatccat gagatcgaag acaatacaga cgaactgaaa 3120

ttcagcaact gtgtagaaga ggaagtatat ccaaacaaca cggtaacgtg taatgattat 3180

actgcgactc aagaagaata tgagggtacg tacacttctc gtaatcgagg atatgacgga 3240

gcctatgaaa gcaattcttc tgtaccagct gattatgcat cagcctatga agaaaaagcg 3300

tatacagatg gaagaagaga gaatccttgt gaatctaata gaggatatgg ggattacgcg 3360

ccactaccag ctggttatgt gacaaaggaa ttagagtact tcccagaaac cgataaggta 3420

tggattgaga tcggagaaac ggaaggaaca ttcattgtgg atagtgtgga attactcctt 3480

atggaggaat aa 3492

<210> 4

<211> 1163

<212> PRT

<213> 蘇云金芽孢桿菌

<400> 4

Met Glu Gly Asn Asn Leu Asn Gln Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu Ser

1 5 10 15

Asn Pro Lys Asp Ile Ile Leu Gly Asp Glu Arg Leu Glu Thr Gly Asn

20 25 30

Thr Val Ala Asp Ile Thr Leu Gly Ile Val Asn Leu Leu Phe Ser Glu

35 40 45

Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Ile Leu Gly Leu Leu Asp Leu Ile Trp

50 55 60

Gly Ser Ile Gly Arg Ser Gln Trp Asp Leu Phe Leu Glu Gln Ile Glu

65 70 75 80

Gln Leu Ile Lys Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Ile

85 90 95

Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asp Leu Tyr Lys Thr Tyr Ala Arg Ala

100 105 110

Phe Ser Asp Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu Glu

115 120 125

Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Ile Ile Thr Ala Leu

130 135 140

Pro Leu Phe Arg Val Gln Asn Tyr Glu Val Ala Leu Leu Ser Val Tyr

145 150 155 160

Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Ile Leu Arg Asp Val Ser Val

165 170 175

Phe Gly Glu Arg Trp Gly Tyr Asp Thr Ala Thr Ile Asn Asn Arg Tyr

180 185 190

Ser Asp Leu Thr Ser Leu Ile His Val Tyr Thr Asn His Cys Val Asp

195 200 205

Thr Tyr Asn Gln Gly Leu Arg Arg Leu Glu Gly Arg Phe Leu Thr Asp

210 215 220

Trp Ile Val Tyr Asn Arg Phe Arg Arg Gln Leu Thr Ile Ser Val Leu

225 230 235 240

Asp Ile Val Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Ile Arg Thr Tyr Pro Ile

245 250 255

Gln Thr Ala Thr Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Leu Asp Leu Pro Phe

260 265 270

Ile Asn Glu Asn Leu Ser Pro Ala Ala Ser Tyr Pro Ser Phe Ser Asp

275 280 285

Ala Glu Ser Ala Ile Ile Arg Ser Pro His Leu Val Asp Phe Leu Asn

290 295 300

Ser Phe Thr Ile Tyr Thr Asp Ser Leu Ala Arg Tyr Leu Tyr Trp Gly

305 310 315 320

Gly His Arg Val Asn Phe Thr Arg Ser Gly Val Thr Thr Phe Ile Gln

325 330 335

Ser Pro Leu Tyr Gly Arg Glu Gly Asn Ala Glu Arg Ser Val Ile Ile

340 345 350

Ser Ala Ser Ser Ser Val Pro Ile Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Val Thr

355 360 365

Gly Leu Asp Asn Ala Asn Pro Val Ala Gly Ile Glu Gly Val Glu Phe

370 375 380

Gln Asn Thr Ile Ser Arg Ser Ile Tyr Arg Lys Ser Gly Pro Ile Asp

385 390 395 400

Ser Phe Asn Glu Leu Pro Pro Gln Asp Ala Ser Val Ser Pro Ser Ile

405 410 415

Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His Ala Thr Phe Leu Glu Arg Ile Ser

420 425 430

Gly Pro Arg Ile Ala Gly Val Val Phe Ser Trp Thr His Arg Ser Ala

435 440 445

Ser Pro Thr Asn Glu Val Ser Ser Ser Arg Ile Thr Gln Ile Pro Trp

450 455 460

Val Lys Ala His Thr Leu Ala Ser Gly Ala Ser Val Ile Lys Gly Pro

465 470 475 480

Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Thr Arg Asn Thr Leu Gly Glu Leu

485 490 495

Gly Thr Leu Arg Val Thr Phe Ala Gly Arg Leu Ser Gln Ser Tyr Tyr

500 505 510

Ile Arg Phe Arg Tyr Ala Ser Val Ala Asn Arg Ser Gly Ile Phe Ser

515 520 525

Tyr Ser Gln Pro Thr Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Pro Lys Thr Met Asp

