本發(fā)明涉及一種親和色譜用載體。特別是涉及一種對于抗體等蛋白質(zhì)的純化有用的親和色譜用載體。

背景技術(shù)：

親和色譜用載體在包含單克隆抗體的蛋白質(zhì)的研究、開發(fā)和制造中起到重要的作用。親和色譜用載體一般而言包含具有與靶物質(zhì)選擇性地結(jié)合的配體的固相載體。親和色譜用載體由于固相載體上的配體對靶物質(zhì)具有高的選擇性，因此，與離子色譜、凝膠過濾色譜、反相液相色譜等其它色譜相比，能夠以優(yōu)異的收率且高速地進(jìn)行經(jīng)濟(jì)的純化。

通常，作為蛋白質(zhì)純化用的親和色譜所要求的性能，可以舉出：(1)不會非特異吸附靶蛋白質(zhì)以外的雜質(zhì)；(2)不會因長時間保管而使結(jié)合容量降低，保存穩(wěn)定性優(yōu)異；(3)柱操作上具有充分的機(jī)械強(qiáng)度等。

其中，作為親和色譜用載體的固相載體，提出了瓊脂糖粒子(專利文獻(xiàn)1、2)、由苯乙烯－二乙烯基苯的共聚物構(gòu)成的多孔粒子(專利文獻(xiàn)3、4)、由甲基丙烯酸酯系乙烯基單體的聚合物所成的多孔粒子(專利文獻(xiàn)5、6)。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：日本特表2008－523140號公報

專利文獻(xiàn)2：日本特表2009－522580號公報

專利文獻(xiàn)3：日本特開平08－278299號公報

專利文獻(xiàn)4：日本特表平10－501173號公報

專利文獻(xiàn)5：國際公開第2011/125674號公報

專利文獻(xiàn)6：日本特開2012－141212號公報

技術(shù)實現(xiàn)要素：

然而，瓊脂糖粒子通常彈性模量低，因此，具有以高速流動介質(zhì)時柱的壓力變高這樣缺點。另外，瓊脂糖粒子通常由天然海草經(jīng)過漫長、繁雜的工序而制造，因此，難以得到品質(zhì)一定的瓊脂糖。

另外，由苯乙烯－二乙烯基苯這樣的芳香族乙烯基單體的共聚物構(gòu)成的多孔粒子通常耐堿性優(yōu)異，但親水性低，因此，具有配體的活性低、對靶物質(zhì)的動態(tài)結(jié)合容量低這樣的缺點。

進(jìn)而，由甲基丙烯酸酯系乙烯基單體的聚合物構(gòu)成的多孔粒子雖然具有高的親水性和機(jī)械強(qiáng)度，但對于雜質(zhì)的除去性能期望進(jìn)一步的改善。

本發(fā)明所要解決的課題在于提供一種雜質(zhì)的非特異性吸附得到抑制、且因長期保存所致的動態(tài)結(jié)合容量的降低得到抑制的保存穩(wěn)定性優(yōu)異的親和色譜用載體。

因此，本發(fā)明人進(jìn)行了潛心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有含有分別包含特定量的來自含環(huán)氧基的單乙烯基單體的結(jié)構(gòu)單元和來自聚乙烯基單體的結(jié)構(gòu)單元的共聚物的固相載體、結(jié)合于所述固相載體的配體和開環(huán)環(huán)氧基的特定親和色譜用載體的靶物質(zhì)的動態(tài)結(jié)合容量高，而且雜質(zhì)的除去性能和保存穩(wěn)定性優(yōu)異，完成了本發(fā)明。

即，本發(fā)明提供＜1＞一種親和色譜用載體，包含固相載體、使環(huán)氧基開環(huán)而得到的開環(huán)環(huán)氧基和結(jié)合于所述固相載體的配體，所述固相載體含有包含(M－1)結(jié)構(gòu)單元和(M－2)結(jié)構(gòu)單元的共聚物，

(M－1)結(jié)構(gòu)單元是來自含環(huán)氧基的單乙烯基單體的結(jié)構(gòu)單元，相對于全部結(jié)構(gòu)單元為大于20質(zhì)量份且為99.5質(zhì)量份以下，

(M－2)結(jié)構(gòu)單元是來自聚乙烯基單體的結(jié)構(gòu)單元，相對于全部結(jié)構(gòu)單元為0.5～80質(zhì)量份，其中，

將所述親和色譜用載體填充于任意的柱容器，用含有2M的NaCl的pH7.5的20mM磷酸鈉緩沖液對柱進(jìn)行置換，在40℃下靜置7天時的柱內(nèi)的pH上升幅度為2以下。

另外，本發(fā)明提供＜2＞一種親和色譜柱，是將上述＜1＞的親和色譜用載體填充于柱容器而成的。

另外，本發(fā)明提供＜3＞一種靶物質(zhì)的純化方法，其特征在于，使用上述＜1＞的親和色譜用載體。

本發(fā)明的親和色譜用載體的表面上的環(huán)氧基殘留量減少，而且因開環(huán)環(huán)氧基而具備高的親水性。

因此，利用本發(fā)明的親和色譜用載體，能夠改善非特異性地吸附的雜質(zhì)、例如宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(HCP＝Host Cell Protein)、DNA的除去性能。

另外，由于能夠較高地保持配體的活性，因此，即使在將本發(fā)明的親和色譜用載體用于例如免疫球蛋白的純化之后進(jìn)一步長時間反復(fù)使用，免疫球蛋白等的動態(tài)結(jié)合容量也不易降低，能夠以低成本進(jìn)行免疫球蛋白的純化。

具體實施方式

以下，對本發(fā)明的親和色譜用載體詳細(xì)地進(jìn)行說明。

[親和色譜用載體]

＜固相載體的構(gòu)成＞

構(gòu)成本發(fā)明的親和色譜用載體的固相載體含有包含(M－1)和(M－2)的共聚物，

(M－1)是來自含環(huán)氧基的單乙烯基單體的結(jié)構(gòu)單元，相對于全部結(jié)構(gòu)單元為大于20質(zhì)量份且為99.5質(zhì)量份以下，

(M－2)是來自聚乙烯基單體的結(jié)構(gòu)單元，相對于全部結(jié)構(gòu)單元為0.5～80質(zhì)量份，

并且含有使環(huán)氧基開環(huán)而得到的開環(huán)環(huán)氧基。固相載體的形態(tài)可以為整體(monolith)、膜、中空纖維、粒子、盒(cassette)、片(chip)等中的任一種，但優(yōu)選粒子。另外，從提高表面積的觀點考慮，固相載體優(yōu)選多孔粒子等經(jīng)多孔化的載體。另外，作為多孔粒子，優(yōu)選多孔聚合物粒子。應(yīng)予說明，固相載體除上述共聚物以外，也可以含有天然高分子、合成高分子等。

((M－1)來自含環(huán)氧基的單乙烯基單體的結(jié)構(gòu)單元)

含環(huán)氧基的單乙烯基單體為1分子中具有1個聚合性乙烯基(具有乙烯性不飽和鍵的基團(tuán))和1個以上環(huán)氧基的單體。含環(huán)氧基的乙烯基單體能夠利用于將適當(dāng)量的環(huán)氧基導(dǎo)入固相載體中而得到適當(dāng)?shù)呐潴w結(jié)合量、開環(huán)環(huán)氧基量。

作為含環(huán)氧基的單乙烯基單體，例如可以舉出：(甲基)丙烯酸縮水甘油酯、(甲基)丙烯酸4－羥基丁酯縮水甘油醚、(甲基)丙烯酸3,4－環(huán)氧環(huán)己基甲酯、α－(甲基)丙烯基－ω－縮水甘油基聚乙二醇等不含羥基的(甲基)丙烯酸酯類；甘油單(甲基)丙烯酸酯縮水甘油醚等含羥基的(甲基)丙烯酸酯類；乙烯基芐基縮水甘油醚等芳香族單乙烯基化合物，此外，可以舉出：烯丙基縮水甘油醚、3,4－環(huán)氧－1－丁烯、3,4－環(huán)氧－3－甲基－1－丁烯等?？梢詥为毷褂眠@些中的1種，也可以組合使用2種以上。

