本申請要求保護(hù)2014年3月16日提交的美國臨時申請第61/953,889號的優(yōu)先權(quán)的權(quán)益，其全部內(nèi)容出于全部目的在此處通過提述以其全文并入。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于合成包含至少一個2′-C-橋接雙環(huán)核苷酸的修飾的核苷、核苷酸和寡核苷酸的方法，還涉及在該方法中使用的中間體。發(fā)明背景包含至少一個2′-C-橋接雙環(huán)核苷酸的修飾的寡核苷酸可提供效力、遞送效率、靶標(biāo)特異性、穩(wěn)定性和/或毒性方面的優(yōu)勢。因此，需要用于有效合成用于摻入該寡核苷酸的2′-C-橋接雙環(huán)核苷酸的方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生2′-C-橋接雙環(huán)核苷或核苷酸(CBBN)或其亞磷酰胺和包含至少一個2′-C-橋接雙環(huán)核苷酸的寡核苷酸方法，以及在該方法中使用的合成性中間體。在多個實(shí)施方案中，合成的寡核苷酸為在效力、遞送效率、靶標(biāo)特異性、穩(wěn)定性和/或毒性方面提供優(yōu)勢的反義抑制劑。在一個方面，本文提供用于產(chǎn)生2’C-橋接雙環(huán)核苷或核苷酸(CBBN)的β-端基異構(gòu)體的方法。所述方法包括糖基化核堿基(例如，全甲硅烷基化的(persilylated)核堿基)的步驟，其中所述糖基供體在2’位置包含經(jīng)保護(hù)的烷基羥基。糖基化步驟隨后是環(huán)化步驟，其中環(huán)化糖基的2’和4’位置。在實(shí)施方案中，所述方法可進(jìn)一步包括純化或回收2’C-橋接雙環(huán)核苷或核苷酸(CBBN)的β-端基異構(gòu)體的步驟。在一個實(shí)施方案中，2’C-橋接雙環(huán)核苷或核苷酸具有式I的結(jié)構(gòu)：其中X為N、S或O。在一個實(shí)施方案中，X為N，與W3形成氨基。在另一個實(shí)施方案中，X為S。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，X為O。W1和W2獨(dú)立地為H、醇保護(hù)基、包含圖示的O的磷酸酯，包含圖示的O的硫代磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或亞磷酰胺(phosphoramidite)。W3獨(dú)立地為空、H、O、胺保護(hù)基、亞磷酰胺、包含O的氨基磷酸酯(phosphoramidate)(當(dāng)X為O時)、包含O的二氨基磷酸酯(phosphordiamidate)(當(dāng)X為O時)、甲基、烷基、環(huán)烷基、羧酰胺、糖、脂肪酸或其他本文所述的綴合分子、-C(O)R或-COOR，其中R為芳基、直鏈烷基、支鏈烷基、環(huán)狀烷基、直鏈烯基、支鏈烯基、環(huán)狀烯基、糖、脂肪酸或其他分子綴合物諸如藥物綴合物。B為核堿基。在一些實(shí)施方案中，核堿基為嘧啶堿基。在其他實(shí)施方案中，核堿基為嘌呤堿基。在一個實(shí)施方案中，W3獨(dú)立地選自空、H、O、胺保護(hù)基、亞磷酰胺、包含N的氨基磷酸酯(當(dāng)X為N時)，包含N的二氨基磷酸酯(當(dāng)X為N時)、甲基、烷基、環(huán)烷基、羧酰胺、糖、脂肪酸、其他分子綴合物、-C1(O)R，或-COOR，其中R為芳基；直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基或烯基；糖、脂肪酸或其他分子綴合物諸如藥物綴合物。此外，在一些方面，當(dāng)X為S時，W3可為＝O或(＝O)2。X＝N、S或OY1、Y2＝-C(O)R、-COCF3、烷基、-COOR式II在多個實(shí)施方案中，糖基化步驟涉及式II結(jié)構(gòu)的糖基供體，其中C為N、S或O。在一個實(shí)施方案中，X為N。在另一個實(shí)施方案中，X為S。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，X為O。W4、W5、W6獨(dú)立地為醇保護(hù)基、烷基磺酸酯(包含圖示的O)或芳基磺酸酯(包含圖示的O)。Y1和Y2獨(dú)立地為H、胺保護(hù)基、甲基、烷基、環(huán)烷基、羧酰胺、糖、脂肪酸，或本文所述的其他綴合分子、-C1(O)R，或-COOR，其中R為芳基；直鏈烷基、支鏈烷基、環(huán)狀烷基、直鏈烯基、支鏈烯基、環(huán)狀烯基、糖、脂肪酸或其他分子綴合物諸如藥物綴合物。在多個實(shí)施方案中，糖基化步驟涉及在2’位置具有經(jīng)保護(hù)的烷基羥基的糖基供體。在一個實(shí)施方案中，糖基供體在2’位置包含經(jīng)乙?；Ｗo(hù)的甲基羥基，且環(huán)化步驟包括用胺、掩蔽的胺或經(jīng)保護(hù)的胺取代羥基并環(huán)化2’和4’位置。在一個實(shí)施方案中，糖基供體在2’位置包含經(jīng)乙?；Ｗo(hù)的甲基氨基取代基，且環(huán)化步驟包括直接環(huán)化2’和4’位置。在一個實(shí)施方案中，糖基供體在2’位置包含經(jīng)乙?；Ｗo(hù)的甲基羥基，且環(huán)化步驟包括用巰基、掩蔽的巰基或經(jīng)保護(hù)的巰基取代羥基并環(huán)化2’和4’位置。在另一個實(shí)施方案中，糖基供體在2’位置包含經(jīng)乙?；Ｗo(hù)的甲基羥基，且環(huán)化步驟包括羥基的脫乙?；h(huán)化2’和4’位置以得到具有醚連接的2’C-4’C-橋接雙環(huán)核苷。在一個實(shí)施方案中，糖基供體在3’位置包含醇保護(hù)基。在一個實(shí)施方案中，醇保護(hù)基為任選取代的芐基醚。在另一個實(shí)施方案中，醇保護(hù)基為熱穩(wěn)定的。在多個實(shí)施方案中，醇保護(hù)基可為乙?；?、甲硅烷基或不穩(wěn)定性醚。在多個實(shí)施方案中，糖基供體為可被取代的戊糖。在一個實(shí)施方案中，糖基供體源自作為起始物質(zhì)的核糖、阿拉伯糖或葡萄糖。在另一方面，本文的方法以高效和高產(chǎn)量的產(chǎn)生2’C-橋接雙環(huán)核苷或核苷酸。在一個實(shí)施方案中，糖基化步驟產(chǎn)生大于50％的β-端基異構(gòu)體產(chǎn)量。在另一個實(shí)施方案中，糖基化步驟產(chǎn)生大于7∶3、大于8∶2或大于9∶1的β∶α端基異構(gòu)體比率。在一個方面，本文提供用于產(chǎn)生2’C-橋接雙環(huán)核苷或核苷酸的β-端基異構(gòu)體的方法，其包括步驟：a)糖基化核堿基，其中糖基供體在2’位置包含經(jīng)保護(hù)的烷基羥基或烷基胺；和b)環(huán)化糖基的2’和4’位置以得到糖基化的雙環(huán)[3.2.1]辛烷環(huán)系統(tǒng)。在某些方面，糖基化包括其中碳水化合物(糖基供體)附接至另一分子(糖基受體)的羥基或其他官能團(tuán)的反應(yīng)。本文的其他方面和實(shí)施方案從以下詳述說明和實(shí)施例將是顯而易見的。附圖簡述圖1提供胺2′-C-橋接雙環(huán)核苷示例性的合成路線。圖2A-2C提供具有不同的核堿基的2′-C-橋接雙環(huán)核苷的示例性生成。圖2A說明胸腺嘧啶核堿基的摻入。圖2B說明完全保護(hù)的腺苷氧代CBBN的合成。摻入腺嘌呤核堿基后為包括羥基脫乙酰化的環(huán)化步驟，環(huán)化2’和4’位置以得到具有醚連接的2’C-4’C-橋接雙環(huán)核苷，且最終苯甲?；?’位置以得到完全保護(hù)的2’C-4’C-橋接雙環(huán)核苷，其中來自式I的“X”為O。圖2C說明鳥嘌呤核堿基的摻入且其中來自式I的“X”為O。圖3A提供鎖核苷(LNA)、其氨基LNA對應(yīng)物、以及2′-O，4′-C-乙烯-橋接核苷(氧代ENA)及其氨基ENA對應(yīng)物的親和性增加(ΔTm，C/修飾)的比較圖表。圖3B提供胺2′-C-橋接雙環(huán)核苷(氨基CBBN)及其氧代CBBN對應(yīng)物的親和性增加(ΔTm，C/修飾)的比較圖表。如所示，胺2′-C-橋接雙環(huán)核苷每個修飾賦予比其氧代CBBN對應(yīng)物多得多的親和性。此外，在寡核苷酸內(nèi)的單一和多重的氨基CBBN修飾賦予等于或大于LNA核苷所具有的親和性。圖4描述了多種miR-208a抑制劑對miR-208a表達(dá)的效力，如在雙熒光素酶報告蛋白測定中所測量。測量了化合物M-10591、M-10101、M-11919和M-11920的活性?；衔颩-10591為非靶向的對照?；衔颩-10101，即混合的9LNA/7DNA硫代磷酸酯寡核苷酸，為優(yōu)化的miR208a抑制劑。M10101化合物描述于美國專利第8,642,751號，其在本文以其整體通過提述并入?；衔颩-10919和M-11920為混合的LNA/DNA/氨基CBBN硫代磷酸酯寡核苷酸，其中專利化合物(M-10101)的LNA胸腺嘧啶分別用1或2氨基CBBN殘基替換。如所示，其中多個LNA殘基用氨基CBBN殘基替換的化合物M-11920保留優(yōu)化的M-10101化合物的全部活性。圖5提供具有腺嘌呤堿基的2′-C-橋接雙環(huán)核苷的示例性生成且其中來自式I的“X”為N。圖6提供具有鳥嘌呤堿基的2′-C-橋接雙環(huán)核苷的示例性生成且其中來自式I的“X”為N。圖7提供具有胸腺嘧啶堿基的2′-C-橋接雙環(huán)核苷的示例性生成且其中來自式I的“X”為N。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于合成包括2′-C-橋接雙環(huán)核苷(CBBN)的經(jīng)修飾的核苷的方法，并涉及在該方法中使用的中間體。在多個方面，合成方法通過使用便宜的容易獲得的起始物質(zhì)和試劑提供成本和便利性方面的優(yōu)勢。本文的方法還允許顯著更高的產(chǎn)量。在一個方面，本文提供用于產(chǎn)生2’C-橋接雙環(huán)核苷或核苷酸(CBBN)的β-端基異構(gòu)體的方法。所述方法包括糖基化核堿基(例如，全甲硅烷基化的核堿基)的步驟，其中糖基供體在2’位置包含經(jīng)保護(hù)的烷基羥基。糖基化步驟隨后為環(huán)化步驟，其中糖基的2’和4’位置環(huán)化導(dǎo)致環(huán)閉合。在一個實(shí)施方案中，所述方法可進(jìn)一步包括純化或回收β-端基異構(gòu)體的步驟。在一個實(shí)施方案中，本文涉及具有式I結(jié)構(gòu)的CBBN的β-端基異構(gòu)體的合成：其中X為N、S或O。在一個實(shí)施方案中，X為N。在另一個實(shí)施方案中，X為S。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，X為O。在多個實(shí)施方案中，W1和W2獨(dú)立地為H、醇保護(hù)基、包含圖示的O的磷酸酯、包含圖示的O的硫代磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或亞磷酰胺。在一個實(shí)施方案中，W3獨(dú)立地為空、H、O、胺保護(hù)基、亞磷酰胺、包含O的氨基磷酸酯(當(dāng)X為O時)、包含O的二氨基磷酸酯(當(dāng)X為O時)、甲基、烷基、環(huán)烷基、羧酰胺、糖、脂肪酸、或其他本文所述的綴合分子、-C1-4(O)R或-COOR，其中R為芳基；直鏈烷基、支鏈烷基、環(huán)狀烷基、直鏈烯基、支鏈烯基、環(huán)狀烯基、糖、脂肪酸或其他分子綴合物諸如藥物綴合物。在一個實(shí)施方案中，W3獨(dú)立地選自空、H、O、胺保護(hù)基、亞磷酰胺、包含N的氨基磷酸酯(當(dāng)X為N時)、包含N的二氨基磷酸酯(當(dāng)X為N時)、甲基、烷基、環(huán)烷基、羧酰胺、糖、脂肪酸、其他分子綴合物、-C1(O)R或-COOR，其中R為芳基；直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基或烯基；糖、脂肪酸或其他分子綴合物諸如藥物綴合物。此外，在一些方面，當(dāng)X為S時，W3可為＝O或(＝O)2。在多個實(shí)施方案中，醇保護(hù)基團(tuán)選自4’4-二甲氧基三苯甲基、乙?；⒓坠柰榛蛩岵环€(wěn)定性醚。在一個實(shí)施方案中，W1和W2分別獨(dú)立選自下組的醇保護(hù)基：4’4-二甲氧基三苯甲基、乙酰基、甲硅烷基或酸不穩(wěn)定性醚。在多個實(shí)施方案中，胺保護(hù)基為芐氧羰基(carbobenzyloxy，Cbz)、對甲氧基芐基羰基(Moz或MeOZ)、叔丁基氧基羰基(BOC)，9-芴基甲基氧基羰基(FMOC)、乙?；?Ac)、苯甲?；?Bz)、芐基(Bn)、三氟乙?；?tfa)。在一個實(shí)施方案中，W3為選自芐氧羰基、叔丁基氧基羰基或三氟乙酰胺基(trifluoroacetamidyl)的胺保護(hù)基團(tuán)。在一個實(shí)施方案中，W3為不穩(wěn)定的烷基取代基，產(chǎn)生叔胺。在多個實(shí)施方案中，2’-C-橋接雙環(huán)核苷為2’-脫氧-2’-C，4’-C橋接的雙環(huán)核苷(2’-CBBN)。在多個實(shí)施方案中，氧代-2’-C-橋接雙環(huán)核苷為2’-脫氧-2’-C，4’-C橋接的雙環(huán)核苷，其中2’C和4’C通過氧連接，產(chǎn)生三原子連接(-C-O-C-)(氧代CBBN)。在多個實(shí)施方案中，氨基-2’-C-橋接雙環(huán)核苷或氮雜-2’-橋接雙環(huán)核苷為2’-脫氧-2’-C，4’-C-橋接雙環(huán)核苷，其中2’C和4’C通過氮連接，產(chǎn)生三原子連接(-C-N-C-)(氨基CBBN)。在多個實(shí)施方案中，硫代-2’-C-橋接雙環(huán)核苷為2’-脫氧-2’-C，4’-C-橋接雙環(huán)核苷，其中2’C和4’C通過硫連接，產(chǎn)生三原子連接(-C-S-C-)(硫代CBBN)。在多個實(shí)施方案中，氨基-2’-C-橋接雙環(huán)核苷酸和硫代-2’-C-橋接雙環(huán)核苷酸分別為氨基-2’-C-橋接雙環(huán)核苷和硫代-2’-C-橋接雙環(huán)核苷的磷酸酯。在多個實(shí)施方案中，鎖核苷為2’-氧-4’-C橋接雙環(huán)核苷(LNA)，其在核苷的核糖環(huán)的2’和4’位置之間具有2原子連接。核心糖形成2.5-二氧雜雙環(huán)[2.2.1]庚烷結(jié)構(gòu)。在多個實(shí)施方案中，ENA和氧代ENA為2’-氧-4’-C橋接雙環(huán)核苷，其在核苷的核糖環(huán)的2’和4’位置間具有3原子連接。核心糖形成2.6-二氧雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷結(jié)構(gòu)。在多個實(shí)施方案中，氨基ENA和氮雜ENA為2’-氮雜-4’-C橋接雙環(huán)核苷，其在核苷的核糖環(huán)的2’和4’位置間具有3原子連接。核心糖形成6-氧雜-2-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷結(jié)構(gòu)。在多個實(shí)施方案中，B為核堿基。核堿基或堿基可為嘌呤或嘧啶堿基，其可經(jīng)修飾。在一個實(shí)施方案中，核堿基為嘌呤堿基。在另一個實(shí)施方案中，核堿基為嘧啶堿基。在多個實(shí)施方案中，核堿基可選自天然核苷堿基，諸如腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶，或其衍生物和替代物。另外，本發(fā)明也考慮使用非天然存在的核堿基。在某些實(shí)施方案中，非天然存在的核堿基可為其中核堿基的環(huán)原子中任意一個被另一個原子取代的堿基。例如，CH可被N取代，反之亦然。這些修飾可發(fā)生在多于一個位置。非天然存在的堿基的另一個例子為其中天然存在堿基的2-和4-取代基反轉(zhuǎn)的堿基。另外的嘌呤和/或嘧啶堿基修飾描述于WO2012/061810，其通過提述完整并入本文。在一些實(shí)施方案中，堿基修飾為氨基羰基，諸如羧酰氨基、氨基甲?；?carbamoyl)或脲(carbamide)基。在多個實(shí)施方案中，修飾在一個或多個嘧啶堿基的C-5位置，和/或在一個或多個嘌呤堿基的C-8位置。示例性的核堿基包括但不限于，9-N-腺嘌呤、9-N-鳥嘌呤、胸苷、胞苷、尿苷、5-甲基-胞嘧啶、肌苷、5-取代的尿苷、5-取代的胞嘧啶、2-氨基腺嘌呤或5-甲基胞嘧啶。在多個實(shí)施方案中，糖基化步驟涉及在2’位置具有經(jīng)保護(hù)的烷基羥基的糖基供體，其中烷基羥基可為C1-C4烷基羥基。在一個實(shí)施方案中，糖基供體在2’位置包含經(jīng)乙?；Ｗo(hù)的甲基羥基。在某些實(shí)施方案中，糖基供體在3’位置包含醇保護(hù)基。在一個實(shí)施方案中，醇保護(hù)基包含任選取代的芐基醚。在另一個實(shí)施方案中，醇保護(hù)基為熱穩(wěn)定的。示例性的醇保護(hù)基包括但不限于乙酰基、甲硅烷基或堿不穩(wěn)定性醚。在一個實(shí)施方案中，醇保護(hù)基為4-鹵代芐基。如圖1(化合物17和18)所示，該方案提供高比率的β-端基異構(gòu)體。在多個實(shí)施方案中，糖基供體可為戊糖，其可被取代。在某些實(shí)施方案中，糖基供體源自便利的起始物質(zhì)例如核糖、阿拉伯糖或葡萄糖。2’和4’位置可隨后環(huán)化。2’-羥基甲基可脫保護(hù)或直接環(huán)化以得到2’-C，4’-C-橋接雙環(huán)核苷?？商鎿Q地，環(huán)化前，脫保護(hù)的2’-羥基甲基可轉(zhuǎn)化為胺、掩蔽的胺或經(jīng)保護(hù)的胺，隨后在N-中心環(huán)化以得到氨基-2’-C，4’-C-橋接雙環(huán)核苷。可替換地，環(huán)化前，脫保護(hù)的2’-羥基甲基可轉(zhuǎn)化為巰基、掩蔽的巰基或經(jīng)保護(hù)的巰基，隨后在S-中心環(huán)化以得到硫代-2’-C，4’-C-橋接雙環(huán)核苷。在一個方面，本文的合成方法通過使用便宜、更易獲得和更安全的化學(xué)試劑提供成本、便利和安全性方面的優(yōu)勢。在多個實(shí)施方案中，本文的方法以高效和高產(chǎn)量產(chǎn)生2’C-橋接雙環(huán)核苷或核苷酸。在一個實(shí)施方案中，糖基化步驟產(chǎn)生大于50％、大于60％、大于70％、大于80％或大于90％的β-端基異構(gòu)體。在一個實(shí)施方案中，糖基化步驟產(chǎn)生大于7∶3、大于8∶2或大于9∶1的β∶α端基異構(gòu)體比率。在一些實(shí)施方案中，2’C-橋接雙環(huán)核苷或核苷酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的亞磷酰胺，通過固相合成摻入寡核苷酸。在多個實(shí)施方案中，2’C-橋接雙環(huán)核苷或核苷酸合成可涉及所示的一種或多種中間體，例如圖1和2中所示，包括但不限于甲基-D-核糖、甲基5-O-(TBDPS)-α，β-D-核糖呋喃糖苷、甲基5-O-(TBDPS)-2，3-O-雙(4-氯芐基)-α，β-D-核糖呋喃糖苷、甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯芐基)-α-D-核糖呋喃糖苷、甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯芐基)-2-氧代-α-D-核糖呋喃糖苷、甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯芐基)-2-脫氧-2-亞甲基-α-D-核糖呋喃糖苷、甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯芐基)-2-脫氧-2-α-羥基甲基-α-D-核糖呋喃糖苷、甲基3-O-(4-氯芐基)-2-脫氧-2-α-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷、甲基5-氧代-3-O-(4-氯芐基)-2-脫氧-2-α-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷、甲基4-C-羥基甲基-3-O-(4-氯芐基)-2-脫氧-2-α-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷、甲基5-O-甲磺?