本文所公開的實(shí)施方案涉及用于減少含有所需待純化的蛋白質(zhì)的制劑中的病毒和病毒多核苷酸的方法。
已知一些病毒物種通過借助于暴露于極端條件如高酸性pH而被滅活。這些物種包括大多數(shù)脂質(zhì)包膜病毒物種。已知一些病毒物種對此類滅活具有抗性。這些物種包括許多非脂質(zhì)包膜病毒物種，也被稱為蛋白質(zhì)衣殼病毒。
陰離子交換色譜通常用于純化蛋白質(zhì)，包括去除污染病毒物種。用于此類應(yīng)用的陰離子交換劑通常是季胺離子交換劑。這些應(yīng)用在中性到微堿性pH下進(jìn)行，因?yàn)樗鼈兺ǔＴ谀切l件下支持最強(qiáng)的病毒結(jié)合(C.Curtis等，Biotechnol.Bioeng.84(2003)179-185)，并且需要此類條件以在去除病毒的同時(shí)去除污染宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(P.Gagnon，J.Chromatogr.A 1221(2012)57-70)?；诓返年庪x子交換劑也已被描述用于在中性到堿性操作pH下去除病毒和宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(W.Riordan等，Biotechnol.Prog.25(2009)1695-1702)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
在一些實(shí)施方案中，本文公開了用于降低所需蛋白質(zhì)的酸性制劑中的病毒和病毒DNA水平的方法，所述方法包括使所需蛋白質(zhì)的酸性制劑與負(fù)載伯胺、仲胺或兩者的表面接觸。
具體實(shí)施方式
提供了用于在低pH處理期間或之后通過使低pH制劑與負(fù)載伯胺和/或仲胺的固體表面接觸來增強(qiáng)從含有所需蛋白質(zhì)的制劑中去除病毒和病毒DNA的方法。如本文所用，“低pH”處理是指作為病毒滅活處理的一部分的足夠低的pH，即使至少一種病毒滅活的足夠低的pH。因此，pH范圍的上限通常不大于約4.0。因此，在一些實(shí)施方案中，低pH可以在例如約1.0到約4.0，在一些實(shí)施方案中，或約2.0到約4.0、或約2.0到約3.8的范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，可以選擇pH以符合調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)。在典型的情況下，上端調(diào)節(jié)極限pH可以是約3.8。在一些實(shí)施方案中，提供了用于降低所需蛋白質(zhì)的酸性制劑中的病毒和病毒DNA水平的方法，所述方法包括使所需蛋白質(zhì)的酸性制劑與負(fù)載伯胺、仲胺或兩者的表面接觸。
在一些實(shí)施方案中，接觸步驟期間的操作pH在選自由以下所組成的組的范圍內(nèi)：(a)約2.0到約4.0、(b)約2.25到約3.75、(c)約2.5到約3.5、(d)約2.75到約3.25、(e)約3.5到約3.75、和(f)約3.25到約3.5，以及其間的中間范圍或中間單個(gè)值。
在一些實(shí)施方案中，接觸步驟期間的鹽濃度在選自由以下所組成的組的范圍內(nèi)：(a)約0.0或非零值到高達(dá)約0.5M、(b)0.05M到約0.3M、和(c)約0.1M到約0.2M。鹽濃度可以是這些列舉的范圍之間的任何中間范圍或中間單個(gè)值。
在一些實(shí)施方案中，接觸步驟的持續(xù)時(shí)間在選自由以下所組成的組的范圍內(nèi)：(a)約15到約120分鐘、(b)約30至約60分鐘、(c)小于約30分鐘的非零量、(d)小于約15分鐘的非零量、(e)小于約10分鐘的非零量、(f)小于約5分鐘的非零量、(g)小于約2分鐘的非零量、(h)小于約1分鐘的非零量、和(i)使制劑通過容納負(fù)載伯胺的表面的裝置所需的時(shí)間。