其中，作為含環(huán)氧基的單乙烯基單體，從防污性、保存穩(wěn)定性等觀點考慮，優(yōu)選含環(huán)氧基的(甲基)丙烯酸酯類、含環(huán)氧基的芳香族單乙烯基化合物，更優(yōu)選含環(huán)氧基的(甲基)丙烯酸酯類，進(jìn)一步優(yōu)選(甲基)丙烯酸縮水甘油酯、(甲基)丙烯酸4－羥基丁酯縮水甘油醚，特別優(yōu)選(甲基)丙烯酸縮水甘油酯。應(yīng)予說明，通過正相懸浮聚合使固相載體為粒子狀時，作為含環(huán)氧基的單乙烯基單體，從開環(huán)環(huán)氧基量的控制容易的方面考慮，優(yōu)選水不溶性的含環(huán)氧基的單乙烯基單體。在此，水不溶性是指相對于水100mL在室溫(25℃)下不溶解10g以上。應(yīng)予說明，含環(huán)氧基的單乙烯基單體可以使用市售品，也可以依照公知的方法合成而使用。

來自含環(huán)氧基的單乙烯基單體的結(jié)構(gòu)單元的含量相對于全部結(jié)構(gòu)單元為大于20質(zhì)量份且為99.5質(zhì)量份以下。若該含量為20質(zhì)量份以下，則開環(huán)環(huán)氧基的量減少而配體結(jié)合后的親和色譜用載體的親水性變低，雜質(zhì)的除去性能變低。另一方面，若大于99.5質(zhì)量份，則機(jī)械強(qiáng)度變低，無法耐受作為親和色譜用載體的操作。

從防污性、保存穩(wěn)定性等觀點考慮，來自含環(huán)氧基的單乙烯基單體的結(jié)構(gòu)單元的含量相對于全部結(jié)構(gòu)單元，優(yōu)選為25質(zhì)量份以上，更優(yōu)選為30質(zhì)量份以上，進(jìn)一步優(yōu)選為40質(zhì)量份以上，特別優(yōu)選為50質(zhì)量份以上，另外，從防污性、保存穩(wěn)定性等觀點考慮，相對于全部結(jié)構(gòu)單元，優(yōu)選為95質(zhì)量份以下，更優(yōu)選為90質(zhì)量份以下，進(jìn)一步優(yōu)選為85質(zhì)量份以下，特別優(yōu)選為80質(zhì)量份以下。

((M－2)來自聚乙烯基單體的結(jié)構(gòu)單元)

聚乙烯基單體為1分子中具有2個以上聚合性乙烯基(具有乙烯性不飽和鍵的基團(tuán))的乙烯基單體。以下，將該聚乙烯基單體分成不含羥基的聚乙烯基單體和含羥基的聚乙烯基單體進(jìn)行說明。應(yīng)予說明，聚乙烯基單體可以單獨使用1種或組合使用2種以上。

作為不含羥基的聚乙烯基單體，例如可以舉出：乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、二乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、三乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、四乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、二丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、三丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、四丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、1,4－丁二醇二(甲基)丙烯酸酯、1,6－己二醇二(甲基)丙烯酸酯、三羥甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇四(甲基)丙烯酸酯等(甲基)丙烯酸酯類；二乙烯基苯、三乙烯基苯等芳香族聚乙烯基化合物；丁二烯、異氰脲酸二烯丙酯、異氰脲酸三烯丙酯等烯丙基化合物等，可以單獨使用1種或組合使用2種以上。其中，作為不含羥基的聚乙烯基單體，優(yōu)選(甲基)丙烯酸酯類、芳香族聚乙烯基化合物。

另外，作為上述不含羥基的聚乙烯基單體中所含的聚合性乙烯基的個數(shù)，在1分子中優(yōu)選2～5個，更優(yōu)選2或3個。

作為含羥基的聚乙烯基單體，優(yōu)選多元醇的(甲基)丙烯酸酯類、各種糖類的2取代以上的(甲基)丙烯酸酯類、多元醇的(甲基)丙烯酰胺類。

作為多元醇的(甲基)丙烯酸酯類，可以舉出：甘油二(甲基)丙烯酸酯、三羥甲基乙烷二(甲基)丙烯酸酯、三羥甲基丙烷二(甲基)丙烯酸酯、丁三醇二(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇二(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇三(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇二(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇三(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇四(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇五(甲基)丙烯酸酯、肌醇二(甲基)丙烯酸酯、肌醇三(甲基)丙烯酸酯、肌醇四(甲基)丙烯酸酯等。

作為各種糖類的2取代以上的(甲基)丙烯酸酯類，例如可以舉出：葡萄糖二(甲基)丙烯酸酯、葡萄糖三(甲基)丙烯酸酯、葡萄糖四(甲基)丙烯酸酯、甘露糖醇二(甲基)丙烯酸酯、甘露糖醇三(甲基)丙烯酸酯、甘露糖醇四(甲基)丙烯酸酯、甘露糖醇五(甲基)丙烯酸酯等。

進(jìn)而，作為含羥基的聚乙烯基單體，除上述例示的含羥基的聚乙烯基單體以外，還可以舉出：二氨基丙醇、三羥基甲基氨基甲烷、葡萄糖胺等氨基醇與(甲基)丙烯酸的脫水縮合反應(yīng)物等。

另外，作為上述含羥基的聚乙烯基單體中所含的聚合性乙烯基的個數(shù)，在1分子中，優(yōu)選2～5個，更優(yōu)選2或3個。

其中，作為聚乙烯基單體，從較少量使用即可得到良好的多孔性和機(jī)械強(qiáng)度，對含環(huán)氧基的單乙烯基單體的使用量的限制少等觀點考慮，優(yōu)選不含羥基的聚乙烯基單體。不含羥基的聚乙烯基單體中，從防污性、保存穩(wěn)定性等觀點考慮，特別優(yōu)選聚合性乙烯基的個數(shù)為3個的(甲基)丙烯酸酯類、聚合性乙烯基的個數(shù)為2或3個的芳香族聚乙烯基化合物。作為特別適合的具體例，可以舉出：三羥甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯、二乙烯基苯、三乙烯基苯。

來自聚乙烯基單體的結(jié)構(gòu)單元的含量相對于全部結(jié)構(gòu)單為0.5～80質(zhì)量份。若來自聚乙烯基單體的結(jié)構(gòu)單元的含量小于0.5質(zhì)量份，則固相載體的機(jī)械強(qiáng)度變低，無法耐受作為親和色譜用載體的操作。另外，若大于80質(zhì)量份，則親水性降低，得不到HCP的減少效果，另外，配體的活性降低。

從防污性、保存穩(wěn)定性等觀點考慮，來自聚乙烯基單體的結(jié)構(gòu)單元的含量相對于全部結(jié)構(gòu)單元，優(yōu)選為5質(zhì)量份以上，更優(yōu)選為10質(zhì)量份以上，進(jìn)一步優(yōu)選為15質(zhì)量份以上，進(jìn)一步優(yōu)選為20質(zhì)量份以上，特別優(yōu)選為25質(zhì)量份以上，另外，從防污性、保存穩(wěn)定性等觀點考慮，相對于全部結(jié)構(gòu)單元，優(yōu)選為70質(zhì)量份以下，更優(yōu)選為65質(zhì)量份以下，進(jìn)一步優(yōu)選為60質(zhì)量份以下，進(jìn)一步優(yōu)選為50質(zhì)量份以下，特別優(yōu)選為40質(zhì)量份以下。

((M－3)來自不含環(huán)氧基的單乙烯基單體的結(jié)構(gòu)單元)

作為本發(fā)明中使用的固相載體中所含的共聚物，優(yōu)選除上述結(jié)構(gòu)單元(M－1)和結(jié)構(gòu)單元(M－2)以外還進(jìn)一步含有(M－3)來自不含環(huán)氧基的單乙烯基單體的結(jié)構(gòu)單元：相對于全部結(jié)構(gòu)單元為40質(zhì)量份以下的共聚物。

