根據(jù)35U.S.C.§119(e)，本申請(qǐng)要求2014年5月1日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)序列第61/987,396號(hào)和2015年4月23日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)序列第62/151,909號(hào)(代理人參考第185/002X號(hào))的申請(qǐng)日的優(yōu)先權(quán)，所述申請(qǐng)的公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。

引言

核酸聚合物化學(xué)已在醫(yī)藥、診斷和分析領(lǐng)域且更具體地說在反義和抗基因治療學(xué)、組合化學(xué)、分支DNA信號(hào)放大以及基于陣列的DNA診斷學(xué)和分析中的許多開發(fā)中的技術(shù)中起作用。一些這種聚合物化學(xué)已涉及改進(jìn)天然核酸聚合物如DNA的結(jié)合強(qiáng)度、特異性和核酸酶抗性。肽核酸(PNA)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酰胺酯核苷間鍵聯(lián)是已應(yīng)用至寡核苷酸以提供一種或多種期望性質(zhì)如核酸酶抗性、細(xì)胞攝取和溶解性的一些聚合物化學(xué)的實(shí)例。

寡核苷酸N3'→P5'磷酰胺酯可與互補(bǔ)DNA和RNA鏈形成穩(wěn)定雙鏈體，以及與DNA雙鏈體形成穩(wěn)定三鏈體，并且對(duì)核酸酶具有抗性。已發(fā)現(xiàn)寡核苷酸N3'→P5'硫代磷酰胺酯在體外和體內(nèi)用作有效反義劑。例如，含有抑制端粒酶活性的化合物的寡核苷酸可用于治療端粒酶介導(dǎo)的病癥(如癌癥)，因?yàn)榘┘?xì)胞表達(dá)端粒酶活性且正常人類體細(xì)胞不具有生物學(xué)相關(guān)水平下的端粒酶活性。因此，制備和分離此類寡核苷酸的方法是令人感興趣的。

概述

本公開提供一種經(jīng)由依次偶聯(lián)循環(huán)制備寡核苷酸的固相方法，所述方法包括二核苷酸二聚體亞基至少一次偶聯(lián)至生長(zhǎng)鏈的游離3’-端基(例如，3’-羥基或3’-氨基)。主題方法包括制備寡核苷酸，其中至少兩個(gè)核苷亞基通過N3′→P5′磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)連接。所述方法可包括以下步驟：(a)使連接至固相支撐物的末端核苷的受保護(hù)的3'氨基脫保護(hù)，所述脫保護(hù)形成游離3'氨基；(b)使所述游離3'氨基與3'-保護(hù)的氨基-二核苷酸-5'-亞磷酰胺二聚體在親核催化劑存在下接觸以形成核苷間N3'→P5'亞磷酰胺鍵聯(lián)；以及(c)使所述鍵聯(lián)氧化。在一些情況下，使所述鍵聯(lián)氧化包括硫化以產(chǎn)生核苷間N3'→P5'硫代磷酰胺酯鍵聯(lián)。

本公開的方面包括通過主題方法產(chǎn)生的寡核苷酸組合物，所述組合物包含減少量的一種或多種(N-x)寡核苷酸產(chǎn)物。在一些情況下，所述減少量是相對(duì)于N產(chǎn)物少于一種或多種(N-x)產(chǎn)物的(1.9x N)重量份至100重量份。根據(jù)主題方法制備的寡核苷酸包括具有與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的N核苷亞基的序列的寡核苷酸，其中至少兩個(gè)核苷亞基通過N3′→P5′硫代磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)連接。還提供包含主題寡核苷酸組合物的藥物組合物。

附圖簡(jiǎn)述

圖1A和1B示出TA二聚體硫代磷酰胺酯(化合物7e，方案1)的HPLC色譜圖(A)和³¹P NMR譜(B)。

圖2A和2B示出AA二聚體硫代磷酰胺酯(化合物7a，方案1)的HPLC色譜圖(A)和³¹P NMR譜(B)。

圖3A和3B示出GG二聚體硫代磷酰胺酯(化合物7c，方案1)的HPLC色譜圖(A)和³¹P NMR譜(B)。

圖4A和4B示出GT二聚體硫代磷酰胺酯(化合物7d，方案1)的HPLC色譜圖(A)和³¹P NMR譜(B)。

圖5A和5B示出GA二聚體硫代磷酰胺酯(化合物7b，方案1)的HPLC色譜圖(A)和³¹P NMR譜(B)。

圖6A和6B示出二聚體酰胺化物TA、AA、GA、GT和GG的LCMS跡線。

圖7示出使用單體偶聯(lián)策略，伊美司他的140μmole規(guī)模合成的產(chǎn)物的HPLC色譜圖。

圖8示出使用二聚體嵌段偶聯(lián)策略，伊美司他的140μmole規(guī)模合成的產(chǎn)物的HPLC色譜圖。

定義

除非另外指示，否則以下術(shù)語具有以下含義。任何未定義的術(shù)語具有其領(lǐng)域公認(rèn)的含義。

如本文所用，術(shù)語多核苷酸和寡核苷酸可互換使用。每當(dāng)寡核苷酸由諸如“ATGUCCTG”的字母序列表示時(shí)，除非另外指示，否則應(yīng)理解核苷酸是呈從左至右的5'→3'順序，且“A”表示脫氧腺苷，“C”表示脫氧胞苷，“G”表示脫氧鳥苷，“T”表示胸苷，且“U”表示脫氧尿苷。

如本文所用，“核苷”包括天然核苷，包括2'-脫氧和2'-羥基形式，例如如Kornberg和Baker,DNA Replication,第2版(Freeman,San Francisco,1992)中所描述。提及核苷的“類似物”包括具有修飾的堿基部分和/或修飾的糖部分的合成核苷，例如通常由Scheit,Nucleotide Analogs(John Wiley,New York,1980)描述。所述類似物包括經(jīng)設(shè)計(jì)以增強(qiáng)結(jié)合性質(zhì)(例如穩(wěn)定性、特異性等)的合成核苷，如由Uhlmann和Peyman(Chemical Reviews,90:543-584,1990)所公開。在一些實(shí)施方案中，核苷或核苷類似物包括3’-羥基或3’-氨基。

術(shù)語“堿基”和“核堿基”可互換使用且在本文定義為包括(i)常規(guī)DNA和RNA堿基(尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤和胞嘧啶)，和(ii)修飾的堿基或堿基類似物(例如，5-甲基-胞嘧啶、5-溴尿嘧啶或肌苷)。堿基類似物是其分子結(jié)構(gòu)模擬常規(guī)DNA或RNA堿基的分子結(jié)構(gòu)的化學(xué)品。

如本文所用，“嘧啶”意指存在于天然核苷中的嘧啶，包括胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶以及其共同類似物，如含有氧基、甲基、丙炔基、甲氧基、羥基、氨基、硫代、鹵代等取代基的那些。如本文所用的術(shù)語還包括具有連接的常見保護(hù)基的嘧啶，如N⁴-苯甲?；奏?。其他常見的嘧啶保護(hù)基由Beaucage和Iyer Tetrahedron 48:2223-2311(1992)公開。

如本文所用，“嘌呤”意指存在于天然核苷中的嘌呤，包括腺嘌呤、鳥嘌呤和次黃嘌呤以及其共同類似物，如含有氧基、甲基、丙炔基、甲氧基、羥基、氨基、硫代、鹵代等取代基的那些。如本文所用的術(shù)語還包括具有連接的常見保護(hù)基的嘌呤，如N²-苯甲?；B嘌呤、N²-異丁?；B嘌呤、N⁶-苯甲酰基腺嘌呤等。其他常見的嘌呤保護(hù)基由Beaucage和Iyer Tetrahedron 48:2223-2311(1992)公開。如本文所用，作為化學(xué)名稱的組成部分的術(shù)語“-受保護(hù)的-”是指本領(lǐng)域公認(rèn)的用于化合物的特定部分的保護(hù)基，例如關(guān)于核苷之“5'-保護(hù)的-羥基”包括三苯基甲基(即三苯甲基)、對(duì)茴香基二苯基甲基(即單甲氧基三苯甲基或MMT)、二-對(duì)茴香基苯基甲基(即二甲氧基三苯甲基或DMT)等；且關(guān)于核堿基的受保護(hù)的核堿基包括用如二甲基氨基甲脒(DMF)、苯甲?；?Bz)、異丁?；然鶊F(tuán)保護(hù)的雜原子。本領(lǐng)域公認(rèn)的保護(hù)基包括在以下參考文獻(xiàn)中描述的那些保護(hù)基：Gait編輯,Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach(IRL Press,Oxford,1984)；Amarnath和Broom,Chemical Reviews,77:183-217,1977；Pon等人,Biotechniques,6:768-775,1988；Ohtsuka等人,Nicleic Acids Research,10:6553-6570,1982；Eckstein編輯,Oligonucleotides.and Analogues:A Practical Approach(IRL Press,Oxford,1991)；Greene和Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,第2版(John Wiley&Sons,New York,1991)；Narang編輯,Synthesis and Applications of DNA and RNA(Academic Press,New York,1987)；Beaucage和Iyer Tetrahedron 48:2223-2311(1992)以及類似參考文獻(xiàn)。

如本文所用，“寡核苷酸N3'→P5'磷酰胺酯”意指具有通過至少一個(gè)N3'→P5'磷酰胺酯鍵聯(lián)連接的核苷亞基的通常直鏈的寡聚物。一般而言，核苷亞基包含核苷或核苷類似物，但也可包含具有可相容化學(xué)的更一般性部分，如無堿基糖和其他烴部分，如以下參考文獻(xiàn)中所描述：Newton等人,Nucleic Acids Research,21:1155-1162(1993)；Griffin等人,J.Am.Chem.Soc.,114:7976-7982(1992)；Jaschke等人,Tetrahedron Letters,34:301-304(1992)；Ma等人,國際申請(qǐng)PCT/CA92/00423；Zon等人,國際申請(qǐng)PCT/US90/06630；Durand等人,Nucleic Acids Research,18:6353-6359(1990)；Salunkhe等人,J.Am.Chem.Soc.,114:8768-8772(1992)等。在一些情況下，所述術(shù)語意指其中所有核苷間鍵聯(lián)均被N3'→P5'磷酰胺酯鍵聯(lián)置換的寡核苷酸，即所述術(shù)語包括部分以及完全“酰胺化的”寡聚物。在一些情況下，其意指其中所有核苷間鍵聯(lián)均被N3'→P5'磷酰胺酯鍵聯(lián)置換，且其中核苷亞基是天然核苷或其類似物的寡核苷酸。其中每個(gè)鍵聯(lián)均為N3'→P5'磷酰胺酯鍵聯(lián)的主題寡核苷酸N3'→P5'磷酰胺酯(“完全酰胺化”)可包埋于其他寡核苷酸或多核苷酸中或連接至其他寡核苷酸或多核苷酸以形成“部分酰胺化”的較大寡聚物。主題寡核苷酸N3'→P5'磷酰胺酯可包括任何適宜的3’和/或5’端基。在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸N3'→P5'磷酰胺酯包括3’-羥基端基或3’-氨基端基。

如本文所用，術(shù)語“磷酸酯”和“磷酸酯基”意在涵蓋硫代磷酸酯基和氧代磷酸酯基。

如本文所用，術(shù)語“亞磷酰胺氨基”是指連接至亞磷酰胺基團(tuán)的磷原子的氨基--NR⁴R⁵，并且術(shù)語“亞磷酰胺氮”是指亞磷酰胺氨基的氮原子。

“烷基”是指具有1至10個(gè)碳原子和如1至6個(gè)碳原子(例如，“1至6個(gè)碳原子的烷基”)或1至5(例如，“1至5個(gè)碳原子的烷基”)或1至4(例如，“1至4個(gè)碳原子的烷基”)或1至3個(gè)碳原子(例如，“1至3個(gè)碳原子的烷基”)的單價(jià)飽和脂族烴基。所述術(shù)語包括例如直鏈和支鏈烴基，如甲基(CH₃-)、乙基(CH₃CH₂-)、正丙基(CH₃CH₂CH₂-)、異丙基((CH₃)₂CH-)、正丁基(CH₃CH₂CH₂CH₂-)、異丁基((CH₃)₂CHCH₂-)、仲丁基((CH₃)(CH₃CH₂)CH-)、叔丁基((CH₃)₃C-)、正戊基(CH₃CH₂CH₂CH₂CH₂-)及新戊基((CH₃)₃CCH₂-)。

術(shù)語“取代的烷基”是指如本文所定義的烷基，其中烷基鏈中的一個(gè)或多個(gè)碳原子已任選地被雜原子如-O-、-N-、-S-、-S(O)_n-(其中n是0至2)、-NR-(其中R是氫或烷基)置換且具有選自由以下組成的組的1至5個(gè)取代基：烷氧基、取代的烷氧基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、環(huán)烯基、取代的環(huán)烯基、?；Ⅴ０被?、酰氧基、氨基、氨基?；?、氨基酰氧基、氧基氨?；B氮基、氰基、鹵素、羥基、氧代、硫酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代雜芳氧基、硫代雜環(huán)氧基、巰基、硫代烷氧基、取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、雜芳基、雜芳氧基、雜環(huán)基、雜環(huán)氧基、羥基氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-芳基、-SO-雜芳基、-SO₂-烷基、-SO₂-芳基-SO₂-雜芳基以及-NR^aR^b，其中R^a和R^b可以是相同的或不同的并且選自氫、任選取代的烷基、環(huán)烷基、烯基、環(huán)烯基、炔基、芳基、雜芳基以及雜環(huán)。在一些實(shí)例中，“取代的烷基”是指如本文所定義的具有選自由以下組成的組的1至5個(gè)取代基的烷基：烷氧基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、?；?、酰氨基、酰氧基、氨基、氨酰基、氨基酰氧基、氧基氨?；?、疊氮基、氰基、鹵素、羥基、羧基、羧基烷基、巰基、硫代烷氧基、芳基、芳氧基、雜芳基、雜芳氧基、雜環(huán)基、雜環(huán)氧基、磺酰胺基以及-NR^aR^b，其中R^a和R^b可以是相同的或不同的且選自氫、烷基、環(huán)烷基、烯基、環(huán)烯基、炔基、芳基、雜芳基以及雜環(huán)。