；?4-C-(甲磺酰氧基甲基)-3-O-(4-氯芐基)-2-脫氧-2-α-(羥基甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷、乙酸((2S，3R，4S)-2-乙酰氧基-4-((4-氯芐基)氧基)-5，5-二(((甲基磺?；?氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)甲酯、乙酸((3R，4S)-4-((4-氯芐基)氧基)-2-(胸苷-基)-5，5-二(((甲基磺?；?氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)甲酯、二甲磺酸((3S，4R)-3-((4-氯芐基)氧基)-4-(羥基甲基)-5-(胸苷-基)四氫呋喃-2，2-二基)二(亞甲基)酯、二甲磺酸((3S，4R)-5-(胸苷-基)-3-((4-氯芐基)氧基)-4-(羥基甲基)四氫呋喃-2，2-二基)二(亞甲基)酯、二甲磺酸((3S，4R，5R)-4-(((叔丁氧基-(2，2，2-三氟乙氧基)二羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯芐基)氧基)-5-(3-苯甲?；?-胸苷-基)四氫呋喃-2，2-二基)二(亞甲基)酯、二甲磺酸((3S，4R，5R)-4-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯芐基)氧基)-5-(胸苷-基)四氫呋喃-2，2-二基)二(亞甲基)酯、(1R，5R，7R，8S)-8-((4-氯芐基)氧基)-7-(胸苷-基)-5-(((甲基磺?；?氧基)甲基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯、1-((1R，5R，7R，8S)-8-((4-氯芐基)氧基)-5-(羥基甲基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-7-基)-胸苷、(1R，5R，7R，8S)-8-((4-氯芐基)氧基)-7-(胸苷-基)-5-(羥基甲基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯、(1R，5R，7R，8S)-8-羥基-7-(胸苷-基)-5-(羥基甲基)-3-(2，2，2-三氟乙?；?-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷、(1R，5R，7R，8S)-8-羥基-7-(胸苷-基)-5-((4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基)甲基)-3-(2，2，2-三氟乙?；?-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷、(1R，5R，7R，8S)-7-(胸苷-基)-5-((4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基)甲基)-3-(2，2，2-三氟乙?；?-6，8-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-8-O-(2-氰基乙基)-N，N-二異丙基亞磷酰胺、乙酸((3R，4S)-4-((4-氯芐基)氧基)-2-(6-N-苯甲?；佘?基)-5，5-二(((甲基磺?；?氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)甲酯、乙酸((3R，4S)-4-((4-氯芐基)氧基)-2-(6-N-異丁酰鳥苷-基)-5，5-雙(((甲基磺?；?氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)甲酯和苯甲酸{(1R，5R，7R，8S)-7-[(9R)-9a-苯甲?；?9-腺嘌呤]-8-(4-氯芐基氧基)-3.6-二氧雜雙環(huán)[3.2.1]辛-5-基}甲酯。這些中間體中所述的保護(hù)基可替換地可用其他本領(lǐng)域已知或本文所述的保護(hù)基取代，諸如4-單甲氧基三苯甲基氧基代替4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基保護(hù)基。在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸包含與miR-15a或b、miR-29、miR-92、miR-143、miR-145、miR-195、miR-206、miR-208a、miR-208b、miR-378、miR-451和/或miR-499的核苷酸序列基本上互補(bǔ)的序列。在示例性的實(shí)施方案中，寡核苷酸可包含與人miR-208a、miR-208b、miR-378、miR-451和/或miR-499的序列基本上互補(bǔ)的序列。在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸可包含與人miR-208a、miR-208b、miR-378、miR-451和/或miR-499的序列基本上相同的序列。如本文使用，″基本上互補(bǔ)”或“基本上相同”是指與靶標(biāo)多核苷酸序列至少約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％互補(bǔ)或相同的序列。通過固相合成對寡核苷酸(包括修飾的多核苷酸)進(jìn)行合成為本領(lǐng)域公知且由Caruthers等人，“NewChemicalMethodsforSynthesizingPolyNucleicAcid，”NucleicAcidsSymp.Ser.，(7)：215-23(1980)綜述，其在本文通過提述全部并入。寡核苷酸的合成取決于所選利用的核苷酸單體將有所變化。在示例性的實(shí)施方案中，用于合成的核苷酸單體包括但不限于二甲氧基三苯甲基(DMTr)-保護(hù)的胺2′-C-橋接雙環(huán)核苷亞磷酰胺、DMTr-保護(hù)的胺2′-C-橋接雙環(huán)核苷的內(nèi)亞磷酰胺衍生物、DMTr-和三氟乙酸酯-保護(hù)的胺2′-C-橋接雙環(huán)核苷亞磷酰胺、DMTr-保護(hù)的脂肪酸綴合的胺2′-C-橋接雙環(huán)核苷亞磷酰胺，和DMTr-保護(hù)的糖綴合的胺2′-C-橋接雙環(huán)核苷亞磷酰胺。在某些實(shí)施方案中，利用二甲氧基三苯甲基(DMTr)-保護(hù)的胺2′-C-橋接雙環(huán)核苷亞磷酰胺、DMTr-和三氟乙酸酯-保護(hù)的胺2′-C-橋接雙環(huán)核苷亞磷酰胺、DMTr-保護(hù)的脂肪酸綴合的胺2′-C-橋接雙環(huán)核苷亞磷酰胺和DMTr-保護(hù)的糖綴合的胺2′-C-橋接雙環(huán)核苷亞磷酰胺合成寡核苷酸可能需要延長的偶聯(lián)時間。在某些實(shí)施方案中，對于涉及DMTr-保護(hù)的胺2′-C-橋接雙環(huán)核苷的內(nèi)亞磷酰胺衍生物的寡核苷酸的合成，標(biāo)準(zhǔn)的寡核苷酸合成循環(huán)可通過用非標(biāo)準(zhǔn)的封蓋試劑替換利用Ac2O/堿的常規(guī)封蓋試劑修飾?？商鎿Q地，在亞磷酰胺偶聯(lián)循環(huán)后但在標(biāo)準(zhǔn)封蓋步驟前，合成可立即通過用對于合成循環(huán)穩(wěn)定的胺反應(yīng)性綴合物或保護(hù)基(但如果合意，可在隨后去除)處理新偶聯(lián)的寡核苷酸修飾。參考文獻(xiàn)的并入本文引用的全部參考文獻(xiàn)、文章、出版物、專利、專利公開和專利申請出于全部目的通過提述以其整體并入。然而，本文引用的任何參考文獻(xiàn)、文章、出版物、專利、專利公開和專利申請的提述并非，也不應(yīng)該被認(rèn)作是對其構(gòu)成有效現(xiàn)有技術(shù)的承認(rèn)或任何形式的建議。實(shí)施例實(shí)施例1：氨基2’-C-4’C-橋接雙環(huán)核苷的產(chǎn)生本實(shí)施例描述了用于產(chǎn)生胺2’-C-橋接雙環(huán)核苷的關(guān)鍵中間體的合成(參見圖1)。甲基-D-核糖(2)將D-核糖(1)(90g，599mmol)、Amberlyst15(H+)(90g，599mmol)和MolecularTrapPack(90g，599mmol)平分到三個500mL的肖特瓶(SchottBottle)中(即每個肖特瓶中各30g)。每個瓶中使用等量的甲醇填充(體積：1350ml，即450ml/瓶)以得到無色溶液。將所有的瓶放置到定軌搖床上，在250rpm/25℃持續(xù)17小時。在15％MeOH/DCM作為顯色溶劑中，相比于與未經(jīng)保護(hù)的核糖的共位點(diǎn)(co-spot)，通過反應(yīng)溶液的TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。經(jīng)由Hannessian染色劑通過炭化顯現(xiàn)糖類。溶液通過玻璃垂熔漏斗過濾。使用過量的MeOH(約500mL/瓶，其含有各30g的Amberlyst和TrapPack)清洗催化劑和MolecularTrapPack。通過添加15mLTEA(5ml/反應(yīng)瓶)使甲醇溶液為堿性。該混合物濃縮至干。將殘留物與二氯甲烷(3x200mL)共蒸發(fā)以共沸除去殘留的MeOH。殘留物在高真空下過夜干燥，得到97.55g(99％)甲基-D-核糖(2)，其未經(jīng)進(jìn)一步純化即使用。甲基5-O-(TBDPS)-α，β-D-核糖呋喃糖苷(3)在1L的圓底燒瓶中，甲基-D-核糖(2，60.12g，366mmol)和DIEA(128ml，732mmol)溶解于DMF(體積：400ml)以得到無色溶液。該燒瓶使用氬氣沖洗，并在冰浴中冷卻到0℃。在10分鐘內(nèi)逐滴添加TBDPS-Cl(99ml，385mmol)，并允許該混合物過夜達(dá)到室溫。將反應(yīng)混合物倒入飽和NaHCO3溶液(1L)中。使用EtOAc(3x300mL)萃取水相。合并有機(jī)相并使用水(1x400mL)和鹽水(1x400mL)清洗。將有機(jī)相經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并濃縮以得到深棕色油，其通過分為4個等份并經(jīng)由硅膠色譜純化來純化，所述硅膠色譜在75分鐘內(nèi)以100mL/min運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)的0-100％EtOAc/Hex梯度，接著為7分鐘保持在100％EtOAc。合并純級分以得到121.59g(82％)作為無色油狀物的甲基5-O-(TBDPS)-α，β-D-核糖呋喃糖苷(3)。甲基5-O-(TBDPS)-2，3-O-雙(4-氯芐基)-α，β-D-核糖呋喃耱苷(4)在2L的圓底燒瓶中稱量甲基5-O-(TBDPS)-α，β-D-核糖呋喃糖苷(3，55.0g，137mmol)。將該物質(zhì)與甲苯(2x100mL)在高真空在40℃共蒸發(fā)。該燒瓶裝有回流冷凝器并且該起始物質(zhì)在氬氣下溶解于甲苯(體積：500ml)。在約5g部分中添加氫化鈉(21.86g，547mmol)以得到灰色懸浮液。將混合物加熱到60℃且保持30分鐘，隨后使用冰浴冷卻到室溫。在劇烈攪拌下，在約15g部分中添加1-氯-4-(氯甲基)苯(66.0g，410mmol)。將混合物加熱并在回流攪拌過夜。將反應(yīng)混合物冷卻到0℃并使用500mLEtOAc稀釋。通過緩慢添加EtOH(50mL)使混合物淬滅，以使起泡最小化。將混合物用EtOAc進(jìn)一步稀釋到1.5L，并使用10％Na2CO3(2x500mL)和飽和NaCl(1x500mL)清洗。將有機(jī)物經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并濃縮。通過硅膠色譜純化粗產(chǎn)物。使用0-30％EtOAc/己烷梯度洗脫產(chǎn)物。將收集的純級分合并以得到作為黃褐色油狀物的甲基5-O-(TBDPS)-2，3-O-雙(4-氯芐基)-α，β-D-核糖呋喃糖苷(4，62.15g，70％)。甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯芐基)-α-D-核糖呋喃耱苷(5)在1L的圓底燒瓶中，將甲基5-O-(TBDPS)-2，3-O-雙(4-氯芐基)-α，β-D-核糖呋喃糖苷(4，65g，100mmol)溶解于600mLDCM以得到黃色溶液。將該混合物在氬氣下冷卻至0℃。在10分鐘內(nèi)緩慢添加氯化錫(IV)(150ml，150mmol)，期間溶液變成清澈的深棕色溶液。將反應(yīng)混合物在4℃在氬氣下伴隨攪拌儲存過夜。使用DCM(250mL)稀釋反應(yīng)混合物，并在4L分液漏斗(sepfunnel)中添加至500mLDI水中。將混合物劇烈振搖并使其分離。保留所有有機(jī)物和乳液/沉淀物，并使用第二等分試樣的500mL水清洗。保留所有有機(jī)物和乳液/沉淀物，并使用500mL水中的10％Na2CO3清洗。通過添加MeOH和機(jī)械攪拌減少乳液。保留所有有機(jī)物和乳液/沉淀物并最后使用500mL鹽水清洗。再次，通過添加MeOH和機(jī)械攪拌減少乳液。取出有機(jī)相并通過MgSO4懸浮液干燥。使用與MgSO4懸浮液組合的另外的DCM(2x100mL)萃取剩下的乳液和水相。過濾有機(jī)相并濃縮為棕色油。通過使用0-30％EtOAc/己烷梯度的硅膠柱色譜純化粗產(chǎn)物。將收集的純級分合并以的作為黃褐色油狀物的甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯芐基)-α-D-核糖呋喃糖苷(5，41.20g，78％)。甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯芐基)-2-氧代-α-D-核糖呋喃糖苷(6)在1L的圓底燒瓶中，將甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯芐基)-α-D-核糖呋喃糖苷(5，41.00g，78mmol)和TEMPO(1.215g，7.78mmol)溶解于DCM(體積：250ml)以得到橙色溶液。添加二乙酸碘苯(37.6g，117mmol)并將該混合物在室溫攪拌過夜。使用DCM將反應(yīng)混合物稀釋到500mL并使用飽和硫代硫酸鈉溶液(2x300mL)和鹽水(1x300mL)清洗。將有機(jī)相經(jīng)MgSO4干燥，過濾并濃縮。該橙色殘留物在高真空下在50℃干燥3小時。作為黃褐色油狀物的粗制甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯芐基)-2-氧代-α-D-核糖呋喃糖苷(6，40.50，“99％”)用于后續(xù)反應(yīng)。甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯芐基)-2-脫氧-2-亞甲基-α-D-核耱呋喃糖苷(7)在2000mL圓底燒瓶中將甲基三苯基溴化鏻(6，26.6g，75mmol)懸浮于乙醚(比率：20.00，體積：1500ml)以得到白色懸浮液。使用氬氣沖洗燒瓶并在冰浴中冷卻至0℃。將叔戊醇鈉(7.39g，67mmol)溶解于苯(比率：1.000，體積：75ml)并立即添加至懸浮液。再次使用氬氣沖洗該燒瓶并允許在2小時內(nèi)達(dá)到室溫。將該懸浮液再攪拌4小時。接著將該懸浮液在丙酮/干冰浴中冷卻至-72℃。將甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯芐基)-2-氧代-α-D-核糖呋喃糖苷(19.56g，37.25mmol)溶解于另外的乙醚(比率：1.067，體積：40ml)。通過注射器添加碳水化合物溶液并將該反應(yīng)混合物在4℃攪拌17小時。TLC顯示該反應(yīng)是完全的(15％EtOAc/Hex)。使用飽和NH4Cl(2x500mL)和鹽水(1x250mL)清洗該反應(yīng)混合物。使用乙醚(150mL)反萃取水相。將有機(jī)相合并，并通過鹽水清洗(1x250mL)和添加Na2SO4干燥。過濾并濃縮有機(jī)相。通過使用0-20％EtOAc/己烷梯度的硅膠柱色譜完成純化。合并純級分并濃縮至干以的作為無色油狀物的甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯芐基)-2-脫氧-2-亞甲基-α-D-核糖呋喃糖苷(7，14.79g，28.3mmol，76％收率)。甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯芐基)-2-脫氧-2-α-羥基甲基-α-D-核糖呋喃糖苷(8)在氬氣下，在室溫將9-BBN(8.97g，73.5mmol)添加至于THF(300ml)中的甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯芐基)-2-脫氧-2-亞甲基-α-D-核糖呋喃糖苷(7，28.50g，54.5mmol)溶液。在室溫將反應(yīng)混合物攪拌1.5小時后，TCL顯示所有起始物質(zhì)被消耗。添加過硼酸鈉四水合物(33.9g，221mmol)和水(80mL)，并在室溫將混合物再攪拌2小時。分離有機(jī)層，將水相稀釋至400mL，接著使用乙酸乙酯(3x250mL)萃取。將有機(jī)層合并，并經(jīng)MgSO4干燥。去除溶劑，通過使用0-60％的乙酸乙酯/己烷梯度洗脫的硅膠色譜純化產(chǎn)物。合并純化的級分并濃縮至干以得到作為無色油狀物的甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯芐基)-2-脫氧-2-α-羥基甲基-α-D-核糖呋喃糖苷(8，26.39g，48.8mmol，90％收率)。甲基3-O-(4-氯芐基)-2-脫氧-2-α-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷(10)在1L圓底燒瓶中，在氬氣下，將甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯芐基)-2-脫氧-2-α-羥甲基-α-D-核糖呋喃糖苷(8，26.30g，48.6mmol)溶解于吡啶(200ml)以得到無色溶液。將DMTr-C1(20.58g，60.8mmol)立刻添加至攪拌的溶液。將反應(yīng)混合物攪拌過夜。通過以下方式將三苯甲基化反應(yīng)淬滅：伴隨攪拌添加50mLMeOH達(dá)20分鐘，隨后使用EtOAc將混合物稀釋至750mL。使用飽和NaHCO3溶液(3x350mL)和鹽水(1x150mL)清洗有機(jī)相。將該有機(jī)相經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并濃縮至干。將粗產(chǎn)物(9a)溶解于THF(體積：70ml)。將1.0MTBAF/THF溶液(72.9ml，72.9mmol)添加到混合物并在室溫攪拌1.5小時。