在一些實(shí)施方案中，所述表面包含選自由以下所組成的組的一種或多種部分：乙二胺、三(2-氨乙基)胺、二乙基胺三胺、三亞乙基四胺、四亞乙基五胺、聚烷基胺。在一些實(shí)施方案中，所述表面可以包含任何伯胺、仲胺或其組合。所述表面可以衍生自附著在襯底的表面的任何直鏈或支鏈的伯單胺片段或表現(xiàn)為附著在襯底的表面的任何直鏈或支鏈的伯單胺片段的形式。示例性的伯胺部分包括但不限于基于以下的片段：甲胺、乙胺、丙胺、異丙胺、丁胺、仲丁胺、異丁胺、己胺的任何異構(gòu)構(gòu)型、庚胺的任何異構(gòu)構(gòu)型、辛胺、壬胺的任何異構(gòu)構(gòu)型、癸胺的任何異構(gòu)構(gòu)型、或其混合物或組合。
在一些實(shí)施方案中，可以采用二胺片段。合適的二胺包括但不限于以下通式的二胺
H2N—R—NH2
其中R是具有約1到約20個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基或烯基、具有約1到約20個(gè)碳原子的環(huán)烯基、具有約1到約20個(gè)碳原子的烷基環(huán)烯基、具有約1到約20個(gè)碳原子的烷芳烯基(alkarenyl)、具有約1到約20個(gè)碳原子的芳烯基(aralkenyl)等、或其混合物或組合。R基團(tuán)還可以包含除碳和氫之外的原子，如氧、氮、氟和/或氯。
合適的表面胺部分可以基于二胺和三胺，包括但不限于烷基二胺、環(huán)烷基二胺、烷基環(huán)烷基二胺、芳烷基二胺、芳基二胺、烷芳基二胺等和其類似物，并且其中一個(gè)或多個(gè)碳原子可以被氮原子、氧原子或其混合物替代，其中所述氧原子形成羧基、羥基和或醚部分，并且所述氮原子形成叔胺和/或酰胺部分，和/或一個(gè)或多個(gè)氫原子可以被氟原子、氯原子或其混合物替代，并且包括2到約20個(gè)碳原子，包括約3到約15個(gè)碳原子，并且包括約4到約10個(gè)碳原子。示例性的烷基二胺包括但不限于1,2-二氨基乙烷(1,2-乙二胺)、1,2-二氨基丙烷、1,3-二氨基丙烷、1,2-二氨基丁烷、1,3-二氨基丁烷、1,4-二氨基丁烷、1,2-二氨基戊烷、1,3-二氨基戊烷、1,4-二氨基戊烷、1,5-二氨基戊烷和類似的高級二氨基烷烴、六亞甲基二胺、氨基甲基環(huán)戊胺、1,2-環(huán)戊烷二胺、1,6-己二胺、1,2-苯二胺、賴氨酸(或其它二胺氨基酸)、1,2-苯二胺、1,4-苯二胺、1,2-二苯基-1,2-乙烷二胺、苯二胺、2-羥基丙二胺、乙內(nèi)酰脲、N,N-雙(二羥乙基)乙二胺、六氫三嗪、氨乙基哌嗪(AEP)等、或其混合物或組合?？梢粤钊藵M意地用于制備主題組合物的其它脂族胺和三胺的示例包括1,4-環(huán)己二胺和雙-六亞甲基三胺。在所有上述實(shí)施方案中，胺在襯底表面上的呈現(xiàn)可以通過與任何片段的任何原子(包括氮自身)的連接來實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，還可以采用仲胺。此類仲胺可以包含另外的直鏈或支鏈的C1到C20片段。
在一些實(shí)施方案中，所述表面為選自由以下所組成的組中的一種的形式：顆粒、膜、整體柱(monolith)、水凝膠涂覆的骨架和其組合。
在一些實(shí)施方案中，接觸步驟通過選自由以下所組成的組的操作進(jìn)行：(a)將負(fù)載伯胺和/或仲胺的顆粒分散在所述制劑中，(b)使所述制劑通過與所述表面流體接觸的裝置，(c)使所述制劑再循環(huán)通過提供與所述表面流體接觸的裝置，和(d)其組合。