530 535 540

Ala Asp Glu Ser Leu Thr Ser Arg Ser Phe Ala Leu Ala Thr Leu Ala

545 550 555 560

Thr Pro Leu Thr Phe Arg Arg Gln Glu Glu Leu Asn Leu Gln Ile Pro

565 570 575

Ser Gly Thr Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Phe Val Pro Val Asp Glu Thr

580 585 590

Phe Thr Thr Glu Ser Asp Leu Asp Arg Ala Gln Gln Ala Val Asn Ala

595 600 605

Leu Phe Thr Ser Ser Asn Gln Ile Gly Leu Lys Thr Asp Val Thr Asp

610 615 620

Tyr His Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Asp Cys Leu Ser Asp Glu

625 630 635 640

Phe Cys Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Ser Glu Lys Val Lys His Ala

645 650 655

Lys Arg Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asn Phe Arg

660 665 670

Gly Ile Asn Arg Gln Pro Asp Arg Gly Trp Arg Gly Ser Thr Asp Ile

675 680 685

Thr Ile Gln Gly Gly Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val Thr Leu

690 695 700

Pro Gly Thr Phe Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln Lys Ile

705 710 715 720

Asp Glu Ser Lys Leu Lys Ala Tyr Thr Arg Tyr Gln Leu Arg Gly Tyr

725 730 735

Ile Gly Asp Ser Gln Asp Leu Glu Ile Tyr Leu Ile Arg Tyr Asn Ala

740 745 750

Lys His Glu Ile Val Asn Val Pro Gly Thr Gly Ser Leu Trp Thr Leu

755 760 765

Ser Val Glu Asn Ser Ile Gly Pro Cys Gly Glu Pro Asn Arg Cys Ala

770 775 780

Pro His Leu Glu Trp Asn Pro Asn Leu Glu Cys Ser Cys Arg Glu Gly

785 790 795 800

Glu Lys Cys Ala His His Ser His His Phe Ser Leu Asp Ile Asp Val

805 810 815

Gly Cys Thr Asp Leu Asn Glu Asp Leu Gly Val Trp Ala Ile Phe Lys

820 825 830

Ile Lys Thr Gln Asp Gly His Ala Arg Leu Gly Asn Leu Glu Phe Leu

835 840 845

Glu Glu Lys Pro Leu Leu Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val Lys Arg Ala

850 855 860

Glu Lys Lys Trp Arg Asp Lys Arg Glu Lys Leu Glu Trp Glu Thr Asn

865 870 875 880

Ile Val Tyr Lys Glu Ala Lys Glu Ser Val Asp Ala Leu Phe Val Asn

885 890 895

Ser Gln Tyr Asp Arg Leu Gln Ala Asp Thr Asn Ile Ala Met Ile His

900 905 910

Ala Ala Asp Lys Arg Val His Arg Ile Arg Glu Ala Tyr Leu Pro Glu

915 920 925

Leu Ser Val Ile Pro Gly Val Asn Ala Gly Ile Phe Glu Glu Leu Glu

930 935 940

Gly Arg Ile Phe Thr Ala Tyr Ser Leu Tyr Asp Ala Arg Asn Val Ile

945 950 955 960

Lys Asn Gly Asp Phe Asn Asn Gly Leu Leu Cys Trp Asn Leu Lys Gly

965 970 975

His Val Asp Val Glu Glu Gln Asn Asn His Arg Ser Val Leu Val Val

980 985 990

Pro Glu Trp Glu Ala Glu Val Ser Gln Glu Val Arg Val Cys Pro Gly

995 1000 1005

Arg Gly Tyr Ile Leu Arg Val Thr Ala Tyr Lys Glu Gly Tyr Gly

1010 1015 1020

Glu Gly Cys Val Thr Ile His Glu Ile Glu Asp Asn Thr Asp Glu

1025 1030 1035

Leu Lys Phe Ser Asn Cys Val Glu Glu Glu Val Tyr Pro Asn Asn

1040 1045 1050

Thr Val Thr Cys Asn Asp Tyr Thr Ala Thr Gln Glu Glu Tyr Glu

1055 1060 1065

Gly Thr Tyr Thr Ser Arg Asn Arg Gly Tyr Asp Gly Ala Tyr Glu

1070 1075 1080

Ser Asn Ser Ser Val Pro Ala Asp Tyr Ala Ser Ala Tyr Glu Glu

1085 1090 1095

Lys Ala Tyr Thr Asp Gly Arg Arg Glu Asn Pro Cys Glu Ser Asn

1100 1105 1110

Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Ala Pro Leu Pro Ala Gly Tyr Val Thr