“亞烷基”是指直鏈或支鏈的優(yōu)選具有1至6且更優(yōu)選1至3個(gè)碳原子且任選地被選自-O-、-NR¹⁰-、-NR¹⁰C(O)-、-C(O)NR¹⁰-等的一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)間斷的二價(jià)脂族烴基。所述術(shù)語包括例如亞甲基(-CH₂-)、亞乙基(-CH₂CH₂-)、正亞丙基(-CH₂CH₂CH₂-)、異亞丙基(-CH₂CH(CH₃)-)、(-C(CH₃)₂CH₂CH₂-)、(-C(CH₃)₂CH₂C(O)-)、(-C(CH₃)₂CH₂C(O)NH-)、(-CH(CH₃)CH₂-)等。

“取代的亞烷基”是指1至3個(gè)氫被如在下文“取代的”定義中針對(duì)碳所描述的取代基置換的亞烷基。

術(shù)語“烷烴”是指如本文所定義的烷基和亞烷基。

術(shù)語“烷基氨基烷基”、“烷基氨基烯基”和“烷基氨基炔基”是指基團(tuán)R’NHR”-，其中R’是如本文定義的烷基，且R”是如本文定義的亞烷基、亞烯基或亞炔基。

術(shù)語“烷芳基”或“芳烷基”是指基團(tuán)-亞烷基-芳基和-取代的亞烷基-芳基，其中亞烷基、取代的亞烷基和芳基是本文所定義。

“烷氧基”是指基團(tuán)-O-烷基，其中烷基如本文所定義。烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基等。術(shù)語“烷氧基”還指基團(tuán)烯基-O-、環(huán)烷基-O-、環(huán)烯基-O-和炔基-O-，其中烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基和炔基如本文所定義。

術(shù)語“取代的烷氧基”是指基團(tuán)取代的烷基-O-、取代的烯基-O-、取代的環(huán)烷基-O-、取代的環(huán)烯基-O-和取代的炔基-O-，其中取代的烷基、取代的烯基、取代的環(huán)烷基、取代的環(huán)烯基以及取代的炔基如本文所定義。

術(shù)語“烷氧基氨基”是指基團(tuán)-NH-烷氧基，其中烷氧基是本文所定義。

術(shù)語“鹵代烷氧基”是指基團(tuán)烷基-O-，其中烷基上的一個(gè)或多個(gè)氫原子已被鹵代基團(tuán)取代并且包括例如基團(tuán)如三氟甲氧基等。

術(shù)語“鹵代烷基”是指如上所述的取代的烷基，其中烷基上的一個(gè)或多個(gè)氫原子已被鹵代基團(tuán)取代。此類基團(tuán)的實(shí)例包括氟乙基、氟甲基、三氟甲基或三氟乙基等。

術(shù)語“烷基烷氧基”是指基團(tuán)-亞烷基-O-烷基、亞烷基-O-取代的烷基、取代的亞烷基-O-烷基以及取代的亞烷基-O-取代的烷基，其中烷基、取代的烷基、亞烷基以及取代的亞烷基如本文所定義。

術(shù)語“烷基硫代烷氧基”是指基團(tuán)-亞烷基-S-烷基、亞烷基-S-取代的烷基、取代的亞烷基-S-烷基以及取代的亞烷基-S-取代的烷基，其中烷基、取代的烷基、亞烷基以及取代的亞烷基如本文所定義。

“烯基”是指具有2至6個(gè)碳原子且優(yōu)選2至4個(gè)碳原子并且具有至少1個(gè)且優(yōu)選1至2個(gè)雙鍵不飽和位點(diǎn)的直鏈或支鏈烴基。所述術(shù)語包括例如雙乙烯基、烯丙基和丁-3-烯-1-基。所述術(shù)語內(nèi)包括這些異構(gòu)體的順式和反式異構(gòu)體或混合物。

術(shù)語“取代的烯基”是指如本文所定義的具有選自由以下組成的組的1至5個(gè)取代基或1至3個(gè)取代基的烯基：烷氧基、取代的烷氧基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、環(huán)烯基、取代的環(huán)烯基、?；Ⅴ０被?、酰氧基、氨基、取代的氨基、氨?；?、氨基酰氧基、氧基氨?；?、疊氮基、氰基、鹵素、羥基、氧代、硫酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代雜芳氧基、硫代雜環(huán)氧基、巰基、硫代烷氧基、取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、雜芳基、雜芳氧基、雜環(huán)基、雜環(huán)氧基、羥基氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-取代的烷基、-SO-芳基、-SO-雜芳基、-SO₂-烷基、-SO₂-取代的烷基、-SO₂-芳基以及-SO₂-雜芳基。

“炔基”是指具有2至6個(gè)碳原子且優(yōu)選2至3個(gè)碳原子并且具有至少1個(gè)且優(yōu)選1至2個(gè)三鍵不飽和位點(diǎn)的直鏈或支鏈單價(jià)烴基。此類炔基的實(shí)例包括乙炔基(-C≡CH)和炔丙基(-CH₂C≡CH)。

術(shù)語“取代的炔基”是指如本文所定義的具有選自由以下組成的組的1至5個(gè)取代基或1至3個(gè)取代基的炔基：烷氧基、取代的烷氧基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、環(huán)烯基、取代的環(huán)烯基、?；?、酰氨基、酰氧基、氨基、取代的氨基、氨酰基、氨基酰氧基、氧基氨酰基、疊氮基、氰基、鹵素、羥基、氧代、硫酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代雜芳氧基、硫代雜環(huán)氧基、巰基、硫代烷氧基、取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、雜芳基、雜芳氧基、雜環(huán)基、雜環(huán)氧基、羥基氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-取代的烷基、-SO-芳基、-SO-雜芳基、-SO₂-烷基、-SO₂-取代的烷基、-SO₂-芳基以及-SO₂-雜芳基。

“炔氧基”是指基團(tuán)-O-炔基，其中炔基如本文所定義。炔氧基包括例如乙炔氧基、丙炔氧基等。

“?；笔侵富鶊F(tuán)：H-C(O)-、烷基-C(O)-、取代的烷基-C(O)-、烯基-C(O)-、取代的烯基-C(O)-、炔基-C(O)-、取代的炔基-C(O)-、環(huán)烷基C-(O)-、取代的環(huán)烷基-C(O)-、環(huán)烯基-C(O)-、取代的環(huán)烯基-C(O)-、芳基-C(O)-、取代的芳基-C(O)-、雜芳基-C(O)-、取代的雜芳基-C(O)、雜環(huán)基-C(O)-以及取代的雜環(huán)基-C(O)-，其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、環(huán)烯基、取代的環(huán)烯基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、雜環(huán)以及取代的雜環(huán)如本文所定義。例如，?；ā耙阴；盋H₃C(O)-。

“酰氨基”是指基團(tuán)–NR²⁰C(O)烷基、-NR²⁰C(O)取代的烷基、NR²⁰C(O)環(huán)烷基、-NR²⁰C(O)取代的環(huán)烷基、-NR²⁰C(O)環(huán)烯基、-NR²⁰C(O)取代的環(huán)烯基、-NR²⁰C(O)烯基、-NR²⁰C(O)取代的烯基、-NR²⁰C(O)炔基、-NR²⁰C(O)取代的炔基、-NR²⁰C(O)芳基、-NR²⁰C(O)取代的芳基、-NR²⁰C(O)雜芳基、-NR²⁰C(O)取代的雜芳基、-NR²⁰C(O)雜環(huán)及-NR²⁰C(O)取代的雜環(huán)，其中R²⁰是氫或烷基并且其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、環(huán)烯基、取代的環(huán)烯基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、雜環(huán)以及取代的雜環(huán)如本文所定義。

“氨基羰基”或術(shù)語“氨?；笔侵富鶊F(tuán)-C(O)NR²¹R²²，其中R²¹和R²²獨(dú)立地選自由以下組成的組：氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、環(huán)烯基、取代的環(huán)烯基、雜芳基、取代的雜芳基、雜環(huán)以及取代的雜環(huán)，并且其中R²¹和R²²任選地與與其結(jié)合的氮連接在一起以形成雜環(huán)或取代的雜環(huán)基團(tuán)，并且其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、環(huán)烯基、取代的環(huán)烯基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、雜環(huán)和取代的雜環(huán)如本文所定義。

“氨基羰基氨基”是指基團(tuán)–NR²¹C(O)NR²²R²³，其中R²¹、R²²和R²³獨(dú)立地選自氫、烷基、芳基或環(huán)烷基，或其中兩個(gè)R基團(tuán)連接以形成雜環(huán)基。

術(shù)語“烷氧基羰基氨基”是指基團(tuán)-NRC(O)OR，其中各R獨(dú)立地是氫、烷基、取代的烷基、芳基、雜芳基或雜環(huán)基，其中烷基、取代的烷基、芳基、雜芳基以及雜環(huán)基如本文所定義。

術(shù)語“酰氧基”是指基團(tuán)烷基-C(O)O-、取代的烷基-C(O)O-、環(huán)烷基-C(O)O-、取代的環(huán)烷基-C(O)O-、芳基-C(O)O-、雜芳基-C(O)O-以及雜環(huán)基-C(O)O-，其中烷基、取代的烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基如本文所定義。

“氨基磺?；笔侵富鶊F(tuán)–SO₂NR²¹R²²，其中R²¹和R²²獨(dú)立地選自由以下組成的組：氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、環(huán)烯基、取代的環(huán)烯基、雜芳基、取代的雜芳基、雜環(huán)、取代的雜環(huán)，并且其中R²¹和R²²任選地與與其結(jié)合的氮連接在一起以形成雜環(huán)或取代的雜環(huán)基團(tuán)，并且烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、環(huán)烯基、取代的環(huán)烯基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、雜環(huán)和取代的雜環(huán)如本文所定義。

“磺?；被笔侵富鶊F(tuán)–NR²¹SO₂R²²，其中R²¹和R²²獨(dú)立地選自由以下組成的組：氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、環(huán)烯基、取代的環(huán)烯基、雜芳基、取代的雜芳基、雜環(huán)以及取代的雜環(huán)，并且其中R²¹和R²²任選地與與其結(jié)合的源自連接在一起以形成雜環(huán)或取代的雜環(huán)基團(tuán)，并且其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、環(huán)烯基、取代的環(huán)烯基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、雜環(huán)和取代的雜環(huán)如本文所定義。

“芳基”或“Ar”是指具有單環(huán)(如存在于苯基中)的6至18個(gè)碳原子的單價(jià)芳族碳環(huán)基團(tuán)或具有多個(gè)稠環(huán)的環(huán)系統(tǒng)(此類芳族環(huán)系統(tǒng)的實(shí)例包括萘基、蒽基和茚滿基)，所述稠環(huán)可以是或可以不是芳族的，條件是連接點(diǎn)是通過芳族環(huán)的原子。所述術(shù)語包括例如苯基和萘基。除非另外通過針對(duì)芳基取代基的定義約束，否則此類芳基可任選地被選自以下的1至5個(gè)取代基或1至3個(gè)取代基取代：酰氧基、羥基、巰基、酰基、烷基、烷氧基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、取代的烷基、取代的烷氧基、取代的烯基、取代的炔基、取代的環(huán)烷基、取代的環(huán)烯基、氨基、取代的氨基、氨?；?、酰氨基、烷芳基、芳基、芳氧基、疊氮基、羧基、羧基烷基、氰基、鹵素、硝基、雜芳基、雜芳氧基、雜環(huán)基、雜環(huán)氧基、氨基酰氧基、氧基酰氨基、硫代烷氧基、取代的硫代烷氧基、硫代芳氧基、硫代雜芳氧基、-SO-烷基，-SO-取代的烷基、-SO-芳基、-SO-雜芳基、-SO₂-烷基、-SO₂-取代的烷基、-SO₂-芳基、-SO₂-雜芳基以及三鹵代甲基。在這類情況下，被1至5個(gè)取代基(例如，如本文所描述)取代的芳基被稱為“取代的芳基”。

“芳氧基”是指基團(tuán)–O-芳基，其中芳基如本文所定義，包括例如苯氧基、萘氧基等，包括任選取代的芳基，如也在本文中所定義。

“氨基”是指基團(tuán)-NH₂。

術(shù)語“取代的氨基”是指基團(tuán)-NRR，其中各R獨(dú)立地選自由以下組成的組：氫、烷基、取代的烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、烯基、取代的烯基、環(huán)烯基、取代的環(huán)烯基、炔基、取代的炔基、芳基、雜芳基以及雜環(huán)基，條件是至少一個(gè)R不是氫。

術(shù)語“疊氮基”是指基團(tuán)-N₃。

“羧基(Carboxyl)”、“羧基(carboxy)”或“羧酸酯”是指其–CO₂H鹽。

“羧基酯(Carboxyl ester)”或“羧基酯(carboxy ester)”或術(shù)語“羧基烷基(carboxyalkyl)”或“羧基烷基(carboxylalkyl)”是指基團(tuán)-C(O)O-烷基、-C(O)O-取代的烷基、-C(O)O-烯基、-C(O)O-取代的烯基、-C(O)O-炔基、-C(O)O-取代的炔基、-C(O)O-芳基、-C(O)O-取代的芳基、-C(O)O-環(huán)烷基、-C(O)O-取代的環(huán)烷基、-C(O)O-環(huán)烯基、-C(O)O-取代的環(huán)烯基、-C(O)O-雜芳基、-C(O)O-取代的雜芳基、-C(O)O-雜環(huán)以及-C(O)O-取代的雜環(huán)，其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、環(huán)烯基、取代的環(huán)烯基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、雜環(huán)以及取代的雜環(huán)如本文所定義。

“(羧基酯)氧基”或“碳酸酯”是指基團(tuán)–O-C(O)O-烷基、-O-C(O)O-取代的烷基、-O-C(O)O-烯基、-O-C(O)O-取代的烯基、-O-C(O)O-炔基、-O-C(O)O-取代的炔基、-O-C(O)O-芳基、-O-C(O)O-取代的芳基、-O-C(O)O-環(huán)烷基、-O-C(O)O-取代的環(huán)烷基、-O-C(O)O-環(huán)烯基、-O-C(O)O-取代的環(huán)烯基、-O-C(O)O-雜芳基、-O-C(O)O-取代的雜芳基、-O-C(O)O-雜環(huán)以及-O-C(O)O-取代的雜環(huán)，其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、環(huán)烯基、取代的環(huán)烯基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、雜環(huán)以及取代的雜環(huán)如本文所定義。