已意外地發(fā)現(xiàn)，病毒結(jié)合到固體表面的伯胺和/或仲胺違反了陰離子交換色譜的公認(rèn)規(guī)則。通過從負(fù)載伯胺的表面洗脫結(jié)合的病毒或病毒多核苷酸所需的鹽濃度測量的結(jié)合強(qiáng)度隨著pH降低而增加，在一些情況下，與在pH 8在同一表面上的結(jié)合相比，結(jié)合強(qiáng)度增加了超過2倍，與在pH 8在季胺交換劑(quaternary exchanger)上的結(jié)合相比，結(jié)合強(qiáng)度增加了超過5倍，并且與在pH 6在季胺交換劑上的結(jié)合相比，結(jié)合強(qiáng)度增加了接近10倍。在更低的pH值下，結(jié)合變得逐漸更強(qiáng)，使得在pH 3需要高達(dá)5M的胍以從負(fù)載伯胺和/或仲胺的表面去除DNA。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，與pH8相比，未增強(qiáng)具有低于約150kDa的質(zhì)量的肽和蛋白質(zhì)的保留，從而產(chǎn)生一個(gè)窗口，其中在增強(qiáng)病毒和病毒DNA的保留的條件下，大部分制劑中的所需蛋白質(zhì)未結(jié)合到負(fù)載伯胺和/或仲胺的表面。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，這轉(zhuǎn)化為非脂質(zhì)包膜病毒如甲型肝炎病毒和小鼠細(xì)小病毒的超過700倍的減少，所述病毒通過用低pH處理未被顯著滅活。這是意外的，因?yàn)槿苜|(zhì)如病毒、DNA和蛋白質(zhì)在季胺鹽陰離子交換劑(quaternary anion exchanger)上的保留隨著pH降低而減少，這是由于所述溶質(zhì)變得正電性更高(和/或負(fù)電性更低)。這通常被理解為使得陰離子交換色譜對于在酸性pH，尤其是在強(qiáng)酸性pH值，如通常用于病毒滅活的條件下的病毒去除是無用的。不歸于任何特定理論，病毒和病毒DNA在負(fù)載伯胺和/或仲胺的表面上的相反行為可能通過氫鍵合被介導(dǎo)。這是意外的，因?yàn)橐阎獨(dú)滏I合涉及傾向于顯示其作用應(yīng)當(dāng)與離子交換行為相似的靜電組分。然而，來自使用選擇性氫供體-受體如山梨醇的競爭實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)顯示氫鍵合。該行為是更意外的，因?yàn)樗诙鄠€(gè)方面與本領(lǐng)域中已知的結(jié)果不同并且相反，表明對于大小范圍在18至78kDa的蛋白質(zhì)，與pH 8相比，在pH 6保留顯著增加；表明增加的結(jié)合與降低的pH沒有大小相關(guān)性；并且表明保留在約pH 6下變得最強(qiáng)，在更低的pH下減弱，在pH 4-5下喪失(美國專利6,090,288)。支持本文所公開的方法，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，對于約66kDa的蛋白質(zhì)，基本上沒有增強(qiáng)保留，同時(shí)存在大小和增強(qiáng)之間的強(qiáng)相關(guān)性，而對于大小接近約1MDa以及更大的溶質(zhì)，在低于6的pH值下，特別是在小于4的pH值下，保留繼續(xù)變得更強(qiáng)，所有這些都是必要的促成因素。
在一些實(shí)施方案中，操作pH可以小于6，如pH 5或更小、或4或更小、或3.9或更小、或3.8或更小、或3.7或更小、或3.6或更小、或3.5或更小、或3.4或更小、或3.3或更小、或3.3或更小、或3.2或更小、或3.1或更小、或3.0或更小，低到所需蛋白質(zhì)可以耐受的且不產(chǎn)生可能影響其臨床功效或安全性的持續(xù)永久性損害最低pH。在一些實(shí)施方案中，可耐受的pH可以是2.5或更小、或2.0或更小、或約1.0。最低可耐受的pH應(yīng)被理解為對于每種所需產(chǎn)物是獨(dú)特的并且不可能在廣泛的一般基礎(chǔ)上表示。在一些實(shí)施方案中，最大pH將不大于約4，因?yàn)樯踔林|(zhì)包膜的病毒物種的滅活也需要低于4的pH。在一些實(shí)施方案中，pH將為3.25到3.75之間。