1115 1120 1125

Lys Glu Leu Glu Tyr Phe Pro Glu Thr Asp Lys Val Trp Ile Glu

1130 1135 1140

Ile Gly Glu Thr Glu Gly Thr Phe Ile Val Asp Ser Val Glu Leu

1145 1150 1155

Leu Leu Met Glu Glu

1160

<210> 5

<211> 2259

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MP589FL的變體

<400> 5

atggaaggca acaacctgaa ccagtgcatt ccgtataact gcctgagcaa cccgaaagat 60

attattctgg gcgatgaacg tctggaaacc ggcaacaccg tggcggatat taccctgggc 120

attgtgaacc tgctgtttag cgaatttgtg ccgggcggcg gctttattct gggcctgctg 180

gatctgattt ggggcagcat tggccgtagc cagtgggatc tgtttctgga acagattgaa 240

cagctgatta aacagcgtat tgaagaattt gcgcgtaacc aggcgattag ccgtctggaa 300

ggcctgagcg atctgtataa aacctatgcg cgtgcgttta gcgattggga agcggatccg 360

accaacccgg cgctgcgtga agaaatgcgt attcagttta acgatatgaa cagcgcgatt 420

attaccgcgc tgccgctgtt tcgtgtgcag aactatgaag tggcgctgct gagcgtgtat 480

gtgcaggcgg cgaacctgca tctgagcatt ctgcgtgatg tgagcgtgtt tggcgaacgt 540

tggggctatg ataccgcgac cattaacaac cgttatagcg atctgaccag cctgattcat 600

gtgtatacca accattgcgt ggatacctat aaccagggcc tgcgtcgtct ggaaggccgt 660

tttctgaccg attggattgt gtataaccgt tttcgtcgtc agctgaccat tagcgtgctg 720

gatattgtgg cgttttttcc gaactatgat attcgtacct atccgattca gaccgcgacc 780

cagctgaccc gtgaagtgta tctggatctg ccgtttatta acgaaaacct gagcccggcg 840

gcgagctatc cgacctttag cgcggcggaa agcgcgatta ttcgtagccc gcatctggtg 900

gattttctga acagctttac catttatacc gatagcctgg cgcgttatgc gtattggggc 960

ggccatctgg tgaacagctt tcgtaccggc accaccacca acctgattcg tagcccgctg 1020

tatggccgtg aaggcaacac cgaacgtccg gtgaccatta ccgcgagccc gagcgtgccg 1080

atttttcgta ccctgagcta tattaccggc ctggataaca gcaacccggt ggcgggcatt 1140

gaaggcgtgg aatttcagaa caccattagc cgtagcattt atcgtaaaag cggcccgatt 1200

gatagcttta gcgaactgcc gccgcaggat gcgagcgtga gcccggcgat tggctatagc 1260

catcgtctgt gccatgcgac ctttctggaa cgtattagcg gcccgcgtat tgcgggcacc 1320

gtgtttagct ggacccatcg tagcgcgagc ccgaccaacg aagtgagccc gagccgtatt 1380

acccagattc cgtgggtgaa agcgcatacc ctggcgagcg gcgcgagcgt gattaaaggc 1440

ccgggcttta ccggcggcga tattctgacc cgtaacagca tgggcgaact gggcaccctg 1500

cgtgtgacct ttaccggccg tctgccgcag agctattata ttcgttttcg ttatgcgagc 1560

gtggcgaacc gtagcggcac ctttcgttat agccagccgc cgagctatgg cattagcttt 1620

ccgaaaacca tggatgcggg cgaaccgctg accagccgta gctttgcgca taccaccctg 1680

tttaccccga ttacctttag ccgtgcgcag gaagaatttg atctgtatat tcagagcggc 1740

gtgtatattg atcgtattga atttattccg gtgaccgcga cctttgaagc ggaatatgat 1800

ctggaacgtg cgcagaaagt ggtgaacgcg ctgtttacca gcaccaacca gctgggcctg 1860

aaaaccgatg tgaccgatta tcatattgat caggtgagca acctggtggc gtgcctgagc 1920

gatgaatttt gcctggatga aaaacgtgaa ctgagcgaaa aagtgaaaca tgcgaaacgt 1980

ctgagcgatg aacgtaacct gctgcaggat ccgaactttc gtggcattaa ccgtcagccg 2040

gatcgtggct ggcgtggcag caccgatatt accattcagg gcggcgatga tgtgtttaaa 2100

gaaaactatg tgaccctgcc gggcaccttt gatgaatgct atccgaccta tctgtatcag 2160

aaaattgatg aaagcaaact gaaagcgtat acccgttatc agctgcgtgg ctatattgaa 2220

gatagccagg atctggaaat ttatctgatt cgttataac 2259

<210> 6

<211> 753

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MP589FL的變體

<400> 6

Met Glu Gly Asn Asn Leu Asn Gln Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu Ser

1 5 10 15

Asn Pro Lys Asp Ile Ile Leu Gly Asp Glu Arg Leu Glu Thr Gly Asn

20 25 30

Thr Val Ala Asp Ile Thr Leu Gly Ile Val Asn Leu Leu Phe Ser Glu

35 40 45

Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Ile Leu Gly Leu Leu Asp Leu Ile Trp