TBAF的添加導(dǎo)致產(chǎn)生深色、煙熏色的溶液。將該混合物濃縮至干并應(yīng)用于使用3％TEA/己烷預(yù)處理的330gISCO硅膠柱。使用0-60％EtOAc/己烷梯度在50分鐘內(nèi)以100mL/min洗脫產(chǎn)物。合并純級分并濃縮以得到作為無色油狀物的甲基3-O-(4-氯芐基)-2-脫氧-2-α-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷(10，27.17g，44.9mmol，92％收率)。甲基3-O-(4-氯芐基)-2-脫氧-2-α-(4單甲氧基三苯甲基氧基甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷(10b)在250圓底燒瓶中，在氬氣下，將甲基5-O-(TBDPS)-3-O-(4-氯芐基)-2-脫氧-2-α-羥基甲基-α-D-核糖呋喃糖苷(8，1.82g，3.36mmol)溶解于吡啶(25ml)以得到無色溶液。將MMTr-Cl(1.30g，4.20mmol)立刻添加至攪拌的溶液。將反應(yīng)混合物攪拌過夜。通過以下方式將三苯甲基化反應(yīng)淬滅：伴隨攪拌添加50mLMeOH達(dá)20分鐘，接著使用EtOAc將混合物稀釋至150mL。使用飽和NaHCO3溶液(3x75mL)和鹽水(1x50mL)清洗有機(jī)相。將該有機(jī)相經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并濃縮至干。將粗產(chǎn)物(9b)溶解于THF(體積：10ml)。將1.0MTBAF/THF溶液(5.0ml，5.0mmol)添加到混合物并在室溫攪拌1.5小時。TBAF的添加導(dǎo)致產(chǎn)生深色、煙熏色的溶液。將該混合物濃縮至干并應(yīng)用于使用3％TEA/己烷預(yù)處理的100gISCO硅膠柱。使用0-60％EtOAc/己烷梯度在30分鐘內(nèi)以50mL/min洗脫產(chǎn)物。合并純級分并濃縮以得到作為無色油狀物的甲基3-O-(4-氯芐基)-2-脫氧-2-α-(4-單甲氧基三苯甲基氧基甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷(10b，1.74g，3.02mmol，90％產(chǎn)率)。甲基5-氧代-3-O-(4-氯芐基)-2-脫氧-2-α-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷(11)在1L圓底燒瓶中，將甲基3-O-(4-氯芐基)-2-脫氧-2-α-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷(10a，27.15g，44.9mmol)和DCC(27.8g，135mmol)溶解于DMSO(166ml，2333mmol)以得到無色溶液。將吡啶(5.44ml，67.3mmol)和TFA(1.728ml，22.43mmol)組合于40mLDMSO中并將所得溶液添加至反應(yīng)混合物。將燒瓶蓋好并在室溫攪拌過夜。添加水(25mL)，并使反應(yīng)在室溫攪拌3小時。使用500mLEtOAc稀釋該反應(yīng)并過濾。使用另外的200mLEtOAc清洗沉淀。合并的有機(jī)物使用鹽水(5x400mL)清洗，使用Na2SO4干燥，過濾并濃縮。該產(chǎn)物通過使用0-100％EtOAc/Hex梯度的硅膠柱色譜純化。合并且濃縮純級分，以得到作為白色泡沫狀物的甲基5-氧代-3-O-(4-氯芐基)-2-脫氧-2-α-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷(11a，25.22g，41.8mmol，93％收率)。甲基4-C-羥基甲基-3-O-(4-氯芐基)-2-脫氧-2-α-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷(12)在2L的圓底燒瓶中，將甲基5-氧-3-O-(4-氯芐基)-2-脫氧-2-α-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷(11a，25.20g，41.8mmol)溶解于二噁烷(1000ml)以得到無色溶液。伴隨攪拌添加甲醛(249ml，3343mmol)。該反應(yīng)混合物在冰浴中冷卻至0℃。該燒瓶裝有750mL的恒壓滴液漏斗，在30分鐘內(nèi)添加2.0M氫氧化鈉(606ml，1212mmol)以得到渾濁的白色溶液。在42小時里允許攪拌混合物，期間達(dá)到室溫。該溶液變清澈。通過添加磷酸二氫鈉一水合物(86g，627mmol)中和該溶液。該溶液濃縮至其體積的約三分之一，使用500mL水稀釋并用DCM(3x300mL)萃取。將有機(jī)層合并且使用鹽水清洗(1x300mL)，隨后經(jīng)Na2SO4干燥。除去溶劑，并將產(chǎn)物通過使用0-10％MeOH/DCM梯度洗脫的硅膠色譜純化。合并純化的級分并濃縮至干以得到作為無色油狀物的甲基4-C-羥基甲基-3-O-(4-氯芐基)-2-脫氧-2-α-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷(12a，22.50g，35.4mmol，85％收率)。甲基5-O-甲磺?；?4-C-(甲磺酰氧基)-3-O-(4-氯芐基)-2-脫氧-2-α-(羥基甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷(14)在1L圓底燒瓶中，在Ar下，將甲基4-羥甲基-3-O-(4-氯芐基)-2-脫氧-2-α-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷(12a，2.50g，35.4mmol)溶解于吡啶(200ml)以得到無色溶液。該混合物在冰浴中冷卻至0℃。將甲磺?；?Cl(8.28ml，106mmol)在10分鐘內(nèi)逐滴添加到攪拌的溶液。該反應(yīng)混合物在室溫攪拌45分鐘。通過以下方式將甲磺?；磻?yīng)淬滅：將該反應(yīng)冷卻至0℃，并伴隨攪拌添加15mL水達(dá)20分鐘。使用EtOAc將該混合物稀釋至750mL，并使用鹽水清洗(3x400mL)。有機(jī)相經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并濃縮至干。該粗產(chǎn)物(13a)溶解于800mLAcOH。將水(200mL)添加至攪拌的溶液。該溶液在室溫攪拌2.5小時，隨后使用500mL水稀釋。將該混合物濃縮至約400mL并使用另外250mL水稀釋。將該溶液在高真空下濃縮至干。將殘留物應(yīng)用于220gISCO硅膠柱并使用0-100％EtOAc/己烷梯度洗脫該產(chǎn)物。合并純級分并濃縮以得到作為無色油狀物的甲基5-O-甲磺?；?4-C-(甲磺酰基氧基甲基)-3-O-(4-氯芐基)-2-脫氧-2-α-(羥甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷(14，10.01g，20.47mmol，57.8％收率)。可替換地，將粗產(chǎn)物(13b)二甲磺酸((3S，4R，5S)-3-((4-氯芐基)氧基)-5-甲氧基-4-((4-單甲氧基三苯甲基氧基)甲基)四氫呋喃-2，2-二基)雙(亞甲基)酯(1.60g，2.10mmol)稱量于帶有攪拌棒的200ml圓底燒瓶中。向該燒瓶加入乙腈且設(shè)置為攪拌直至碳水化合物完全溶解。將水添加至攪拌的溶液，隨后添加硝酸鈰銨(0.115g，0.21mmol)?；厥栈旌衔锊⒓訜嶂?0℃達(dá)1小時。將溶液冷卻至室溫并倒入鹽水溶液(500mL)中。用乙酸乙酯(3x100mL)萃取水相。合并有機(jī)相并經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾并濃縮。將所得的物質(zhì)應(yīng)用于50gBiotageSNAP硅膠柱并用0-100％EtOAc/己烷梯度洗脫。合并純級分并濃縮以得到作為無色油狀物的甲基5-O-甲磺?；?4-C-(甲磺酰氧基甲基)-3-O-(4-氯芐基)-2-脫氧-2-α-(羥基甲基)-α-D-核糖呋喃糖苷(14，0.94g，91.5％)。乙酸((2S，3R，4S)-2-乙酰氧基-4-((4-氯芐基)氧基)-5，5-雙(((甲基磺酰基)氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)甲酯(16)將二甲磺酸((3S，4R，5S)-3-((4-氯芐基)氧基)-4-(羥基甲基)-5-甲氧基四氫呋喃-2，2-二基)雙(亞甲基)酯(3.41g，6.97mmol)稱量于帶有攪拌棒的100ml圓底燒瓶中，并用隔膜密封。將該燒瓶冷卻至0℃并加入吡啶(體積：25ml)和乙酸酐(1.316ml，13.95mmol)。使混合物在6小時內(nèi)達(dá)到室溫。將該混合物冷卻至0℃并添加MeOH(1mL)且攪拌15分鐘。將混合物濃縮至干并再溶解于EtOAc(100mL)。使用水性1％HCl(50mL)、飽和碳酸氫鈉(50mL)和鹽水(50mL)清洗有機(jī)相。將有機(jī)相經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并濃縮。在100mL圓底燒瓶中使用乙酸(9.98ml，174mmol)和乙酸酐(2.63ml，27.9mmol)再溶解所得的油狀物。添加H2SO4(0.037ml，0.697mmol)，用隔膜密封該燒瓶，過夜攪拌該混合物。使用水(100mL)稀釋混合物并使用EtOAc(3x75mL)萃取。將有機(jī)相合并且使用飽和碳酸氫鈉(2x100mL)和鹽水(1x100mL)小心清洗。將有機(jī)相經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并濃縮以得到作為淺黃色油狀物的3.15g粗制((2S，3R，4S)-2-乙酰氧基-4-((4-氯芐基)氧基)-5，5-雙(((甲基磺?；?氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)甲基乙酸酯(3.15g，5.64mmol，81％收率)，其未經(jīng)進(jìn)一步純化即使用。ESI-MS：617(M+乙酸鹽)-((3R，4S)-4-((4-氯芐基)氧基)-2-(胸-苷-基)-5，5-雙(((甲基磺?；?氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)甲基乙酸酯(17)將N，O-雙(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(4.07ml，16.64mmol)添加到于無水乙腈(20ml)中的((3R，4S)-2-乙酰氧基-4-((4-氯芐基)氧)-5，5-雙(((甲基磺?；?氧)甲基)四氫呋喃-3-基)甲基乙酸酯(3.10g，5.55mmol)和胸腺嘧啶(0.874g，6.93mmol)的混合物。將該反應(yīng)混合物回流1小時以得到澄清溶液。將溶液冷卻至40℃并添加TMS-OTf(1.303ml，7.21mmol)。將該混合物在60℃加熱4小時。將溶液冷卻至室溫，使用CH2Cl2(100mL)稀釋，并使用飽和NaHCO3(2x100mL)和鹽水(1x100mL)清洗。將有機(jī)層干燥(Na2SO4)，減壓濃縮，殘留物通過在標(biāo)準(zhǔn)的BiotageIsolera梯度(0-10％v/vMeOH/CH2Cl2)上的硅膠柱色譜純化以得到作為白色固體物質(zhì)的((3R，4S)-4-((4-氯芐基)氧基)-2-(胸苷-基)-5，5-雙(((甲基磺?；?氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)甲基乙酸酯(2.84g，4.54mmol，82％收率)。ESI-MS：624(M)-二甲磺酸((3S，4R)-3-((4-氯芐基)氧基)-4-(羥基甲基)-5-(胸苷-基)四氫呋喃-2，2-二基)雙(亞甲基)酯(19)在裝有攪拌棒的100mL圓底燒瓶中，將((3R，4S)-4-((4-氯芐基)氧基)-2-(胸苷-基)-5，5-雙(((甲基磺?；?氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)甲基乙酸酯(2.84g，4.54mmol)溶解于甲醇(體積：20ml)。添加甲醇鈉(0.123g，2.272mmol)，將燒瓶蓋好并在室溫攪拌過夜。TLC(100％EtOAc)顯示該反應(yīng)是完全的。將反應(yīng)混合物在真空中蒸發(fā)至干，并直接應(yīng)用于安裝在25gBiotageSNAP柱上的3gBiotageSampler。使用40-100％EtOAc/Hex梯度洗脫產(chǎn)物，以得到作為白色泡沫狀物的二甲磺酸((3S，4R)-3-((4-氯芐基)氧基)-4-(羥基甲基)-5-(胸苷-基)四氫呋喃-2，2-二基)雙(亞甲基)酯(2.32g，3.98mmol，88％收率)。ESI-MS：582(M)-二甲磺酸((3S，4R)-5-(胸苷-基)-3-((4-氯芐基)氧基)-4-(羥基甲基)四氫呋喃-2，2-二基)雙(亞甲基)酯(20)在室溫向二甲磺酸((3S，4R)-3-((4-氯芐基)氧)-4-(羥甲基)-5-(胸苷-基)四氫呋喃-2，2-二基)雙(亞甲基)酯(1.0g，1.715mmol)和吡啶(10ml)的混合物添加TMS-Cl(0.219ml，1.715mmol)。攪拌1小時后，將該反應(yīng)混合物冷卻至0℃，并通過注射器逐滴添加苯甲酰氯(0.199ml，1.715mmol)。隨后，移除冰浴并將反應(yīng)混合物在室溫攪拌48小時。通過添加水(2mL)淬滅反應(yīng)；在室溫攪拌15分鐘后，使用EtOAc(50mL)稀釋該混合物并使用5％HCl水溶液(2x25mL)、飽和NaHCO3(1x25mL)和鹽水(1x25mL)清洗。有機(jī)相經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并在真空中濃縮至干。以最小DCM將殘留物應(yīng)用于3gBiotageSamplet，隨后將其安裝到25gBiotageSNAP柱。使用40-100％EtOAc/Hex梯度洗脫預(yù)期的產(chǎn)物，以得到作為白色泡沫狀物的((3S，4R)-5-(3-苯甲酰-5-甲基-2，4-二氧代-3，4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-3-((4-氯芐基)氧基)-4-(羥基甲基)四氫呋喃-2，2-二基)雙(亞甲基)二甲磺酸酯(0.87g，1.266mmol，73.8％收率)。胸苷的N-苯甲酰保護(hù)導(dǎo)致非對映異構(gòu)體的混合物，其產(chǎn)生3∶2比率的兩個C-5甲基單峰和兩個C-6質(zhì)子單峰。對于α-端基異構(gòu)體：1HNMR(400MHz，氯仿-d)δ7.89(s，1H，非對映異構(gòu)體1)，7.87(d，J＝1.3Hz，1H，非對映異構(gòu)體2)，7.67-7.60(m，1H)，7.60-7.39(m，3H)，7.39-7.17(m，5H)，6.02(d，J＝8.6Hz，1H)，4.67-4.46(m，3H)，4.42-4.26(m，5H)，3.87-3.73(m，2H)，3.02(s，3H)，2.98(s，2H)，2.82(p，J＝6.5Hz，1H)，2.03(s，3H，非對映異構(gòu)體1)，1.94(s，3H，非對映異構(gòu)體2)。二甲磺酸((3S，4R，5R)-4-(((叔丁氧基-(2，2，2-三氟乙氧基)二羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯芐基)氧基)-5-(3-苯甲?；?-胸苷-基)四氫呋喃-2，2-二基)雙(亞甲基)酯(21)在裝有攪拌棒的20mL閃爍瓶中，稱量二甲磺酸((3S，4R)-5-(3-苯甲?；?胸苷-基)-3-((4-氯芐基)氧基)-4-(羥基甲基)四氫呋喃-2，2-二基)雙(亞甲基)酯(0.25g，0.364mmol)、亞氨基二碳酸(2，2，2-三氟乙基)-叔丁基酯(0.088g，0.364mmol)和三苯基膦(0.095g，0.364mmol)。在小瓶中裝入THF(體積：4ml)，逐滴添加1.0MDLAD/THF溶液(0.364ml，0.364mmol)。攪拌過夜后，將反應(yīng)混合物在真空中濃縮至干并應(yīng)用于25gBiotageSNAP柱。使用40-100％EtOAc/己烷梯度洗脫產(chǎn)物以得到作為白色泡沫狀物的二甲磺酸((3S，4R，5R)-4(((叔丁氧基-(2，2，2-三氟乙氧基)二羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯芐基)氧基)-5-(3-苯甲?；?-胸苷-基)四氫呋喃-2，2-二基)雙(亞甲基)酯(0.228g，0.25mmol，68.7％收率)。1HNMR(400MHz，氯仿-d)δ7.94(d，J＝7.6Hz，2H)，7.63(t，J＝7.4Hz，1H)，7.47(t，J＝7.8Hz，2H)，7.34(d，J＝8.4Hz，2H)，7.28(d，J＝8.4Hz，2H)，7.15(s，1H)，5.99(d，J＝9.2Hz，1H)，4.70(d，J＝11.0Hz，1H)，4.60(d，J＝10.9Hz，1H)，4.49(qd，J＝8.3，3.4Hz，2H)，4.41-4.24(m，6H)，3.94(d，J＝5.6Hz，2H)，3.20-3.05(m，1H)，2.98(s，2H)，2.97(s，4H)，1.92(s，3H)，1.46(s，9H)。ESI-MS：971(M+乙酸鹽)-二甲磺酸((3S，4R，5R)-4-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯芐基)氧基)-5-(胸苷-基)四氫呋喃-2，2-二基)雙(亞甲基)酯(22)在具有磁性攪拌棒的20ml螺旋蓋閃爍瓶中，稱量二甲磺酸((3S，4R，5R)-4(((叔丁氧基-(2，2，2-三氟乙氧基)二羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯芐基)氧基)-5-(3-苯甲酰基-胸苷-基)四氫呋喃-2，2-二基)雙(亞甲基)酯(125mg，0.137mmol)。在小瓶中裝入THF(體積：1.5ml)和2.0MLiOH/水(1.507ml，3.01mmol)，蓋好并在室溫過夜攪拌。使用EtOAc(7mL)稀釋該反應(yīng)混合物并使用飽和碳酸氫鈉(1x5mL)和鹽水(1x5mL)清洗。該有機(jī)相經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并在真空中濃縮以得到作為灰白色泡沫狀物的二甲磺酸((3S，4R，5R)-4-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯芐基)氧基)-5-(胸苷-基)四氫呋喃-2，2-二基)雙(亞甲基)酯(80mg，0.117mmol，86％收率)，其純度足以將粗品用于后續(xù)反應(yīng)。1HNMR(400MHz，氯仿-d)δ8.61(s，1H)，7.36(d，J＝8.4Hz，2H)，7.27(d，J＝8.4Hz，2H)，7.13(s，1H)，6.04(d，J＝9.3Hz，1H)，4.74-4.64(m，1H)，4.59(d，J＝11.3Hz，1H)，4.50(d，J＝11.3Hz，1H)，4.40-4.23(m，6H)，4.00-3.89(m，1H)，3.44(dd，J＝13.6，6.7Hz，1H)，3.17(ddd，J＝14.3，8.4，5.8Hz，1H)，3.09(s，3H)，3.00(s，3H)，1.89(s，3H)，1.32(s，9H)。ESI-MS：681(M)-(1R，5R，7R，8S)-8-((4-氨芐基)氫基)-7-(胸苷-基)-5-(((甲基磺?