在一些實(shí)施方案中，所述制劑可以不含鹽。在一些實(shí)施方案中，所述制劑可以含有一種或多種鹽種類，其中此類鹽的濃度是高達(dá)0.01M、高達(dá)0.05M、高達(dá)0.1M、高達(dá)0.2M、高達(dá)0.3M、高達(dá)0.4M、高達(dá)0.5M、或更高、潛在高達(dá)1.0M的非零量。在一些此類實(shí)施方案中，鹽種類可以是氯化鈉(NaCl)。在一些實(shí)施方案中，鹽的存在可能對通過負(fù)載伯胺的表面的病毒去除具有可忽略的影響，而在一些實(shí)施方案中，鹽的存在可能降低通過負(fù)載伯胺的表面所實(shí)現(xiàn)的病毒去除的程度。在一些實(shí)施方案中，鹽的存在可以增強(qiáng)病毒滅活，或改善所需蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，或降低所需蛋白質(zhì)的溶解度。對于每種所需蛋白質(zhì)種類，此類效應(yīng)都可以確定。在一些實(shí)施方案中，在所示范圍內(nèi)增加鹽濃度可以限制該程度于通過負(fù)載伯胺的表面增強(qiáng)病毒去除且超過僅僅通過在低pH下處理所實(shí)現(xiàn)的滅活程度，但去除程度將保持顯著。
在一些實(shí)施方案中，所述制劑可以含有意在增強(qiáng)病毒滅活的成分，如依沙吖啶、亞甲藍(lán)、道諾霉素、亞德里亞霉素、氯己定、阿立西定、苯扎氯銨、三(2-氨乙基)胺、磷酸三(正丁基)酯、表面活性劑、螯合劑或此類成分的組合。
在一些實(shí)施方案中，負(fù)載伯胺的表面可以另外包含其它種類的正電性化學(xué)部分，如仲胺基。在其它實(shí)施方案中，負(fù)載伯胺的表面可以另外包含其它種類的正電性化學(xué)，如叔胺基或季胺基。在一些實(shí)施方案中，負(fù)載伯胺的表面可以另外包含一種以上種類的正電性化學(xué)部分。在一些實(shí)施方案中，負(fù)載伯胺的表面可以另外包含正電性化學(xué)部分的組合，所述組合由仲胺和叔胺，仲胺和季胺，叔胺和季胺，仲胺、叔胺和季胺，以任意相對比例組成。
在一些實(shí)施方案中，含有伯胺的化學(xué)物種可以是三(2-氨乙基)胺(TREN)。在其它實(shí)施方案中，含有伯胺的化學(xué)物種可以是乙二胺。在其它實(shí)施方案中，含有伯胺的化學(xué)物種可以是聚烯丙胺或另一種聚合的伯胺。
在一些實(shí)施方案中，負(fù)載伯胺的表面可以包含允許所述表面作為整體參與靜電相互作用、氫鍵、疏水相互作用、π-π鍵合和金屬配位相互作用的化學(xué)成分。
在一些實(shí)施方案中，負(fù)載伯胺的表面可以包含與伯胺具有相反電荷的成分。在一些實(shí)施方案中，負(fù)載伯胺的表面可以包含由于不帶電荷或由于含有平衡比例的負(fù)電荷和正電荷、或者兩者而為電中性的成分。
在其中存在多個(gè)表面的一些實(shí)施方案中，各個(gè)表面可以負(fù)載相同的含伯胺的物種。在其中存在多個(gè)表面的一些實(shí)施方案中，各個(gè)表面可以負(fù)載不同的含伯胺的物種。在其中存在多個(gè)表面的一些實(shí)施方案中，各個(gè)表面中的一些可以負(fù)載除伯胺以外的物種。
在一些實(shí)施方案中，負(fù)載伯胺的固體表面可以呈顆粒、膜、整體柱、大網(wǎng)狀骨架上的水凝膠的物理形式。在一些此類實(shí)施方案中，可以存在一個(gè)以上物理單元，如多個(gè)顆粒、或多個(gè)膜、或多個(gè)其它物理形式、或不同物理形式的組合。在一些此類實(shí)施方案中，多個(gè)顆?？梢员惶畛湓谥?。