不含環(huán)氧基的單乙烯基單體為1分子中具有1個聚合性乙烯基(具有乙烯性不飽和鍵的基團(tuán))且不含環(huán)氧基的乙烯基單體。以下，將不含環(huán)氧基的單乙烯基單體分成不含環(huán)氧基的不含羥基的單乙烯基單體、不含環(huán)氧基的含羥基的單乙烯基單體進(jìn)行說明。

作為不含環(huán)氧基的不含羥基的單乙烯基單體，從防止純化時的雜質(zhì)的非特異性吸附的觀點考慮，優(yōu)選非離子性單體。作為這樣的非離子性單體，例如可以舉出：(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸環(huán)己酯、(甲基)丙烯酸甲氧基乙酯等(甲基)丙烯酸酯類；(甲基)丙烯酰胺、二甲基(甲基)丙烯酰胺、(甲基)丙烯?；鶈徇⒍?甲基)丙烯酰胺等(甲基)丙烯酰胺類，可以單獨使用1種或組合使用2種以上。應(yīng)予說明，作為非離子性單體，也可以使用(甲基)丙烯酸2－乙基己酯、(甲基)丙烯酸硬脂酯這樣的疏水性(甲基)丙烯酸酯類；苯乙烯、α－甲基苯乙烯、乙基乙烯基苯這樣的芳香族乙烯基化合物，但從抑制純化時的雜質(zhì)的非特異吸附的觀點考慮，優(yōu)選不為這樣的單體而為上述例示的單體中具有碳原子數(shù)5以下的烷基或烷氧基烷基這樣的(甲基)丙烯酸烷酯類或上述的(甲基)丙烯酰胺類。

作為不含環(huán)氧基的含羥基的單乙烯基單體，例如可以舉出：丙三醇單(甲基)丙烯酸酯、三羥甲基乙烷單(甲基)丙烯酸酯、三羥甲基丙烷單(甲基)丙烯酸酯、丁三醇單(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇單(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇單(甲基)丙烯酸酯、肌醇單(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸羥基乙酯、(甲基)丙烯酸羥基丙酯、聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯等(甲基)丙烯酸酯類；羥基乙基(甲基)丙烯酰胺等(甲基)丙烯酰胺類等，可以單獨使用1種或組合使用2種以上。

另外，作為不含環(huán)氧基的含羥基的單乙烯基單體中所含的羥基的個數(shù)，在1分子中，優(yōu)選1～5個，更優(yōu)選1～3個。

其中，作為不含環(huán)氧基的單乙烯基單體，從防污性等觀點考慮，優(yōu)選不含環(huán)氧基的含羥基的單乙烯基單體，更優(yōu)選丙三醇單(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸羥基乙酯、(甲基)丙烯酸羥基丙酯、羥基乙基(甲基)丙烯酰胺，進(jìn)一步優(yōu)選丙三醇單(甲基)丙烯酸酯、羥基乙基(甲基)丙烯酰胺，特別優(yōu)選羥基乙基(甲基)丙烯酰胺。

來自不含環(huán)氧基的單乙烯基單體的結(jié)構(gòu)單元的含量相對于全部結(jié)構(gòu)單元，優(yōu)選40質(zhì)量份以下。通過使該含量為40質(zhì)量份以下，在含羥基的單乙烯基單體的情況下，多孔粒子的親水性提高，凝聚得到抑制，配體的變高，靶物質(zhì)的動態(tài)結(jié)合量得到改善。另外，機(jī)械強(qiáng)度也得到改善。作為上述結(jié)構(gòu)單元的含量，相對于全部結(jié)構(gòu)單元，更優(yōu)選為35質(zhì)量份以下，進(jìn)一步優(yōu)選為30質(zhì)量份以下，進(jìn)一步優(yōu)選為25質(zhì)量份以下，特別優(yōu)選為20質(zhì)量份以下。另外，來自不含環(huán)氧基的單乙烯基單體的結(jié)構(gòu)單元的含量也可以為0質(zhì)量份。含有該結(jié)構(gòu)單為時，相對于全部結(jié)構(gòu)單元，優(yōu)選5質(zhì)量份以上。

上述結(jié)構(gòu)單元(M－1)～(M－3)的含量的優(yōu)選的組合為結(jié)構(gòu)單元(M－1)：相對于全部結(jié)構(gòu)單元為40～90質(zhì)量份，結(jié)構(gòu)單元(M－2)：相對于全部結(jié)構(gòu)單元為10～60質(zhì)量份，結(jié)構(gòu)單元(M－3)：相對于全部結(jié)構(gòu)單元為0～25質(zhì)量份，更優(yōu)選的組合為結(jié)構(gòu)單元(M－1)：相對于全部結(jié)構(gòu)單元為40～80質(zhì)量份，結(jié)構(gòu)單元(M－2)：相對于全部結(jié)構(gòu)單元為15～60質(zhì)量份，結(jié)構(gòu)單元(M－3)：相對于全部結(jié)構(gòu)單元為0～25質(zhì)量份，特別優(yōu)選的組合為結(jié)構(gòu)單元(M－1)：相對于全部結(jié)構(gòu)單元為40～80質(zhì)量份，結(jié)構(gòu)單元(M－2)：相對于全部結(jié)構(gòu)單元為20～60質(zhì)量份，結(jié)構(gòu)單元(M－3)：相對于全部結(jié)構(gòu)單元為0～20質(zhì)量份。

(環(huán)氧基含量)

配體結(jié)合前的固相載體中所含的環(huán)氧基為用于結(jié)合配體的官能團(tuán)，另外，進(jìn)一步在開環(huán)后成為作為親和色譜用載體的親水性提高的基礎(chǔ)的官能團(tuán)。配體結(jié)合前的固相載體的環(huán)氧基含量優(yōu)選為1～6mmol/g，更優(yōu)選為2～5mmol/g，特別優(yōu)選為2.5～4mmol/g。若配體結(jié)合前的固相載體的環(huán)氧基含量為1mmol/g以上，則配體結(jié)合后得到的開環(huán)環(huán)氧基的量為適當(dāng)量，靶物質(zhì)以外的雜質(zhì)的除去性能提高。若配體結(jié)合前的固相載體的環(huán)氧基含量為6mmol/g以下，則配體結(jié)合后的環(huán)氧基的殘留量減少，作為親和色譜用載體保存時的配體的活性的降低得到抑制，反復(fù)使用時的靶物質(zhì)的動態(tài)結(jié)合容量的降低也得到抑制。

配體結(jié)合前的固相載體的環(huán)氧基含量可以通過含環(huán)氧基的單乙烯基單體的量、聚合溫度、聚合時間、聚合液的pH以及聚合后的開環(huán)處理等進(jìn)行調(diào)整。

＜固相載體的制造＞

舉出固相載體為多孔粒子的情況為例對固相單體的制造法進(jìn)行說明。

多孔粒子可以通過公知的晶種聚合、懸浮聚合等來制造。作為晶種聚合法，可以舉出：日本特公昭57－24369號公報記載的二步溶脹聚合法。聚合時，除上述單體以外，可以根據(jù)需要使用聚合引發(fā)劑、多孔化劑、水系介質(zhì)、分散穩(wěn)定劑、表面活性劑、聚合調(diào)整劑、聚合抑制劑、晶種粒子等。

多孔粒子的制造中的優(yōu)選的聚合法為以單體混合物、多孔化劑為必需成分的水系混合物的懸浮聚合法。

另外，作為懸浮聚合的具體方法，例如可以舉出：將聚合引發(fā)劑溶解于含有單體混合物和多孔化劑的混合溶液(單體溶液)中，使其懸浮于水系介質(zhì)并加熱至規(guī)定溫度使其聚合的方法、將聚合引發(fā)劑溶解于含有單體混合物和多孔化劑的混合溶液(單體溶液)中，添加于加熱至規(guī)定溫度的水系介質(zhì)中使其聚合的方法、使含有單體混合物和多孔化劑的混合溶液(單體溶液)懸浮于水系介質(zhì)中并加熱至規(guī)定溫度，添加聚合引發(fā)劑使其聚合的方法等。