“氰基”或“腈”是指基團(tuán)–CN。

“環(huán)烷基”是指具有單個(gè)或多個(gè)環(huán)狀環(huán)的3至10個(gè)碳原子的環(huán)狀烷基，包括稠合、橋聯(lián)和螺環(huán)系統(tǒng)。適合的環(huán)烷基的實(shí)例包括例如金剛烷基、環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)辛基等。此類環(huán)烷基包括例如單環(huán)結(jié)構(gòu)，如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)辛基等；或多環(huán)結(jié)構(gòu)，如金剛烷基等。

術(shù)語“取代的環(huán)烷基”是指具有選自以下的1至5個(gè)取代基或1至3個(gè)取代基的環(huán)烷基：烷基、取代的烷基、烷氧基、取代的烷氧基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、環(huán)烯基、取代的環(huán)烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、取代的氨基、氨?；?、氨基酰氧基、氧基氨?；?、疊氮基、氰基、鹵素、羥基、氧代、硫酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代雜芳氧基、硫代雜環(huán)氧基、巰基、硫代烷氧基、取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、雜芳基、雜芳氧基、雜環(huán)基、雜環(huán)氧基、羥基氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-取代的烷基、-SO-芳基、-SO-雜芳基、-SO₂-烷基、-SO₂-取代的烷基、-SO₂-芳基以及-SO₂-雜芳基。

“環(huán)烯基”是指具有單個(gè)或多個(gè)環(huán)且具有至少一個(gè)雙鍵且優(yōu)選1至2個(gè)雙鍵的3至10個(gè)碳原子的非芳族環(huán)狀烷基。

術(shù)語“取代的環(huán)烯基”是指具有選自以下的1至5個(gè)取代基或1至3個(gè)取代基的環(huán)烯基：烷氧基、取代的烷氧基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、環(huán)烯基、取代的環(huán)烯基、?；?、酰氨基、酰氧基、氨基、取代的氨基、氨酰基、氨基酰氧基、氧基氨酰基、疊氮基、氰基、鹵素、羥基、酮基、硫酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代雜芳氧基、硫代雜環(huán)氧基、巰基、硫代烷氧基、取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、雜芳基、雜芳氧基、雜環(huán)基、雜環(huán)氧基、羥基氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-取代的烷基、-SO-芳基、-SO-雜芳基、-SO₂-烷基、-SO₂-取代的烷基、-SO₂-芳基以及-SO₂-雜芳基。

“環(huán)炔基”是指具有單個(gè)或多個(gè)環(huán)且具有至少一個(gè)三鍵的5至10個(gè)碳原子的非芳族環(huán)烷基。

“環(huán)烷氧基”是指–O-環(huán)烷基。

“環(huán)烯基氧基”是指–O-環(huán)烯基。

“鹵代”或“鹵素”是指氟、氯、溴和碘。

“羥基(hydroxy)”或“羥基(hydroxyl)”是指基團(tuán)-OH。

“雜芳基”是指1至15個(gè)碳原子如1至10個(gè)碳原子和1至10個(gè)環(huán)內(nèi)雜原子的芳族基團(tuán)，所述雜原子選自由氧、氮和硫組成的組。此類雜芳基可具有單環(huán)(如吡啶基、咪唑基或呋喃基)或環(huán)系統(tǒng)中的多個(gè)稠環(huán)(例如，如在基團(tuán)如吲哚嗪基、喹啉基、苯并呋喃、苯并咪唑基或苯并噻吩基中)，其中環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的至少一個(gè)環(huán)是芳族的并且環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的至少一個(gè)環(huán)是芳族的，條件是連接點(diǎn)是通過芳族環(huán)的原子。在某些實(shí)施方案中，雜芳基的氮和/或硫環(huán)原子任選被氧化以提供N-氧化物(N→O)、亞磺酰基或磺?；糠?。所述術(shù)語包括例如，吡啶基、吡咯基、吲哚基、噻吩基以及呋喃基。除非另外通過針對(duì)雜芳基取代基的定義約束，否則此類雜芳基可任選地被選自以下的1至5個(gè)取代基或1至3個(gè)取代基取代：酰氧基、羥基、巰基、?；⑼榛?、烷氧基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、取代的烷基、取代的烷氧基、取代的烯基、取代的炔基、取代的環(huán)烷基、取代的環(huán)烯基、氨基、取代的氨基、氨?；?、酰氨基、烷芳基、芳基、芳氧基、疊氮基、羧基、羧基烷基、氰基、鹵素、硝基、雜芳基、雜芳氧基、雜環(huán)基、雜環(huán)氧基、氨基酰氧基、氧基酰氨基、硫代烷氧基、取代的硫代烷氧基、硫代芳氧基、硫代雜芳氧基、-SO-烷基，-SO-取代的烷基、-SO-芳基、-SO-雜芳基、-SO₂-烷基、-SO₂-取代的烷基、-SO₂-芳基和-SO₂-雜芳基以及三鹵代甲基。在這類情況下，被1至5個(gè)取代基(例如，如本文所描述)取代的雜芳基被稱為“取代的雜芳基”。

術(shù)語“雜芳烷基”是指基團(tuán)-亞烷基-雜芳基，其中亞烷基和雜芳基在本文定義。所述術(shù)語包括例如吡啶基甲基、吡啶基乙基、吲哚基甲基等。

“雜芳氧基”是指–O-雜芳基。

“雜環(huán)”、“雜環(huán)的”、“雜環(huán)烷基”和“雜環(huán)基”是指具有單環(huán)或多個(gè)稠環(huán)的飽和或不飽和基團(tuán)，包括稠合、橋聯(lián)和螺環(huán)系統(tǒng)且具有3至20個(gè)環(huán)原子，包括1至10個(gè)雜原子。這些環(huán)原子選自由氮、硫或氧組成的組，其中在稠環(huán)系統(tǒng)中，一個(gè)或多個(gè)環(huán)可以是環(huán)烷基、芳基或雜芳基，條件是連接點(diǎn)是通過非芳族環(huán)。在某些實(shí)施方案中，雜環(huán)基團(tuán)的氮和/或硫原子任選被氧化以提供N-氧化物、-S(O)-或–SO₂-部分。

雜環(huán)和雜芳基的實(shí)例包括但不限于，氮雜環(huán)丁烷、吡咯、咪唑、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、噠嗪、吲哚嗪、異吲哚、吲哚、二氫吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、異喹啉、喹啉、酞嗪、萘基吡啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、菲咯啉、異噻唑、吩嗪、異噁唑、吩噁嗪、吩噻嗪、咪唑烷、咪唑啉、哌啶、哌嗪、二氫吲哚、鄰苯二甲酰亞胺、1,2,3,4-四氫異喹啉、4,5,6,7-四氫苯并[b]噻吩、噻唑、噻唑烷、噻吩、苯并[b]噻吩、嗎啉基、硫代嗎啉基(也被稱為硫雜嗎啉基)、1,1-二氧代硫代嗎啉基、哌啶基、吡咯烷、四氫呋喃基等。

除非另外通過針對(duì)雜環(huán)取代基的定義約束，所述雜環(huán)基團(tuán)可任選地被選自以下的1至5或1至3個(gè)取代基取代：烷氧基、取代的烷氧基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、環(huán)烯基、取代的環(huán)烯基、?；?、酰氨基、酰氧基、氨基、取代的氨基、氨?；?、氨基酰氧基、氧基氨?；B氮基、氰基、鹵素、羥基、氧代、硫酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代雜芳氧基、硫代雜環(huán)氧基、巰基、硫代烷氧基、取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、雜芳基、雜芳氧基、雜環(huán)基、雜環(huán)氧基、羥基氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-取代的烷基、-SO-芳基、-SO-雜芳基、-SO₂-烷基、-SO₂-取代的烷基、-SO₂-芳基、-SO₂-雜芳基以及稠合雜環(huán)。

“雜環(huán)基氧基”是指基團(tuán)–O-雜環(huán)基。

術(shù)語“雜環(huán)基硫基”是指基團(tuán)雜環(huán)-S-。

術(shù)語“亞雜環(huán)基”是指由如本文定義的雜環(huán)形成的二基基團(tuán)。

術(shù)語“羥基氨基”是指基團(tuán)-NHOH。

“硝基”是指基團(tuán)-NO₂。

“氧代”是指原子(＝O)。

“磺酰基”是指基團(tuán)SO₂-烷基、SO₂-取代的烷基、SO₂-烯基、SO₂-取代的烯基、SO₂-環(huán)烷基、SO₂-取代的環(huán)烷基、SO₂-環(huán)烯基、SO₂-取代的環(huán)烯基、SO₂-芳基、SO₂-取代的芳基、SO₂-雜芳基、SO₂-取代的雜芳基、SO₂-雜環(huán)和SO₂-取代的雜環(huán)，其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、環(huán)烯基、取代的環(huán)烯基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、雜環(huán)以及取代的雜環(huán)如本文所定義?；酋；ɡ缂谆?SO₂-、苯基-SO₂-以及4-甲基苯基-SO₂-。

“磺酰氧基”是指基團(tuán)–OSO₂-烷基、OSO₂-取代的烷基、OSO₂-烯基、OSO₂-取代的烯基、OSO₂-環(huán)烷基、OSO₂-取代的環(huán)烷基、OSO₂-環(huán)烯基、OSO₂-取代的環(huán)烯基、OSO₂-芳基、OSO₂-取代的芳基、OSO₂-雜芳基、OSO₂-取代的雜芳基、OSO₂-雜環(huán)和OSO₂-取代的雜環(huán)，其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、環(huán)烯基、取代的環(huán)烯基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、雜環(huán)以及取代的雜環(huán)如本文所定義。

術(shù)語“氨基羰基氧基”是指基團(tuán)-OC(O)NRR，其中各R獨(dú)立地是氫、烷基、取代的烷基、芳基、雜芳基或雜環(huán)，其中烷基、取代的烷基、芳基、雜芳基以及雜環(huán)如本文所定義。

“巰基”是指基團(tuán)-SH。

“硫代”或術(shù)語“硫酮基”是指原子(＝S)。

“烷硫基”或術(shù)語“硫代烷氧基”是指基團(tuán)-S-烷基，其中烷基如本文所定義。在某些實(shí)施方案中，硫可氧化為-S(O)-。亞砜可作為一種或多種立體異構(gòu)體存在。

術(shù)語“取代的硫代烷氧基”是指基團(tuán)-S-取代的烷基。

術(shù)語“硫代芳氧基”是指基團(tuán)芳基-S-，其中芳基如本文所定義，包括也在本文定義的任選取代的芳基。

術(shù)語“硫代雜芳氧基”是指基團(tuán)雜芳基-S-，其中雜芳基如本文所定義，包括如也在本文定義的任選取代的芳基。

術(shù)語“硫代雜環(huán)氧基”是指基團(tuán)雜環(huán)基-S-，其中雜環(huán)基如本文所定義，包括如也在本文定義的任選取代的雜環(huán)基。

除了本文的公開內(nèi)容外，術(shù)語“取代的”當(dāng)用于限定指定基團(tuán)或自由基時(shí)還可意指指定基團(tuán)或自由基的一個(gè)或多個(gè)氫原子彼此各自獨(dú)立地被如下文定義的相同或不同的取代基基團(tuán)置換。

除了關(guān)于本文的單獨(dú)術(shù)語公開的基團(tuán)外，除非另外指明，否則用于取代指定基團(tuán)或自由基中的飽和碳原子上的一個(gè)或多個(gè)氫(單個(gè)碳上的任何兩個(gè)氫可被＝O、＝NR⁷⁰、＝N-OR⁷⁰、＝N₂或＝S置換)的取代基基團(tuán)是-R⁶⁰、鹵代、＝O、-OR⁷⁰、-SR⁷⁰、-NR⁸⁰R⁸⁰、三鹵代甲基、-CN、-OCN、-SCN、-NO、-NO₂、＝N₂、-N₃、-SO₂R⁷⁰、-SO₂O^–M⁺、-SO₂OR⁷⁰、-OSO₂R⁷⁰、-OSO₂O^–M⁺、-OSO₂OR⁷⁰、-P(O)(O^–)₂(M⁺)₂、-P(O)(OR⁷⁰)O^–M⁺、-P(O)(OR⁷⁰)₂、-C(O)R⁷⁰、-C(S)R⁷⁰、-C(NR⁷⁰)R⁷⁰、-C(O)O^–M⁺、-C(O)OR⁷⁰、-C(S)OR⁷⁰、-C(O)NR⁸⁰R⁸⁰、-C(NR⁷⁰)NR⁸⁰R⁸⁰、-OC(O)R⁷⁰、-OC(S)R⁷⁰、-OC(O)O^-M⁺、-OC(O)OR⁷⁰、-OC(S)OR⁷⁰、-NR⁷⁰C(O)R⁷⁰、-NR⁷⁰C(S)R⁷⁰、-NR⁷⁰CO₂^–M⁺、-NR⁷⁰CO₂R⁷⁰、-NR⁷⁰C(S)OR⁷⁰、-NR⁷⁰C(O)NR⁸⁰R⁸⁰、-NR⁷⁰C(NR⁷⁰)R⁷⁰以及-NR⁷⁰C(NR⁷⁰)NR⁸⁰R⁸⁰，其中R⁶⁰選自由以下組成的組：任選取代的烷基、環(huán)烷基、雜烷基、雜環(huán)烷基烷基、環(huán)烷基烷基、芳基、芳基烷基、雜芳基和雜芳基烷基，各R⁷⁰獨(dú)立地是氫或R⁶⁰；各R⁸⁰獨(dú)立地是R⁷⁰或可替代地兩個(gè)R⁸⁰與它們所鍵合的氮原子一起形成5-、6-或7-元雜環(huán)烷基，其可任選地包括選自由O、N和S組成的組的1至4個(gè)相同或不同的另外雜原子，其中N可具有-H或C₁-C₃烷基取代；并且各M⁺是具有凈單個(gè)正電荷的抗衡離子。各M⁺可獨(dú)立地是例如堿離子，如K⁺、Na⁺、Li⁺；銨離子，如⁺N(R⁶⁰)₄；或堿土離子，如[Ca²⁺]_0.5、[Mg²⁺]_0.5或[Ba²⁺]_0.5(“下標(biāo)0.5意指此類二價(jià)堿土離子的一個(gè)抗衡離子可以是本發(fā)明化合物的離子化形式，并且另一個(gè)抗衡離子是如氯化物的抗衡離子，或本文公開的兩種離子化化合物可充當(dāng)此類二價(jià)堿土離子的抗衡離子，或本發(fā)明的雙重離子化化合物可充當(dāng)此類二價(jià)堿土離子的抗衡離子)。作為指定實(shí)例，-NR⁸⁰R⁸⁰意指包括-NH₂、-NH-烷基、N-吡咯烷基、N-哌嗪基、4N-甲基-哌嗪-1-基和N-嗎啉基。