在一些實(shí)施方案中，多個(gè)伯胺表面可以懸浮在含有所需蛋白質(zhì)的制劑內(nèi)。在一些此類實(shí)施方案中，懸浮表面可以在處理之后通過沉降、或過濾、或浮選、或在磁場中捕集、或在帶相反電荷的表面上捕集、或任何其它便利的手段而被去除。在一些實(shí)施方案中，在用于病毒滅活的低pH處理已經(jīng)名義上完成之后，可以使含有所需蛋白質(zhì)的制劑流動通過含有一個(gè)或多個(gè)負(fù)載伯胺的流體接觸表面的裝置。在一些實(shí)施方案中，可以使所需蛋白質(zhì)制劑連續(xù)再循環(huán)通過含有一個(gè)或多個(gè)伯胺流體接觸表面的裝置一段時(shí)間，直到低pH處理的整個(gè)持續(xù)時(shí)間。在一些實(shí)施方案中，通過前述接觸模式的任何組合可以使所需蛋白質(zhì)制劑與一個(gè)或多個(gè)結(jié)合伯胺的表面接觸。
在說明所公開的方法的關(guān)鍵要素的一個(gè)實(shí)施方案中，將含有部分純化的所需蛋白質(zhì)如IgG單克隆抗體的制劑滴定到pH為3.5，并在該pH下保持60分鐘。將具有經(jīng)改性負(fù)載乙二胺的表面的整體柱平衡到與抗體制劑名義上相同的pH和鹽條件。然后使制劑流動通過整體柱?？梢匀芜x地用pH 3.5的清潔緩沖液沖洗整體柱，以使所需蛋白質(zhì)的回收最大化。然后可以任選地丟棄或再生整體柱。
在說明所公開的方法的關(guān)鍵要素的另一實(shí)施方案中，將含有部分純化的抗體的制劑滴定至pH為3.5，將具有經(jīng)改性負(fù)載乙二胺的表面的整體柱平衡到與抗體制劑名義上相同的pH和鹽條件。然后使制劑再循環(huán)通過整體柱，直到所需蛋白質(zhì)已暴露于pH 3.5達(dá)60分鐘，或另指定某一時(shí)間間隔。
在說明所公開的方法的關(guān)鍵要素的另一實(shí)施方案中，將含有部分純化的抗體的制劑滴定至pH為3.5，將具有經(jīng)改性負(fù)載聚烯丙胺的表面的膜吸附器平衡到與抗體制劑名義上相同的pH和鹽條件。然后使制劑再循環(huán)通過所述膜為60分鐘的一段時(shí)間。在密切相關(guān)的實(shí)施方案中，將抗體制劑在pH 3.5溫育60分鐘，然后單次流動通過膜吸附器。
在說明所公開的方法的關(guān)鍵要素的另一實(shí)施方案中，將含有部分純化的抗體的制劑滴定至pH為3.5。將具有經(jīng)改性負(fù)載乙二胺或聚烯丙胺或其它含伯胺的配體的表面的顆粒平衡到與抗體制劑名義上相同的pH和鹽條件。通過攪拌60分鐘的一段時(shí)間使顆粒維持懸浮狀態(tài)，然后通過沉降或過濾或任何其它適當(dāng)?shù)姆椒▽⑺鼈內(nèi)コ??？梢匀芜x地用pH 3.5的清潔緩沖液沖洗顆粒，以使所需蛋白質(zhì)的回收最大化。在密切相關(guān)的實(shí)施方案中，抗體制劑在pH 3.5溫育60分鐘，然后通過填充有顆粒的柱，所述顆粒負(fù)載乙二胺、聚烯丙胺、三(2-氨乙基)胺或其它含伯胺的配體。
對下面的術(shù)語進(jìn)行了定義，使得可以更容易地理解本文的實(shí)施方案。另外的定義陳述于整個(gè)詳細(xì)描述中。
“胺”定義為通過用有機(jī)基團(tuán)(通常用烴如甲基或乙基)替代一個(gè)或多個(gè)氫原子而衍生自氨的有機(jī)化合物。在“伯胺”上，一個(gè)氫原子被有機(jī)基團(tuán)替代。在“仲胺”上，兩個(gè)氫被有機(jī)基團(tuán)替代。在“叔胺”上，三個(gè)氫被有機(jī)基團(tuán)替代。在“季胺”上，三個(gè)氫被有機(jī)基團(tuán)替代并且第四有機(jī)基團(tuán)替代存在于較少取代的胺上的電子對。含伯胺的化合物還可以含有其它類型的胺或非胺物種。
“氫鍵”定義為兩個(gè)分子之間的弱鍵，其部分地由一個(gè)分子中的質(zhì)子與另一分子中的負(fù)電性原子之間的靜電吸引引起，并且部分地由共價(jià)相互作用引起。