50 55 60

Gly Ser Ile Gly Arg Ser Gln Trp Asp Leu Phe Leu Glu Gln Ile Glu

65 70 75 80

Gln Leu Ile Lys Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Ile

85 90 95

Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asp Leu Tyr Lys Thr Tyr Ala Arg Ala

100 105 110

Phe Ser Asp Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu Glu

115 120 125

Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Ile Ile Thr Ala Leu

130 135 140

Pro Leu Phe Arg Val Gln Asn Tyr Glu Val Ala Leu Leu Ser Val Tyr

145 150 155 160

Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Ile Leu Arg Asp Val Ser Val

165 170 175

Phe Gly Glu Arg Trp Gly Tyr Asp Thr Ala Thr Ile Asn Asn Arg Tyr

180 185 190

Ser Asp Leu Thr Ser Leu Ile His Val Tyr Thr Asn His Cys Val Asp

195 200 205

Thr Tyr Asn Gln Gly Leu Arg Arg Leu Glu Gly Arg Phe Leu Thr Asp

210 215 220

Trp Ile Val Tyr Asn Arg Phe Arg Arg Gln Leu Thr Ile Ser Val Leu

225 230 235 240

Asp Ile Val Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Ile Arg Thr Tyr Pro Ile

245 250 255

Gln Thr Ala Thr Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Leu Asp Leu Pro Phe

260 265 270

Ile Asn Glu Asn Leu Ser Pro Ala Ala Ser Tyr Pro Thr Phe Ser Ala

275 280 285

Ala Glu Ser Ala Ile Ile Arg Ser Pro His Leu Val Asp Phe Leu Asn

290 295 300

Ser Phe Thr Ile Tyr Thr Asp Ser Leu Ala Arg Tyr Ala Tyr Trp Gly

305 310 315 320

Gly His Leu Val Asn Ser Phe Arg Thr Gly Thr Thr Thr Asn Leu Ile

325 330 335

Arg Ser Pro Leu Tyr Gly Arg Glu Gly Asn Thr Glu Arg Pro Val Thr

340 345 350

Ile Thr Ala Ser Pro Ser Val Pro Ile Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Ile

355 360 365

Thr Gly Leu Asp Asn Ser Asn Pro Val Ala Gly Ile Glu Gly Val Glu

370 375 380

Phe Gln Asn Thr Ile Ser Arg Ser Ile Tyr Arg Lys Ser Gly Pro Ile

385 390 395 400

Asp Ser Phe Ser Glu Leu Pro Pro Gln Asp Ala Ser Val Ser Pro Ala

405 410 415

Ile Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His Ala Thr Phe Leu Glu Arg Ile

420 425 430

Ser Gly Pro Arg Ile Ala Gly Thr Val Phe Ser Trp Thr His Arg Ser

435 440 445

Ala Ser Pro Thr Asn Glu Val Ser Pro Ser Arg Ile Thr Gln Ile Pro

450 455 460

Trp Val Lys Ala His Thr Leu Ala Ser Gly Ala Ser Val Ile Lys Gly

465 470 475 480

Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Thr Arg Asn Ser Met Gly Glu

485 490 495

Leu Gly Thr Leu Arg Val Thr Phe Thr Gly Arg Leu Pro Gln Ser Tyr

500 505 510

Tyr Ile Arg Phe Arg Tyr Ala Ser Val Ala Asn Arg Ser Gly Thr Phe

515 520 525

Arg Tyr Ser Gln Pro Pro Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Pro Lys Thr Met

530 535 540

Asp Ala Gly Glu Pro Leu Thr Ser Arg Ser Phe Ala His Thr Thr Leu

545 550 555 560

Phe Thr Pro Ile Thr Phe Ser Arg Ala Gln Glu Glu Phe Asp Leu Tyr

565 570 575

Ile Gln Ser Gly Val Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Phe Ile Pro Val Thr

580 585 590

Ala Thr Phe Glu Ala Glu Tyr Asp Leu Glu Arg Ala Gln Lys Val Val

595 600 605

Asn Ala Leu Phe Thr Ser Thr Asn Gln Leu Gly Leu Lys Thr Asp Val

610 615 620

Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Ala Cys Leu Ser

625 630 635 640

Asp Glu Phe Cys Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Ser Glu Lys Val Lys

645 650 655

His Ala Lys Arg Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asn

660 665 670

Phe Arg Gly Ile Asn Arg Gln Pro Asp Arg Gly Trp Arg Gly Ser Thr

675 680 685

Asp Ile Thr Ile Gln Gly Gly Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val