作為聚合引發(fā)劑，優(yōu)選自由基聚合引發(fā)劑。作為自由基聚合引發(fā)劑，例如可以舉出：偶氮系引發(fā)劑、過氧化物系引發(fā)劑、氧化還原系引發(fā)劑等，具體而言，可以舉出：偶氮雙異丁腈、偶氮雙異丁酸甲酯、偶氮雙－2,4－二甲基戊腈、過氧化苯甲酰、過氧化二叔丁基、過氧化苯甲酰－二甲基苯胺等。聚合引發(fā)劑的合計使用量通常相對于單體總量100質(zhì)量份為0.01～10質(zhì)量份左右。

上述多孔化劑為了制造多孔粒子而使用，在油滴內(nèi)的聚合中，與單體一同存在，作為非聚成分具有形成孔的作用。多孔化劑只要是在多孔表面能夠容易地除去的物質(zhì)就沒有特別限制，例如可以舉出：可溶于各種有機(jī)溶劑、單體混合物的線狀聚合物等，也可以將它們并用。

作為上述多孔化劑，例如可以舉出：己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷等脂肪族烴類；環(huán)己烷、環(huán)戊烷等脂環(huán)式烴類；苯、甲苯、二甲苯、萘、乙基苯等芳香族烴類；四氯化碳、1,2－二氯乙烷、四氯乙烷、氯苯等鹵化烴類；丁醇、戊醇、己醇、庚醇、己醇、4－甲基－2－戊醇、2－乙基－1－己醇等脂肪族醇類；環(huán)己醇等脂環(huán)式醇類；2－苯基乙基醇、芐基醇等芳香族醇類；二乙基酮、甲基異丁基酮、二異丁基酮、苯乙酮、2－辛酮、環(huán)己酮等酮類；二丁基醚、二異丁基醚、苯甲醚、乙氧基苯等醚類；乙酸異戊酯、乙酸丁酯、乙酸－3－甲氧基丁酯、丙二酸二乙酯等酯類以及非交聯(lián)性乙烯基單體的均聚物等線狀聚合物。多孔化劑可以單獨使用或混合使用2種以上。

上述多孔化劑的合計使用量通常相對于單體總量100質(zhì)量份為40～400質(zhì)量份左右。

作為上述水系介質(zhì)，可以舉出例如水溶性高分子水溶液等，作為水溶性高分子，例如可以舉出：羥乙基纖維素、聚乙烯醇、羧甲基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮、淀粉、明膠等。水系介質(zhì)的合計使用量相對于單體總量100質(zhì)量份，通常為200～7000質(zhì)量份左右。

另外，使用水作為水系介質(zhì)的分散介質(zhì)時，也可以使用例如氯化鈉、硫酸鈉、碳酸鈉、碳酸鈣、磷酸鈣等分散穩(wěn)定劑。

另外，也可以使用以烷基硫酸酯鹽、烷基芳基硫酸酯鹽、烷基磷酸酯鹽、脂肪酸鹽等陰離子性表面活性劑為代表的各種表面活性劑。

另外，也可以使用亞硝酸鈉等亞硝酸鹽、碘化鉀等碘化物鹽、叔丁基兒茶酚、苯醌、苦味酸、氫醌、氯化銅、氯化鐵等聚合抑制劑。

另外，也可以使用十二烷基硫醇等聚合調(diào)整劑。

另外，聚合溫度只要根據(jù)聚合引發(fā)劑決定即可，例如使用偶氮雙異丁腈作為聚合引發(fā)劑時，優(yōu)選50～100℃，更優(yōu)選60～90℃。

另外，聚合時間通常為5分鐘～48小時，優(yōu)選為10分鐘～24小時。

聚合結(jié)束后，為了除去附著于得到的多孔粒子上的水溶性高分子等，優(yōu)選使用水和/或熱水進(jìn)行清洗。

另外，從后述的配體的結(jié)合容易的觀點考慮，優(yōu)選使用晶種粒子或/或多孔化劑的良溶劑進(jìn)行清洗。作為清洗溶劑，可以優(yōu)選使用丙酮、乙醇、異丙醇等。另外，也可以根據(jù)需要在清洗前后，使用超聲波分散機(jī)等分散多孔粒子。進(jìn)而，從壓力特性的提高、靶物質(zhì)等的動態(tài)結(jié)合容量的提高方面考慮，優(yōu)選通過傾析、過濾、篩分級等方法來除去小粒子、粗大粒子，。

＜親和色譜用載體的上述以外的構(gòu)成＞

(開環(huán)環(huán)氧基)

本發(fā)明的親和色譜用載體具有使環(huán)氧基開環(huán)而得到的開環(huán)環(huán)氧基。該開環(huán)環(huán)氧基可以在將配體結(jié)合于含有上述共聚物的固相載體后，使該共聚物中所含的環(huán)氧基，即與配體結(jié)合的環(huán)氧基以外的剩余環(huán)氧基開環(huán)而得到。環(huán)氧基除上述共聚物中所含的環(huán)氧基以外，也包含利用表氯醇、二縮水甘油醚化合物等在之后導(dǎo)入的環(huán)氧基，不論在本發(fā)明的親和色譜用載體的制造中的哪一階段導(dǎo)入。

而且，本發(fā)明的親和色譜用載體系使固相載體表面的大部分環(huán)氧基開環(huán)，使親和色譜用載體與高濃度的氯化物離子接觸，使剩余的環(huán)氧基開環(huán)時放出的氫氧化物離子的量明顯少。

因此，對于本發(fā)明的親和色譜用載體，將親和色譜用載體填充于任意的柱容器中，用含有2M的NaCl的pH7.5的20mM磷酸鈉緩沖液對柱進(jìn)行置換，在40℃下靜置7天時的柱內(nèi)的pH上升幅度為2以下。通過該構(gòu)成，雜質(zhì)的除去性能和保存穩(wěn)定性優(yōu)異。上述pH上升幅度優(yōu)選為1.9以下，進(jìn)一步改善雜質(zhì)的除去性能時，更優(yōu)選1.7以下。另外，pH上升幅度的下限值沒有特別限制，例如為0.01。

上述pH上升幅度具體而言可以由以下的式子求出，更詳細(xì)而言，可以通過實施例中記載的方法來測定。另外，本發(fā)明中，pH上升幅度的測定對新的親和色譜用載體進(jìn)行。新的親和色譜用載體是指以前未使用的狀態(tài)的載體，例如若使用于抗體純化，則是指使用于抗體純化之前的狀態(tài)的記載。

(pH上升幅度)＝(負(fù)荷pH)－(初期pH)

上述式中“初期pH”是指使含有2M的NaCl的pH7.5的20mM磷酸鈉緩沖液通入柱中，柱內(nèi)的pH達(dá)到平衡時的pH的值。

上述式中“負(fù)荷pH”是指測定初期pH后在40℃的恒溫器內(nèi)靜置7天后，使含有2M的NaCl的pH7.5的20mM磷酸鈉緩沖液再次通入柱中，pH變得最高時的pH的值。

另外，作為環(huán)氧基開環(huán)而生成的開環(huán)環(huán)氧基，從防止雜質(zhì)的非特異吸附，并且防止在保存中配體的活性降低的觀點考慮，優(yōu)選下述式(1)所示的基團(tuán)。

[式(1)中，

R¹表示碳原子數(shù)1～6的2價的有機(jī)基團(tuán)，

R²表示氫原子或碳原子數(shù)1～10的1價的有機(jī)基團(tuán)，

X表示硫基(＞S)、亞硫酰基(＞S＝O)、磺?；?＞S(＝O)₂)、亞氨基(＞NH)或氧基(＞O)，

*表示鍵合位置]。

R¹表示碳原子數(shù)1～6的2價的有機(jī)基團(tuán)。作為該有機(jī)基團(tuán)的碳原子數(shù)，優(yōu)選為1～4，更優(yōu)選為1或2。

另外，上述2價的有機(jī)基團(tuán)可以為直鏈狀，也可以為支鏈狀。另外，作為該2價的有機(jī)基團(tuán)，可以舉出：2價的烴基、在2價的烴基的碳－碳原子間具有選自醚鍵、亞氨基和酯鍵中的1種以上的基團(tuán)，優(yōu)選2價的烴基。