；?氫基)甲基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(23)在10mL錐形反應(yīng)瓶，將二甲磺酸((3S，4R，5R)-4-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯芐基)氧基)-5-(胸苷-基)四氫呋喃-2，2-二基)雙(亞甲基)酯(60mg，0.076mmol)溶解于四氫呋喃(7mL)。將氫化鈉(60％于油中的懸浮物)(12.21mg，0.305mmol)立即添加到小瓶，該小瓶裝有攪拌棒和聚四氟乙烯(teflon)襯里隔膜螺旋帽，并將混合物在55℃攪拌過夜。將反應(yīng)冷卻至室溫并伴隨攪拌添加數(shù)滴MeOH淬滅該反應(yīng)。使用EtOAc(10mL)稀釋混合物并使用飽和碳酸氫鈉水溶液(2x10mL)和鹽水(1x10mL)清洗。有機(jī)相經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并濃縮以得到棕褐色泡沫狀物，將其溶解于最小量的DCM并應(yīng)用于與10gBiotageSNAP柱裝配的1gBiotageSamplet。使用0-100％EtOAc/己烷梯度洗脫產(chǎn)物，以得到作為白色泡沫狀物的((1R，5R，7R，8S)-8-((4-氯芐基)氧基)-7-(胸苷-基)-5-(((甲基磺?；?氧基)甲基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3，2，1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(35mg，0.060mmol，78％收率)。環(huán)化得到3∶2比率的N-非對映異構(gòu)體的混合物，其不可通過TCL/柱色譜解析。少量非對映異構(gòu)體的存在產(chǎn)生了數(shù)個不同的信號，其表示為a(*)。1HNMR(400MHz，氯仿-d)δ8.63(s，1H)，8.59*(s)，7.62(s，1H)，7.58*(s)，7.40-7.27(m，2H)，7.23(d，J＝8.1Hz，3H)，5.80*(s)，5.79(s，1H)，4.66-4.44(m，2H)，4.44-4.27(m，2H)，4.09-3.92(m，2H)，3.79(d，J＝12.8Hz，1H)，3.61*(d，J＝12.6Hz)，3.36-3.10(m，2H)，3.08(s，3H)，2.81*(s)，2.70(s，1H)，1.94(s，3H)，1.46(s，9H)，1.44*(s)。ESI-MS：585(M)-1-((1R，5R，7R，8S)-8-((4-氯芐基)氧基)-5-(羥基甲基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-7-基)-胸苷(24)在10mL玻璃反應(yīng)瓶中，將((1R，5R，7R，8S)-8-((4-氯芐基)氧基)-7-(胸苷-基)-5-(((甲基磺?；?氧基)甲基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3，2，1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(35mg，0.060mmol)和苯甲酸鈉(17.21mg，0.119mmol)溶解于DMF(2ml)。該小瓶裝有攪拌棒并使用聚四氟乙烯襯里的螺紋蓋隔膜密封。將該混合物在油浴中加熱至105℃過夜。所有組分都已實(shí)現(xiàn)溶解。將該小瓶從油浴移除并取出10uL通過TLC評估反應(yīng)完全性。一旦冷卻，立即開始形成白色晶體。TLC顯示反應(yīng)僅50％完全，因此添加另一部分的苯甲酸鈉(17.21mg，0.119mmol)連同1mLDMF以容許攪拌。將該混合物加熱至105℃，再持續(xù)48小時，定期取出等分試樣用于TLC分析。稠厚沉淀物一直沒有完全實(shí)現(xiàn)溶解，甚至在加熱至105℃達(dá)兩天后，然而反應(yīng)在無可檢測分解的情況下達(dá)到完全。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，使用EtOAc(10mL)稀釋，并使用水(2x10mL)、飽和碳酸氫鹽溶液(1x10mL)和鹽水(1x10mL)清洗。將有機(jī)相經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并在真空中濃縮。將殘留物再溶解于MeOH(2ml)中并立即加入甲醇鈉(6.45mg，0.119mmol)。將該混合物攪拌過夜。TLC顯示反應(yīng)完全并將混合物濃縮至干。所得殘留物再溶解于1mL1∶1DCM/TFA中，并在室溫攪拌30分鐘。將混合物濃縮至干并使用最小量的DCM應(yīng)用于4gRediSepRf硅膠柱。使用含有3％TEA的0-100％EtOAc/Hex梯度洗脫產(chǎn)物。合并產(chǎn)物級分并濃縮至干。所得白色粉末再溶解于DCM(3mL)并使用飽和碳酸氫鹽溶液(1x5mL)清洗。使用70/30的氯仿/異丙醇(2x5mL)反萃取含水部分。合并有機(jī)相，經(jīng)MgSO4干燥，過濾并濃縮以得到作為白色粉末的1-((1R，5R，7R，8S)-8-((4-氯芐基)氧基)-5-(羥基甲基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3，2，1]辛-7-基)-胸苷(17mg，0.042mmol，69.8％收率)。1HNMR(400MHz，乙腈-d3)δ8.05(q，J＝1.2Hz，1H)，7.36(s，4H)，5.94(s，1H)，4.52(dd，J＝38.6，11.9Hz，2H)，4.14(d，J＝5.1Hz，1H)，3.58(dd，J＝33.9，12.3Hz，2H)，3.09(d，J＝12.7Hz，1H)，2.89(d，J＝13.0Hz，1H)，2.75(dd，J＝13.0，3.2Hz，1H)，2.57-2.50(m，1H)，2.34(d，J＝13.0Hz，1H)，1.98-1.90(m，2H)，1.81(d，J＝1.1Hz，3H)。13CNMR(101MHz，CD3CN)δ165.01，151.22，138.07，136.98，133.72，130.05，129.23，109.19，87.42，85.04，73.06，71.38，61.04，45.85，43.60，41.58，12.71。(1R，5R，7R，8S)-8-((4-氯芐基)氧基)-7-(胸苷-基)-5-(羥基甲基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(25)將(1R，5R，7R，8S)-8-((4-氯芐基)氧基)-7-(胸苷-基)-5-(((甲基磺?；?氧基)甲基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3，2，1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(1.0g，1.47mmol)和苯甲酸鈉(0.63g，4.40mmol)稱量到具有攪拌棒的100mL圓底燒瓶中。在該燒瓶中裝入DMF(10mL)，用隔膜密封并加熱至100℃達(dá)40小時。TLC(65％EtOAc/Hex)表明該反應(yīng)完全。使用飽和碳酸氫鈉(100mL)稀釋該混合物并使用乙酸乙酯(3x50mL)萃取。合并有機(jī)相并使用鹽水清洗，經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并在真空中濃縮以得到棕褐色固體，其溶解于二噁烷(20mL)和2MNaOH(3mL)的混合物中。將該混合物加熱至50℃過夜。該反應(yīng)混合物在真空中濃縮至固體并應(yīng)用于50gBiotageSNAP硅膠柱，且使用50-100％EtOAc/己烷梯度洗脫7個柱體積，并保持在100％EtOAc達(dá)7個柱體積。合并含有產(chǎn)物的級分并在真空中濃縮以得到作為白色泡沫狀物的(1R，5R，7R，8S)-8-(羥基)-7-(胸苷-基)-5-(羥基甲基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3，2，1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(0.63g，1.24mmol，84.6％)。ESI-MS：506(M)-(1R，5R，7R，8S)-8-羥基-7-(胸苷-基)-5-(羥基甲基)-3-(2，2，2-三氟乙?；?-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷(26)將(1R，5R，7R，8S)-8-(羥基)-7-(胸苷-基)-5-(羥基甲基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3，2，1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(0.6g，1.18mmol)溶解于乙醇(25mL)并轉(zhuǎn)移到500mL的帕爾氫化器(Parrhydrogenationvessel)。立即添加Pearlman催化劑(0.35g)和一滴冰醋酸，并將混合物在帕爾氫化器上在氫氣氣氛(40psi)下?lián)u動4小時。TLC表明該反應(yīng)完全并為點(diǎn)對點(diǎn)的(5％甲醇/DCM)。將混合物小心過濾通過硅藻土床，其之前使用數(shù)個體積的甲醇清洗。使用乙酸乙酯(100mL)和乙醇(100mL)清洗該硅藻土床。濾液在真空中濃縮至約5mL并轉(zhuǎn)移到20mL的玻璃閃爍小瓶。使物質(zhì)在真空中干燥以得到作為灰白色粉末的(1R，5R，7R，8S)-8-羥基-5-(羥基甲基)-7-(5-甲基-2，4-二氧代-3，4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(54)，其未經(jīng)進(jìn)一步純化即使用。該玻璃閃爍小瓶裝有微攪拌棒并裝入二氯甲烷(2mL)和三氟乙酸(2mL)。將小瓶密封并設(shè)置為攪拌30分鐘。移除微攪拌棒并在真空中除去揮發(fā)物。所得油狀物與甲苯(2x4mL)、甲醇(1x4mL)和DCM(2x4mL)共蒸發(fā)以在小瓶中得到灰白色粉末/殘留物。使用微攪拌棒在閃爍小瓶中將該殘留物再溶解于甲醇(5mL)。添加三氟乙酸乙酯(2.00mL，16.9mmol)和TEA(0.410mL，3.54mmol)，密封小瓶并將混合物設(shè)置為攪拌過夜。20小時后，混合物的TLC顯示起始物質(zhì)已經(jīng)完全消耗而新的產(chǎn)物已經(jīng)形成。在真空中除去揮發(fā)物。將殘留物與EtOAc(2x5mL)和甲苯(2x5mL)共蒸發(fā)以得到(1R，5R，7R，8S)-8-羥基-7-(胸苷-基)-5-(羥基甲基)-3-(2，2，2-三氟乙?；?-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3，2，1]辛烷(0.30g，79.8％)直接用于下一步三苯甲基化步驟。粗物質(zhì)的1HNMR分析表明形成了以約55∶45比率的非對映異構(gòu)體的混合物(通過端基異構(gòu)體信號的積分)。(1R，5R，7R，8S)-8-羥基-7-(胸苷-基)-5-((4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基)甲基)-3-(2，2，2-三氟乙?；?-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷(27)5′-O-DMTr-aCBBN(tfa)在50mL圓底燒瓶中，將(1R，5R，7R，8S)-8-羥基-7-(胸苷-基)-5-(羥基甲基)-3-(2，2，2-三氟乙酰基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3，2，1]辛烷(0.28g，0.74mmol)與吡啶(2x10mL)共蒸發(fā)。燒瓶中裝入無水吡啶(7mL)并立即向該溶液添加DMTr-Cl。密封燒瓶并將混合物在室溫攪拌過夜。TLC顯示所有起始物質(zhì)被消耗(95％EtOAc/Hex或5％MeOH/DCM)。通過以下方式淬滅反應(yīng)：添加甲醇(0.5mL)并持續(xù)攪拌30分鐘，隨后添加飽和NaHCO3水溶液(30mL)。使用EtOAc(3x20mL)萃取水相。合并有機(jī)相并使用鹽水(1x20mL)清洗，經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并在真空中濃縮以得到棕褐色泡沫狀物。固體溶解于最小量的DCM并應(yīng)用于50gBiotage硅膠SNAP柱，其之前使用60ml25％TEA/己烷溶液處理并使用200mL30％EtOAc/Hex平衡。使用10個柱體積的30-100％EtOAc/己烷梯度隨后4個柱體積的100％EtOAc將產(chǎn)物從柱上洗脫。合并含有純產(chǎn)物的級分并濃縮以得到作為白色泡沫狀物的DMTr-(N-tfa)-氨基CBBN。1H和19FNMR兩者指示兩種不同的非對映異構(gòu)體。1HNMR列表中的星號表示其中非對映異構(gòu)體質(zhì)子以約55∶45的比率解析的峰。1HNMR(400MHz，氯仿-d)δ7.72*(d，J＝1.0Hz，1H)，7.68*(d，J＝1.1Hz，1H)，7.49-7.38(m，4H)，7.35-7.20(m，14H)，6.93-6.78(m，8H)，5.73*(s，1H)，5.68*(s，1H)，4.55-4.36(m，3H)，4.05*(s，2H)，4.01*(s，2H)，3.94-3.84(m，1H)，3.79(q，J＝0.7Hz，13H)，3.64(t，J＝12.0Hz，1H)，3.57-3.38(m，4H)，3.38-3.15(m，4H)，2.70*(d，J＝3.6Hz，1H)，2.65*(t，J＝4.0Hz，1H)，1.47*(s，3H)，1.41*(s，3H)，1.28(bs，2H)。19FNMR(376MHz，cdcl3)δ-68.61，-68.90。ESIMS：680(M)-(1R，5R，7R，8S)-7-(胸苷-基)-5-((4，4’-二甲氧基三苯甲基氧基)甲基)-3-(2，2，2-三氟乙酰基)-6，8-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-8-O-(2-氰基乙基)-N，N-二異丙基亞磷酰胺(28)5′-O-DMTr-aCBBN(tfa)亞酰胺(amidite)在裝有攪拌棒的100mL圓底燒瓶中稱量5′-O-DMTr-aCBBN(tfa)(0.32g，0.47mmol)。向瓶中裝入二氯甲烷(7mL)并設(shè)置為攪拌。在注射器中稱量2-氰乙基N，N，N’，N’-四異丙基亞磷酰二胺(0.283g，0.94mmol)并立即添加到溶液，隨后添加4，5-二氰基咪唑(55.44mg，0.47mmol)。立即將燒瓶用隔膜密封并攪拌過夜。在過程中，在20小時的TLC顯示僅存在微量的起始物質(zhì)，出現(xiàn)了兩個三苯甲基陽性的新點(diǎn)，且使用5％甲醇/DCMw/UV顯現(xiàn)后用Hanessian染色劑處理時似乎與起始核苷類似地炭化。通過添加飽和NaHCO3水溶液(50mL)淬滅反應(yīng)。使用乙酸乙酯(4x20mL)萃取水相。合并有機(jī)相并使用飽和NaHCO3溶液(2x50mL)和鹽水(1x20mL)萃取。有機(jī)相經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并濃縮以得到無色油狀物。粗產(chǎn)物溶解于最小量的DCM并應(yīng)用于50gBiotage硅膠SNAP柱，其之前使用60ml25％TEA/己烷溶液處理并使用150mL30％乙酸乙酯/己烷平衡。使用10個柱體積的30-100％的EtOAc/己烷梯度隨后使用4個柱體積的100％EtOAc將產(chǎn)物從柱上洗脫。合并含有純產(chǎn)物的級分并濃縮以得到作為白色泡沫狀物的DMTr-(N-tfa)-氨基CBBN亞酰胺。正如預(yù)期的，31P和1HNMR指示存在四種不同產(chǎn)物，每種對應(yīng)單獨(dú)的立體異構(gòu)體，其從環(huán)胺的tfa保護(hù)和亞磷酸化(phosphitylation)反應(yīng)產(chǎn)生。31PNMR(162MHz，CD3CN)δ150.03，149.97，147.46。相對強(qiáng)度1∶1∶2。19FNMR(376MHz，CD3CN)δ-69.30，-69.31，-69.47，-69.47。ESIMS：904.8(M+Na+)+實(shí)施例2：2’-C-橋接雙環(huán)核苷的產(chǎn)生本實(shí)施例描述了用于產(chǎn)生具有不同核堿基的2’-C-橋接雙環(huán)核苷的的關(guān)鍵中間體的合成(參見圖2A-2C)。乙酸((3R，4S)-4-((4-氯芐基)氧基)-2-(胸苷-基)-5，5-雙(((甲基磺酰基)氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)甲酯(圖2A)將N，O-雙(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(4.07ml，16.64mmol)添加到于無水乙腈(20ml)中的乙酸((3R，4S)-2-乙酰氧基-4-((4-氯芐基)氧基)-5，5-雙(((甲基磺?；?氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)甲酯(3.10g，5.55mmol)和胸腺嘧啶(0.874g，6.93mmol)的混合物。將該反應(yīng)混合物回流1小時以得到澄清溶液。將溶液冷卻至40℃并添加TMS-OTf(1.303ml，7.21mmol)。將該混合物在60℃加熱4小時。溶液冷卻至室溫，使用CH2Cl2(100mL)稀釋，并使用飽和NaHCO3(2x100mL)和鹽水(1x100mL)清洗。將有機(jī)層干燥(Na2SO4)，減壓濃縮，殘留物通過硅膠柱色譜在標(biāo)準(zhǔn)的BiotageIsolera梯度(0-10％v/vMeOH/CH2Cl2)上純化以得到作為白色固體物質(zhì)的乙酸((3R，4S)-4-((4-氯芐基)氧基)-2-(胸苷-基)-5，5-雙(((甲基磺?；?氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)甲酯(2.84g，4.54mmol，82％收率)。ESI-MS：624(M)-粗物質(zhì)的NMR顯示具有0.10∶1.00相對積分的主要和次要的端基異構(gòu)體信號端基異構(gòu)體峰的1HNMR(300MHz，氯仿-d)δ6.54(d，J＝8.1Hz，次要)，6.04(d，J＝9.2Hz，主要)乙酸((3R，4S)-4-((4-氯芐基)氧基)-2-(6-N-苯甲酰基腺苷-基)-5，5-雙(((甲基磺?；?氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)甲酯(29)將N，O-雙(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(1.09g，1.31ml，5.37mmol)添加到于無水乙腈(15ml)中的乙酸((3R，4S)-2-乙酰氧基-4-((4-氯芐基)氧基)-5，5-雙(((甲基磺酰基)氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)甲酯(1.00g，1.79mmol)和N6-苯甲?；汆堰?0.640g，2.68mmol)的混合物。將該反應(yīng)混合物回流1小時以得到澄清溶液。將溶液冷卻至40℃并添加TMS-OTf(0.60g，0.49ml，2.68mmol)?