690 695 700

Thr Leu Pro Gly Thr Phe Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln

705 710 715 720

Lys Ile Asp Glu Ser Lys Leu Lys Ala Tyr Thr Arg Tyr Gln Leu Arg

725 730 735

Gly Tyr Ile Glu Asp Ser Gln Asp Leu Glu Ile Tyr Leu Ile Arg Tyr

740 745 750

Asn

<210> 7

<211> 2259

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MP589FL的變體

<400> 7

atggaaggca acaacctgaa ccagtgcatt ccgtataact gcctgaccaa cccgaaagat 60

attattctgg gcgatgaacg tctggaaacc ggcaacaccg tggcggatat taccctgggc 120

attgtgaacc tgctgtttac cgaatttgtg ccgggcggcg gctttattct gggcctgctg 180

gatgtgattt ggggcagcat tggccgtagc cagtgggaac tgtttctgga acagattgaa 240

cagctgatta aacagcgtat tgaagaattt gcgcgtaacc aggcgattag ccgtctggaa 300

ggcctgagcg atctgtataa aacctatgcg cgtgcgttta gcgattggga agcggatccg 360

accaacccgg cgctgcgtga agaaatgcgt attcagttta acgatatgaa cagcgcgatt 420

attaccgcgc tgccgctgtt tcgtgtgcag aactatgaag tggcgctgct gagcgtgtat 480

gtgcaggcgg cgaacctgca tctgagcatt ctgcgtgatg tgagcgtgtt tggcgaacgt 540

tggggctatg ataccgcgac cattaacaac cgttatagcg atctgaccag cctgattcat 600

gtgtatacca accattgcgt ggatacctat aaccagggcc tgcgtcgtct ggaaggccgt 660

tttctgaccg attggattgt gtataaccgt tttcgtcgtc agctgaccat tagcgtgctg 720

gatattgtgg cgttttttcc gaactatgat attcgtacct atccgattca gaccgcgacc 780

cagctgaccc gtgaagtgta tctggatctg ccgtttatta acgaaaacct gagcccggcg 840

gcgagctatc cgacctttag cgcggcggaa agcgcgatta ttcgtagccc gcatctggtg 900

gattttctga acagctttac catttatacc gatagcctgg cgcgttatgc gtattggggc 960

ggccatctgg tgaacagctt tcgtaccggc accaccacca acctgattcg tagcccgctg 1020

tatggccgtg aaggcaacac cgaacgtccg gtgaccatta ccgcgagccc gagcgtgccg 1080

atttttcgta ccctgagcta tattaccggc ctggataaca gcaacccggt ggcgggcatt 1140

gaaggcgtgg aatttcagaa caccattagc cgtagcattt atcgtaaaag cggcccgatt 1200

gatagcttta gcgaactgcc gccgcaggat gcgagcgtga gcccggcgat tggctatagc 1260

catcgtctgt gccatgcgac ctttctggaa cgtattagcg gcccgcgtat tgcgggcacc 1320

gtgtttagct ggacccatcg tagcgcgagc ccgaccaacg aagtgagccc gagccgtatt 1380

acccagattc cgtgggtgaa agcgcatacc ctggcgagcg gcgcgagcgt gattaaaggc 1440

ccgggcttta ccggcggcga tattctgacc cgtaacagca tgggcgaact gggcaccctg 1500

cgtgtgagct ttaccggccg tctgccgcag agctattata ttcgttttcg ttatgcgagc 1560

gtggcgaacc gtaccggcac ctttcgttat agccagccgc cgagctatgg cctgagcttt 1620

ccgaaaacca tggatgcggg cgaaccgctg accagccgta gctttgcgca taccaccctg 1680

tttaccccga ttacctttag ccgtgcgcag gaagaatttg atctgtatat tcagagcggc 1740

gtgtatattg atcgtattga atttattccg gtgaccgcga cctttgaagc ggaatatgat 1800

ctggaacgtg cgcagaaagt ggtgaacgcg ctgtttacca gcaccaacca gctgggcctg 1860

aaaaccgatg tgaccgatta tcatattgat caggtgagca acctggtggc gtgcctgagc 1920

gatgaatttt gcctggatga aaaacgtgaa ctgagcgaaa aagtgaaaca tgcgaaacgt 1980

ctgagcgatg aacgtaacct gctgcaggat ccgaactttc gtggcattaa ccgtcagccg 2040

gatcgtggct ggcgtggcag caccgatatt accattcagg gcggcgatga tgtgtttaaa 2100

gaaaactatg tgaccctgcc gggcaccttt gatgaatgct atccgaccta tctgtatcag 2160

aaaattgatg aaagcaaact gaaagcgtat acccgttatc agctgcgtgg ctatattgaa 2220

gatagccagg atctggaaat ttatctgatt cgttataac 2259

<210> 8

<211> 753

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MP589FL的變體

<400> 8

Met Glu Gly Asn Asn Leu Asn Gln Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu Thr

1 5 10 15

Asn Pro Lys Asp Ile Ile Leu Gly Asp Glu Arg Leu Glu Thr Gly Asn

20 25 30

Thr Val Ala Asp Ile Thr Leu Gly Ile Val Asn Leu Leu Phe Thr Glu

35 40 45

Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Ile Leu Gly Leu Leu Asp Val Ile Trp