上述2價的烴基優(yōu)選為2價的脂肪族烴基，更優(yōu)選為烷烴二基。

作為烷烴二基的具體例，可以舉出：甲烷－1,1－二基、乙烷－1,1－二基、乙烷－1,2－二基、丙烷－1,1－二基、丙烷－1,2－二基、丙烷－1,3－二基、丙烷－2,2－二基、丁烷－1,4－二基、戊烷－1,5－二基、己烷－1,6－二基等。

R²表示氫原子或碳原子數(shù)1～10的1價的有機(jī)基團(tuán)，優(yōu)選碳原子數(shù)1～10的1價的有機(jī)基團(tuán)。作為該有機(jī)基團(tuán)，從使配體結(jié)合時的動態(tài)結(jié)合容量、防污性的觀點考慮，優(yōu)選下述式(2)或(3)所示的有機(jī)基團(tuán)，更優(yōu)選式(2)所示的有機(jī)基團(tuán)。

[式(2)中，

R³表示碳原子數(shù)1～10的2價或3價的有機(jī)基團(tuán)，

n表示1或2，

**表示與式(1)中的X的鍵合位置]。

[式(3)中，

R⁴表示碳原子數(shù)1～10的2價或3價的有機(jī)基團(tuán)，

Y表示酸性基團(tuán)或氨基，

m表示1或2，

**表示與式(1)中的X的鍵合位置]。

作為式(2)中的R³、式(3)中的R⁴所示的2價或3價的有機(jī)基團(tuán)的碳原子數(shù)，從使配體結(jié)合時的動態(tài)結(jié)合容量等觀點考慮，優(yōu)選1～8，更優(yōu)選1～6，進(jìn)一步優(yōu)選2～4。

另外，作為上述2價的有機(jī)基團(tuán)，可以舉出2價的烴基，可以為直鏈狀，也可以為支鏈狀。上述2價的烴基優(yōu)選為2價的脂肪族烴基，更優(yōu)選為烷烴二基。作為該烷烴二基的碳原子數(shù)，從使配體結(jié)合時的動態(tài)結(jié)合容量等觀點考慮，優(yōu)選1～8，更優(yōu)選1～6，進(jìn)一步優(yōu)選2～4。

作為上述烷二基的具體例，可以舉出：甲烷－1,1－二基、乙烷－1,1－二基、乙烷－1,2－二基、丙烷－1,1－二基、丙烷－1,2－二基、丙烷－1,3－二基、丙烷－2,2－二基等。

另外，作為上述3價的有機(jī)基團(tuán)，可以舉出3價的烴基，可以為直鏈狀，也可以為支鏈狀。上述3價的烴基優(yōu)選為3價的脂肪族烴基，更優(yōu)選為烷烴三基。作為該烷烴三基的碳原子數(shù)，從使配體結(jié)合時的動態(tài)結(jié)合容量、防污性的觀點考慮，優(yōu)選1～8，更優(yōu)選1～6，進(jìn)一步優(yōu)選2～4。

作為上述烷烴三基的具體例，可以舉出：甲烷－1,1,1－三基、乙烷－1,1,2－三基、丙烷－1,2,3－三基、丙烷－1,2,2－三基等。

式(2)中，n表示1或2，優(yōu)選2。

式(3)中，Y表示酸性基團(tuán)或氨基，但優(yōu)選酸性基團(tuán)。作為酸性基團(tuán)，可以舉出：羧基、磷酸基、磺基、它們的鹽等。應(yīng)予說明，作為鹽，可以舉出：鈉鹽、鉀鹽等堿金屬鹽；鎂鹽、鈣鹽等堿土金屬鹽；銨鹽；有機(jī)銨鹽等。

式(3)中，m表示1或2，優(yōu)選1。

X表示硫基(＞S)、亞硫?；?＞S＝O)、磺?；?＞S(＝O)₂)、亞氨基(＞NH)或氧基(＞O)，但優(yōu)選硫基(＞S)、亞硫?；?＞S＝O)、氧基(＞O)，更優(yōu)選硫基(＞S)、亞硫?；?＞S＝O)，特別優(yōu)選亞硫?；?＞S＝O)。

作為固相載體中的環(huán)氧基的開環(huán)方法，例如可以舉出在水溶劑中，在酸或堿存在下攪拌的方法。攪拌可以加熱而進(jìn)行，也可以在室溫下進(jìn)行。

另外，也可以使用巰基乙醇、硫代丙三醇、巰基乙酸、其鹽、巰基琥珀酸、其鹽、巰基乙磺酸、其鹽、巰基丙磺酸、其鹽等具有親水性基團(tuán)的巰基化合物；單乙醇胺、葡萄糖胺等具有親水性基團(tuán)的胺化合物；二乙二醇、甘油等多元醇類作為使環(huán)氧基開環(huán)的封閉劑(blocking agent)。應(yīng)予說明，作為在此所謂的親水性基團(tuán)，可以舉出：羥基；氨基；羧基、磷酸基、磺基、它們的鹽等酸性基團(tuán)等。作為鹽，可以舉出：鈉鹽、鉀鹽等堿金屬鹽；鎂鹽、鈣鹽等堿土金屬鹽；銨鹽；有機(jī)銨鹽等。

上述酸、堿、封閉劑的使用量相對于剩余的環(huán)氧基1摩爾，通常為0.1～40摩爾當(dāng)量。剩余的環(huán)氧基與配體多點結(jié)合，因此，在保存中使配體的活性降低，因此，優(yōu)選以2～40摩爾當(dāng)量的過量進(jìn)行封閉。

另外，開環(huán)反應(yīng)的反應(yīng)時間沒有特別限制，但通常為0.5～72小時左右，優(yōu)選為1～48小時。又，反應(yīng)溫度只要在溶劑的沸點以下適當(dāng)選擇即可，但通常為2～100℃左右。

另外，也可以根據(jù)需要在堿性催化劑存在下進(jìn)行封閉。作為該堿性催化劑，可以舉出：三乙胺、N,N－二甲基－4－氨基吡啶、二異丙基乙胺等，可以單獨使用1種或組合使用2種以上。

優(yōu)選的開環(huán)環(huán)氧基為利用巰基化合物和/或多元醇類使固相載體中所含的環(huán)氧基開環(huán)而得到的開環(huán)環(huán)氧基，具有非特異吸附比利用具有氨基的封閉劑得到的開環(huán)基團(tuán)少、并且動態(tài)結(jié)合量變高這樣的優(yōu)點。

另外，使用巰基化合物作為封閉劑時，可以使用氧化劑使硫基氧化成亞硫?；?，進(jìn)一步提高親水性。

上述氧化劑大致分成有機(jī)氧化劑和無機(jī)氧化劑，作為有機(jī)氧化劑，例如可以舉出：過乙酸、過苯甲酸、偏氯過苯甲酸等。另一方面，作為無機(jī)氧化劑，例如可以舉出：過氧化氫、鉻酸、高錳酸鹽等。應(yīng)予說明，這些氧化劑可以單獨使用1種或組合使用2種以上。

另外，氧化劑的合計使用量相對于硫基1摩爾，通常為0.1～10摩爾當(dāng)量左右，優(yōu)選為0.5～3摩爾當(dāng)量。

另外，上述氧化反應(yīng)優(yōu)選在溶劑存在下進(jìn)行。作為該溶劑，可以舉出：水；二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺等酰胺系溶劑；甲醇、乙醇等醇系溶劑等，這些溶劑可以單獨使用1種或組合使用2種以上。

上述溶劑的合計使用量相對于原料的固相載體，通常為1～50質(zhì)量倍左右，優(yōu)選為5～15質(zhì)量倍左右。

另外，上述氧化反應(yīng)的反應(yīng)時間沒有特別限制，通常為1～72小時左右，反應(yīng)溫度只要在溶劑的沸點以下適當(dāng)選擇即可，但通常為1～90℃左右。

(配體)

本發(fā)明的親和色譜用載體包含結(jié)合于固相載體的配體。

配體只要是對靶物質(zhì)具有適度的親和性即可，其種類沒有特別限定，例如可以使用蛋白A、蛋白G、蛋白F、Fc結(jié)合蛋白、抗生物素蛋白等蛋白質(zhì)；胰島素等肽；單克隆抗體等抗體；酶；激素；DNA；RNA；肝素、路易斯X(Lewis X)、神經(jīng)節(jié)糖苷等糖質(zhì)；亞氨基二乙酸、合成色素、2－氨基苯基硼酸、4－氨基苯甲脒、谷胱甘肽、生物素、其衍生物這樣的低分子化合物。上述例示的配體可以使用其整體，也可以使用通過重組、酶處理等而得到的片段。另外，也可以為人工合成的肽、肽衍生物。