“病毒”或“病毒粒子”是指僅在主要為細(xì)菌、植物和動物的活宿主的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的超顯微的(直徑大約為20nm到300nm)、代謝惰性的感染原：其由RNA或DNA核、蛋白質(zhì)外殼和在更復(fù)雜的類型中含有一層或兩層脂質(zhì)的包膜構(gòu)成。示例包括但不限于dsDNA病毒、ssDNA病毒、dsRNA病毒、(+)ssRNA病毒、(-)ssRNA病毒、ssRNA RT病毒和dsDNA-RT病毒；腺病毒、皰疹病毒、痘病毒、細(xì)小病毒、呼腸孤病毒、諾如病毒、小核糖核酸病毒、披膜病毒、正粘病毒、棒狀病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、嗜肝性DNA病毒、乳頭瘤病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、登革熱病毒、日本腦炎病毒、西尼羅河病毒和噬菌體。術(shù)語病毒理解為包括用于用作基因療法的載體、用作疫苗和用作抗生素的替代物的病毒顆粒。它還理解為包括所謂的假病毒粒子，其可以描述為已經(jīng)過重組修飾而保留它們產(chǎn)生保護(hù)性免疫的能力同時(shí)消除它們引起感染的能力的病毒顆粒，并且還可以描述為在感染有兩種病毒物種的宿主內(nèi)不同的病毒物種自發(fā)地將基因從一個(gè)轉(zhuǎn)移到另一個(gè)的異嗜性病毒物種。
“病毒滅活”是指以使病毒復(fù)制能力暫停的方式破壞該病毒的過程。熱通常用于該目的，以及暴露于化學(xué)試劑或極端化學(xué)環(huán)境，如高酸性或高堿性條件，或暴露于有機(jī)溶劑等。
“病毒去除”是指從制劑中去除病毒的過程。此類去除可以由物理方法如過濾(其中過濾裝置的孔隙度阻止病毒通過)或尺寸排阻色譜(其中病毒的大小使其與更小的蛋白質(zhì)分級分離)而引起。去除還可以由如在離子交換、親和性、疏水性相互作用或羥基磷灰石色譜法或其它色譜方法中病毒與互補(bǔ)表面如色譜表面的化學(xué)結(jié)合而引起。
“病毒減少”是指通過滅活和去除實(shí)現(xiàn)的來自制劑的病毒負(fù)載的總減少。
“病毒多核苷酸”是指病毒的遺傳物質(zhì)，在一些情況下是DNA，在一些情況下是RNA。
在某些實(shí)施方案中，可以在不偏離上述一般實(shí)施例的情況下應(yīng)用所公開的方法以增強(qiáng)病毒減少。在不考慮負(fù)載伯胺的固體材料的情況下滅活溶液的pH應(yīng)當(dāng)選擇為實(shí)現(xiàn)最高可能程度的病毒滅活。在已知使病毒滅活而不永久破壞目標(biāo)產(chǎn)物的有效pH值范圍(其可以是低于pH 4的值到約pH 3的值)內(nèi)，可以預(yù)期所述固體材料顯著增強(qiáng)凈病毒減少。暴露時(shí)間也可以獨(dú)立于負(fù)載伯胺的固體材料被選擇。暴露溫度也可以獨(dú)立于負(fù)載伯胺的固體材料被選擇?？梢钥紤]添加抗病毒組分，然而，應(yīng)當(dāng)審慎地檢查某些變量以評估它們的單個(gè)影響和共同影響?？梢灶A(yù)期非離子型添加劑、兩性離子型添加劑或帶正電荷的添加劑是可耐受的，且不顯著干擾負(fù)載伯胺的固體材料保留病毒或病毒DNA的能力。負(fù)電性添加劑可能具有干擾病毒與負(fù)載伯胺的固體材料結(jié)合的傾向。導(dǎo)電添加劑如鹽可以限制負(fù)載伯胺的固體材料結(jié)合病毒的能力，雖然產(chǎn)生大致生理電導(dǎo)率或更低電導(dǎo)率的鹽濃度通常是耐受良好的，并且在一些實(shí)施方案中，鹽濃度是生理電導(dǎo)率的兩倍或三倍將仍然允許負(fù)載伯胺的固體材料對總體病毒減少提供有價(jià)值的增強(qiáng)?？梢栽诟鞣N水平的添加劑下進(jìn)行簡單實(shí)驗(yàn)，以確定它們可能降低負(fù)載伯胺的固體材料減少病毒的能力的程度。用于使獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)上有效的數(shù)據(jù)體以確定給定變量集的最佳條件所需的測試數(shù)量最小化的稱為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(DoE)的技術(shù)在本領(lǐng)域中是眾所周知的。作為一般情況，支持最有效的病毒滅活的條件(獨(dú)立于負(fù)載伯胺的固體材料)與負(fù)載伯胺的固體材料組合將支持病毒的最大總體減少。