除了本文的公開內(nèi)容外，除非另外指明，否則用于“取代的”烯烴、炔烴、芳基和雜芳基種的不飽和碳原子上的氫的取代基基團(tuán)是-R⁶⁰、鹵代、-O^-M⁺、-OR⁷⁰、-SR⁷⁰、-S^–M⁺、-NR⁸⁰R⁸⁰、三鹵代甲基、-CF₃、-CN、-OCN、-SCN、-NO、-NO₂、-N₃、-SO₂R⁷⁰、-SO₃^–M⁺、-SO₃R⁷⁰、-OSO₂R⁷⁰、-OSO₃^–M⁺、-OSO₃R⁷⁰、-PO₃^-2(M⁺)₂、-P(O)(OR⁷⁰)O^–M⁺、-P(O)(OR⁷⁰)₂、-C(O)R⁷⁰、-C(S)R⁷⁰、-C(NR⁷⁰)R⁷⁰、-CO₂^–M⁺、-CO₂R⁷⁰、-C(S)OR⁷⁰、-C(O)NR⁸⁰R⁸⁰、-C(NR⁷⁰)NR⁸⁰R⁸⁰、-OC(O)R⁷⁰、-OC(S)R⁷⁰、-OCO₂^–M⁺、-OCO₂R⁷⁰、-OC(S)OR⁷⁰、-NR⁷⁰C(O)R⁷⁰、-NR⁷⁰C(S)R⁷⁰、-NR⁷⁰CO₂^–M⁺、-NR⁷⁰CO₂R⁷⁰、-NR⁷⁰C(S)OR⁷⁰、-NR⁷⁰C(O)NR⁸⁰R⁸⁰、-NR⁷⁰C(NR⁷⁰)R⁷⁰以及-NR⁷⁰C(NR⁷⁰)NR⁸⁰R⁸⁰，其中R⁶⁰、R⁷⁰、R⁸⁰和M⁺如先前所定義，條件是在取代的烯烴或炔烴的情況下，所述取代基不是-O^-M⁺、-OR⁷⁰、-SR⁷⁰或-S^–M⁺。

除了關(guān)于本文的單獨(dú)術(shù)語公開的基團(tuán)外，除非另外指明，用于“取代的”雜烷基和環(huán)雜烷基中的氮原子上的氫的取代基基團(tuán)是-R⁶⁰、-O^-M⁺、-OR⁷⁰、-SR⁷⁰、-S^-M⁺、-NR⁸⁰R⁸⁰、三鹵代甲基、-CF₃、-CN、-NO、-NO₂、-S(O)₂R⁷⁰、-S(O)₂O^-M⁺、-S(O)₂OR⁷⁰、-OS(O)₂R⁷⁰、-OS(O)₂O^-M⁺、-OS(O)₂OR⁷⁰、-P(O)(O^-)₂(M⁺)₂、-P(O)(OR⁷⁰)O^-M⁺、-P(O)(OR⁷⁰)(OR⁷⁰)、-C(O)R⁷⁰、-C(S)R⁷⁰、-C(NR⁷⁰)R⁷⁰、-C(O)OR⁷⁰、-C(S)OR⁷⁰、-C(O)NR⁸⁰R⁸⁰、-C(NR⁷⁰)NR⁸⁰R⁸⁰、-OC(O)R⁷⁰、-OC(S)R⁷⁰、-OC(O)OR⁷⁰、-OC(S)OR⁷⁰、-NR⁷⁰C(O)R⁷⁰、-NR⁷⁰C(S)R⁷⁰、-NR⁷⁰C(O)OR⁷⁰、-NR⁷⁰C(S)OR⁷⁰、-NR⁷⁰C(O)NR⁸⁰R⁸⁰、-NR⁷⁰C(NR⁷⁰)R⁷⁰以及-NR⁷⁰C(NR⁷⁰)NR⁸⁰R⁸⁰，其中R⁶⁰、R⁷⁰、R⁸⁰和M⁺如先前所定義。

除了本文的公開內(nèi)容外，在某一實(shí)施方案中，被取代的基團(tuán)具有1、2、3或4個(gè)取代基、1、2或3個(gè)取代基、1或2個(gè)取代基或1個(gè)取代基。

應(yīng)理解，在以上定義的所有取代的基團(tuán)中，通過定義具有針對(duì)本身的其他取代基的取代基(例如，具有本身被取代的芳基取代的取代的芳基作為取代基的取代的芳基，其進(jìn)一步被取代的芳基取代等)得到的聚合物不意圖包括在本文中。在這類情況下，這類取代的最大數(shù)目是三。例如，在本文具體地考慮的取代的芳基的連續(xù)取代限于取代的芳基-(取代的芳基)-取代的芳基。

除非另外指示，在本文未明確定義的取代基的命名法通過命名官能度的末端部分、接著朝向連接點(diǎn)的相鄰官能度來實(shí)現(xiàn)。例如，取代基“芳基烷基氧基羰基”是指基團(tuán)(芳基)-(烷基)-O-C(O)-。

關(guān)于本文公開的含有一個(gè)或多個(gè)取代基的任何基團(tuán)，當(dāng)然應(yīng)理解這類基團(tuán)不含有立體不切實(shí)際的和/或合成不可行的任何取代或取代型式。此外，主題化合物包括由這些化合物的取代產(chǎn)生的所有立體化學(xué)異構(gòu)體。

術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”意指可為向如哺乳動(dòng)物的患者施用所接受的鹽(具有抗衡離子的鹽對(duì)于給定劑量方案具有可接受的哺乳動(dòng)物安全性)。這類鹽可源自藥學(xué)上可接受的無機(jī)或有機(jī)堿和源自藥學(xué)上可接受的無機(jī)或有機(jī)酸?！八帉W(xué)上可接受的鹽”是指化合物的藥學(xué)上可接受的鹽，所述鹽來源于本領(lǐng)域中熟知的各種有機(jī)和無機(jī)抗衡離子，并且包括(僅舉例說明)鈉鹽等；并且當(dāng)分子含有堿性官能度時(shí)，包括有機(jī)或無機(jī)酸的鹽，如鹽酸鹽等。目標(biāo)藥學(xué)上可接受的鹽包括但不限于鋁、銨、精氨酸、鋇、芐星青霉素(benzathine)、鈣、膽茶堿、乙二胺、賴氨酸、鋰、鎂、葡甲胺、普魯卡因、鉀、鈉、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺、N,N′-二芐基乙二胺、氯普魯卡因、二乙醇胺、乙醇胺、哌嗪、鋅、二異丙胺、二異丙基乙胺、三乙胺以及三乙醇胺鹽。

術(shù)語“其鹽”意指當(dāng)酸的質(zhì)子被陽離子如金屬陽離子或有機(jī)陽離子等置換時(shí)形成的化合物。當(dāng)適用時(shí)，所述鹽是藥學(xué)上可接受的鹽，但是對(duì)于不意圖用于施用至患者的中間體化合物的鹽并不要求如此。作為舉例，本發(fā)明化合物的鹽包括其中化合物通過無機(jī)或有機(jī)酸質(zhì)子化以形成陽離子的那些鹽，其中無機(jī)或有機(jī)酸的綴合堿作為鹽的陰離子組分。目標(biāo)鹽包括但不限于鋁、銨、精氨酸、鋇、芐星青霉素、鈣、銫、膽茶堿、乙二胺、鋰、鎂、葡甲胺、普魯卡因、N-甲基葡糖胺、哌嗪、鉀、鈉、氨丁三醇、鋅、N,N′-二芐基乙二胺、氯普魯卡因、二乙醇胺、乙醇胺、哌嗪、二異丙胺、二異丙基乙胺、三乙胺以及三乙醇胺鹽。應(yīng)理解對(duì)于本文描繪的包括核苷間鍵聯(lián)的主鏈的任何寡核苷酸結(jié)構(gòu)，這類寡核苷酸還可包括任何適宜的鹽形式。在一些實(shí)施方案中，為簡(jiǎn)單起見描繪核苷間鍵聯(lián)的酸性形式。在一些實(shí)例中，主題化合物的鹽是單價(jià)陽離子鹽。在某些實(shí)例中，主題化合物的鹽是二價(jià)陽離子鹽。在一些實(shí)例中，主題化合物的鹽是三價(jià)陽離子鹽?！叭軇┗铩笔侵赣扇軇┓肿优c溶質(zhì)的分子或離子的組合形成的復(fù)合物。溶劑可以是有機(jī)化合物、無機(jī)化合物或兩者的混合物。溶劑的一些實(shí)例包括但不限于，甲醇、N,N-二甲基甲酰胺、四氫呋喃、二甲亞砜和水。當(dāng)溶劑是水時(shí)，所形成的溶劑化物是水合物。

“立體異構(gòu)體(Stereoisomer/stereoisomers)”是指具有相同原子連接性、但空間中的原子排列不同的化合物。立體異構(gòu)體包括順式-反式異構(gòu)體、E和Z異構(gòu)體、對(duì)映異構(gòu)體和非對(duì)映異構(gòu)體。

“互變異構(gòu)體”是指分子的僅在原子的電子鍵合方面和/或在質(zhì)子的位置方面不同的替代性形式，如烯醇-酮和亞胺-烯胺互變異構(gòu)體、-NH-P(＝S)(OH)-O-和-NH-P(＝O)(SH)-O-，或含有-N＝C(H)-NH-環(huán)原子排列的雜芳基的互變異構(gòu)形式，如吡唑、咪唑、苯并咪唑、三唑和四唑。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到本文描述的基團(tuán)的其他互變異構(gòu)排列也是可能的。例如，應(yīng)理解描述為以下結(jié)構(gòu)的寡核苷酸：

也涵蓋顯示鍵聯(lián)基團(tuán)的一種可能的替代互變異構(gòu)排列的以下結(jié)構(gòu)：

其中“nps”表示將一個(gè)核苷的3'-碳連接至相鄰核苷的5'-碳的硫代磷酰胺酯鍵聯(lián)(—NH—P(＝O)(SH)—O—或—NH—P(＝S)(OH)—O—)。應(yīng)理解即使未明確指示，主題化合物的所有互變異構(gòu)形式也均由其中描述所述化合物的基團(tuán)的一種可能的互變異構(gòu)排列的結(jié)構(gòu)涵蓋。主題化合物的基團(tuán)的任何適宜的互變異構(gòu)排列均可用于描述所述化合物。

應(yīng)理解術(shù)語“或其鹽或溶劑化物或立體異構(gòu)體”意圖包括鹽、溶劑化物和立體異構(gòu)體的所有排列，如主題化合物的立體異構(gòu)體的藥學(xué)上可接受的鹽的溶劑化物。應(yīng)理解術(shù)語“或其鹽”意圖包括鹽的所有排列。應(yīng)理解術(shù)語“或其藥學(xué)上可接受的鹽”意圖包括鹽的所有排列。應(yīng)理解術(shù)語“或其溶劑化物”意圖包括溶劑化物的所有排列。應(yīng)理解術(shù)語“或其立體異構(gòu)體”意圖包括立體異構(gòu)體的所有排列。應(yīng)理解術(shù)語“或其互變異構(gòu)體”意圖包括互變異構(gòu)體的所有排列。因此例如，由此可見意圖包括主題化合物的立體異構(gòu)體的互變異構(gòu)體的藥學(xué)上可接受的鹽的溶劑化物。

“藥學(xué)有效量”或“治療有效量”是指化合物的足以治療指定病癥或疾病或其一種或多種癥狀和/或預(yù)防所述疾病或病癥的發(fā)生的量。關(guān)于致腫瘤增生性病癥，藥學(xué)或治療有效量包含尤其足以導(dǎo)致腫瘤萎縮或降低腫瘤的生長(zhǎng)速率的量。

“患者”是指人和非人受試者，尤其哺乳動(dòng)物受試者。

如本文所用的術(shù)語“治療(treating)”或“治療(treatment)”意指患者如哺乳動(dòng)物(具體地說人)的疾病或醫(yī)學(xué)病狀的治療，所述治療包括：(a)預(yù)防所述疾病或醫(yī)學(xué)病狀發(fā)生，如受試者的預(yù)防性治療；(b)改善所述疾病或醫(yī)學(xué)病狀，如消除患者的疾病或醫(yī)學(xué)病狀或引起所述疾病或醫(yī)學(xué)病狀的消退；(c)抑制所述疾病或醫(yī)學(xué)病狀，例如通過減緩或阻止患者的疾病或醫(yī)學(xué)病狀的發(fā)展；或(d)緩解患者的疾病或醫(yī)學(xué)病狀的癥狀。

如本文所用，術(shù)語“分離”意指描述目標(biāo)化合物所處的環(huán)境不同于所述化合物天然存在所處的環(huán)境。“分離的”意圖包括處于大體上富含目標(biāo)化合物和/或其中目標(biāo)化合物得以部分或大體上純化的樣品內(nèi)的化合物。

如本文所用，術(shù)語“大體上純化的”是指從其天然環(huán)境中除去的化合物，并且至少60％不含、至少75％不含、至少80％不含、至少85％不含、至少90％不含、至少95％不含、至少98％不含或多于98％不含其所天然締合的其他組分。

術(shù)語“生理?xiàng)l件”意指涵蓋可與活細(xì)胞相容的那些條件，例如可與活細(xì)胞相容的具有一定溫度、pH、鹽度等的主要水性條件。

在進(jìn)一步描述本發(fā)明之前，應(yīng)理解本發(fā)明不限于所描述的特定實(shí)施方案，因而，當(dāng)然也可有所變化。還應(yīng)理解本文所用的術(shù)語僅出于描述具體實(shí)施方案的目的，并且不意圖具有限制性，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍將僅受隨附權(quán)利要求限制。

在提供值的范圍的情況下，應(yīng)理解本發(fā)明內(nèi)涵蓋所述范圍的上限與下限之間的各介入值，準(zhǔn)確到下限的單位的十分之一(除非上下文另外清楚指示)，以及所述范圍內(nèi)的任何其它所述值或介入值。這些較小范圍的上限和下限可獨(dú)立地包括在更小的范圍內(nèi)，并且也涵蓋在本發(fā)明內(nèi)，服從所述范圍內(nèi)任何明確排除在外的界限。在所述范圍包括所述限值中的一個(gè)或兩個(gè)的情況下，本發(fā)明中還包括排除那些所包括的限值中的任一個(gè)或兩個(gè)的范圍。