；亓髟摶旌衔?小時。溶液冷卻至室溫，使用CH2Cl2(100mL)稀釋，并使用飽和NaHCO3(2x100mL)和鹽水(1x100mL)清洗。將有機(jī)層干燥(Na2SO4)，減壓濃縮，殘留物通過硅膠柱色譜在標(biāo)準(zhǔn)的BiotageIsolera梯度(0-10％v/vMeOH/CH2Cl2)上純化以得到作為白色固體物質(zhì)的乙酸((3R，4S)-4-((4-氯芐基)氧基)-2-(6-N-苯甲?；佘?基)-5，5-雙(((甲基磺?；?氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)甲酯(0.95g，1.28mmol，72％收率)。不存在任何相當(dāng)量的可分離的核苷副產(chǎn)物。苯甲酸{[1R，5R，7R，8S)-7-[(9R)-9a-苯甲?；?9-腺嘌呤]-8-化-氯芐基氧基)-3.6-二氧雜雙環(huán)[3.2.1]辛-5-基}甲酯(30)將乙酸((3R，4S)-4-((4-氯芐基)氧基)-2-(6-N-苯甲酰基腺苷-基)-5，5-雙(((甲基磺?；?氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)甲酯(0.70g，mmol)稱量入具有微攪拌棒的20mL玻璃閃爍小瓶。在小瓶中裝入THF(5mL)和LiOH水溶液(0.47mL，1.0M)。隨后允許混合物在室溫攪拌2小時。TLC表明脫乙?；呀?jīng)發(fā)生，同時使N-苯甲酰基完整。用水(7mL)稀釋反應(yīng)并用乙酸乙酯(3x5mL)萃取。合并有機(jī)相，用鹽水(1x5mL)洗滌，經(jīng)Na2SO4干燥，真空過濾并濃縮以得到作為粗品使用的白色泡沫狀物。將固體轉(zhuǎn)移至10mL裝有攪拌棒的錐形反應(yīng)小瓶并溶于水性THF(5mL)。立刻將氫化鈉添加至小瓶。隔膜密封小瓶并設(shè)置在55℃攪拌4小時。TLC表明反應(yīng)完成。通過小心添加碳酸氫鈉溶液至冷卻的反應(yīng)混合物(3mL)淬滅反應(yīng)。該混合物進(jìn)一步用水稀釋至10mL并用乙酸乙酯(3x5mL)萃取。合并有機(jī)相，用鹽水(1x5mL)洗滌，經(jīng)Na2SO4干燥，在真空過濾并濃縮以得到作為粗品使用的灰白色/棕褐色泡沫狀物。粗制固體轉(zhuǎn)移至裝有攪拌棒的20mL閃爍小瓶。將苯甲酸鈉添加至小瓶，其隨后裝入DMF(5mL)。將小瓶密封并伴隨持續(xù)攪拌在油浴中加熱至110℃。30分鐘后，混合物變?yōu)槌砗駶{料。允許混合物連續(xù)攪拌過夜。TLC表明反應(yīng)完成。冷卻時，混合物成為稠厚凝膠，其用飽和的碳酸氫鈉溶液(30mL)和乙酸乙酯(10mL)分配。用乙酸乙酯(2x10mL)萃取水相。合并有機(jī)相，用鹽水(1x5mL)洗滌，經(jīng)Na2SO4干燥，在真空過濾并濃縮以得到灰白色/棕褐色泡沫狀物，其進(jìn)一步經(jīng)由硅膠柱色譜(EtOAc/己烷梯度30％-100％)純化以得到苯甲酸{(1R，5R，7R，8S)-7-[(9R)-9a-苯甲?；?9-腺嘌呤]-8-(4-氯芐基氧基)-3.6-二氧雜雙環(huán)[3.2.1]辛-5-基}甲酯(0.48g，0.77mmol，80.5％)。乙酸((3R，4S)-4-((4-氯芐基)氧基)-2-(6-N-異丁酰基鳥苷-基)-5，5-雙(((甲基磺酰基)氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)甲酯(31)將N，O-雙(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(1.09g，1.31ml，5.37mmol)添加至于無水乙腈(15ml)中的乙酸((3R，4S)-2-乙酰氧基-4-((4-氯芐基)氧基)-5，5-雙(((甲基磺酰基)氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)甲酯(1.00g，1.79mmol)和N2-異丁酰基鳥苷(0.59g，2.68mmol)混合物。將該反應(yīng)混合物回流1小時。將溶液冷卻至40℃并添加TMS-OTf(0.60g，0.49ml，2.68mmol)。將該混合物回流4小時。將溶液冷卻到室溫，用CH2Cl2(100mL)稀釋，并用飽和NaHCO3(2x100mL)和鹽水(1x100mL)洗滌。將有機(jī)層干燥(Na2SO4)，減壓濃縮，且殘留物通過硅膠柱色譜在標(biāo)準(zhǔn)的BiotageIsolera梯度(0-10％v/vMeOH/CH2Cl2)上純化以得到作為白色固體物質(zhì)的β-9-N-鳥苷端基異構(gòu)體(0.67g，0.93mmol，52％收率)和β-7-N鳥苷端基異構(gòu)體(0.17g，0.23mmol，13.2％)。粗糖基化的NMR分析顯示75∶17∶8比率的1個主要和2個次要的端基異構(gòu)體峰；分別與β-N9、β-N7和α-N9端基異構(gòu)體相關(guān)。1HNMR的端基異構(gòu)體峰(300MHz，氯仿-d)δ6.30(d，J＝7.7Hz)次要8％，6.14(d，J＝9.1Hz)次要17％，5.98(d，J＝8.8Hz)主要75％。1-[(9S)-9-{(1R，7R，8S)-8-(4-氯芐基氧基)-5-[(甲基磺酰氧基)甲基]-3.6-二氧雜雙環(huán)[3.2.1]辛-7-基}-6-氧代-1，9-二氫嘌呤-2-基氨基]-2-甲基-1-丙酮(34)(34)將25mg含有82∶18比率的化合物31∶32的粗糖基化產(chǎn)物稱量入具有攪拌棒的4mL玻璃小瓶。小瓶裝有THF(1mL)并添加60％NaH分散體(4.5mg)。將小瓶密封并伴隨攪拌在油浴中加熱至55℃且持續(xù)4小時。經(jīng)由TLC監(jiān)測反應(yīng)(Rxn)直至反應(yīng)完成。通過添加數(shù)滴水至粗反應(yīng)混合物淬滅混合物。將混合物轉(zhuǎn)至具有水(約7mL)和乙酸乙酯(約7mL)的閃爍小瓶中。進(jìn)一步用乙酸乙酯(2x5mL)萃取水相。合并有機(jī)層，用鹽水(1x5mL)洗滌，經(jīng)Na2SO4干燥，在真空過濾并濃縮以得到作為棕褐色泡沫狀物的粗環(huán)化混合物(12mg)。將混合物溶于CDCl3并進(jìn)行1HNMR，由于主要和次要的端基異構(gòu)體峰兩者均以82∶18比率變?yōu)閱畏澹?HNMR確證主要雜質(zhì)為N7-端基異構(gòu)體。還殘留ibu-甲基峰，確證環(huán)化反應(yīng)與(ibu)G-糖基化分子兼容。實(shí)施例3：帶有2’-C-橋接雙環(huán)核苷酸的寡核苷酸的合成一般合成方法一旦合成經(jīng)修飾的核苷且使用適當(dāng)反應(yīng)基團(tuán)掩蔽游離的5’和3’羥基以成為核苷酸單體，可制備攜帶糖和堿基修飾的短鏈寡核苷酸。例如，可使用亞磷酰胺化學(xué)使用自動固相合成(參見McBride等人，TetrahedronLetters24：245-248(1983)和Sinha等人，TetrahedronLetters24：5843-5846(1983))。亞磷酰胺化學(xué)，連同相關(guān)方法諸如氫膦酸酯(hydrogenphosphonate)化學(xué)就它們在寡核苷酸化學(xué)中的用途已被廣泛地綜述(參見，例如Beaucage等人，Tetrahedron48：2223-2311(1992))。在固相寡核苷酸合成期間，一系列核苷酸單體以預(yù)定的順序通過其亞磷酰胺衍生物順序附接，所述順序取決于鏈延伸的方向，即生長的寡核苷酸鏈的5’-官能團(tuán)或3’-官能團(tuán)。該寡核苷酸鏈錨定于不可溶部分，諸如可控孔玻璃或聚苯乙烯樹脂珠粒。附接每個單體的方法一般包括以下的步驟1至5。步驟1涉及反應(yīng)官能基的保護(hù)。常見的反應(yīng)官能基為末端核苷的5’-羥基。該官能基通常使用4，4’-二甲氧基三苯甲基(DMT)部分保護(hù)，其可通過酸處理移除。DMT部分的一個特征是其在酸去保護(hù)期間形成亮橙色DMT陽離子。該陽離子有效充當(dāng)報告基團(tuán)，其可在波長480和500nm之間監(jiān)測，用于判斷之前偶聯(lián)步驟完成度的目的。大多數(shù)市售自動合成儀具有監(jiān)測釋放的DMT陽離子的能力。該數(shù)據(jù)給予操作員合成是否在任意給定步驟失敗的即時提示。步驟2涉及通過添加亞磷酰胺衍生物和活化劑的偶聯(lián)。該亞磷酰胺衍生物通常為核苷亞磷酰胺。然而，其也可為用不同有機(jī)部分衍生化的亞磷酰胺。步驟3涉及未反應(yīng)的末端官能團(tuán)的加帽。該步驟引入惰性保護(hù)基團(tuán)，其阻止進(jìn)一步偶聯(lián)到失效序列。步驟4涉及新形成的磷核苷酸骨架連接從三價亞磷酸酯至穩(wěn)定的五價狀態(tài)的氧化。該氧化步驟可使用導(dǎo)致磷酸核苷酸的基于氧的氧化劑或者導(dǎo)致硫代磷酸核苷酸的硫化氧化劑進(jìn)行。步驟5涉及清洗步驟后的方法重復(fù)。以1μmol規(guī)模在MerMade-12自動化寡核苷酸合成系統(tǒng)(Bioautomation，Plano，TX，USA)上合成與人miR-208a的核苷酸序列互補(bǔ)的截短的、16個核苷酸的序列。使用標(biāo)準(zhǔn)的脫三苯甲基化、活化劑和加帽溶液(其對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的)操作合成儀。寡核苷酸鏈的延長如下進(jìn)行：對每個脫氧核苷酸亞酰胺(amidite)使用420秒的單一偶聯(lián)，對于LNA亞磷酰胺使用共持續(xù)900秒的雙重偶聯(lián)，以及對新穎的核苷亞酰胺，諸如DMTr-aCBBN(tfa)亞酰胺使用共持續(xù)1800秒的三重偶聯(lián)。在進(jìn)行每個偶聯(lián)循環(huán)后，使用0.025M碘溶液或0.2MPADS氧化溶液氧化，以分別產(chǎn)生磷酸二酯或硫代磷酸酯核苷酸間連接。未修飾的反-208aDNA序列摻入九個2’-脫氧胸苷殘基，其選擇性地使用胸苷LNA(lT)、胸苷氧代CBBN(bT)、胞苷氧代CBBN(bC)或胸苷氨基CBBN(abT)核苷酸替換。胸苷LNA亞酰胺購于商業(yè)來源并與報道的光譜數(shù)據(jù)匹配(參見，Singh，S.K.；Nielsen，P.；Koshkin，A.A.；Wengel，J.Chem.Commun.1998，455-6)。根據(jù)文獻(xiàn)操作合成胸苷-2’-C，4’-C-橋接雙環(huán)核苷(胸苷氧代CBBN，bT)和胞苷-2’-C，4’-C-橋接雙環(huán)核苷(胞苷氧代CBBN，bC)并且所有光譜數(shù)據(jù)與報道值匹配(參見，美國專利第6,403,566號，Wang，G.，Girardet，J.，Gunic，E.Tetrahedron55，1999，7707-7724)。核苷酸的平衡由具有對應(yīng)于天然反-208aRNA序列的堿基的2’-脫氧核苷酸或LNA核苷酸構(gòu)成。硫代磷酸酯核苷酸間連接表示為堿基后的“s”(例如，abTs或dGs)，而堿基后沒有字母表示磷酸二酯核苷酸間連接(例如，abT或dG)。制備化合物M-11915：dC.dT.dT.dT.dT.dT.dGdC.abT.dC.dG.dT.dC.dT.dT.dA亞磷酰胺試劑(28)用于單修飾的氨基CBBN寡核苷酸的合成中。所述寡核苷酸使用BioautomationMerMade-12自動化寡核苷酸合成系統(tǒng)合成。根據(jù)制造商的推薦在DMT-ON模式采用商業(yè)合成試劑和0.025M碘溶液進(jìn)行合成。在如前所述的適當(dāng)偶聯(lián)循環(huán)期間，添加作為0.1M于乙腈中的溶液的亞磷酰胺試劑。通過使用濃氫氧化銨水溶液在55℃加熱CPG結(jié)合的寡核苷酸17小時，完成所述寡核苷酸從支持物的切割。通過以下方式進(jìn)一步純化所得的寡核苷酸水溶液：將粗制DMT-ON寡核苷酸溶液裝載在WatersVacC18筒上并使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)DMT-ON寡核苷酸脫鹽操作洗脫。通過HPLC-MS質(zhì)譜分析法，利用裝至具有WatersAcuitySQ檢測器的WatersAllianceMDHPLC的XBridgeOSTC182.5um柱，使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行產(chǎn)物的表征：計(jì)算值4845.2，實(shí)測值4844.0(M)-。制備化合物M-11916：dC.dT.dT.dT.dT.abT.dG.dC.abT.dC.dG.dT.dC.dT.dT.dA亞磷酰胺試劑(28)用于雙重修飾的氨基CBBN寡核苷酸的合成。所述寡核苷酸使用BioautomationMerMade-12自動化寡核苷酸合成系統(tǒng)合成。根據(jù)制造商的推薦在DMT-ON模式采用商業(yè)合成試劑和0.025M碘溶液進(jìn)行合成。在如前所述的適當(dāng)偶聯(lián)循環(huán)期間，添加作為0.1M于乙腈中的溶液的亞磷酰胺試劑。通過使用濃氫氧化銨水溶液在55℃加熱CPG結(jié)合的寡核苷酸17小時，完成所述寡核苷酸從支持物的切割。通過以下方式進(jìn)一步純化所得的寡核苷酸水溶液：將粗制DMT-ON寡核苷酸溶液裝載在WatersVacC18筒上并使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)DMT-ON寡核苷酸脫鹽操作洗脫。通過HPLC-MS質(zhì)譜分析法，利用裝到具有WatersAcuitySQ檢測器的WatersAllianceMDHPLC的XBridgeOSTC182.5um柱，使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行產(chǎn)物的表征：計(jì)算值4886.2，實(shí)測值4885.2(M)-。制備化合物M-11917：dC.dT.dT.dT.abT.abT.dG.dC.abT.dC.dG.dT.dC.dT.dT.dA亞磷酰胺試劑(28)用于三重修飾的氨基CBBN寡核苷酸的合成。所述寡核苷酸使用BioautomationMerMade-12自動化寡核苷酸合成系統(tǒng)合成。根據(jù)制造商的推薦在DMT-ON模式采用商業(yè)合成試劑和0.025M碘溶液進(jìn)行合成。在如前所述的適當(dāng)偶聯(lián)循環(huán)期間，添加作為0.1M于乙腈中的溶液的亞磷酰胺試劑。通過使用濃氫氧化銨水溶液在55℃加熱CPG結(jié)合的寡核苷酸17小時，完成所述寡核苷酸從支持物的切割。通過以下方式進(jìn)一步純化所得的寡核苷酸水溶液：將粗制DMT-ON寡核苷酸溶液裝載在WatersVacC18筒上并使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)DMT-ON寡核苷酸脫鹽操作洗脫。通過HPLC-MS質(zhì)譜分析法，利用裝到具有WatersAcuitySQ檢測器的WatersAllianceMDHPLC的XBridgeOSTC182.5um柱，使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行產(chǎn)物的表征：計(jì)算值4927.3，實(shí)測值4926.1(M)-。制備化合物M-11918：dC.dT.dT.dT.abT.abT.dG.dC.dT.dC.dG.dT.dC.dT.dT.dA亞磷酰胺試劑(28)用于雙重修飾的氨基CBBN寡核苷酸的合成。所述寡核苷酸使用BioautomationMerMade-12自動化寡核苷酸合成系統(tǒng)合成。根據(jù)制造商的推薦在DMT-ON模式采用商業(yè)合成試劑和0.025M碘溶液進(jìn)行合成。在如前所述的適當(dāng)偶聯(lián)循環(huán)期間，添加作為0.1M于乙腈中的溶液的亞磷酰胺試劑。通過使用濃氫氧化銨水溶液在55℃加熱CPG結(jié)合的寡核苷酸17小時，完成所述寡核苷酸從支持物的切割。通過以下方式進(jìn)一步純化所得的寡核苷酸水溶液：將粗制DMT-ON寡核苷酸溶液裝載在WatersVacC18筒上并使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)DMT-ON寡核苷酸脫鹽操作洗脫。通過HPLC-MS質(zhì)譜分析法，利用裝到具有WatersAcuitySQ檢測器的WatersAllianceMDHPLC的XBridgeOSTC182.5um柱，使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行產(chǎn)物的表征：計(jì)算值4886.2，實(shí)測值4885.0(M)-。制備化合物M-11919：lCs.dTs.dTs.dTs.abTs.abTs.dGs.lCs.dTs.lCs.lGs.dTs.lCs.dTs.lTs.lA亞磷酰胺試劑(28)用于嵌合DNA/LNA/氨基CBBN寡核苷酸的合成。所述寡核苷酸使用BioautomationMerMade-12自動化寡核苷酸合成系統(tǒng)合成。根據(jù)制造商的推薦在DMT-ON模式采用商業(yè)合成試劑進(jìn)行合成，將0.2M于1∶1嘧啶/CAN中的PADS更換為氧化溶液。在如前所述的適當(dāng)偶聯(lián)循環(huán)期間，添加作為0.1M于乙腈中的溶液的亞磷酰胺試劑。通過使用濃氫氧化銨水溶液在55℃加熱CPG結(jié)合的寡核苷酸17小時，完成所述寡核苷酸從支持物的切割。通過以下方式進(jìn)一步純化所得的寡核苷酸水溶液：將粗制DMT-ON寡核苷酸溶液裝載在WatersVacC18筒上并使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)DMT-ON寡核苷酸脫鹽操作洗脫。通過HPLC-MS質(zhì)譜分析法，利用裝到具有WatersAcuitySQ檢測器的WatersAllianceMDHPLC的XBridgeOSTC182.5um柱，使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行產(chǎn)物的表征：計(jì)算值5379.3，實(shí)測值5378.3(M)-。制備化合物M-11920：lCs.dTs.dTs.dTs.lTs.lTs.dGs.lCs.dTs.lCs.lGs.dTs.lCs.dTs.abTs.lA亞磷酰胺試劑(28)用于嵌合DNA/LNA/氨基CBBN寡核苷酸的合成。所述寡核苷酸使用BioautomationMerMade-12自動化寡核苷酸合成系統(tǒng)合成。根據(jù)制造商的推薦在DMT-ON模式采用商業(yè)合成試劑進(jìn)行合成，將0.2M于1∶1嘧啶/CAN中的PADS更換為氧化溶液。在如前在“截短核苷酸的一般合成方法”中所述的適當(dāng)偶聯(lián)循環(huán)期間，添加作為0.1M于乙腈中的溶液的亞磷酰胺試劑。通過使用濃氫氧化銨水溶液在55℃加熱CPG結(jié)合的寡核苷酸17小時，完成所述寡核苷酸從支持物的切割。通過以下方式進(jìn)一步純化所得的寡核苷酸水溶液：將粗制DMT-ON寡核苷酸溶液裝載在WatersVacC18筒上并使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)DMT-ON寡核苷酸脫鹽操作洗脫。通過HPLC-MS質(zhì)譜分析法，利用裝到具有WatersAcuitySQ檢測器的WatersAllianceMDHPLC的XBridgeOSTC182.5um柱，使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行產(chǎn)物的表征：計(jì)算值5366.3，實(shí)測值5365.3(M)-。