50 55 60

Gly Ser Ile Gly Arg Ser Gln Trp Glu Leu Phe Leu Glu Gln Ile Glu

65 70 75 80

Gln Leu Ile Lys Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Ile

85 90 95

Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asp Leu Tyr Lys Thr Tyr Ala Arg Ala

100 105 110

Phe Ser Asp Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu Glu

115 120 125

Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Ile Ile Thr Ala Leu

130 135 140

Pro Leu Phe Arg Val Gln Asn Tyr Glu Val Ala Leu Leu Ser Val Tyr

145 150 155 160

Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Ile Leu Arg Asp Val Ser Val

165 170 175

Phe Gly Glu Arg Trp Gly Tyr Asp Thr Ala Thr Ile Asn Asn Arg Tyr

180 185 190

Ser Asp Leu Thr Ser Leu Ile His Val Tyr Thr Asn His Cys Val Asp

195 200 205

Thr Tyr Asn Gln Gly Leu Arg Arg Leu Glu Gly Arg Phe Leu Thr Asp

210 215 220

Trp Ile Val Tyr Asn Arg Phe Arg Arg Gln Leu Thr Ile Ser Val Leu

225 230 235 240

Asp Ile Val Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Ile Arg Thr Tyr Pro Ile

245 250 255

Gln Thr Ala Thr Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Leu Asp Leu Pro Phe

260 265 270

Ile Asn Glu Asn Leu Ser Pro Ala Ala Ser Tyr Pro Thr Phe Ser Ala

275 280 285

Ala Glu Ser Ala Ile Ile Arg Ser Pro His Leu Val Asp Phe Leu Asn

290 295 300

Ser Phe Thr Ile Tyr Thr Asp Ser Leu Ala Arg Tyr Ala Tyr Trp Gly

305 310 315 320

Gly His Leu Val Asn Ser Phe Arg Thr Gly Thr Thr Thr Asn Leu Ile

325 330 335

Arg Ser Pro Leu Tyr Gly Arg Glu Gly Asn Thr Glu Arg Pro Val Thr

340 345 350

Ile Thr Ala Ser Pro Ser Val Pro Ile Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Ile

355 360 365

Thr Gly Leu Asp Asn Ser Asn Pro Val Ala Gly Ile Glu Gly Val Glu

370 375 380

Phe Gln Asn Thr Ile Ser Arg Ser Ile Tyr Arg Lys Ser Gly Pro Ile

385 390 395 400

Asp Ser Phe Ser Glu Leu Pro Pro Gln Asp Ala Ser Val Ser Pro Ala

405 410 415

Ile Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His Ala Thr Phe Leu Glu Arg Ile

420 425 430

Ser Gly Pro Arg Ile Ala Gly Thr Val Phe Ser Trp Thr His Arg Ser

435 440 445

Ala Ser Pro Thr Asn Glu Val Ser Pro Ser Arg Ile Thr Gln Ile Pro

450 455 460

Trp Val Lys Ala His Thr Leu Ala Ser Gly Ala Ser Val Ile Lys Gly

465 470 475 480

Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Thr Arg Asn Ser Met Gly Glu

485 490 495

Leu Gly Thr Leu Arg Val Ser Phe Thr Gly Arg Leu Pro Gln Ser Tyr

500 505 510

Tyr Ile Arg Phe Arg Tyr Ala Ser Val Ala Asn Arg Thr Gly Thr Phe

515 520 525

Arg Tyr Ser Gln Pro Pro Ser Tyr Gly Leu Ser Phe Pro Lys Thr Met

530 535 540

Asp Ala Gly Glu Pro Leu Thr Ser Arg Ser Phe Ala His Thr Thr Leu

545 550 555 560

Phe Thr Pro Ile Thr Phe Ser Arg Ala Gln Glu Glu Phe Asp Leu Tyr

565 570 575

Ile Gln Ser Gly Val Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Phe Ile Pro Val Thr

580 585 590

Ala Thr Phe Glu Ala Glu Tyr Asp Leu Glu Arg Ala Gln Lys Val Val

595 600 605

Asn Ala Leu Phe Thr Ser Thr Asn Gln Leu Gly Leu Lys Thr Asp Val

610 615 620

Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Ala Cys Leu Ser

625 630 635 640

Asp Glu Phe Cys Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Ser Glu Lys Val Lys

645 650 655

His Ala Lys Arg Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asn

660 665 670

Phe Arg Gly Ile Asn Arg Gln Pro Asp Arg Gly Trp Arg Gly Ser Thr

675 680 685

Asp Ile Thr Ile Gln Gly Gly Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val