應(yīng)理解，出于清晰目的而在分開的實(shí)施方案的上下文中所描述的本發(fā)明的某些特征也可以在單個(gè)實(shí)施方案中組合提供。相反，出于簡(jiǎn)潔目的而在單個(gè)實(shí)施方案的上下文中所描述的本發(fā)明的各種特征也可以分開地或以任何適合的子組合來提供。與本發(fā)明有關(guān)的實(shí)施方案的所有組合明確地由本發(fā)明包含并且就猶如每個(gè)和每一組合被單獨(dú)地并明確地公開一樣而在本文中公開，程度為這類組合包含為例如為穩(wěn)定化合物(即，可被制備、分離、表征且測(cè)試生物活性的化合物)的化合物的主題。此外，各種實(shí)施方案及其要素的所有子組合(例如，在描述這類變量的實(shí)施方案中所列舉的化學(xué)基團(tuán)的要素)也明確地由本發(fā)明包含，并且就猶如每個(gè)和每一這樣的子組合被單獨(dú)地并明確地公開在本文中一樣而在本文中公開。

除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。盡管在實(shí)踐或測(cè)試本發(fā)明中還可使用與本文所述的那些方法和材料類似或等效的任何方法和材料，但是現(xiàn)在描述目標(biāo)方法和材料。為了公開和描述公布在引用時(shí)所涉及的方法和/或材料，本文中提到的所有公布均以引用方式并入本文。

必須指出，如本文和在所附權(quán)利要求書中所使用，單數(shù)形式“一個(gè)(a)/一種(an)”和“所述(the)”包括復(fù)數(shù)對(duì)象，除非上下文另外清楚地指出。應(yīng)進(jìn)一步指出，權(quán)利要求書可以經(jīng)擬訂以排除任何任選的要素。因此，所述表述旨在作為在列舉權(quán)利要求要素時(shí)使用如“單獨(dú)地”、“僅/只”等的獨(dú)占性術(shù)語或使用“否定”限制的先行基礎(chǔ)。

應(yīng)理解，出于清晰目的而在分開的實(shí)施方案的上下文中所描述的本發(fā)明的某些特征也可以在單個(gè)實(shí)施方案中組合提供。相反，出于簡(jiǎn)潔目的而在單個(gè)實(shí)施方案的上下文中所描述的本發(fā)明的各種特征也可以分開地或以任何適合的子組合來提供。

提供本文中討論的公布僅僅是針對(duì)它們?cè)诒旧暾?qǐng)的提交日期之前的公開。本文中的任何內(nèi)容均不應(yīng)被理解為承認(rèn)由于先前發(fā)明而使本發(fā)明無權(quán)享有這些公布的優(yōu)先權(quán)。此外，所提供的公布日期可不同于可能需要獨(dú)立確認(rèn)的實(shí)際公布日期。

詳述

如上文所概述，本公開提供一種經(jīng)由依次偶聯(lián)循環(huán)制備寡核苷酸的固相方法，所述方法包括二核苷酸二聚體偶聯(lián)至生長(zhǎng)鏈的游離3’端基(例如3’-羥基或3’-氨基)。一般而言，合成自靶寡核苷酸序列的5’-末端進(jìn)行至3’-末端，并且包括至少一次二核苷酸二聚體偶聯(lián)。二聚體可經(jīng)由任何適宜化學(xué)偶聯(lián)至生長(zhǎng)鏈的游離3’端基。在一些情況下，二聚體是3’-保護(hù)的-二核苷酸-5'-亞磷酰胺二聚體，其中所述二核苷酸可包括任何適宜的核苷間鍵聯(lián)。所述寡核苷酸可包含一個(gè)或多個(gè)磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)(例如，氧代-磷酰胺酯或硫代磷酰胺酯鍵聯(lián))。

在一些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸包含含有至少一個(gè)由下式定義的亞基的核苷亞基的序列：

其中B是嘌呤、受保護(hù)的嘌呤、嘧啶或受保護(hù)的嘧啶或其類似物；X是O或S；R選自由以下組成的組：氫、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、磷酸酯保護(hù)基；并且R³選自由氫、O-R²和鹵素組成的組，其中R²是H、烷基、取代的烷基(例如-(CH₂)_nW(CH₂)_mH，其中n是1-10之間，m是0-10之間且W是O、S或NH)或羥基保護(hù)基。應(yīng)理解包含上式描述的亞基的一些寡核苷酸也可呈鹽形式存在。此類形式只要其可存在就意圖包括在本公開的范圍內(nèi)。

相對(duì)于僅涉及核苷單體亞基偶聯(lián)的方法，主題方法提供偶聯(lián)循環(huán)的數(shù)目降低，并且提供合成的非靶寡核苷酸產(chǎn)物的量降低?？扇Q于如靶寡核苷酸的長(zhǎng)度和序列的多種因素來選擇用于制備靶寡核苷酸序列的逆合成策略以便使合成的特定非靶寡核苷酸產(chǎn)物的量最小。

在一些實(shí)施方案中，主題方法提供制備相對(duì)于目標(biāo)靶寡核苷酸具有降低量的一種或多種(N-x)產(chǎn)物的組合物。

在某些實(shí)施方案中，本文所述的相對(duì)于目標(biāo)靶寡核苷酸具有降低量的一種或多種(N-x)產(chǎn)物的任何組合物都是未純化的。

如本文所用，術(shù)語“(N-x)產(chǎn)物”(其中x是1至N-1的整數(shù)，并且N是靶寡核苷酸中的核苷殘基的數(shù)目)是指在主題制備方法期間產(chǎn)生的相對(duì)于長(zhǎng)度為N個(gè)殘基的靶寡核苷酸的序列缺乏x個(gè)核苷殘基的非靶寡核苷酸。所述靶寡核苷酸是主題制備方法被設(shè)計(jì)來產(chǎn)生的產(chǎn)物。因此，(N-1)產(chǎn)物是缺乏出自靶寡核苷酸的序列的任一核苷殘基的非靶寡核苷酸。因此，在一些情況下，術(shù)語“(N-1)產(chǎn)物”是指多種非靶寡核苷酸產(chǎn)物，其各自相對(duì)于靶寡核苷酸的序列缺乏一個(gè)核苷殘基。類似地，術(shù)語“(N-x)產(chǎn)物”是指多種非靶寡核苷酸產(chǎn)物，其各自相對(duì)于靶寡核苷酸的序列缺乏x個(gè)核苷殘基。因此，(N-2)產(chǎn)物是缺乏出自靶寡核苷酸的序列的任兩個(gè)核苷殘基的非靶寡核苷酸。在一些情況下，所述x個(gè)殘基是相對(duì)于靶寡核苷酸序列彼此連續(xù)的。在其他情況下，所述x個(gè)殘基是相對(duì)于靶寡核苷酸序列彼此不連續(xù)的。x個(gè)核苷殘基可自靶序列的任何位置缺乏，并且可在偶聯(lián)循環(huán)期間由未反應(yīng)的3’-端基產(chǎn)生。主題方法的(N-x)產(chǎn)物可包括一種或多種由主題合成方法獲得的其他修飾，例如部分脫保護(hù)修飾、損失核堿基(例如脫嘌呤)、端基加帽、經(jīng)由合成試劑衍生(例如由硫化試劑實(shí)現(xiàn)苯基乙?；?等。取決于所使用的寡核苷酸合成和試劑的化學(xué)，多種修飾的寡核苷酸是可能的。除非另外指示，否則所有此類修飾意指由術(shù)語(N-x)產(chǎn)物涵蓋。

在一些實(shí)施方案中，主題方法導(dǎo)致寡核苷酸合成的選自部分保護(hù)的產(chǎn)物或部分保護(hù)的(N-x)產(chǎn)物的一種或多種非靶產(chǎn)物的減少，例如，包含一個(gè)或多個(gè)核堿基保護(hù)基的寡核苷酸產(chǎn)物。在主題寡核苷酸組合物中，靶寡核苷酸序列可更易于與所述方法的其他含寡核苷酸產(chǎn)物(例如(N-x)產(chǎn)物和缺乏核堿基的產(chǎn)物)分離或純化。

在下文部分中更詳細(xì)地描述主題方法和組合物的實(shí)施方案。

制備寡核苷酸的方法

本公開提供一種制備寡核苷酸的方法。主題方法可包括二核苷酸二聚體至少一次偶聯(lián)至生長(zhǎng)寡核苷酸鏈的游離3’端基。任何適宜的寡核苷酸合成方法和化學(xué)均可用于主題制備方法中?？蛇m合于在主題方法中使用的目標(biāo)寡核苷酸合成化學(xué)和方法包括但不限于亞磷酰胺、H-膦酸酯、磷酸二酯、磷酸三酯、亞磷酸三酯以及由Fearon等人在U.S.5,824,793中所述的那些，所述專利的公開內(nèi)容以引用的方式整體并入本文。本發(fā)明化合物的寡核苷酸組分可通過使常規(guī)方案適合于所選化學(xué)類型來合成。用于合成具有N3′→P5′磷酰胺酯化學(xué)的寡核苷酸的目標(biāo)方法包括但不限于McCurdy等人,(1997)Tetrahedron Letters,38:207-210以及Pongracz和Gryaznov,(1999)Tetrahedron Letters,49:7661-7664中所述的那些方法。

目標(biāo)寡核苷酸可使用主題方法，經(jīng)由自靶寡核苷酸序列的5’-末端開始，且進(jìn)行至3’-末端的依次偶聯(lián)來制備。5’-末端核苷亞基可經(jīng)由任選的連接基團(tuán)或5’-端基連接至任何適宜的固體支撐物。接著，可使用二聚體亞磷酰胺或單體亞磷酰胺實(shí)現(xiàn)亞基偶聯(lián)至生長(zhǎng)寡核苷酸鏈?；蛘?，5’-末端二核苷酸亞基可經(jīng)由任選的連接基團(tuán)或5’-端基連接至任何適宜的固體支撐物。一旦第一亞基(例如單體或二聚體亞基)連接至固體支撐物，就可將所述亞基脫保護(hù)以產(chǎn)生游離、固定的3’-端基。在一些情況下，所述方法包括使支撐物結(jié)合的3’-端基與3’-保護(hù)的-二核苷酸-5'-亞磷酰胺二聚體偶聯(lián)。在某些實(shí)施方案中，所述3’-端基是3’-羥基。在某些實(shí)施方案中，所述3’-端基是3’-氨基。

在一些情況下，所述方法包括以下步驟：(a)使連接至固相支撐物的末端核苷的受保護(hù)的3'氨基脫保護(hù)，所述脫保護(hù)形成游離3'氨基；(b)使所述游離3'氨基與3'-受保護(hù)的氨基-二核苷酸硫代磷酰胺酯或亞磷酰胺-5'-亞磷酰胺二聚體在親核催化劑存在下接觸以形成核苷間N3’→P5’亞磷酰胺鍵聯(lián)；以及(c)使所述鍵聯(lián)氧化。

靶寡核苷酸序列可使用逆合成策略來合成，所述策略包括二聚體亞基與單體亞基兩者依次偶聯(lián)至生長(zhǎng)寡核苷酸鏈的3’端基。因此，在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括以下步驟：(a)將連接至固相支撐物的末端核苷的受保護(hù)的3'氨基脫保護(hù)，所述脫保護(hù)形成游離3'氨基；(b)使所述游離3'氨基與3'-受保護(hù)的氨基核苷-5'-亞磷酰胺單體在親核催化劑存在下接觸以形成核苷間N3’→P5’亞磷酰胺鍵聯(lián)；以及(c)使所述鍵聯(lián)氧化以產(chǎn)生N3'→P5'磷酰胺酯鍵聯(lián)。

如本文所用，術(shù)語“N3’→P5’亞磷酰胺鍵聯(lián)”是指N3’→P5’磷酰胺酯鍵聯(lián)的磷(III)中間體。一般而言，N3’→P5’磷酰胺酯鍵聯(lián)通過使N3’→P5’亞磷酰胺鍵聯(lián)氧化成磷(V)產(chǎn)物(例如可包括氧代(P＝O)或硫代(P＝S)的N3’→P5’磷酰胺酯鍵聯(lián))來形成。在一些情況下，氧化步驟可描述為使N3’→P5’亞磷酰胺鍵聯(lián)硫化以產(chǎn)生N3’→P5’硫代磷酰胺酯鍵聯(lián)。

如本文所用，“N3'→P5'磷酰胺酯”、“P5'→N3'磷酰胺酯”和“磷酰胺酯”是指描述為下式的核苷間亞基鍵聯(lián)：

3’-NH-P(＝X)(OR)-O-5’