上述配體中，作為免疫球蛋白的分離或純化中優(yōu)選的配體，可以舉出：免疫球蛋白結(jié)合性蛋白質(zhì)。

作為免疫球蛋白結(jié)合性蛋白質(zhì)，優(yōu)選選自蛋白A、蛋白G、蛋白L、Fc結(jié)合蛋白和它們的功能性變異體中的至少1種以上。其中，優(yōu)選為蛋白A、蛋白G、它們的功能性變異體，更優(yōu)選為蛋白A、其功能性變異體。

另外，本發(fā)明中，“蛋白質(zhì)”是指具有肽結(jié)構(gòu)單元的所有分子，例如是包含人為地改變天然型蛋白質(zhì)的部分片段、天然型蛋白質(zhì)的氨基酸序列的變異體的概念。另外，“免疫球蛋白結(jié)合域”表示單獨具有免疫球蛋白結(jié)合活性的多肽的功能單元，“免疫球蛋白結(jié)合性蛋白質(zhì)”表示對免疫球蛋白具有特異性的親和性、且包含“免疫球蛋白結(jié)合域”的蛋白質(zhì)?！懊庖咔虻鞍捉Y(jié)合”表示結(jié)合于免疫球蛋白分子的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)以外的區(qū)域、特別是Fc片段。本發(fā)明中，與親和色譜有關(guān)而使用的術(shù)語“配體”表示與親和色譜的靶物質(zhì)結(jié)合的分子。

作為上述配體與固相載體的結(jié)合方法，將固相載體中所含的環(huán)氧基直接作為與配體的結(jié)合部位來利用作為工藝簡便而優(yōu)選。此外，也可以用甲苯磺?；葘⒐滔噍d體中所含的環(huán)氧基開環(huán)而生成的醇性羥基活化后，結(jié)合配體的方法，也可以由固相載體中所含的環(huán)氧基或通過該環(huán)氧基的開環(huán)而生成的基團(tuán)進(jìn)一步使連接體(linker)延長后，介由該連接體將使配體結(jié)合于固相載體。作為連接體，優(yōu)選二縮水甘油氧基烷烴、聚亞烷基二醇二縮水甘油醚等二縮水甘油醚化合物。

配體的結(jié)合條件根據(jù)配體結(jié)合前的固相載體的環(huán)氧基含量、配體的種類而不同，可以采用對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言公知的方法。配體為蛋白質(zhì)時，蛋白質(zhì)的N末端的氨基、蛋白質(zhì)中所含的賴氨酸、半胱氨酸可以成為與環(huán)氧基的反應(yīng)點。結(jié)合蛋白質(zhì)時，例如可以使用與蛋白質(zhì)的等電點接近的緩沖液類的水溶液，根據(jù)需要添加氯化鈉、硫酸鈉等鹽，一邊將蛋白質(zhì)與固相載體混合一邊使其在0～40℃下反應(yīng)1～48小時，結(jié)合作為配體的蛋白質(zhì)。

配體的結(jié)合量根據(jù)配體的種類、靶物質(zhì)的種類等適當(dāng)調(diào)節(jié)，將蛋白A這樣的免疫球蛋白結(jié)合性蛋白質(zhì)作為配體結(jié)合時，每1g固相載體優(yōu)選為10～200mg，更優(yōu)選為25～100mg。將蛋白A這樣的免疫球蛋白結(jié)合性蛋白質(zhì)作為配體結(jié)合時，若每1g固相載體的配體的結(jié)合量為10mg以上，則動態(tài)結(jié)合容量優(yōu)異，若為200mg以下，則為了洗脫結(jié)合的抗體而使用的洗脫液的量為特別適當(dāng)?shù)牧俊?/p>

(粒徑、比表面積)

構(gòu)成本發(fā)明的親和色譜用載體的固相載體為多孔粒子時，上述多孔粒子的粒徑通常為35～100μm，優(yōu)選為40～85μm。若粒徑為35μm以上，則壓力特性優(yōu)異。若為100μm以下，則得到動態(tài)結(jié)合容量高的填充劑。

多孔粒子的粒徑可以通過聚合時的條件進(jìn)行調(diào)整。應(yīng)予說明，本發(fā)明中的“粒徑”是指利用激光衍射散射式粒度分布測定裝置(Beckman Coulter公司制的LS13 320)得到的體積平均粒徑。

構(gòu)成本發(fā)明的親和色譜用載體的固相載體為多孔粒子時，上述多孔粒子的比表面積在測定相當(dāng)于孔徑10～5000nm的范圍的孔隙(pore)時，以孔隙尺寸10nm～5000nm的比表面積計優(yōu)選為70m²/g以上，更優(yōu)選為90m²/g以上。若比表面積在上述范圍內(nèi)，則得到靶物質(zhì)的動態(tài)結(jié)合容量高的親和色譜用載體。應(yīng)予說明，本發(fā)明中的“比表面積”是指利用壓汞儀(島津制作所株式會社制的Autopore IV9520)得到的細(xì)孔徑10～5000nm的細(xì)孔所具有的表面積除以粒子的干燥質(zhì)量而得到的值。

本發(fā)明的親和色譜用載體的雜質(zhì)除去性能高，而且保存穩(wěn)定性優(yōu)異，對于抗體等蛋白質(zhì)的純化特別有用。

[親和色譜柱]

本發(fā)明的親和色譜柱是將本發(fā)明的親和色譜用載體填充于柱容器中而成的。

[靶物質(zhì)的純化方法]

本發(fā)明的靶物質(zhì)的純化方法的特征在于，使用本發(fā)明的親和色譜用載體。

純化除使用本發(fā)明的親和色譜用載體以外，與常規(guī)方法同樣，例如可以舉出包含如下工序的方法：準(zhǔn)備含有靶物質(zhì)的組合物的準(zhǔn)備工序；將上述組合物通入本發(fā)明的色譜柱的通液工序；以及使通過該通液工序而吸附于載體的靶物質(zhì)洗脫的洗脫工序。

本發(fā)明的純化方法適于蛋白質(zhì)的純化，特別適于免疫球蛋白的純化。

實施例

以下，舉出實施例對本發(fā)明詳細(xì)地進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不限定于這些實施例。

(實施例1)

(1)在360g的純水中添加聚乙烯醇(KURARAY公司制，PVA－217)3.58g，加熱攪拌使聚乙烯醇溶解，冷卻后，添加十二烷基硫酸鈉(和光純藥工業(yè)制)0.36g、硫酸鈉(和光純藥工業(yè)制)0.36g、亞硝酸鈉(和光純藥工業(yè)制)0.18g，進(jìn)行攪拌而制備水溶液S。

另一方面，將由甲基丙烯酸縮水甘油酯(三菱麗陽公司制)12.00g和二乙烯基苯(新日鐵化學(xué)公司制)1.33g構(gòu)成的單體組合物溶解于二異丁基酮(三井化學(xué)公司制)24.43g中，制備單體溶液。

接著，將上述水溶液S總量投入500mL可拆式燒瓶內(nèi)，安裝溫度計、攪拌槳和冷卻管，設(shè)置于溫水浴，在氮氣氛下開始攪拌。將上述單體溶液總量投入可拆式燒瓶內(nèi)，在利用溫水浴進(jìn)行加溫而內(nèi)溫到達(dá)85℃時添加2,2’－偶氮異丁腈(和光純藥工業(yè)公司制)0.53g，將溫度維持在86℃。

(2)然后，將溫度維持在86℃，進(jìn)行3小時攪拌。接著，將反應(yīng)液冷卻后，過濾該反應(yīng)液，用純水和乙醇進(jìn)行清洗。使清洗的粒子分散于純水中進(jìn)行3次傾析，除去小粒子。接著，以粒子的濃度成為10質(zhì)量％的方式使粒子分散于純水中，得到多孔粒子分散液。