690 695 700

Thr Leu Pro Gly Thr Phe Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln

705 710 715 720

Lys Ile Asp Glu Ser Lys Leu Lys Ala Tyr Thr Arg Tyr Gln Leu Arg

725 730 735

Gly Tyr Ile Glu Asp Ser Gln Asp Leu Glu Ile Tyr Leu Ile Arg Tyr

740 745 750

Asn

<210> 9

<211> 2259

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MP589FL的變體

<400> 9

atggaaggca acaacctgaa ccagtgcatt ccgtataact gcctgaccaa cccgaaagat 60

attattctgg gcgatgaacg tctggaaacc ggcaacaccg tggcggatat taccctgggc 120

attgtgaacc tgctgtttac cgaatttgtg ccgggcggcg gctttattct gggcctgctg 180

gatgtgattt ggggcagcat tggccgtagc cagtgggaac tgtttctgga acagattgaa 240

cagctgatta aacagcgtat tgatgatttt gcgcgtaacc aggcgattag ccgtctggaa 300

ggcctgagcg atctgtataa aacctatgcg cgtgcgttta gcgattggga agcggatccg 360

accaacccgg cgctgcgtga agaaatgcgt attcagttta acgatatgaa cagcgcgatt 420

attaccgcgc tgccgctgtt tcgtgtgcag aactatgaag tggcgctgct gagcgtgtat 480

gtgcaggcgg cgaacctgca tctgagcatt ctgcgtgatg tgagcgtgtt tggcgaacgt 540

tggggctatg ataccgcgac cattaacaac cgttatagcg atctgaccag cctgattcat 600

gtgtatacca accattgcgt ggatacctat aaccagggcc tgcgtcgtct ggaaggccgt 660

tttctgaccg attggattgt gtataaccgt tttcgtcgtc agctgaccat tagcgtgctg 720

gatattgtgg cgttttttcc gaactatgat attcgtacct atccgattca gaccgcgacc 780

cagctgaccc gtgaagtgta tctggatctg ccgtttatta acgaaaacct gagcccggcg 840

gcgagctatc cgacctttag cgcggcggaa agcgcgatta ttcgtagccc gcatctggtg 900

gattttatta acagctttac catttatacc gatagcctgg cgcgttatgc gtattggggc 960

ggccatctgg tgaacagctt tcgtaccggc accaccacca acctgattcg tagcccgctg 1020

tatggccgtg aaggcaacac cgaacgtccg gtgaccatta ccgcgagccc gagcgtgccg 1080

atttttcgta ccctgagcta tattaccggc ctggataaca gcaacccggt ggcgggcatt 1140

gaaggcgtgg aatttcagaa caccattagc cgtagcattt atcgtaaaag cggcccgatt 1200

gatagcttta gcgaactgcc gccgcaggat gcgagcgtga gcccggcgat tggctatagc 1260

catcgtctgt gccatgcgac ctttctggaa cgtattagcg gcccgcgtat tgcgggcacc 1320

gtgtttagct ggacccatcg tagcgcgagc ccgaccaacg aagtgagccc gagccgtatt 1380

acccagattc cgtgggtgaa agcgcatacc ctggcgagcg gcgcgagcgt gattaaaggc 1440

ccgggcttta ccggcggcga tattctgacc cgtaacagca tgggcgaact gggcaccctg 1500

cgtgtgagct ttaccggccg tctgccgcag agctattata ttcgttttcg ttatgcgagc 1560

gtggcgaacc gtaccggcac ctttcgttat agccagccgc cgagctatgg cctgagcttt 1620

ccgaaaacca tggatgcggg cgaaccgctg accagccgta gctttgcgca taccaccctg 1680

tttaccccga ttacctttag ccgtgcgcag gaagaatttg atctgtatat tcagagcggc 1740

gtgtatattg atcgtattga atttattccg gtgaccgcga cctttgaagc ggaatatgat 1800

ctggaacgtg cgcagaaagt ggtgaacgcg ctgtttacca gcaccaacca gctgggcctg 1860

aaaaccgatg tgaccgatta tcatattgat caggtgagca acctggtggc gtgcctgagc 1920

gatgaatttt gcctggatga aaaacgtgaa ctgagcgaaa aagtgaaaca tgcgaaacgt 1980

ctgagcgatg aacgtaacct gctgcaggat ccgaactttc gtggcattaa ccgtcagccg 2040

gatcgtggct ggcgtggcag caccgatatt accattcagg gcggcgatga tgtgtttaaa 2100

gaaaactatg tgaccctgcc gggcaccttt gatgaatgct atccgaccta tctgtatcag 2160

aaaattgatg aaagcaaact gaaagcgtat acccgttatc agctgcgtgg ctatattgaa 2220

gatagccagg atctggaaat ttatctgatt cgttataac 2259

<210> 10

<211> 753

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MP589FL的變體

<400> 10

Met Glu Gly Asn Asn Leu Asn Gln Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu Thr

1 5 10 15

Asn Pro Lys Asp Ile Ile Leu Gly Asp Glu Arg Leu Glu Thr Gly Asn

20 25 30

Thr Val Ala Asp Ile Thr Leu Gly Ile Val Asn Leu Leu Phe Thr Glu

35 40 45

Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Ile Leu Gly Leu Leu Asp Val Ile Trp