或其互變異構(gòu)體，其中3’和5’是指通過鍵聯(lián)連接的連續(xù)核苷的糖部分的碳原子，并且其中R是氫、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基或磷酸酯保護(hù)基，并且X是硫?qū)僭?，如氧或硫。?yīng)理解，當(dāng)R是氫、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基或磷酸酯保護(hù)基時(shí)，由上式所描述的一些核苷間亞基鍵聯(lián)也可以鹽形式存在。此類形式只要其可存在就意圖包括在本公開的范圍內(nèi)。在一些情況下，當(dāng)X是硫時(shí)，磷酰胺酯可被稱為硫代磷酰胺酯。在一些情況下，當(dāng)X是氧時(shí)，“磷酰胺酯”可被稱為“氧代磷酰胺酯”。在一些情況下，當(dāng)R是磷酸酯保護(hù)基時(shí)，它可以是烷基、烯基、芳基、芳烷基或其取代型式。在一些情況下，R是含有10個(gè)或更少碳原子的磷酸酯保護(hù)基。在某些實(shí)例中，當(dāng)R是磷酸酯保護(hù)基時(shí)，其是具有1至6個(gè)碳原子的烷基；吸電子β-取代的乙基(例如β-三鹵代甲基-、β-氰基-、β-磺基-或β-硝基-取代的乙基)；吸電子取代的苯基(例如鹵代-、磺基-、氰基-或硝基-取代的苯基)；或吸電子取代的苯基乙基。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)R是磷酸酯保護(hù)基時(shí)，其是甲基、β-氰基乙基或4-硝基苯基乙基。在某些實(shí)施方案中，R是氫、甲基或β-氰基乙基。目標(biāo)吸電子取代基包括但不限于鹵代、氰基、硝基、磺基或者單-、二-或三鹵代甲基等。鹵素原子取代基通常是氟、氯、溴或碘；并且在一些實(shí)例中，它們是氟或氯?！拔娮印北硎救〈鶅A向于吸引作為其一部分的分子的價(jià)電子，即它是電負(fù)性的，例如March,Advanced Organic Chemistry,第16-18頁(John Wiley,New York,1985)。用于選擇磷酸酯保護(hù)基的指導(dǎo)提供于Beaucage和Iyer,Tetrahedron 48:2223-2311(1992)中。為方便起見，核苷酸磷酰胺酯有時(shí)在本文中由分別用于N3’→P5’磷酰胺酯和P3’→N5’磷酰胺酯的下標(biāo)“np”或“pn”指示。因此，“U_npU”是其中3'-氨基尿苷和尿苷通過N3'→P5'磷酰胺酯鍵聯(lián)連接的二核苷酸。當(dāng)鍵聯(lián)是氧代-磷酰胺酯時(shí)，核苷酸氧代-磷酰胺酯有時(shí)在本文中由分別用于N3’→P5’磷酰胺酯和P3’→N5’磷酰胺酯的下標(biāo)“npo”或“opn”指示。類似地，核苷酸硫代磷酰胺酯有時(shí)在本文中由分別用于N3’→P5’硫代磷酰胺酯和P3’→N5’硫代磷酰胺酯的下標(biāo)“nps”或“spn”指示。類似地，2'-氟取代基由下標(biāo)“f”指示。因此，“U_f.npU”是二核苷酸，其中最5'-3'-氨基-2'-氟尿苷通過N3’→P5’磷酰胺酯鍵聯(lián)連接至尿苷。單一先導(dǎo)下標(biāo)“p”指示5'單磷酸酯，并且單一拖尾下標(biāo)“n”指示3'-氨基。

在一些實(shí)例中，核苷間亞基鍵聯(lián)描述為下式：

3’-NH-P(＝X)(OR)-O-5’

或其互變異構(gòu)體，其中3’和5’是指通過鍵聯(lián)連接的連續(xù)核苷的糖部分的碳原子，并且其中R是氫且X是氧或硫。應(yīng)理解對(duì)于本文所述的包括所述核苷間鍵聯(lián)的任何寡核苷酸，所述寡核苷酸液可包括鍵聯(lián)的任何適宜鹽形式。因此，核苷間鍵聯(lián)可呈包括任何適宜的抗衡離子的鹽形式。

任何適宜的保護(hù)基策略均可用于主題方法中以保護(hù)堿基、亞磷酰胺、磷酰胺酯、5’、2’和/或3’基團(tuán)。目標(biāo)保護(hù)基包括但不限于由Ohkubo等人,Org.Lett.,2010,12(11),第2496–2499頁；以及Beaucage和Iyer,Tetrahedron 48:2223-2311(1992)描述的那些保護(hù)基。

如本文所用，術(shù)語“磷酸酯保護(hù)基”是指可連接至寡核苷酸的含磷亞基間鍵聯(lián)的保護(hù)基。當(dāng)存在時(shí)，磷酸酯保護(hù)基可阻止(即阻斷)在連接磷酸酯保護(hù)基所處的位置處的含磷鍵聯(lián)的反應(yīng)。任何適宜的含磷亞基間鍵聯(lián)(例如P(III)和P(V)鍵聯(lián))均可由主題磷酸酯保護(hù)基保護(hù)，包括但不限于亞磷酰胺、氧代磷酰胺酯、硫代磷酰胺酯、磷酸酯、硫代磷酸酯、磷酸二酯鍵聯(lián)等。磷酸酯保護(hù)基可連接至含磷亞基間鍵聯(lián)的可用氧原子。任何適宜的保護(hù)基可用作磷酸酯保護(hù)基。目標(biāo)磷酸酯保護(hù)基包括但不限于烷基、烯基、芳基、芳烷基、環(huán)烷基或其取代型式，如具有1至6個(gè)碳原子的烷基，如吸電子β-取代的乙基(例如，β-三鹵代甲基、β-氰基-、β-磺基-或β-硝基-取代的乙基)；吸電子取代的苯基(例如鹵代-、磺基-、氰基-或硝基-取代的苯基)；或吸電子取代的苯基乙基、甲基、β-氰基乙基或4-硝基苯基乙基。在某些實(shí)施方案中，磷酸酯保護(hù)基是甲基或β-氰基乙基。目標(biāo)吸電子取代基包括但不限于鹵代(例如，氯或氟)、氰基、硝基、磺基或單-、二-或三鹵代甲基等。

生長(zhǎng)寡核苷酸鏈的3’-端基可包括3’-羥基、3’-氨基或其保護(hù)型式。任何適宜的羥基和/或氨基保護(hù)基可在寡核苷酸合成期間在3’-端基處使用。在一些實(shí)施方案中，3’端基是受保護(hù)的3’-氨基，并且所述方法包括使保護(hù)基脫保護(hù)或移除以產(chǎn)生游離的3’氨基。

如本文所用，關(guān)于單體和二聚體的術(shù)語“游離氨基”意指可用于與進(jìn)入的單體或二聚體的亞磷酰胺基團(tuán)反應(yīng)的氨基。在一些實(shí)施方案中，游離氨基是伯胺。在脫保護(hù)(例如脫三苯甲基化)步驟之后，氨基可呈鹽形式(例如用于脫三苯甲基化的酸的綴合堿的鹽)。此鹽任選地可在脫三苯甲基化步驟之后用如含2％三乙胺或吡啶的乙腈的堿性溶液中和。

在一些實(shí)施方案中，3’-端基是受保護(hù)的3’-羥基，并且所述方法包括使保護(hù)基脫保護(hù)或移除以產(chǎn)生游離的3’-羥基。在一些實(shí)施方案中，3’-端基是受保護(hù)的3’-氨基，并且所述方法包括使保護(hù)基脫保護(hù)或移除以產(chǎn)生游離的3’-氨基。所述受保護(hù)的3’-氨基或3’-羥基可用三苯甲基保護(hù)基保護(hù)。在某些實(shí)施方案中，三苯甲基保護(hù)基是三苯基甲基(Tr，Ph₃C-)。在某些實(shí)施方案中，三苯甲基保護(hù)基是4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMT)。

使3’-末端氨基或羥基脫保護(hù)可使用任何適宜的方法來實(shí)現(xiàn)。目標(biāo)方法包括但不限于由Beaucage和Iyer,Tetrahedron 48:2223-2311(1992)描述的那些方法。在一些情況下，使末端核苷的受保護(hù)的3'氨基脫保護(hù)包括脫三苯甲基化以產(chǎn)生游離的3’端基，例如酸催化的脫三苯甲基化。

一般而言，二聚體或單體亞基亞磷酰胺包括與連接至固體支撐物的末端核苷的3’端基相同的受保護(hù)的3’-羥基或3’-氨基。進(jìn)入的亞基亞磷酰胺的3’-保護(hù)阻止鏈的不合需要的聚合。

任何適宜的固相支撐物可用于主題方法中。目標(biāo)固體支撐物包括但不限于由可控孔徑玻璃(CPG)制得的微粒、高度交聯(lián)的聚苯乙烯(例如NittoPhase HL 400或GE Primer 350)、丙烯酸共聚物、纖維素、尼龍、葡聚糖、乳膠、聚丙烯醛等，如以下示例性參考文獻(xiàn)中公開的那些：Meth.Enzymol.,章節(jié)A,第11-147頁,第44卷(Academic Press,New York,1976)；美國專利第4,678,814號(hào)；第4,413,070號(hào)；和第4,046；720號(hào)；以及Pon,第19章,Agrawal編輯,Methods in Molecular Biology,第20卷,(Humana Press,Totowa,N.J.,1993)。其他目標(biāo)支撐物包括聚苯乙烯珠粒；接枝有聚乙二醇的聚苯乙烯(例如TentaGel^TM,Rapp Polymere,Tubingen Germany)等。對(duì)如材料、孔隙度、尺寸、形狀等的支撐物特征以及所用連接部分的類型的選擇取決于多種因素，如所用的保護(hù)基、最終產(chǎn)物的長(zhǎng)度、最終產(chǎn)物的量等。示例性連接部分公開于Pon等人,Biotechniques,6:768-775(1988)；Webb,美國專利第4,659,774號(hào)；Barany等人,國際專利申請(qǐng)PCT/US91/06103；Brown等人,J.Chem.Soc.Commun.,1989:891-893；Damha等人,Nucleic Acids Research,18:3813-3821(1990)；Beattie等人,Clinical Chemistry,39:719-722(1993)；Maskos和Southern,Nucleic Acids Research,20:1679-1684(1992)等。

在一些實(shí)施方案中，適用于主題方法中的固體支撐物包括CPG和接枝有聚乙二醇且具有末端氨基的聚苯乙烯(例如TentaGel-NH₂^TM,Rapp Polymere,Tubingen Germany)。氨基丙基可用作CPG與核苷鍵聯(lián)之間之間隔區(qū)。在一些情況下，與第一核苷的5'-羥基的鍵聯(lián)是琥珀酰基，其提供可在合成之后用氨水溶液裂解的堿不穩(wěn)定性酯鍵聯(lián)。

在脫保護(hù)之后，支撐物結(jié)合的核苷能夠與二聚體或單體亞基亞磷酰胺反應(yīng)以形成核苷間鍵聯(lián)。應(yīng)理解支撐物結(jié)合的核苷可指連接至固體支撐物的單一殘基，或可指寡核苷酸鏈的連接至支撐物的末端殘基。

任何適宜的偶聯(lián)化學(xué)、偶聯(lián)試劑和方法均可用于主題方法中。在主題方法的背景下進(jìn)行涉及偶聯(lián)條件、保護(hù)基、固相支撐物、連接基團(tuán)、脫保護(hù)試劑、用于自固相支撐物裂解產(chǎn)物的試劑、產(chǎn)物的純化等的選擇的大量指導(dǎo)可見于例如以下文獻(xiàn)中：Gait編輯,Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach(IRL Press,Oxford,1984)；Amarnath和Broom,Chemical Reviews,第77卷,第183-217頁(1977)；Pon等人,Biotechniques,第6卷,第768-775頁(1988)；Ohtsuka等人,Nucleic Acids Research,第10卷,第6553-6570頁(1982)；Eckstein編輯Oligonucleotides.and Analogues:A Practical Approach(IRL Press,Oxford,1991)；Greene和Wuts“Protective Groups in Organic Synthesis”,第3版,Wiley,New York 1999；Narang編輯,Synthesis and Applications of DNA and RNA(Academic Press,New York,1987)；Beaucage和Iyer,Tetrahedron 48:2223-2311(1992)以及類似參考文獻(xiàn)。

主題方法的偶聯(lián)步驟可在-20至200攝氏度的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。在一些實(shí)例中，所述反應(yīng)在環(huán)境溫度下進(jìn)行(約15-30攝氏度)。反應(yīng)可通過向含有(寡)核苷酸的共價(jià)連接至固體支撐物的游離氨基的反應(yīng)容器中添加亞磷酰胺二聚體或單體的溶液和活化劑的溶液(或含有亞磷酰胺二聚體或單體和活化劑的溶液)來進(jìn)行。一般來說，目標(biāo)活化劑包括親核催化劑，其置換更穩(wěn)定的亞磷酰胺氨基以形成高度反應(yīng)性(及較小穩(wěn)定性)中間體，所述中間體進(jìn)而與固體支撐的寡核苷酸N3’→P5’磷酰胺酯的游離3'氨基反應(yīng)。接著通過如機(jī)械渦旋、用惰性氣體噴射等的這類方法混合所述混合物。或者，可使二聚體或單體和活化劑的溶液流過含有固體支撐的具有游離3'-端基的(寡)核苷酸的反應(yīng)容器(或柱)。單體和活化劑可預(yù)先混合，在適合合成儀的閥體中混合，在預(yù)活化容器中混合且必要時(shí)預(yù)先平衡，或其可分別添加至反應(yīng)容器中。

可用于主題方法中的目標(biāo)活化劑包括但不限于四唑、5-(乙基硫基)四唑、5-(4-硝基苯基)四唑、5-(2-噻吩)四唑、三唑、氯化吡啶鎓等，例如如由Beaucage和Iyer Tetrahedron 48:2223-2311(1992)；Berner等人,Nucleic Acids Research,17:853-864(1989)；Benson,Chem.Rev.41:1-61(1947)所描述的活化劑。如本文所用，術(shù)語“四唑活化劑”是指為四唑或四唑衍生物的活化劑。在一些實(shí)施方案中，活化劑是四唑。適宜的溶劑包括但不限于乙腈、四氫呋喃、二氯甲烷等?？尚⌒氖褂脽o水(不含水)二聚體或單體、活化劑以及用于偶聯(lián)步驟的溶劑以及用于在偶聯(lián)步驟之前立即洗滌固體支撐物的溶劑。

在偶聯(lián)之后，寡核苷酸的支撐物結(jié)合的生長(zhǎng)鏈的未反應(yīng)的3'-氨基可任選地在下一脫保護(hù)步驟(例如脫三苯甲基化步驟)之前用適宜的加帽劑加帽以使其對(duì)隨后偶聯(lián)步驟具有惰性。此加帽步驟可改進(jìn)制備的HPLC概況以使得純化更容易，且也可改進(jìn)產(chǎn)物的總體產(chǎn)率。適用于主題方法中的加帽試劑包括親電子試劑(如乙酸酐和異丁酸酐)、酸氯化物(如金剛烷基羰基氯化物、新戊酰氯等)、異硫氰酸酯、氯甲酸酯等。還適用的是亞磷酰胺連同活化劑一起，且接著氧化，且如異丙基-H-膦酸三乙銨的H-膦酸鹽連同酸氯化物(如新戊酰氯或金剛烷基羰基氯化物)一起使用。