制備化合物M-10930：dC.dT.dT.dT.dT.dT.dG.dC.bT.dC.dG.dT.dC.dT.dT.dA胸苷基-2’-C，4’-C-橋接雙環(huán)核苷亞磷酰胺(參見，例如，美國專利第6,403,566號，Wang，G.，Girardet，J.，Gunic，E.Tetrahedron55，1999，7707-7724)用于單修飾的氧代CBBN寡核苷酸的合成。所述寡核苷酸使用BioautomationMerMade-12自動化寡核苷酸合成系統(tǒng)合成。根據(jù)制造商的推薦在DMT-ON模式采用商業(yè)合成試劑和0.025M碘溶液進(jìn)行合成。在如前所述的適當(dāng)偶聯(lián)循環(huán)期間，添加作為0.1M于乙腈中的溶液的所有亞磷酰胺試劑。通過使用濃氫氧化銨水溶液在55℃加熱CPG結(jié)合的寡核苷酸17小時，完成所述寡核苷酸從支持物的切割。通過以下方式進(jìn)一步純化所得的寡核苷酸水溶液：將粗制DMT-ON寡核苷酸溶液裝載在WatersVacC18筒上并使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)DMT-ON寡核苷酸脫鹽操作洗脫。通過HPLC-MS質(zhì)譜分析法，利用裝到具有WatersAcuitySQ檢測器的WatersAllianceMDHPLC的XBridgeOSTC182.5um柱，使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行產(chǎn)物的表征：計(jì)算值4846.1，實(shí)測值4845.8(M)-。制備化合物M-10924：bC.bT.bT.bT.bT.bT.dG.bC.bT.bC.dG.bT.bC.bT.bT.dA胸苷-2’-C，4’-C-橋接雙環(huán)核苷亞磷酰胺和N-Bz-腺苷-2’-C，4’-C-橋接雙環(huán)核苷亞磷酰胺(參見，例如，美國專利第6,403,566號，Wang，G.，Girardet，J.，Gunic，E.Tetrahedron55，1999，7707-7724)用于單修飾的氧代CBBN寡核苷酸的合成。所述寡核苷酸使用BioautomationMerMade-12自動化寡核苷酸合成系統(tǒng)合成。根據(jù)制造商的推薦在DMT-ON模式采用商業(yè)合成試劑和0.025M碘溶液進(jìn)行合成。在如前所述的適當(dāng)偶聯(lián)循環(huán)期間，所有亞磷酰胺試劑作為0.1M于乙腈中的溶液添加。通過使用濃氫氧化銨水溶液在55℃加熱CPG結(jié)合的寡核苷酸17小時，完成所述寡核苷酸從支持物的切割。通過以下方式進(jìn)一步純化所得的寡核苷酸水溶液：將粗制DMT-ON寡核苷酸溶液裝載在WatersVacC18筒上并使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)DMT-ON寡核苷酸脫鹽操作洗脫。通過HPLC-MS質(zhì)譜分析法，利用裝到具有WatersAcuitySQ檢測器的WatersAllianceMDHPLC的XBridgeOSTC182.5um柱，使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行產(chǎn)物的表征：計(jì)算值5330.6，實(shí)測值5350.2(M)-。實(shí)施例4：攜帶2’-C-橋接雙環(huán)核苷酸的寡核苷酸的功能性表征解鏈溫度(Tm)的確定當(dāng)設(shè)計(jì)合成性寡核苷酸序列作為針對反義和微小RNA靶標(biāo)的藥物時，解鏈溫度(Tm)是一個關(guān)鍵的參數(shù)。一般不存在特定的Tm閾值，高于或低于該Tm閾值決定活性。然而，人們認(rèn)識到對于反義和微小RNA抑制劑寡核苷酸藥物，Tm必須顯著升高。此外，合成性寡核苷酸藥物的核苷酸骨架(例如，硫代磷酸酯)的化學(xué)修飾時常用于賦予針對體內(nèi)生物降解的穩(wěn)定性。然而，大多數(shù)核苷酸磷酸酯骨架修飾時常導(dǎo)致與其靶標(biāo)形成雙鏈體的寡核苷酸藥物的Tm的下降。因此，針對其靶標(biāo)序列的合成性寡核苷酸藥物的Tm相對于天然DNA或RNA、2’-OMeRNA，以及其它類似核苷酸單元的固有Tm的足夠的增加是合成性寡核苷酸藥物具有足夠的特異性、靶標(biāo)結(jié)合(engagement)，以及最終由靶標(biāo)控制的細(xì)胞過程的下游調(diào)控所需要的。確定了經(jīng)修飾的16個核苷酸的磷酸二酯鏈的解鏈溫度(Tm)，并與具有天然磷酸二酯DNA核苷酸的相同的16個核苷酸的序列的Tm比較。具體地，與具有相同核堿基的2’-脫氧核苷或氧代CBBN核苷相比，相對氨基CBBN解鏈溫度(Tm)按照摻入基礎(chǔ)通過確定氨基修飾的16個核苷酸長度的磷酸二酯鏈的解鏈溫度和利用2’-脫氧核苷或氧代CBBN磷酸二酯DNA核苷酸的相同16個核苷酸的序列的解鏈溫度之間的差別確定。僅當(dāng)它們被放置于序列的相同位置時，比較取代的Tm差別。通過參考文獻(xiàn)獲得氨基-LNA及其氧代-LNA對應(yīng)物的可比值(參見Singh，S.K.，Kumar，R.，WengelJ.J.Org.Chem.，Vol.63，No.26，1998)。例如，經(jīng)修飾的反-208a寡核苷酸退火到互補(bǔ)序列，長二十二個核苷酸，由RNA核苷和磷酸酯骨架構(gòu)成?；パa(bǔ)序列與內(nèi)源性成熟miRNA相同。熱變性溫度(Tm)測量為解鏈曲線(A260對Temp)的一階導(dǎo)數(shù)圖的最大值。該雙鏈體以1μM在0.9％NaCl緩沖液中構(gòu)成。溫度以1℃/min從25℃變化到95℃，并且每30秒讀一次260nm的OD。Tm值為至少兩次測量的平均值。使用VarianCary1EUV-Vis分光光度計(jì)測量16個核苷酸(與成熟的人miR-208a核苷酸序列互補(bǔ))的多種修飾的雙鏈體解鏈溫度。測試的反-miRNA208a寡核苷酸序列包括完全的DNA磷酸二酯(化合物M-10931)，四種具有1個、2個或3個氨基CBBN胸苷殘基替代dT殘基的DNA磷酸二酯寡核苷酸(化合物M-11915、M-11916、M-11917和M-11918)，混合的9LNA/7DNA硫代磷酸酯寡核苷酸(化合物M-10101)，以及2種混合的LNA/DNA/氨基CBBN硫代磷酸酯寡核苷酸，其中母體化合物(化合物M-10101)的LNA胸苷使用1個或2個氨基CBBN殘基替代(化合物M-11919和M-11920)。雙鏈體以1μM在0.9％NaCl中構(gòu)成。溫度以1℃/min從25℃變化到95℃，并且每30秒讀一次260nm的OD。具有氨基CBBN修飾的磷酸二酯寡核苷酸相比其完全DNA對應(yīng)物，一致地具有針對互補(bǔ)序列的更高解鏈溫度，以及因此更高的親和力(參見表1)。相對于DNA，親和力增強(qiáng)在5-9℃/修飾的等級上。這些親和力的增加與LNA和氨基LNA的文獻(xiàn)值一樣好或更好。表2符號的描述脫氧AdA氧代CBBNAbA脫氧GdG氧代CBBNGbG脫氧CdC氧代CBBNCbC脫氧TdT氧代CBBNTbTlnaAlA氨基CBBNAabAlnaGlG氨基CBBNGabGlnaClC氨基CBBNCabClnaTlT氨基CBBNTabT脫氧AP＝SdAs脫氧GP＝SdGs脫氧CP＝SdCs脫氧TP＝SdTslnaAP＝SlAslnaGP＝SlGslnaCP＝SlCslnaTP＝SlTs氨基LNA-T與其氧代-類似物L(fēng)NA-T的比較，顯示氨基LNA-T針對其補(bǔ)體沒有LNA-T穩(wěn)定。類似地，氨基ENA-T相對于其氧代-類似物似乎具有非常少的雙鏈體穩(wěn)定化效果。出人意料的是，氨基CBBN-T與其氧代CBBN-T類似物的比較顯示氨基CBBN修飾比氧代CBBN-T顯著地更穩(wěn)定，達(dá)到2-4℃/修飾(參見表3和圖3B)。不希望受到理論的束縛，推測LNA的2’-O(一種質(zhì)子受體)當(dāng)它在2’-位置被質(zhì)子供體替換時，具有針對雙鏈體水合和穩(wěn)定性的更為穩(wěn)定化的效果，正如在氨基LNA的情況下。相反，氨基CBBN比其氧代CBBN類似物似乎在雙鏈體水合和穩(wěn)定性上具有更多陽性效果，并提供在任意其它2’4’-碳-橋接雙環(huán)核苷酸中都沒有見到的Tm提高(參見圖3A和3B)。反-208a寡核苷酸的細(xì)胞培養(yǎng)活性產(chǎn)生了穩(wěn)定表達(dá)miR-208a的HeLa細(xì)胞系。具體地，將表達(dá)miR-208a的miRNA表達(dá)載體(CellBioLabs，Inc.)轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中。隨后使用嘌呤霉素選擇篩選選擇細(xì)胞，并分離通過qPCR測量的具有可檢測miR-208a表達(dá)的克隆(Ct值＝約30)。將細(xì)胞以10,000個細(xì)胞/孔鋪到黑色壁的96孔板中。鋪板后24小時后，使用含有在海腎(renilla)基因的3’UTR中的miR-208a結(jié)合位點(diǎn)和各種miR-208a抑制劑(化合物M-11919、M-11920和M-10101)的雙重螢光素酶質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞?；衔颩-10591為非靶向?qū)φ?。?7℃孵育細(xì)胞24小時，接著通過使用雙重螢光素酶報告蛋白測試系統(tǒng)(Promega)的發(fā)光測量螢火蟲(作為轉(zhuǎn)染標(biāo)準(zhǔn)化)和海腎水平兩者。數(shù)據(jù)相對于僅使用miR-208a雙重螢光素酶質(zhì)粒(psicheck208a)處理的細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化。該psicheck2細(xì)胞使用不包括miR-208a結(jié)合位點(diǎn)的雙重螢光素酶質(zhì)粒處理。結(jié)果證明，化合物M-11920具有與化合物M-10101可比的活性，化合物M-10101是一種優(yōu)化的miR208a抑制劑，其僅包括LNA/DNA堿基(參見圖4)。因此，使用氨基CBBN殘基多重替代LNA殘基導(dǎo)致miR208抑制活性的完全保留。化合物M-11919與其它兩種抑制劑相比具有稍低的活性(參見圖4)?；衔颩-11919的活性與Tm數(shù)據(jù)相關(guān)，表明化合物M-11919與M-11920化合物相比具有對miR-208aRNA的較低的親和力。實(shí)施例5：2’-C-橋接雙環(huán)核苷的產(chǎn)生本實(shí)施例進(jìn)一步描述了具有不同核堿基的2’-C-橋接雙環(huán)核苷的產(chǎn)生中的合成反應(yīng)和關(guān)鍵中間體(參見圖5-7)，其中式1的“X”為N。實(shí)施例5A：2’-C-橋接雙環(huán)核苷(腺苷)乙酸((3R，4S)-4-((4-氯芐基)氧基)-2-(6-N-苯甲?；佘?基)-5，5-雙(((甲基磺?；?氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)甲酯(29)將N，O-雙(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(27.6ml，113mmol)添加至于二氯乙烷(100m1)中的乙酸((3R，4S)-2-乙酰氧基-4-((4-氯芐基)氧基)-5，5-雙(((甲基磺?；?氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)甲酯(20.0g，37.7mmol)和N6-苯甲?；汆堰?11.2g，47.1mmol)的混合物中。將反應(yīng)混合物回流1小時。將該溶液冷卻至60℃并添加TMS-OTf(13.6ml，75.3mmol)。將混合物回流4小時。將該溶液冷卻至室溫，用CH2Cl2(500mL)稀釋，并用飽和NaHCO3(2x200mL)和鹽水(1x100mL)洗滌。干燥有機(jī)層(Na2SO4)，在減壓下濃縮，且殘留物分兩批在經(jīng)由乙酸乙酯洗脫的340gBiotageSNAP硅膠柱上純化。合并純級分并在1L圓底燒瓶中濃縮以得到作為白色固體物質(zhì)的乙酸((3R，4S)-4-((4-氯芐基)氧基)-2-(6-N-苯甲酰基腺苷-基)-5，5-雙(((甲基磺?；?氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)甲酯(18.90g，25.6mmol，68％收率)。不存在相當(dāng)量的可分離的核苷副產(chǎn)物。二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(6-(N-苯甲?；郊柞０被?-9H-嘌呤-9-基)-3-((4-氯芐基)氧基)-4-(羥基甲基)四氫呋喃-2，2-二基)雙(亞甲基)酯(36)包含純化的乙酸((3R，4S)-4-((4-氯芐基)氧基)-2-(6-N-苯甲?；佘?基)-5，5-雙(((甲基磺?；?氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)甲酯(18.90g，25.6mmol)的燒瓶裝有THF(400mL)和1.0MLiOH水溶液(113mL，1.0M)。允許混合物在室溫攪拌2小時。TLC表明脫乙?；呀?jīng)發(fā)生，同時使N-苯甲酰基完整。用水(200mL)稀釋反應(yīng)并用乙酸乙酯(3x300mL)萃取。合并有機(jī)相，用鹽水(1x200mL)洗滌，經(jīng)Na2SO4干燥，過濾至1000mL圓底燒瓶并真空濃縮以得到作為白色泡沫狀物的二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-((4-氯芐基)氧基)-4-(羥基甲基)四氫呋喃-2，2-二基)雙(亞甲基)酯(17.60g，25.3mmol)，其未經(jīng)進(jìn)一步純化即使用。燒瓶配有攪拌棒和隔膜密封。燒瓶裝有吡啶(200mL)并在室溫伴隨攪拌冷卻至約5℃。伴隨攪拌逐滴添加三甲基氯硅烷(7.0mL，55mmol)。將混合物從冷卻浴中移除并允許回到室溫。30分鐘后，在室溫逐滴添加苯甲酰氯(4.4mL，38mmol)并允許混合物攪拌過夜。添加水至反應(yīng)混合物(20mL)并攪拌混合物30分鐘。用DCM(600mL)稀釋混合物并用鹽水(3x150mL)洗滌。經(jīng)Na2SO4干燥有機(jī)相，過濾并濃縮至干燥。將一半的殘留物應(yīng)用至340gSNAP柱并經(jīng)由使用40-100％EtOAc/己烷梯度的Biotage洗脫。重復(fù)該步驟用于另一半粗物質(zhì)。合并包含級分的產(chǎn)物并濃縮以得到作為白色泡沫狀物的純的二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(6-(N-苯甲?；郊柞０被?-9H-嘌呤-9-基)-3-((4-氯芐基)氧基)-4-(羥基甲基)四氫呋喃-2，2-二基)雙(亞甲基)酯(16.21g，80.1％)。二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯芐基)氧基)四氫呋喃2，2-二基)雙(亞甲基)酯(37)將二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(6-(N-苯甲?；郊柞０被?-9H-嘌呤-9-基)-3-((4-氯芐基)氧基)-4-(羥基甲基)四氫呋喃-2，2-二基)雙(亞甲基)酯(16.2g，20.3mmol)、亞氨基二碳酸(2，2，2-三氟乙基)-叔丁基酯(6.16g，25.3mmol)和三苯基膦(6.64g，25.3mmol)稱量入具有攪拌棒的200mL圓底燒瓶。伴隨攪拌，燒瓶裝有200mLTHF。經(jīng)5分鐘，經(jīng)由注射器逐滴添加DIAD(5.0mL，25.3mmol)并允許混合物攪拌45分鐘。粗制混合物的TLC分析(60/40EtOAc/己烷)顯示反應(yīng)已完成，生成新的核苷陽性點(diǎn)(經(jīng)由Hannessians染色)。濃縮混合物至干并應(yīng)用至340gBiotageSNAP柱并用40-100％EtOAc/己烷梯度經(jīng)9個柱體積洗脫。合并包含級分的產(chǎn)物以得到白色泡沫狀物，將其立即再次溶于THF(500mL)并用2.0MLiOH(50.6mL，5當(dāng)量)處理4小時。TLC分析顯示產(chǎn)物為主要產(chǎn)物。無明顯的完全去苯甲?；镔|(zhì)的點(diǎn)。未經(jīng)進(jìn)一步純化即使用產(chǎn)物二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯芐基)氧基)四氫呋喃-2，2-二基)雙(亞甲基)酯(15.8g，98.2％)。(1R，5R，7R，8S)-7-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-8-((4-氯芐基)氧基)-5-(((甲基磺?；?氧基)甲基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(38)將二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯芐基)氧基)四氫呋喃-2，2-二基)雙(亞甲基)酯(5.0g，6.3mmol)稱量入具有攪拌棒的1000mL圓底燒瓶。燒瓶裝有THF(430mL)并允許攪拌溶液。將氫化鈉(60％于油中的分散體)(1.0g，25mmol)添加至溶液，燒瓶配有與干燥管通氣的回流冷凝器并將反應(yīng)加熱至60℃達(dá)1.5小時。在冰浴中無蓋冷卻反應(yīng)混合物，并通過經(jīng)15分鐘逐滴添加10mL水淬滅。真空濃縮混合物并在乙酸乙酯(300mL)中重懸。用鹽水(2x100mL)洗滌有機(jī)相，經(jīng)MgSO4干燥，過濾并濃縮成棕褐色泡沫狀物。該泡沫狀物通過柱色譜進(jìn)一步純化：應(yīng)用至340gBiotageSNAP柱并用35-100％乙酸乙酯/己烷梯度經(jīng)6個柱體積洗脫。合并純級分并濃縮以得到作為白色泡沫狀物的(1R，5R，7R，8S)-7-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-8-((4-氯芐基)氧基)-5-(((甲基磺?；?氧基)甲基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(2.31g，52.5％)。(1R，5R，7R，8S)-7-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-((苯甲酰基氧基)甲基)-8-((4-氯芐基)氧基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(39)將(1R，5R，7R，8S)-7-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-8-((4-氯芐基)氧基)-5-(((甲基磺?；?氧基)甲基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(1.70g，2.43mmol)和苯甲酸鈉(1.75g，12.2mmol)稱量入具有攪拌棒的250mL圓底燒瓶。燒瓶裝有DMF(150mL)并設(shè)置成在100℃攪拌48小時。將反應(yīng)混合物在真空濃縮至1/3體積，用飽和碳酸氫鈉溶液(500mL)稀釋并用乙酸乙酯(3x100mL)萃取。