(3)將改性蛋白A(Repligen制的rSPA)0.15g分散于1.2M硫酸鈉/0.1M磷酸鈉緩沖液(pH6.6)40mL中，得到蛋白A分散液，在該蛋白A分散液中添加實施例1的工序(2)中得到的多孔粒子分散液(以粒子干燥質(zhì)量換算計相當(dāng)于1g)。使該分散液在25℃下振蕩攪拌5小時，將蛋白A固定于粒子。

(4)用0.1M磷酸鈉緩沖液(pH6.6)清洗生成的蛋白A固定粒子后，使其分散于1.0M硫酸水溶液(和光純藥工業(yè)公司制)40mL中，在40℃下振蕩攪拌4小時，由此使未反應(yīng)的環(huán)氧基開環(huán)。

然后，用0.1M磷酸鈉緩沖液(pH6.6)、0.1M氫氧化鈉水溶液、0.1M檸檬酸鈉緩沖液(pH3.2)清洗，得到親和色譜用填充劑1。

(實施例2)

實施例1的工序(1)中，使由甲基丙烯酸縮水甘油酯(三菱麗陽公司制)9.20g、1－乙基－4－乙烯基苯(ChemSampCo公司制)0.58g和二乙烯基苯(新日鐵化學(xué)公司制)1.73g構(gòu)成的單體組合物溶解于二異丁基酮(三井化學(xué)公司制)19.59g和苯甲醚(和光純藥工業(yè)公司制)6.05g的混合液中，制備單體溶液，除此以外，進(jìn)行與實施例1的工序(1)和(2)同樣的操作，得到多孔粒子分散液。

然后，通過與實施例1的工序(3)同樣的操作固定蛋白A，生成蛋白A固定粒子。

接著，使生成的蛋白A固定粒子分散于1.0M 2－巰基乙醇(和光純藥工業(yè)公司制)/0.1M硫酸鈉(pH8.3)40mL中，在25℃下振蕩攪拌17小時，由此使未反應(yīng)的環(huán)氧基開環(huán)。進(jìn)而，將得到的未反應(yīng)的環(huán)氧基開環(huán)的蛋白A固定粒子用0.1M磷酸鈉緩沖液(pH6.6)、0.1M氫氧化鈉水溶液、0.1M檸檬酸鈉緩沖液(pH3.2)進(jìn)行清洗，得到親和色譜用填充劑2。

(實施例3)

實施例1的工序(1)中，使由甲基丙烯酸縮水甘油酯(三菱麗陽公司制)8.18g、N－(2－羥基乙基)丙烯酰胺(東京化成工業(yè)公司制)1.36g和三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(SATOMER公司制)4.09g構(gòu)成的單體組合物溶解于4－甲基－2－戊醇(和光純藥工業(yè)制)21.97g和碳酸二乙酯(和光純藥工業(yè)制)2.95g的混合液中，制備單體溶液，除此以外，進(jìn)行與實施例1的工序(1)和(2)同樣的操作，得到多孔粒子分散液。

然后，通過與實施例1的工序(3)同樣的操作固定蛋白A，生成蛋白A固定粒子。

接著，使生成的蛋白A固定粒子(PA－1)分散于1.0M 1－硫代丙三醇(旭化學(xué)工業(yè)公司制)/0.1M硫酸鈉(pH8.3)40mL中，在25℃下振蕩攪拌17小時，使未反應(yīng)的環(huán)氧基開環(huán)。進(jìn)而，將得到的未反應(yīng)的環(huán)氧基開環(huán)的蛋白A固定粒子(PA－2)用0.1M磷酸鈉緩沖液(pH6.6)、0.1M氫氧化鈉水溶液、0.1M檸檬酸鈉緩沖液(pH3.2)進(jìn)行清洗，得到親和色譜用填充劑3。

(實施例4)

以粒子的濃度成為10質(zhì)量％的方式使通過與實施例3同樣的操作而得到的未反應(yīng)的環(huán)氧基開環(huán)的蛋白A固定粒子(PA－2)分散于純水中。在其中添加30％過氧化氫0.48g，在25℃下振蕩攪拌24小時。進(jìn)而，用0.1M磷酸鈉緩沖液(pH6.6)、0.1M氫氧化鈉水溶液、0.1M檸檬酸鈉緩沖液(pH3.2)進(jìn)行清洗，得到親和色譜用填充劑4。

(實施例5)

使通過與實施例3同樣的操作而生成的蛋白A固定粒子(PA－1)分散于1.0M 1－硫代丙三醇/0.1M硫酸鈉(pH8.3)40mL中，在25℃下振蕩攪拌40小時，使未反應(yīng)的環(huán)氧基開環(huán)。進(jìn)而，將得到的未反應(yīng)的環(huán)氧基開環(huán)的蛋白A固定粒子用0.1M磷酸鈉緩沖液(pH6.6)、0.1M氫氧化鈉水溶液、0.1M檸檬酸鈉緩沖液(pH3.2)進(jìn)行清洗，得到親和色譜用填充劑5。

(實施例6)

實施例1的工序(1)中，使由甲基丙烯酸縮水甘油酯(三菱麗陽公司制)5.26g、丙三醇單甲基丙烯酸酯(日油公司制)2.63g和二乙烯基苯(新日鐵化學(xué)公司制)2.63g構(gòu)成的單體組合物溶解于2－辛酮(東洋合成公司制)25.00g中，制備單體溶液，除此以外，進(jìn)行與實施例1的工序(1)和(2)同樣的操作，得到多孔粒子分散液。

然后，通過與實施例1的工序(3)同樣的操作固定蛋白A，生成蛋白A固定粒子。

接著，使生成的蛋白A固定粒子分散于1.0M 2－巰基丙磺酸鈉(東京化成工業(yè)公司制)/0.1M硫酸鈉(pH8.3)40mL中，在25℃下振蕩攪拌17小時，使未反應(yīng)的環(huán)氧基開環(huán)。進(jìn)而，將得到的未反應(yīng)的環(huán)氧基開環(huán)的蛋白A固定粒子用0.1M磷酸鈉緩沖液(pH6.6)、0.1M氫氧化鈉水溶液、0.1M檸檬酸鈉緩沖液(pH3.2)進(jìn)行清洗，得到親和色譜用填充劑6。

(實施例7)

實施例1的工序(1)中，使由丙烯酸4－羥基丁酯縮水甘油醚(日本化成公司制)4.77g和甘油二甲基丙烯酸酯(新中村化學(xué)工業(yè)公司制)8.86g構(gòu)成的單體組合物溶解于苯乙酮(井上香料制造所公司制)21.52g和2－辛酮(東洋合成公司制)7.35g的混合液中，制備單體溶液，除此以外，進(jìn)行與實施例1的工序(1)和(2)同樣的操作，得到多孔粒子分散液。

然后，通過與實施例3同樣的操作實施蛋白A的固定、未反應(yīng)的環(huán)氧基的開環(huán)和清洗，得到親和色譜用填充劑7。

(實施例8)

實施例1的工序(1)中，使由乙烯基芐基縮水甘油醚(東麗精密化學(xué)公司制)3.43g、丙三醇單甲基丙烯酸酯(日油公司制)4.11g和乙二醇二甲基丙烯酸酯(新中村化學(xué)工業(yè)公司制)6.17g構(gòu)成的單體組合物溶解于苯乙酮(井上香料制造所公司制)21.52g和2－辛酮(東洋合成公司制)7.35g的混合液中，制備單體溶液，除此以外，進(jìn)行與實施例1的工序(1)和(2)同樣的操作，得到多孔粒子分散液。

然后，通過與實施例3同樣的操作，實施蛋白A的固定、未反應(yīng)的環(huán)氧基的開環(huán)和清洗，得到親和色譜用填充劑8。

(比較例1)

實施例3中，在蛋白A固定后未進(jìn)行未反應(yīng)的環(huán)氧基的開環(huán)，除此以外，通過與實施例3同樣的操作得到親和色譜用填充劑9。

(比較例2)