在一些實(shí)施方案中，所述方法包括氧化核苷間N3'→P5'亞磷酰胺鍵聯(lián)。如本文所用，關(guān)于含磷核苷間鍵聯(lián)的術(shù)語“氧化(oxidize/oxidation/oxidizing)”等意指用于使鍵聯(lián)的磷原子自磷(III)形式轉(zhuǎn)化成磷(V)形式的過程或處理。核苷酸間鍵聯(lián)的氧化可使用任何適宜的方法在合成中的任何適宜點(diǎn)處進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，氧化以逐步方式，例如在每個(gè)偶聯(lián)循環(huán)中進(jìn)行。在其他實(shí)施方案中，在合成結(jié)束時(shí)進(jìn)行多個(gè)核苷酸間鍵聯(lián)的氧化。在一些實(shí)例中，使N3’→P5’亞磷酰胺鍵聯(lián)氧化(例如使用基于碘/水的氧化劑)會(huì)產(chǎn)生氧代-磷酰胺酯鍵聯(lián)。在其他實(shí)例中，使N3’→P5’亞磷酰胺鍵聯(lián)氧化包括硫化以產(chǎn)生硫代磷酰胺酯鍵聯(lián)。硫化可使用任何適宜的方法來進(jìn)行。目標(biāo)硫化方法包括由Gryazonov等人,WO2001018015所述的那些方法，所述專利的公開內(nèi)容以引用的方式整體并入本文。用于本發(fā)明中的硫化劑包括元素硫、二硫化秋蘭姆(如二硫化四乙基秋蘭姆)、酰基二硫化物(如苯甲酰甲基二硫化物)、硫膦基二硫化物(如S-Tetra^TM)以及1,1-二氧代-3H-1,2-苯并二巰基-3-酮。在一些實(shí)施方案中，硫化可使用元素硫(S8)來進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中，硫化可使用如由Iyer等人,J.Organic Chemistry 55:4693-4699,1990所述的方法，使用Beaucage試劑來進(jìn)行。

適用于方法中的氧化劑包括碘、氯、溴、過酸(如間氯苯甲酸)、過氧化氫(如叔丁基過氧化氫、乙基過氧化氫、甲基過氧化氫等)、臭氧、混合酰基-亞磺酸酐(如3H-2,1-苯并氧硫雜環(huán)戊烷-3-酮-1-氧化物)、過硫酸鹽(如過硫酸鈉、過硫酸銨和過硫酸四丁銨等)、單過氧硫酸鹽(如oxone^TM)、次氯酸鈉和/或其他次氯酸鹽、過氧化物(如二乙基過氧化物或雙(三甲基甲硅烷基)過氧化物，或過氧化氫或非水性過氧化氫等效物(如脲/過氧化氫復(fù)合物))等?？捎糜谑沽?III)轉(zhuǎn)化成磷(V)的其他適用的氧化劑描述于Beaucage和Iyer Tetrahedron 48:2223-2311(1992)中。

在一些情況下，氧化劑或硫化劑可具有經(jīng)歷與所需氧化并行的非所需阿爾布佐夫(Arbuzov)副反應(yīng)的傾向(Beaucage和Iyer,以上引用)。Arbuzov副反應(yīng)可產(chǎn)生脫保護(hù)的磷酰胺酯，其對(duì)隨后脫三苯甲基化步驟的酸性條件不穩(wěn)定，且導(dǎo)致寡核苷酸片段化。在某些實(shí)施方案中，過氧化氫用作氧化劑以使Arbuzov副反應(yīng)最小化。在某些實(shí)施方案中，氧化包括使寡核苷酸與1.5％過氧化氫、3.5％水、20％吡啶和75％THF的溶液接觸。

在一些實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟：

(a)使連接至固相支撐物的末端核苷的受保護(hù)的3'氨基脫保護(hù)，所述脫保護(hù)形成游離3'氨基；

(b)使所述游離3'氨基與以下任一者：

(i)3'-受保護(hù)的氨基-二核苷酸磷酰胺酯-5'-亞磷酰胺二聚體；或

(ii)3'-受保護(hù)的氨基核苷-5'-亞磷酰胺單體；在親核催化劑存在下反應(yīng)以形成核苷間N3'→P5'亞磷酰胺鍵聯(lián)；

(c)使所述鍵聯(lián)氧化；以及

(d)重復(fù)步驟(a)至(c)直到合成多核苷酸，其中所述重復(fù)步驟(a)至(c)包括進(jìn)行步驟(b)(i)至少一次。

在一些實(shí)施方案中，所述重復(fù)步驟(a)至(c)包括進(jìn)行步驟(b)(i)兩次或更多次。在某些實(shí)施方案中，所述重復(fù)步驟(a)至(c)包括進(jìn)行步驟(b)(i)3次或更多，如4次或更多次、5次或更多次、6次或更多次、7次或更多次、8次或更多次、9次或更多次、10次或更多次、15次或更多次、20次或更多次或甚至30次或更多次。在某些實(shí)施方案中，所述重復(fù)步驟(a)至(c)包括在每個(gè)偶聯(lián)步驟進(jìn)行步驟(b)(i)。在某些實(shí)施方案中，所述重復(fù)步驟(a)至(c)包括在每個(gè)偶聯(lián)步驟(除了一個(gè))進(jìn)行步驟(b)(i)。在某些實(shí)施方案中，所述重復(fù)步驟(a)至(c)包括進(jìn)行步驟(b)(ii)一次且僅一次。在某些實(shí)施方案中，所述重復(fù)步驟(a)至(c)包括進(jìn)行步驟(b)(ii)兩次且僅兩次。

如本文所述，應(yīng)理解術(shù)語磷酰胺酯鍵聯(lián)意指涵蓋氧代-磷酰胺酯鍵聯(lián)與硫代磷酰胺酯鍵聯(lián)兩者(例如，如式I中所描繪)。在所述方法的某些實(shí)施方案中，使核苷間N3'→P5'亞磷酰胺鍵聯(lián)氧化產(chǎn)生氧代磷酰胺酯鍵聯(lián)。在所述方法的一些實(shí)施方案中，使核苷間N3’→P5’亞磷酰胺鍵聯(lián)氧化包括硫化以產(chǎn)生硫代磷酰胺酯鍵聯(lián)。

在所述方法的一些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸由式(I)描述：

其中：

各B獨(dú)立地是嘌呤、受保護(hù)的嘌呤、嘧啶或受保護(hù)的嘧啶，或其類似物；

各X獨(dú)立地是氧或硫；

各R³是氫、氟、羥基、烷氧基、取代的烷氧基或受保護(hù)的羥基；

R⁶是氨基、羥基、受保護(hù)的氨基、受保護(hù)的羥基、-O-L-Z或–NH-L-Z；

各L獨(dú)立地是任選的接頭；

各Z獨(dú)立地是H、脂質(zhì)、支撐物、載體、寡核苷酸、聚合物、多肽、可檢測(cè)標(biāo)記或標(biāo)簽；

R是氫、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基或磷酸酯保護(hù)基；且

n是1至1000的整數(shù)。當(dāng)R是氫、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基或磷酸酯保護(hù)基時(shí)，應(yīng)理解一些式(I)寡核苷酸也可以鹽形式存在。此類形式只要其可存在就意圖包括在本公開的范圍內(nèi)。

在式(I)的一些實(shí)施方案中，各R³是氫。在式(I)的一些實(shí)施方案中，各R³是氟。在式(I)的一些實(shí)施方案中，各R³是羥基。

在式(I)的一些實(shí)施方案中，R⁶是氨基。在式(I)的某些實(shí)施方案中，R⁶是羥基。

在式(I)的一些實(shí)施方案中，各R是氫。應(yīng)理解當(dāng)R是氫時(shí)，磷酸酯鍵聯(lián)在如生理?xiàng)l件的水性條件下可帶電荷。因此，應(yīng)理解式(I)寡核苷酸也可包括鍵聯(lián)的任何適宜鹽形式。因此，式(I)核苷間鍵聯(lián)可呈包括任何適宜的抗衡離子的鹽形式。在式(I)的一些實(shí)施方案中，各R是烷基或取代的烷基。在式(I)的一些實(shí)施方案中，各R是芳基或取代的芳基。在式(I)的一些實(shí)施方案中，各R是磷酸酯保護(hù)基。

在式(I)的一些實(shí)施方案中，Z是H。在式(I)的一些實(shí)施方案中，Z是脂質(zhì)(例如，如本文所描述)。在某些情況下，脂質(zhì)是脂肪酸(例如，如本文所描述)。在式(I)的一些實(shí)施方案中，Z是支撐物。在式(I)的一些實(shí)施方案中，Z是載體。在式(I)的一些實(shí)施方案中，Z是寡核苷酸。在式(I)的一些實(shí)施方案中，Z是聚合物。在某些情況下，聚合物是PEG。在式(I)的一些實(shí)施方案中，Z是多肽。在式(I)的一些實(shí)施方案中，Z是可檢測(cè)標(biāo)記。在式(I)的一些實(shí)施方案中，Z是標(biāo)簽。

在式(I)的一些實(shí)施方案中，L是不存在。

在一些實(shí)施方案中，各B獨(dú)立地選自A、C、G、T和U或其受保護(hù)的型式。

在式(I)的某些實(shí)施方案中，n是在1與500之間，如在1與100之間、在1與75之間、在1與50之間、在1與40之間、在1與30之間、在1與20之間、在1與15之間、在1與10之間，或在4與10之間的整數(shù)。在某些實(shí)施方案中，n是在1與100之間，如在5與50之間、在10與50之間、在10與40之間、在10與30之間、在10與25之間、在10與20之間、在12與18之間，或在12與16之間的整數(shù)。在某些實(shí)施方案中，n是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25。

在所述方法的某些實(shí)施方案中，寡核苷酸包含具有與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的核苷亞基的序列，并且其中至少兩個(gè)核苷亞基通過N3′→P5′磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)連接。

在所述方法的一些實(shí)施方案中，寡核苷酸包括具有在3個(gè)與50個(gè)之間的與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的核苷連續(xù)亞基，如在5個(gè)與40個(gè)之間、在10個(gè)與40個(gè)之間、在10個(gè)與30個(gè)之間、在10個(gè)與25個(gè)之間、在10個(gè)與20個(gè)之間、在12個(gè)與18個(gè)之間，或在12個(gè)與16個(gè)之間的核苷亞基的序列。在某些實(shí)施方案中，寡核苷酸包括具有10個(gè)或更多個(gè)與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的連續(xù)核苷亞基的序列。在某些實(shí)施方案中，寡核苷酸包括具有7個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核苷亞基，如7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個(gè)連續(xù)核苷亞基的序列。在某些實(shí)施方案中，寡核苷酸包括具有11個(gè)或18個(gè)之間、如11個(gè)與16個(gè)之間的與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的連續(xù)核苷亞基的序列。

在所述方法的一些實(shí)例中，N3′→P5′硫代磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)由以下結(jié)構(gòu)所描述：

3′—NH—P(S)(OR)—O—5’

其中R選自由以下組成的組：氫、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基和磷酸酯保護(hù)基。應(yīng)理解，當(dāng)R選自由氫、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基和磷酸酯保護(hù)基組成的組時(shí)，由上式所描述的一些核苷間亞基鍵聯(lián)也可以鹽形式存在。此類形式只要其可存在就意圖包括在本公開的范圍內(nèi)。

在所述方法的一些實(shí)例中，N3′→P5′硫代磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)由以下結(jié)構(gòu)所描述：

3′—NH—P(S)(OR)—O—5’

其中R是氫。應(yīng)理解對(duì)于本文所述的包括所述亞基間鍵聯(lián)的任何寡核苷酸，所述寡核苷酸也可包括鍵聯(lián)的任何適宜鹽形式。因此，亞基間鍵聯(lián)可呈包括任何適宜的抗衡離子的鹽形式。

在所述方法的一些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸保護(hù)序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO:3)。在某些實(shí)施方案中，TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO:3)序列的所有核苷酸間亞基間鍵聯(lián)都是N3'→P5'磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)。在某些實(shí)例中，序列的所有N3'→P5'磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)都是N3'→P5'硫代磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)(例如，nps鍵聯(lián))。在某些實(shí)例中，序列的所有N3’→P5’磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)都是N3'→P5'氧代磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)(例如，np鍵聯(lián))。

在所述方法的一些實(shí)施方案中，多核苷酸包括3’-氨基或3’-羥基端基。在所述方法的某些實(shí)施方案中，多核苷酸包括3’-氨基端基。在所述方法的某些實(shí)施方案中，多核苷酸包括3’-羥基端基。

在所述方法的一些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸描述為以下結(jié)構(gòu)：

其中“nps”表示使一個(gè)核苷的3'-碳連接至相鄰核苷的5'-碳的硫代磷酰胺酯鍵聯(lián)(例如—NH—P(＝O)(SH)—O—或其互變異構(gòu)體)。

應(yīng)理解提及寡核苷酸的所有實(shí)施方案還適用于所述寡核苷酸的鹽形式。

在所述方法的一些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸描述為以下結(jié)構(gòu)：

或其鹽；

其中“nps”表示使一個(gè)核苷的3'-碳連接至相鄰核苷的5'-碳的硫代磷酰胺酯鍵聯(lián)(例如—NH—P(＝O)(SH)—O—或其互變異構(gòu)體或其鹽)。在某些實(shí)施方案中，所述組合物包含所述化合物的藥學(xué)上可接受的鹽。在某些實(shí)例中，所述組合物包含所述化合物的鈉鹽。在某些實(shí)施方案中，所述組合物包含所述化合物的二價(jià)陽離子鹽，如所述化合物的鎂鹽。在某些實(shí)施方案中，所述組合物包含所述化合物的三價(jià)陽離子鹽，如所述化合物的鋁鹽。

在所述方法的某些實(shí)施方案中，寡核苷酸由以下結(jié)構(gòu)所描述，其中各M^x+獨(dú)立地是氫或鹽的任何適宜的抗衡離子，各x獨(dú)立地是1、2或3，并且n是5至13的整數(shù)，如5、6、7、8、9、10、11、12或13，如n是13：

在某些實(shí)例中，各x是1。在某些實(shí)例中，各x獨(dú)立地是1或2。在某些實(shí)例中，各x獨(dú)立地是1或3。在某些實(shí)例中，M^x+是氫。

在所述方法的某些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸由以下結(jié)構(gòu)描述并且可包括鹽的任何適宜的陽離子抗衡離子：

在所述方法的某些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸描述為以下結(jié)構(gòu)：

在所述方法的某些實(shí)施方案中，TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO:3)序列的C11核苷酸殘基來源于3'-受保護(hù)的氨基核苷-5'-亞磷酰胺單體?！皝碓从凇币庵改繕?biāo)殘基在合成期間經(jīng)由特定亞基引入。在某些實(shí)例中，TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO:3)序列的T1至A10、A12和A13殘基來源于3'-受保護(hù)的氨基-二核苷酸硫代磷酰胺酯-5'-亞磷酰胺二聚體。