合并有機(jī)相并用鹽水(1x100mL)洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾并濃縮以得到作為白色泡沫狀物的(1R，5R，7R，8S)-7-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-((苯甲?；趸?甲基)-8-((4-氯芐基)氧基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(1.75g，99.25％)，其未經(jīng)進(jìn)一步純化即使用。(1R，5R，7R，8S)-7-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-8-((4-氯芐基)氧基)-5-(羥基甲基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(40)將(1R，5R，7R，8S)-7-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-((苯甲酰基氧基)甲基)-8-((4-氯芐基)氧基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(6.85g，9.45mmol)稱量入具有攪拌棒的250mL圓底燒瓶。燒瓶裝有甲醇(50mL)并設(shè)置為在50℃攪拌。將甲醇鈉(0.51g，9.4mmol)添加至溶液，允許其攪拌2小時。冷卻反應(yīng)混合物，濃縮至干并在DCM(250mL)中重懸。用鹽水(2x100mL)洗滌有機(jī)相，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾并濃縮至干燥以得到作為白色泡沫狀物的(1R，5R，7R，8S)-7-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-8-((4-氯芐基)氧基)-5-(羥基甲基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(4.25g，87.0％)。(1R，5R，7R，8S)-7-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-8-羥基-5-(羥基甲基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(42)將(1R，5R，7R，8S)-7-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-8-((4-氯芐基)氧基)-5-(羥基甲基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(4.25g，8.22mmol)溶于乙醇(20mL)并轉(zhuǎn)移至具有攪拌棒的100mL硼硅酸鹽瓶。立即添加Pearlman催化劑(3g)至溶液。將未封蓋的瓶置于300mLParr高壓釜(bomb)內(nèi)，密封并裝有氫氣(60psi)。將設(shè)備在油浴中加熱至70℃達(dá)17小時。在冰浴中冷卻設(shè)備并緩慢釋放壓力。從Parr高壓釜取出反應(yīng)混合物并通過硅藻土墊過濾。用溫?zé)岬囊掖?200mL)洗滌硅藻土和催化劑。在500mL圓底燒瓶中真空濃縮乙醇濾液以得到黑色泡沫狀物，將其與DCM(3x20mL)共蒸發(fā)以得到混有少量催化劑的粗制的(1R，5R，7R，8S)-7-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-8-羥基-5-(羥基甲基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(41)。立即將攪拌棒添加至裝有吡啶(50mL)并隔膜密封的燒瓶。將混合物設(shè)置為攪拌同時在冰浴中冷卻至0℃。逐滴添加TMS-Cl(2.6mL，21mmol)至攪拌的溶液。將反應(yīng)混合物從冰浴中移除并允許經(jīng)30分鐘溫?zé)嶂潦覝?。逐滴添加苯甲酰?)至反應(yīng)混合物。允許反應(yīng)在室溫攪拌3小時。通過以下方式淬滅反應(yīng)混合物：添加水(10mL)伴隨攪拌5分鐘，隨后添加濃縮的氫氧化銨(20mL)伴隨在室溫攪拌15分鐘。在真空濃縮混合物至干。將油狀物溶于乙酸乙酯(200mL)隨后用飽和碳酸氫鈉溶液(2x100mL)和鹽水(2x100mL)洗滌。有機(jī)相經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾并濃縮至干。將殘留物溶于THF(10mL)。伴隨攪拌添加1.0M于THF中的TBAF(8.5mL，8.5mmol)。在用乙酸乙酯(100mL)稀釋前攪拌反應(yīng)30分鐘。用10％檸檬酸鈉溶液(2x50mL)和鹽水(1x50mL)洗滌有機(jī)相。有機(jī)相經(jīng)檸檬酸鈉干燥，過濾并濃縮至干。將殘留物應(yīng)用至100gBiotageSNAP柱并用0-10％甲醇/DCM梯度經(jīng)9個柱體積洗脫。合并純級分并濃縮以得到作為白色泡沫狀物的(1R，5R，7R，8S)-7-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-8-羥基-5-(羥基甲基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(2.00g，49.0％)。N-(9-((1R，5R，7R，8S)-8-羥基-5-(羥基甲基)-3-(2，2，2-三氟乙酰基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-7-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺將(1R，5R，7R，8S)-7-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-8-羥基-5-(羥基甲基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(2.00g，4.03mmol)稱量入具有攪拌棒的200mL圓底燒瓶。添加二氯甲烷(10mL)和三氟乙酸(10mL)。無蓋攪拌混合物30分鐘，隨后濃縮至干。殘留物與甲醇(2x10mL)共蒸發(fā)。殘留物再次溶解于甲醇(20mL)和三氟乙酸乙酯(9.6mL，20當(dāng)量)。將三乙胺(4.50mL，8當(dāng)量)添加至溶液并在室溫封蓋攪拌混合物過夜。將混合物濃縮至干，溶解于二氯甲烷(100mL)并用飽和碳酸氫鈉溶液(2x50mL)和鹽水(1x20mL)洗滌。有機(jī)層經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾并濃縮以得到作為白色泡沫狀物的N-(9-((1R，5R，7R，8S)-8-羥基-5-(羥基甲基)-3-(2，2，2-三氟乙酰基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-7-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(1.80g，90.8％)，其未經(jīng)進(jìn)一步純化即使用。N-(9-((1R，5R，7R，8S)-5-((4，4′-二甲氧基三苯甲基氧基)甲基)-8-羥基-3-(2，2，2-三氟乙?；?-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-7-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺[DMTr-aA(Bz)(tfa)](43)將N-(9-((1R，5R，7R，8S)-8-羥基-5-(羥基甲基)-3-(2，2，2-三氟乙?；?-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-7-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(1.80g，3.65mmol)稱量入具有攪拌棒的100mL圓底燒瓶。燒瓶裝有吡啶(30mL)并設(shè)置成攪拌。立即將4，4’-二甲氧基三苯甲基氯(1.49g，4.39mmol)添加至溶液。隔膜密封燒瓶并允許混合物攪拌17小時。將甲醇(2mL)添加至反應(yīng)混合物，將其再攪拌30分鐘。將飽和碳酸氫鈉溶液(4mL)添加至反應(yīng)混合物，其隨后蒸發(fā)至干。殘留物懸浮于DCM中，過濾并應(yīng)用至TEA預(yù)處理的100gBiotageSNAP柱。用30-100％乙酸乙酯/己烷梯度經(jīng)6個柱體積洗脫產(chǎn)物。合并包含產(chǎn)物的級分以得到作為白色泡沫狀物的N-(9-((1R，5R，7R，8S)-5-((4，4′-二甲氧基三苯甲基氧基)甲基)-8-羥基-3-(2，2，2-三氟乙酰基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-7-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(1.50g，51.6％)。DMTr-aA(Bz)(tfa)亞酰胺(44)將DMTr-aA(Bz)(tfa)(1.50g，1.89mmol)稱量入具有攪拌棒并隔膜密封的100mL圓底燒瓶。燒瓶裝有DCM(30mL)和2-氰基乙基N，N，N′，N′-四異丙基亞磷酰二胺(1.14g，3.78mmol)。立即添加4，5-二氰基咪唑(0.22g，1.9mmol)，并允許反應(yīng)混合物攪拌過夜。用DCM(40mL)稀釋反應(yīng)混合物，用飽和碳酸氫鈉溶液(2x50mL)和鹽水(1x50mL)洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾并濃縮。將殘留物應(yīng)用至TEA處理的100gBiotageSNAP柱并用30-100％乙酸乙酯/己烷梯度經(jīng)6個柱體積洗脫。合并包含產(chǎn)物的級分以得到作為白色泡沫狀物的DMTr-aA(Bz)(tfa)亞酰胺(1.64g，87.3％)。實(shí)施例5B：2’-C-橋接雙環(huán)核苷(鳥苷)乙酸((2R，3R，4S)-2-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-4-((4-氯芐基)氧基)-5，5-雙(((甲基磺酰基)氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)甲酯(45)將乙酸((2S，3R，4S)-4-((4-氯芐基)氧基)-2-甲氧基-5，5-雙(((甲基磺?；?氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)甲酯(15.00g，28.25mmol)稱量入具有攪拌棒的500mL圓底燒瓶。燒瓶裝有乙酸酐(10.68ml，113mmol)和乙酸(60mL)。在60℃攪拌混合物直至全部固體成為溶液。逐滴添加濃硫酸(75uL，0.05當(dāng)量)并允許混合物在60℃再攪拌5分鐘。從加熱移除反應(yīng)混合物并允許伴隨攪拌過夜回至室溫。用乙酸乙酯(300mL)稀釋反應(yīng)混合物，轉(zhuǎn)移至分液漏斗并用鹽水(3x200mL)洗滌。用飽和碳酸氫鹽洗滌(2x200mL)和最終的鹽水洗滌(100mL)小心中和有機(jī)相。經(jīng)硫酸鈉干燥有機(jī)相，過濾至500mL圓底燒瓶并濃縮以得到清澈、淺黃棕色油狀物，其作為直接使用的粗品。將2-氨基-6-氯嘌呤(6.23g，36.7mmol)和攪拌棒添加至獲得的油狀物中，且燒瓶配有與干燥管通風(fēng)的回流冷凝器。燒瓶裝有N，O-雙三甲基甲硅烷基乙酰胺(19.34mL，79.1mmol)和乙腈。當(dāng)混合物變?yōu)榫鶆蛉芤簳r，將混合物在油浴中回流攪拌45分鐘。反應(yīng)混合物短暫地從油浴移除并在逐滴添加三氟甲磺酸(三甲基甲硅烷基)酯(10.23mL，56.5mmol)前允許稍微冷卻。添加完成后，將反應(yīng)混合物返回回流1.5小時。過程中經(jīng)由TLC(60％EtOAc/Hex，UV&Hannessian染色顯現(xiàn)，Rf0.5)的監(jiān)測顯示主要UV產(chǎn)物的出現(xiàn)并起始糖的完全消耗。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫并用乙酸乙酯(500mL)稀釋。用飽和碳酸氫鈉(2x200mL)和鹽水(1x100mL)洗滌有機(jī)相。有機(jī)相經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾并濃縮。對半分開粗產(chǎn)物且每部分置于硅膠色譜(BiotageIsolera，340gSNAP柱)。合并全部純級分以得到作為白色泡沫狀物的N9，β糖苷，乙酸((2R，3R，4S)-2-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-4-((4-氯芐基)氧基)-5，5-雙(((甲基磺?；?氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)甲酯(9.80g，51％)。二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-3-((4-氯芐基)氧基)-4-(羥基甲基)四氫呋喃-2，2-二基)雙(亞甲基)酯(46)將乙酸((2R，3R，4S)-2-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-4-((4-氯芐基)氧基)-5，5-雙(((甲基磺?；?氧基)甲基)四氫呋喃-3-基)甲酯(9.80g，14.6mmol)稱量入具有攪拌棒的500mL圓底燒瓶。燒瓶裝有THF(100mL)和1.0MLiOH水溶液(44mL，3當(dāng)量)。允許將混合物攪拌6小時。用乙酸乙酯(500mL)稀釋混合物并用鹽水(2x100mL)洗滌。有機(jī)相經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾并濃縮以得到作為白色泡沫狀物的二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-3-((4-氯芐基)氧基)-4-(羥基甲基)四氫呋喃-2，2-二基)雙(亞甲基)酯(9.184g，99％)，其未經(jīng)進(jìn)一步純化即使用。二甲磺酸((3R，4R，5R)-5-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-4-((N-(叔丁氧基羰基)-2，2，2-三氟乙基氨基甲?；?甲基)-3-((4-氯芐基)氧基)四氫呋喃-2，2-二基)雙(亞甲基)酯亞氨基二碳酸(2，2，2-三氟乙基)-叔丁基酯(圖6)將二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-3-((4-氯芐基)氧基)-4-(羥基甲基)四氫呋喃-2，2-二基)雙(亞甲基)酯(9.09g，14.51mmol)、三苯基膦(5.709g，21.8mmol)和亞氨基二碳酸(2，2，2-三氟乙基)-叔丁基酯(5.29g，21.8mmol)添加至具有攪拌棒的500mL圓底燒瓶。燒瓶裝有THF，隔膜密封并設(shè)置成在20℃水浴中攪拌。經(jīng)3分鐘將二異丙基偶氮二酰亞胺(diisopropylazodiimide)(4.29mL，21.8mmol)逐滴添加至攪拌混合物。允許反應(yīng)混合物攪拌1.5小時。將反應(yīng)混合物濃縮至固體。立即將產(chǎn)物應(yīng)用至340gBiotageSNAP柱并用20-100％乙酸乙酯/己烷梯度經(jīng)9個柱體積洗脫。合并純級分并濃縮以得到作為白色泡沫狀物的產(chǎn)物(11.75g，95.1％)。二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-4-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯芐基)氧基)四氫呋喃-2，2-二基)雙(亞甲基)酯(圖6)將二甲磺酸((3R，4R，5R)-5-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-4-((N-(叔丁氧基羰基)-2，2，2-三氟乙基氨基甲?；?甲基)-3-((4-氯芐基)氧基)四氫呋喃-2，2-二基)雙(亞甲基)酯亞氨基二碳酸(2，2，2-三氟乙基)-叔丁基酯(11.7g，12.7mmol)稱量入具有攪拌棒的500mL圓底燒瓶。燒瓶裝有THF(100mL)和1.0MLiOH水溶液(42mL，3當(dāng)量)。封蓋混合物并在室溫攪拌1.5小時。用乙酸乙酯(500mL)稀釋反應(yīng)并用鹽水(2x100mL)洗滌。有機(jī)相經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾并濃縮至干。所得的泡沫狀物與ACN(2x100mL)共蒸發(fā)并在高真空下使質(zhì)量恒定以得到作為白色泡沫狀物的二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-4-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯芐基)氧基)四氫呋喃-2，2-二基)雙(亞甲基)酯(9.75g，97％)。二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(2-氨基-6-(芐基氧基)-9H-嘌呤-9-基)-4-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯芐基)氧基)四氫呋喃-2，2-二基)雙(亞甲基)酯(47)將二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-4-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯芐基)氧基)四氫呋喃-2，2-二基)雙(亞甲基)酯(9.75g，13.4mmol)稱量入具有攪拌棒的500mL圓底燒瓶。燒瓶裝有ACN(150mL)和芐醇，隔膜密封，隨后在鹽-冰浴中伴隨攪拌冷卻。經(jīng)20分鐘添加400mg份的叔丁醇鉀(2.38g，20.2mmol)。添加最后一份后，允許繼續(xù)攪拌反應(yīng)2小時同時維持鹽-冰浴溫度。反應(yīng)混合物的TLC(95：5DCM：MeOH，UV/Hanessians染色顯現(xiàn))顯示反應(yīng)完成。用水(400mL)稀釋反應(yīng)混合物并用乙酸乙酯(3x250mL)萃取。合并有機(jī)相并用鹽水洗滌(1x100mL)，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾并濃縮至干。將所得的油狀物應(yīng)用至TEA預(yù)處理的BiotageSNAP柱(340g)并用20-100％EtOAc/己烷梯度經(jīng)6個柱體積洗脫。合并純級分，特別注意去除芐醇并濃縮以得到作為白色泡沫狀物的二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(2-氨基-6-(芐基氧基)-9H-嘌呤-9-基)-4-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯芐基)氧基)四氫呋喃-2，2-二基)雙(亞甲基)酯(8.50g，79.3％)。(1R，5R，7R，8S)-7-(2-氨基-6-(芐基氧基)-9H-嘌呤-9-基)-8-((4-氯芐基)氧基)-5-(((甲基磺?；?