50 55 60

Gly Ser Ile Gly Arg Ser Gln Trp Glu Leu Phe Leu Glu Gln Ile Glu

65 70 75 80

Gln Leu Ile Lys Gln Arg Ile Asp Asp Phe Ala Arg Asn Gln Ala Ile

85 90 95

Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asp Leu Tyr Lys Thr Tyr Ala Arg Ala

100 105 110

Phe Ser Asp Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu Glu

115 120 125

Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Ile Ile Thr Ala Leu

130 135 140

Pro Leu Phe Arg Val Gln Asn Tyr Glu Val Ala Leu Leu Ser Val Tyr

145 150 155 160

Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Ile Leu Arg Asp Val Ser Val

165 170 175

Phe Gly Glu Arg Trp Gly Tyr Asp Thr Ala Thr Ile Asn Asn Arg Tyr

180 185 190

Ser Asp Leu Thr Ser Leu Ile His Val Tyr Thr Asn His Cys Val Asp

195 200 205

Thr Tyr Asn Gln Gly Leu Arg Arg Leu Glu Gly Arg Phe Leu Thr Asp

210 215 220

Trp Ile Val Tyr Asn Arg Phe Arg Arg Gln Leu Thr Ile Ser Val Leu

225 230 235 240

Asp Ile Val Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Ile Arg Thr Tyr Pro Ile

245 250 255

Gln Thr Ala Thr Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Leu Asp Leu Pro Phe

260 265 270

Ile Asn Glu Asn Leu Ser Pro Ala Ala Ser Tyr Pro Thr Phe Ser Ala

275 280 285

Ala Glu Ser Ala Ile Ile Arg Ser Pro His Leu Val Asp Phe Ile Asn

290 295 300

Ser Phe Thr Ile Tyr Thr Asp Ser Leu Ala Arg Tyr Ala Tyr Trp Gly

305 310 315 320

Gly His Leu Val Asn Ser Phe Arg Thr Gly Thr Thr Thr Asn Leu Ile

325 330 335

Arg Ser Pro Leu Tyr Gly Arg Glu Gly Asn Thr Glu Arg Pro Val Thr

340 345 350

Ile Thr Ala Ser Pro Ser Val Pro Ile Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Ile

355 360 365

Thr Gly Leu Asp Asn Ser Asn Pro Val Ala Gly Ile Glu Gly Val Glu

370 375 380

Phe Gln Asn Thr Ile Ser Arg Ser Ile Tyr Arg Lys Ser Gly Pro Ile

385 390 395 400

Asp Ser Phe Ser Glu Leu Pro Pro Gln Asp Ala Ser Val Ser Pro Ala

405 410 415

Ile Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His Ala Thr Phe Leu Glu Arg Ile

420 425 430

Ser Gly Pro Arg Ile Ala Gly Thr Val Phe Ser Trp Thr His Arg Ser

435 440 445

Ala Ser Pro Thr Asn Glu Val Ser Pro Ser Arg Ile Thr Gln Ile Pro

450 455 460

Trp Val Lys Ala His Thr Leu Ala Ser Gly Ala Ser Val Ile Lys Gly

465 470 475 480

Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Thr Arg Asn Ser Met Gly Glu

485 490 495

Leu Gly Thr Leu Arg Val Ser Phe Thr Gly Arg Leu Pro Gln Ser Tyr

500 505 510

Tyr Ile Arg Phe Arg Tyr Ala Ser Val Ala Asn Arg Thr Gly Thr Phe

515 520 525

Arg Tyr Ser Gln Pro Pro Ser Tyr Gly Leu Ser Phe Pro Lys Thr Met

530 535 540

Asp Ala Gly Glu Pro Leu Thr Ser Arg Ser Phe Ala His Thr Thr Leu

545 550 555 560

Phe Thr Pro Ile Thr Phe Ser Arg Ala Gln Glu Glu Phe Asp Leu Tyr

565 570 575

Ile Gln Ser Gly Val Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Phe Ile Pro Val Thr

580 585 590

Ala Thr Phe Glu Ala Glu Tyr Asp Leu Glu Arg Ala Gln Lys Val Val

595 600 605

Asn Ala Leu Phe Thr Ser Thr Asn Gln Leu Gly Leu Lys Thr Asp Val

610 615 620

Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Ala Cys Leu Ser

625 630 635 640

Asp Glu Phe Cys Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Ser Glu Lys Val Lys

645 650 655

His Ala Lys Arg Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asn

660 665 670

Phe Arg Gly Ile Asn Arg Gln Pro Asp Arg Gly Trp Arg Gly Ser Thr

675 680 685

Asp Ile Thr Ile Gln Gly Gly Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val

690 695 700

Thr Leu Pro Gly Thr Phe Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln

705 710 715 720

Lys Ile Asp Glu Ser Lys Leu Lys Ala Tyr Thr Arg Tyr Gln Leu Arg

725 730 735

Gly Tyr Ile Glu Asp Ser Gln Asp Leu Glu Ile Tyr Leu Ile Arg Tyr

740 745 750

Asn