在一些實(shí)施方案中，所公開的方法將在增強(qiáng)病毒減少的同時(shí)增強(qiáng)DNA和/或污染蛋白質(zhì)的去除。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，這通過與病毒減少相同的化學(xué)機(jī)制而發(fā)生；意外地隨著pH降低而增加。在一些此類實(shí)施方案中，例如在所需產(chǎn)物確實(shí)結(jié)合到負(fù)載伯胺的表面的情況下，可能有利的是采用最低實(shí)際鹽濃度以有利于病毒的最高減少。在其它實(shí)施方案中，例如在所需蛋白質(zhì)對負(fù)載伯胺的表面具有吸引力的情況下，出于防止所需產(chǎn)物損失和防止被結(jié)合的所需蛋白質(zhì)干擾病毒結(jié)合能力的雙重目的，可能需要增加鹽濃度。在一些此類實(shí)施方案中，鹽濃度的增加通常不應(yīng)大于防止所需蛋白質(zhì)損失和/或防止所需蛋白質(zhì)干擾病毒結(jié)合所必需的鹽濃度。由于每種所需蛋白質(zhì)呈現(xiàn)不同的性質(zhì)，因此應(yīng)當(dāng)理解，可能需要實(shí)驗(yàn)來確定是否需要鹽，并確定它們的最低有效濃度。通過簡單的實(shí)驗(yàn)確定有效濃度在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。
在一些實(shí)施方案中，評價(jià)負(fù)載伯胺的表面和各種形式和組成的裝置以確定哪種提供了對于病毒減少最有效的接觸和最高的能力將是有益的。作為一般情況，膜提供比整體柱更小的流動阻力，但整體柱提供更高的病毒結(jié)合能力。懸浮在所需蛋白質(zhì)制劑中的多孔顆粒通常由于病毒和帶電顆粒之間的大的分子距離而具有差的能力和遲滯的病毒結(jié)合動力學(xué)。填充有多孔顆粒的柱提供比懸浮顆粒更快的動力學(xué)，雖然它們與膜和整體柱相比仍然緩慢并且仍然具有低能力，但多孔顆粒仍然可以實(shí)現(xiàn)有價(jià)值地增強(qiáng)病毒減少。
實(shí)施例
實(shí)施例1.負(fù)載乙二胺的整體柱(CIME DA，BIA Separations)上隨pH而變化的DNA結(jié)合。來自鮭魚精子的基因組DNA用作病毒DNA的替代物。在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中用pH范圍為8.0到3.5的緩沖液平衡EDA整體柱。將懸浮在50mM Tris(pH 8)中的DNA注射到整體柱中。在置換未結(jié)合的樣品組分的洗滌步驟之后，以NaCl或胍的線性梯度洗脫DNA。在兩種情況下，結(jié)果均表明從pH 4開始保留強(qiáng)度不成比例地增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供在表1中：
表1