氧基)甲基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(48)將二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(2-氨基-6-(芐基氧基)-9H-嘌呤-9-基)-4-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯芐基)氧基)四氫呋喃-2，2-二基)雙(亞甲基)酯(8.50g，10.7mmol)稱量入具有攪拌棒的2L圓底燒瓶。燒瓶裝有THF(850mL)和氫化鈉(4.26g，107mmol)，配有具有干燥管通風(fēng)口的回流冷凝器并設(shè)置在60℃攪拌4小時。將反應(yīng)混合物冷卻至0℃并通過逐滴添加10mL水淬滅。將反應(yīng)混合物真空濃縮至干并在乙酸乙酯(300mL)中重新溶解。用水(2x100mL)和鹽水(1x100mL)洗滌有機(jī)相，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾并濃縮至干。將殘留物應(yīng)用至340gBiotageSNAP柱并用30-100％乙酸乙酯梯度經(jīng)9個柱體積洗脫。分開合并包含產(chǎn)物的級分，即(1R，5R，7R，8S)-7-(2-氨基-6-(芐基氧基)-9H-嘌呤-9-基)-8-((4-氯芐基)氧基)-5-(((甲基磺?；?氧基)甲基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(4.70g，62.9％)和起始物質(zhì)二甲磺酸((3S，4R，5R)-5-(2-氨基-6-(芐基氧基)-9H-嘌呤-9-基)-4-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)-3-((4-氯芐基)氧基)四氫呋喃-2，2-二基)雙(亞甲基)酯(2.32g，27.3％)，并濃縮至白色泡沫狀物。(1R，5R，7R，8S)-7-(2-氨基-6-(芐基氧基)-9H-嘌呤-9-基)-5-((苯甲?；趸?甲基)-8-((4-氯芐基)氧基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(49)將(1R，5R，7R，8S)-7-(2-氨基-6-(芐基氧基)-9H-嘌呤-9-基)-8-((4-氯芐基)氧基)-5-(((甲基磺酰基)氧基)甲基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(4.70g，6.70mmol)和苯甲酸鈉(7.80g，54.1mmol)稱量入具有攪拌棒的2L圓底燒瓶。燒瓶裝有DMF(500mL)并隔膜密封。伴隨劇烈攪拌將混合物加熱至100℃過夜。在50℃真空下濃縮反應(yīng)混合物至大約100mL。將混合物用飽和碳酸氫鈉稀釋至500mL。用乙酸乙酯(3x200mL)萃取水相。合并有機(jī)相并用鹽水(1x100mL)洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾并濃縮以得到作為白色泡沫狀物的粗制的(1R，5R，7R，8S)-7-(2-氨基-6-(芐基氧基)-9H-嘌呤-9-基)-5-((苯甲?；趸?甲基)-8-((4-氯芐基)氧基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(4.56g，93.6％)，其未經(jīng)進(jìn)一步純化即使用。(1R，5R，7R，8S)-7-(2-氨基-6-氧代-1，6-二氫-9H-嘌呤-9-基)-8-羥基-5-(羥基甲基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(50)將(1R，5R，7R，8S)-7-(2-氨基-6-(芐基氧基)-9H-嘌呤-9-基)-5-((苯甲?；趸?甲基)-8-((4-氯芐基)氧基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(2.40g，3.30mmol)稱量入具有攪拌棒的250mL圓底燒瓶。燒瓶裝有乙醇(15mL)。將甲醇鈉(0.19g，3.30mmol)添加至混合物，隔膜密封燒瓶并溫?zé)嶂?0℃達(dá)2小時。通過添加乙酸(0.19mL，3.30mmol)中和溶液。將混合物和攪拌棒轉(zhuǎn)移至100mL硼硅酸鹽瓶，將其置于300mLParr高壓釜。將Pearlman催化劑(1.50g)添加至混合物并密封設(shè)備，且裝有氫氣(60psi)。將高壓釜設(shè)備在設(shè)置以500rpm攪拌的磁力攪拌臺上加熱至70℃達(dá)17小時。將設(shè)備冷卻至0℃并在拆卸高壓釜設(shè)備前釋放壓力。通過硅藻土墊過濾溶液以去除大部分催化劑。用額外的200mL溫?zé)嵋掖枷礈旃柙逋痢⑦^濾物濃縮至干并與二氯甲烷(3x25mL)共蒸發(fā)以得到作為白色泡沫狀物的(1R，5R，7R，8S)-7-(2-氨基-6-氧代-1，6-二氫-9H-嘌呤-9-基)-8-羥基-5-(羥基甲基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(1.12g，83.1％)，其未經(jīng)進(jìn)一步純化即使用。N-(9-((1R，5R，7R，8S)-8-羥基-5-(羥基甲基)-3-(2，2，2-三氟乙?；?-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-7-基)-6-氧代-6，9-二氫-1H-嘌呤-2-基)異丁酰胺(51)將(1R，5R，7R，8S)-7-(2-氨基-6-氧代-1，6-二氫-9H-嘌呤-9-基)-8-羥基-5-(羥基甲基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(0.45g，1.1mmol)稱量入具有磁力攪拌棒的100mL圓底燒瓶并隔膜密封。燒瓶裝有吡啶(10mL)并在冰浴中冷卻至0℃。將TMS-Cl(0.42mL，3.3mmol)逐滴添加至混合物并允許反應(yīng)攪拌30分鐘。逐滴添加丁酰氯(0.13mL，1.2mmol)至攪拌的混合物，允許混合物經(jīng)3小時回至室溫。啟封反應(yīng)混合物，用水(2mL)淬滅并允許攪拌30分鐘。淬滅的反應(yīng)用乙酸乙酯(100mL)稀釋并用飽和碳酸氫鈉溶液(2x50mL)和鹽水(1x50mL)萃取。有機(jī)相經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾并濃縮以得到粗制泡沫狀物，伴隨攪拌將該泡沫狀物立即用0.5M于THF中的TBAF(2.4mL，1.1當(dāng)量)處理達(dá)30分鐘。用二氯甲烷(40mL)稀釋混合物并用10％水溶性檸檬酸鈉(2x20mL)洗滌。用鹽水(1x10mL)洗滌有機(jī)相，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾并濃縮至黃棕色粉末，伴隨攪拌將所述粉末立即置于10mL的1∶1TFA∶DCM達(dá)45分鐘。蒸發(fā)混合物至干并與乙醇(2x10mL)共蒸發(fā)。將所得的固體再次溶于乙醇(10mL)和三氟乙酸乙酯(2.5mL，21.55mmol)。將三乙胺添加至攪拌的混合物(2.2mL，15.67mmol)，允許混合物在室溫攪拌過夜。真空濃縮反應(yīng)混合物并用二氯甲烷(30mL)和飽和碳酸氫鈉溶液(20mL)分配。碳酸氫鹽溶液進(jìn)一步用DCM(2x10mL)萃取。合并有機(jī)相，用鹽水(1x20mL)洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾并濃縮以得到作為棕褐色泡沫的N-(9-((1R，5R，7R，8S)-8-羥基-5-(羥基甲基)-3-(2，2，2-三氟乙?；?-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-7-基)-6-氧代-6，9-二氫-1H-嘌呤-2-基)異丁酰胺(0.38g，73％)，其未經(jīng)進(jìn)一步純化即使用。DMTr-aG(ibu)(tfa)(52)將N-(9-((1R，5R，7R，8S)-8-羥基-5-(羥基甲基)-3-(2，2，2-三氟乙?；?-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-7-基)-6-氧代-6，9-二氫-1H-嘌呤-2-基)異丁酰胺(0.38g，0.80mmol)稱量入具有攪拌棒的100mL圓底燒瓶并隔膜密封。燒瓶裝有吡啶(10mL)并立即添加4，4′-二-甲氧基三苯甲基氯(.326g，0.96mmol)。封蓋燒瓶并允許在室溫攪拌過夜。通過添加甲醇(0.5mL)淬滅反應(yīng)。將飽和碳酸氫鈉溶液(4mL)添加至反應(yīng)混合物，隨后將混合物蒸發(fā)至干。將殘留物懸浮于DCM中，過濾并應(yīng)用至TEA預(yù)處理的50gBiotageSNAP柱。用30-100％乙酸乙酯/己烷梯度經(jīng)6個柱體積洗脫產(chǎn)物。合并包含產(chǎn)物的級分以得到作為白色泡沫狀物的DMTr-aG(ibu)(tfa)(0.41g，65.9％)。DMTr-aG(ibu)(tfa)亞酰胺(53)將DMTr-aG(ibu)(tfa)(0.40g，0.53mmol)稱量入具有攪拌棒的100mL圓底燒瓶并隔膜密封。燒瓶裝有DCM(10mL)和2-氰基乙基N，N，N′，N′-四異丙基亞磷酰二胺(0.32g，1.06mmol)。立即添加4，5-二氰基咪唑(62.4mg，0.53mmol)，并允許反應(yīng)混合物攪拌過夜。用DCM(40mL)稀釋反應(yīng)混合物，用飽和碳酸氫鈉溶液(2x50mL)和鹽水(1x50mL)洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾并濃縮。將殘留物應(yīng)用至TEA處理的100gBiotageSNAP柱并用30-100％乙酸乙酯/己烷梯度經(jīng)9個柱體積洗脫。合并包含產(chǎn)物的級分以得到作為白色泡沫狀物的DMTr-aG(ibu)(tfa)亞酰胺(0.39g，76％)。實(shí)施例5C：2’-C-橋接雙環(huán)核苷(胞嘧啶)(1R，5R，7R，8S)-7-(4-氨基-5-甲基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-5-(羥基甲基)-8-((三甲基甲硅烷基)氧基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(55)將(1R，5R，7R，8S)-8-羥基-5-(羥基甲基)-7-(5-甲基-2，4-二氧代-3，4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯，54，(0.80g，2.1mmol)稱量入具有攪拌棒的100mL圓底燒瓶并隔膜密封。燒瓶裝有ACN(10mL)和TEA(1.16mL，8.35mmol)，隨后冷卻至0℃。經(jīng)5分鐘伴隨攪拌逐滴添加TMS-Cl(0.583mL，4.60mmol)。返回室溫的同時允許混合物攪拌達(dá)30分鐘。在另一具有攪拌棒的250mL圓底燒瓶中添加1，2，4-1H-三唑(1.441g，20.9mmol)并隔膜密封。用氬氣沖洗燒瓶并在冰浴中冷卻至0℃。燒瓶裝有ACN(20mL)和TEA(2.90mL，20.9mmol)，隨后設(shè)置為攪拌。經(jīng)5分鐘伴隨劇烈攪拌逐滴添加PO1l3。將甲硅烷基化的核苷溶液吸收于注射器中并經(jīng)數(shù)分鐘逐滴添加至冷卻的POCl3/三唑溶液。從冰浴移除反應(yīng)并允許經(jīng)2小時回到室溫。用乙酸乙酯(200mL)稀釋反應(yīng)混合物并用飽和碳酸氫鈉(2x100mL)和鹽水(1x50mL)小心洗滌。有機(jī)相經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾并在具有攪拌棒的100mL圓底燒瓶中濃縮至黃色泡沫狀物。燒瓶密封并裝有ACN(15mL)和飽和氨溶液(15mL)。啟封前在室溫攪拌混合物17小時。濃縮混合物至干，再次溶解于DCM(50mL)并用飽和碳酸氫鈉(2x10mL)和鹽水(1x10mL)洗滌有機(jī)相。有機(jī)相經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾并濃縮至干以得到作為黃褐色泡沫狀物的粗制(1R，5R，7R，8S)-7-(4-氨基-5-甲基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-5-(羥基甲基)-8-((三甲基甲硅烷基)氧基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(0.63g，66.4％)。(1R，5R，7R，8S)-7-(4-苯甲酰氨基-5-甲基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-8-羥基-5-(羥基甲基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(56)將(1R，5R，7R，8S)-7-(4-氨基-5-甲基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-5-(羥基甲基)-8-((三甲基甲硅烷基)氧基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(0.60g，1.3mmol)稱量入具有攪拌棒的100mL圓底燒瓶并隔膜密封。燒瓶裝有吡啶(25mL)并將混合物設(shè)置為攪拌同時在冰浴中冷卻至0℃。逐滴添加TMS-Cl(0.25mL，2.0mmol)至攪拌的溶液。將反應(yīng)混合物從冰浴移除并允許經(jīng)30分鐘溫?zé)嶂潦覝?。將苯甲酰?0.17mL，1.4mmol)逐滴添加至反應(yīng)混合物。在室溫允許攪拌反應(yīng)3小時。通過添加水(6mL)伴隨攪拌5分鐘淬滅反應(yīng)混合物，隨后添加濃氫氧化銨(10mL)，同時在室溫再攪拌15分鐘。真空濃縮混合物至干。將油狀物溶于乙酸乙酯(200mL)，隨后用飽和碳酸氫鈉溶液(2x100mL)和鹽水(2x100mL)洗滌。有機(jī)相經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾并濃縮至干燥。將殘留物溶于THF(5mL)。伴隨攪拌添加1.0M于THF中的TBAF(2.5mL，2.5mmol)。在用DCM(50mL)稀釋前攪拌反應(yīng)30分鐘。用10％檸檬酸鈉溶液(2x10mL)和鹽水(1x10mL)洗滌有機(jī)相。有機(jī)相經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾并濃縮至干。將殘留物應(yīng)用至25gBiotageSNAP柱并用0-10％甲醇/DCM梯度經(jīng)9個柱體積洗脫。合并純級分并濃縮以得到作為白色泡沫狀物的(1R，5R，7R，8S)-7-(4-苯甲酰氨基-5-甲基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-8-羥基-5-(羥基甲基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(0.49g，76.3％)。N-(1-((1R，5R，7R，8S)-8-羥基-5-(羥基甲基)-3-(2，2，2-三氟乙?；?-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-7-基)-5-甲基-2-氧代-1，2-二氫嘧啶-4-基)苯甲酰胺(圖7)將(1R，5R，7R，8S)-7-(4-苯甲酰氨基-5-甲基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-8-羥基-5-(羥基甲基)-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸叔丁酯(0.49g，1.0mmol)稱量入具有攪拌棒的50mL圓底燒瓶。伴隨攪拌，燒瓶裝有DCM(5mL)和三氟乙酸。30分鐘后，真空濃縮溶液至干。殘留物與乙醇(2x10mL)共蒸發(fā)。將所得的物質(zhì)再次溶于乙醇(10mL)、三氟乙酸乙酯(2.4mL，20mmol)和三甲胺(1.4mL，10mmol)。在室溫攪拌混合物過夜。蒸發(fā)混合物至干并直接應(yīng)用至25gBiotageSNAP柱并用0-10％甲醇/DCM梯度經(jīng)9個柱體積洗脫。合并純級分并濃縮以得到作為白色泡沫作為的N-(1-((1R，5R，7R，8S)-8-羥基-5-(羥基甲基)-3-(2，2，2-三氟乙?；?-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-7-基)-5-甲基-2-氧代-1，2-二氫吡啶-4-基)苯甲酰胺(0.35g，72％)。N-(1-((1R，5R，7R，8S)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-8-羥基-3-(2，2，2-三氟乙?；?-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-7-基)-5-甲基-2-氧代-1，2-二氫吡啶-4-基)苯甲酰胺(57)將來自之前步驟的N-(1-((1R，5R，7R，8S)-8-羥基-5-(羥基甲基)-3-(2，2，2-三氟乙?；?-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-7-基)-5-甲基-2-氧代-1，2-二氫吡啶-4-基)苯甲酰胺(0.35g，0.73mmol)稱量入具有攪拌棒的50mL圓底燒瓶并隔膜密封。燒瓶裝有吡啶(10mL)并立即添加4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(0.295g，0.87mmol)。封蓋燒瓶并允許在室溫攪拌過夜。反應(yīng)通過添加甲醇(0.5mL)淬滅。將飽和碳酸氫鈉溶液(4mL)添加至反應(yīng)混合物，隨后將該混合物蒸發(fā)至干。將殘留物懸浮于DCM中，過濾并應(yīng)用至TEA預(yù)處理的50gBiotageSNAP柱。用30-100％乙酸乙酯/己烷梯度經(jīng)6個柱體積洗脫產(chǎn)物。合并包含產(chǎn)物的級分以得到作為白色泡沫狀物的N-(1-((1R，5R，7R，8S)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-8-羥基-3-(2，2，2-三氟乙?；?-6-氧雜-3-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-7-基)-5-甲基-2-氧代-1，2-二氫吡啶-4-基)苯甲酰胺[DMTr-aC(Bz)(tfa)](0.35g，61.5％)。DMTr-aC(Bz)(tfa)亞酰胺(58)將DMTr-aC(Bz)(tfa)(0.35g，0.45mmol)稱量入具有攪拌棒的100mL圓底燒瓶并隔膜密封。燒瓶裝有DCM(7mL)和2-氰基乙基N，N，N′，N′-四異丙基亞磷酰二胺(0.27g，0.89mmol)。立即添加4，5-二氰基咪唑(53mg，0.45mmol)，并允許反應(yīng)混合物攪拌過夜。用DCM(40mL)稀釋反應(yīng)混合物，用飽和碳酸氫鈉溶液(2x20mL)和鹽水(1x10mL)洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾并濃縮。將殘留物應(yīng)用至TEA處理的25gBiotageSNAP柱并30-100％乙酸乙酯/己烷梯度經(jīng)9個柱體積洗脫。合并包含產(chǎn)物的級分以得到作為白色泡沫狀物的DMTr-aC(Bz)(tfa)亞酰胺(0.38g，86％)。當(dāng)前第1頁1 2 3