實施例1的工序(1)中，使由甲基丙烯酸3,4－環(huán)氧環(huán)己基甲酯(DAICEL公司制)1.41g、丙三醇單甲基丙烯酸酯(日油公司制)8.45g和三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(SATOMER公司制)4.23g構(gòu)成的單體組合物溶解于苯乙酮(井上香料制造所公司制)21.50g和2－辛酮(東洋合成公司制)7.34g的混合液中，制備單體溶液，除此以外，進(jìn)行與實施例1的工序(1)和(2)同樣的操作，得到多孔粒子分散液。

然后，通過與實施例1的工序(3)同樣的操作固定蛋白A，生成蛋白A固定粒子。

接著，使生成的蛋白A固定粒子分散于1.0M 1－硫代丙三醇(旭化學(xué)工業(yè)公司制)/0.1M硫酸鈉(pH8.3)40mL中，在25℃下振蕩攪拌4小時，由此使未反應(yīng)的環(huán)氧基開環(huán)。進(jìn)而，用0.1M磷酸鈉緩沖液(pH6.6)、0.1M氫氧化鈉水溶液、0.1M檸檬酸鈉緩沖液(pH3.2)進(jìn)行清洗，得到親和色譜用填充劑10。

(比較例3)

比較例2中，將使蛋白A固定粒子分散于1.0M 1－硫代丙三醇(旭化學(xué)工業(yè)公司制)/0.1M硫酸鈉(pH8.3)40mL之后的振蕩攪拌時間由4小時變更為17小時，除此以外，通過與比較例2同樣的操作得到親和色譜用填充劑11。

(比較例4)

實施例1的工序(1)中，使由甲基丙烯酸縮水甘油酯(三菱麗陽公司制)1.39g、丙三醇單甲基丙烯酸酯(日油公司制)2.79g和甘油二甲基丙烯酸酯(新中村化學(xué)工業(yè)公司制)9.76g構(gòu)成的單體組合物溶解于苯乙酮(井上香料制造所公司制)21.50g和2－辛酮(東洋合成公司制)7.34g的混合液中，制備單體溶液，除此以外，進(jìn)行與實施例1的工序(1)和(2)同樣的操作，得到多孔粒子分散液。

然后，通過與實施例3同樣的操作實施蛋白A的固定、未反應(yīng)的環(huán)氧基的開環(huán)和清洗，得到親和色譜用填充劑12。

試驗例1(環(huán)氧基含量的定量)

對實施例1～8和比較例1～4中得到的配體結(jié)合前的多孔粒子的環(huán)氧基含量進(jìn)行定量。

即，在懸浮于氯化鈣水溶液中的多孔粒子中過量地添加鹽酸使鹽酸進(jìn)行加成反應(yīng)，由此使環(huán)氧基開環(huán)，將剩余的鹽酸用過量的氫氧化鈉水溶液中和后，添加酚酞溶液，將剩余的氫氧化鈉用鹽酸進(jìn)行反滴定，由此進(jìn)行定量。應(yīng)予說明，滴定的終點為酚酞的紅色消失的蝕刻。將結(jié)果示于表1。

試驗例2(剩余的環(huán)氧基量的評價(pH上升幅度的測定))

以填充高度約5cm將實施例1～8和比較例1～4中得到的親和色譜用填充劑填充于GE Healthcare公司制的Tricorn 5/50柱中，將上述柱與GE Healthcare公司制的AKTAprime plus連接，一邊監(jiān)控pH一邊以流速0.2mL/分鐘通入含有2M的NaCl的pH7.5的20mM磷酸鈉緩沖液，記錄柱內(nèi)的pH達(dá)到平衡時的pH值作為初期pH。進(jìn)而，將置換為上述緩沖液的上述柱從AKTAprime plus取下，在40℃的恒溫器內(nèi)靜置7天。

然后，將上述柱再次與AKTAprime plus連接，一邊監(jiān)控pH一邊以流速0.2mL/分鐘通入上述緩沖液，記錄柱內(nèi)的pH變得最高時的pH值作為負(fù)荷pH。求出初期pH與負(fù)荷pH之差作為pH上升幅度。應(yīng)予說明，初期pH和負(fù)荷pH的測定在23±1℃的恒溫室內(nèi)實施。將結(jié)果示于表1。

試驗例3(蛋白A結(jié)合量的定量)

使用二喹啉甲酸(BCA)試劑對結(jié)合于實施例1～8和比較例1～4中得到的親和色譜用填充劑的配體的蛋白A的結(jié)合量進(jìn)行定量。具體而言，在試管中采取以固體成分換算計為1mg的填充劑，將其用ThermoFisher Scientific公司的BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒進(jìn)行定量。反應(yīng)通過在37℃下顛倒混合30分鐘來進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)曲線使用與結(jié)合于載體的蛋白A相同的蛋白A制作。將結(jié)果示于表1。

試驗例4(DBC的測定和保存穩(wěn)定性的評價)

使用GE Healthcare公司制的AKTAprime plus測定線流速300cm/hr下的各實施例和比較例的各填充劑對蛋白質(zhì)(人類IgG抗體，Equitech Bio公司制的HGG－1000)的DBC。柱使用容量4mL(長)的柱，蛋白質(zhì)分別使用利用20mM磷酸鈉/150mM氯化鈉水溶液(pH7.5)將蛋白質(zhì)溶解成5mg/mL的蛋白質(zhì)，由洗脫前端10％穿過時的蛋白質(zhì)捕捉量和柱填充體積求出DBC。將結(jié)果示于表1。

進(jìn)而，與試驗例2同樣地用含有2M的NaCl的pH7.5的20mM磷酸鈉緩沖液對DBC測定后的柱進(jìn)行置換，直接在40℃下靜置7天。然后，再次在與上述同樣的條件下實施DBC測定，求出負(fù)荷DBC。將負(fù)荷DBC/初期DBC×100作為DBC維持率，評價親和色譜用填充劑的保存穩(wěn)定性。應(yīng)予說明，初期DBC和負(fù)荷DBC的測定在23±1℃的恒溫室內(nèi)實施。將結(jié)果示于表1。

試驗例5(HCP的定量)

以填充高度約5cm將實施例和比較例的各填充劑填充于柱容器(GE Healthcare公司制的Tricorn 10/50柱)中，制作柱。將得到的柱分別與GE Healthcare公司制的AKTAprime plus連接，以流速1mL/分鐘通入5柱容量(柱容積的5倍)的20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)，使其平衡。

接著，以約23mg抗體/mL載體的負(fù)荷量以流速1mL/分鐘將含有單克隆抗體曲妥珠單抗(Trastuzumab)的CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清液通入柱中。

接著，以流速1mL/分鐘分別依次通入5柱容量的20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)、20mM磷酸鈉/1M氯化鈉緩沖液(pH7.5)和20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)。

然后，以流速1mL/分鐘將50mM檸檬酸鈉緩沖液(pH3.2)通入柱中，使柱內(nèi)所捕捉的單克隆抗體洗脫，回收Abs.280＞100mAu的洗脫級分。

接著，使用光譜光度計測定回收的級分中所含有的抗體濃度(mg.mL)。另外，使用Cygnus Technologies公司制的CHO HCP ELISA試劑盒，使用3G，測定回收的級分中所含的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(HCP)的濃度(ng/mL)。進(jìn)而，將HCP的濃度除以抗體濃度，由此算出每單位抗體量的HCP量。將結(jié)果示于表1。

[表1]

表1中的各符號如下所述。

(M－1)GMA：甲基丙烯酸縮水甘油酯，HBAGE：甲基丙烯酸4－羥基丁酯縮水甘油醚，VBGE：(4－乙烯基芐基)縮水甘油醚，METHB：甲基丙烯酸3,4－環(huán)氧環(huán)己基甲酯

(M－2)DVB：二乙烯基苯，TMP：三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，GLDM：甘油二甲基丙烯酸酯，EDMA：乙二醇二甲基丙烯酸酯

(M－3)EVB：1－乙基－4－乙烯基苯，HEAA：N－(2－羥基乙基)甲基丙烯酰胺，GLM：丙三醇單甲基丙烯酸酯

(開環(huán)中使用的化合物)ME：2－巰基乙醇、TG：1－硫代丙三醇，MPSA：2－巰基丙磺酸鈉。