實(shí)施例2.負(fù)載伯胺的表面上的DNA保留的增強(qiáng)相對于負(fù)載季胺的表面上的減弱的保留。來自鮭魚精子的基因組DNA用作病毒DNA的替代物。評價(jià)了相對于負(fù)載季胺的整體柱(CIM QA，BIA Separations)在負(fù)載伯胺的整體柱(CIM EDA，BIA Separations)上在pH 8、pH7和pH6DNA的保留。在pH 8.0以0.6M NaCl將DNA從QA中洗脫出來，在pH 7.0減弱到0.55M NaCl，并且在pH 6.0進(jìn)一步減弱到0.47M NaCl。在pH 8.0下以0.83M NaCl將DNA從EDA中洗脫出來、在pH 7.0以1.11M NaCl將DNA從EDA中洗脫出來并且在pH 6.0以1.8M NaCl將DNA從EDA中洗脫出來。這些結(jié)果突出了以下事實(shí)，即負(fù)載伯胺的表面上的保留與該趨勢相反，并且與使用負(fù)載季胺的表面所觀察到的相比具有顯著更大的量值。
實(shí)施例3.負(fù)載伯胺的表面上的病毒保留的增強(qiáng)相對于負(fù)載季胺的表面上的減弱的保留。噬菌體M13用作測試病毒。評價(jià)了相對于負(fù)載季胺的整體柱(CIM QA，BIA Separations)在負(fù)載伯胺的整體柱(CIM EDA，BIA Separations)上在pH 8、pH 7和pH 6DNA的保留。在pH 8.0以0.7M NaCl將DNA從QA中洗脫出來，在pH 7.0減弱到0.61M NaCl，并且在pH 6.0進(jìn)一步減弱到0.53M NaCl。在pH 8.0以1.02M NaCl將DNA從EDA中洗脫出來，在pH 7.0以1.47M NaCl將DNA從EDA中洗脫出來并且在pH 6.0以2.5M NaCl將DNA從EDA中洗脫出來。這些結(jié)果突出了以下事實(shí)，即負(fù)載伯胺的表面上的保留與該趨勢相反，并且顯著更大使用負(fù)載季胺的表面所觀察到的。
實(shí)施例4.用負(fù)載伯胺的整體柱增強(qiáng)小鼠細(xì)小病毒(MVM)的減少。將含有MVM的病毒細(xì)胞培養(yǎng)物暴露于pH 3.5達(dá)60分鐘。已知MVM不會被這些條件滅活。通過過濾去除固體，并且使濾液通過平衡到pH 3.5的EDA整體柱。MVM含量降低了log10 2.85個(gè)因數(shù)。這表示約700倍增強(qiáng)病毒的減少，并且特別突出了所公開的方法增強(qiáng)非包膜病毒物種(特別包括逆轉(zhuǎn)錄病毒物種如MVM)的去除的能力。
實(shí)施例5.用負(fù)載伯胺的整體柱增強(qiáng)甲型肝炎病毒(HAV)的減少。將含有HAV的病毒細(xì)胞培養(yǎng)物暴露于pH 3.5達(dá)60分鐘。已知HAV不會被這些條件滅活。通過過濾去除固體，并且使濾液通過平衡到pH 3.5的EDA整體柱。MVM含量降低了log10 2.85個(gè)因數(shù)。這表示約700倍增強(qiáng)病毒的減少，并且進(jìn)一步突出了所公開的方法增強(qiáng)非包膜病毒物種的去除的能力。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，所公開的方法還可以用于純化病毒、尤其是非脂質(zhì)包膜病毒，其中低pH的結(jié)合連同純化可以提供使脂質(zhì)包膜病毒滅活的次要益處。出于相同的原因，同樣顯而易見的是，所公開的方法還可以用于從可能被脂質(zhì)包膜病毒污染的制劑中分離DNA。在兩種情況下，所公開的方法根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的大小不成比例地增強(qiáng)它們的保留的能力還將有利于去除更小的污染物如蛋白質(zhì)。
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如對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的，在不脫離其精神和范圍的情況下可以對本文的實(shí)施方案進(jìn)行許多更改和變化。本文所述的具體實(shí)施方案僅以舉例方式提供，而不意在以任何方式進(jìn)行限制。這意味著本說明書和實(shí)施例僅僅被視為示例性的，所述實(shí)施方案的真正范圍和精神由所附權(quán)利要求書指明。