在一些情況下，所述方法包括使以下3'-受保護(hù)的氨基-二核苷酸硫代磷酰胺酯-5'-亞磷酰胺二聚體和3'-受保護(hù)的氨基核苷-5'-亞磷酰胺單體依次偶聯(lián)至固相支撐物的端基：TA、GG、GT、TA、GA、C和AA。應(yīng)理解，為簡(jiǎn)單起見，適用于主題方法的偶聯(lián)中的受保護(hù)的亞磷酰胺亞基可經(jīng)由符號(hào)X¹或X¹X²來描繪，其中X¹和X²獨(dú)立地是經(jīng)由任何適宜的核苷間鍵聯(lián)(例如，如本文所述)連接的任何適宜的核苷。可在主題方法中使用任何適宜的合成策略。以下顯示一些目標(biāo)策略以說明寡核苷酸靶序列的制備可如何向特定二聚體和/或單體亞基分配。

提供示例性靶寡核苷酸序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO:3)的由順序二聚體和/或單體亞基的以下清單表示的示例性逆合成策略。應(yīng)理解此策略清單并非是詳盡的，并且可針對(duì)向任何適宜的靶寡核苷酸合成的應(yīng)用加以修改。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括使3'-受保護(hù)的氨基-二核苷酸硫代磷酰胺酯-5'-亞磷酰胺二聚體和/或3'-保護(hù)的氨基核苷-5'-亞磷酰胺單體的以下序列之一依次偶聯(lián)至固相支撐物的端基：

TA、G、G、G、T、T、A、G、A、C、A、A

T、AG、G、G、T、T、A、G、A、C、A、A

T、A、GG、G、T、T、A、G、A、C、A、A

T、A、G、GG、T、T、A、G、A、C、A、A

T、A、G、G、GT、T、A、G、A、C、A、A

T、A、G、G、G、TT、A、G、A、C、A、A

T、A、G、G、G、T、TA、G、A、C、A、A

T、A、G、G、G、T、T、AG、A、C、A、A

T、A、G、G、G、T、T、A、GA、C、A、A

T、A、G、G、G、T、T、A、G、AC、A、A

T、A、G、G、G、T、T、A、G、A、CA、A

T、A、G、G、G、T、T、A、G、A、C、AA

TA、GG、G、T、T、A、G、A、C、A、A

TA、G、GG、T、T、A、G、A、C、A、A

TA、G、G、GT、T、A、G、A、C、A、A

TA、G、G、G、TT、A、G、A、C、A、A

TA、G、G、G、T、TA、G、A、C、A、A

TA、G、G、G、T、T、AG、A、C、A、A

TA、G、G、G、T、T、A、GA、C、A、A

TA、G、G、G、T、T、A、G、AC、A、A

TA、G、G、G、T、T、A、G、A、CA、A

TA、G、G、G、T、T、A、G、A、C、AA

T、AG、GG、T、T、A、G、A、C、A、A

T、AG、G、GT、T、A、G、A、C、A、A

T、AG、G、G、TT、A、G、A、C、A、A

T、AG、G、G、T、TA、G、A、C、A、A

T、AG、G、G、T、T、AG、A、C、A、A

T、AG、G、G、T、T、A、GA、C、A、A

T、AG、G、G、T、T、A、G、AC、A、A

T、AG、G、G、T、T、A、G、A、CA、A

T、AG、G、G、T、T、A、G、A、C、AA

T、A、GG、GT、T、A、G、A、C、A、A

T、A、GG、G、TT、A、G、A、C、A、A

T、A、GG、G、T、TA、G、A、C、A、A

T、A、GG、G、T、T、AG、A、C、A、A

T、A、GG、G、T、T、A、GA、C、A、A

T、A、GG、G、T、T、A、G、AC、A、A

T、A、GG、G、T、T、A、G、A、CA、A

T、A、GG、G、T、T、A、G、A、C、AA

T、A、G、GG、TT、A、G、A、C、A、A

T、A、G、GG、T、TA、G、A、C、A、A

T、A、G、GG、T、T、AG、A、C、A、A

T、A、G、GG、T、T、A、GA、C、A、A

T、A、G、GG、T、T、A、G、AC、A、A

T、A、G、GG、T、T、A、G、A、CA、A

T、A、G、GG、T、T、A、G、A、C、AA

T、A、G、G、GT、TA、G、A、C、A、A

T、A、G、G、GT、T、AG、A、C、A、A

T、A、G、G、GT、T、A、GA、C、A、A

T、A、G、G、GT、T、A、G、AC、A、A

T、A、G、G、GT、T、A、G、A、CA、A

T、A、G、G、GT、T、A、G、A、C、AA

T、A、G、G、G、TT、AG、A、C、A、A

T、A、G、G、G、TT、A、GA、C、A、A

T、A、G、G、G、TT、A、G、AC、A、A

T、A、G、G、G、TT、A、G、A、CA、A

T、A、G、G、G、TT、A、G、A、C、AA

T、A、G、G、G、T、TA、GA、C、A、A

T、A、G、G、G、T、TA、G、AC、A、A

T、A、G、G、G、T、TA、G、A、CA、A

T、A、G、G、G、T、TA、G、A、C、AA

T、A、G、G、G、T、T、AG、AC、A、A

T、A、G、G、G、T、T、AG、A、CA、A

T、A、G、G、G、T、T、AG、A、C、AA

T、A、G、G、G、T、T、A、GA、CA、A

T、A、G、G、G、T、T、A、GA、C、AA

TA、GG、GT、T、A、G、A、C、A、A

TA、GG、G、TT、A、G、A、C、A、A

TA、GG、G、T、TA、G、A、C、A、A

TA、GG、G、T、T、AG、A、C、A、A

TA、GG、G、T、T、A、GA、C、A、A

TA、GG、G、T、T、A、G、AC、A、A

TA、GG、G、T、T、A、G、A、CA、A

TA、GG、G、T、T、A、G、A、C、AA

TA、G、GG、TT、A、G、A、C、A、A

TA、G、GG、T、TA、G、A、C、A、A

TA、G、GG、T、T、AG、A、C、A、A

TA、G、GG、T、T、A、GA、C、A、A

TA、G、GG、T、T、A、G、AC、A、A

TA、G、GG、T、T、A、G、A、CA、A

TA、G、GG、T、T、A、G、A、C、AA等

TA、GG、GT、TA、G、A、C、A、A

TA、GG、GT、T、AG、A、C、A、A

TA、GG、GT、T、A、GA、C、A、A

TA、GG、GT、T、A、G、AC、A、A

TA、GG、GT、T、A、G、A、CA、A

TA、GG、GT、T、A、G、A、C、AA等

TA、GG、GT、TA、GA、C、A、A

TA、GG、GT、TA、G、AC、A、A

TA、GG、GT、TA、G、A、CA、A

TA、GG、GT、TA、G、A、C、AA等

TA、G、GG、TT、AG、AC、A、A

TA、G、GG、TT、AG、A、CA、A

TA、G、GG、TT、AG、A、C、AA

TA、G、G、GT、TA、GA、CA、A

TA、G、G、GT、TA、GA、C、AA

TA、G、G、GT、TA、GA、CA、A

TA、G、G、G、TT、AG、AC、AA

TA、G、GG、T、TA、GA、CA、A

TA、G、GG、T、TA、GA、C、AA

TA、G、GG、T、TA、G、AC、AA等

T、A、G、GG、TT、AG、AC、AA

T、A、GG、G、TT、AG、AC、AA

T、AG、G、G、TT、AG、AC、AA

TA、G、G、G、TT、AG、AC、AA

T、AG、G、GT、T、AG、AC、AA等

T、AG、GG、T、T、AG、AC、AA等

T、AG、GG、TT、A、G、AC、AA等

T、AG、GG、TT、AG、A、C、AA等

T、AG、GG、TT、AG、AC、A、A

T、AG、GG、TT、AG、AC、AA

TA、G、GG、TT、AG、AC、AA

TA、GG、G、TT、AG、AC、AA

TA、GG、GT、T、AG、AC、AA

TA、GG、GT、TA、G、AC、AA

TA、GG、GT、TA、GA、C、AA或

TA、GG、GT、TA、GA、CA、A。

在一些實(shí)施方案中，所述方法包括使一系列3'-受保護(hù)的氨基-二核苷酸硫代磷酰胺酯-5'-亞磷酰胺二聚體和/或3'-受保護(hù)的氨基核苷-5'-亞磷酰胺單體依次偶聯(lián)至固相支撐物的端基，其中至少合成的末次偶聯(lián)是二聚體偶聯(lián)。在某些實(shí)施方案中，倒數(shù)第二次偶聯(lián)和末次偶聯(lián)是二聚體偶聯(lián)。在某些情況下，當(dāng)N是偶數(shù)時(shí)，所述方法包括N/2二聚體偶聯(lián)。在某些實(shí)例中，當(dāng)N是偶數(shù)時(shí)，所述方法包括N/2-1二聚體偶聯(lián)。在某些實(shí)例中，當(dāng)N是偶數(shù)時(shí)，所述方法包括N/2-2二聚體偶聯(lián)。在某些實(shí)例中，當(dāng)N是偶數(shù)時(shí)，所述方法包括N/2-3二聚體偶聯(lián)。在某些實(shí)例中，當(dāng)N是偶數(shù)時(shí)，所述方法包括N/2-4二聚體偶聯(lián)。在某些實(shí)例中，當(dāng)N是偶數(shù)時(shí)，所述方法包括N/2-5二聚體偶聯(lián)。在某些情況下，當(dāng)N是奇數(shù)時(shí)，所述方法包括N/2-1次二聚體偶聯(lián)。在某些實(shí)例中，當(dāng)N是奇數(shù)時(shí)，所述方法包括N/2-2次二聚體偶聯(lián)。在某些實(shí)例中，當(dāng)N是奇數(shù)時(shí)，所述方法包括N/2-3次二聚體偶聯(lián)。在某些實(shí)例中，當(dāng)N是奇數(shù)時(shí)，所述方法包括N/2-4次二聚體偶聯(lián)。在某些實(shí)例中，當(dāng)N是奇數(shù)時(shí)，所述方法包括N/2-5次二聚體偶聯(lián)。在某些實(shí)例中，當(dāng)N是奇數(shù)時(shí)，所述方法包括N/2-6次二聚體偶聯(lián)。例如，使以下系列的3'-受保護(hù)的氨基-二核苷酸硫代磷酰胺酯-5'-亞磷酰胺二聚體和/或3'-受保護(hù)的氨基核苷-5'-亞磷酰胺單體依次偶聯(lián)至固相支撐物的端基：

T、A、G、G、G、T、T、A、G、A、C、AA

T、A、G、G、G、T、T、A、G、AC、AA

T、A、G、G、G、T、T、A、GA、C、AA

T、A、G、G、G、T、T、AG、A、C、AA

T、A、G、G、G、T、TA、G、A、C、AA

T、A、G、G、G、TT、A、G、A、C、AA

T、A、G、G、GT、T、A、G、A、C、AA

T、A、G、GG、T、T、A、G、A、C、AA

T、A、GG、G、T、T、A、G、A、C、AA

T、AG、G、G、T、T、A、G、A、C、AA

TA、G、G、G、T、T、A、G、A、C、AA等

T、A、G、G、G、T、T、AG、AC、AA

T、A、G、G、G、TT、AG、AC、AA

T、A、G、GG、TT、AG、AC、AA

T、AG、GG、TT、AG、AC、AA

TA、G、GG、TT、AG、AC、AA

TA、GG、G、TT、AG、AC、AA

TA、GG、GT、T、AG、AC、AA

TA、GG、GT、TA、G、AC、AA

TA、GG、GT、TA、GA、C、AA。

在所述方法的一些實(shí)施方案中，3'-受保護(hù)的氨基-二核苷酸硫代磷酰胺酯-5'-亞磷酰胺二聚體由式X¹X²描述，其中X¹和X²獨(dú)立地選自受保護(hù)的腺嘌呤、受保護(hù)的胞嘧啶、受保護(hù)的鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。

脂質(zhì)修飾的寡核苷酸

取決于所選鍵聯(lián)的性質(zhì)，多種合成方法可用于使脂質(zhì)部分L’結(jié)合至寡核苷酸，包括Mishra等人,(1995)Biochemica et Biophysica Acta,1264:229-237；Shea等人,(1990)Nucleic Acids Res.18:3777-3783；以及Rump等人,(1998)Bioconj.Chem.9:341-349中所述的方法。其中脂質(zhì)部分綴合在寡核苷酸的5′或3′末端的化合物的合成可通過在適當(dāng)末端使用可與羧酸、酰氯、酸酐和活性酯反應(yīng)的適合官能團(tuán)，在一些情況下使用氨基來實(shí)現(xiàn)。巰基基團(tuán)也可用作官能團(tuán)(參見Kupihar等人,(2001)Bioorganic and Medicinal Chemistry 9:1241-1247)。具有不同鏈長(zhǎng)度的氨基修飾劑與巰基修飾劑兩者均可商購以用于寡核苷酸合成。具有N3′→P5′磷酰胺酯(例如N3′→P5′硫代磷酰胺酯)鍵聯(lián)的寡核苷酸含有3′-氨基(而非見于大多數(shù)常規(guī)寡核苷酸化學(xué)中的3′-羥基)，且因此這些寡核苷酸為脂質(zhì)基團(tuán)綴合至寡核苷酸的3′-末端提供獨(dú)特機(jī)會(huì)。

各種方法可用于使脂質(zhì)基團(tuán)連接至具有N3′→P5′磷酰胺酯(例如N3′→P5′硫代磷酰胺酯)化學(xué)的寡核苷酸的末端(參見例如表2的3-棕櫚酰胺基-1-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2-O-琥珀?；冀宇^)。對(duì)于連接于3′-末端，可通過使完全受保護(hù)的固體支撐物結(jié)合的寡核苷酸的游離3′-氨基與相應(yīng)酸酐反應(yīng)，隨后用氨脫保護(hù)并純化來合成綴合的化合物?；蛘撸褂萌缣蓟啺?、HBTU或碘化2-氯-1-甲基吡啶鎓的偶聯(lián)劑使脂質(zhì)的羧酸偶聯(lián)于支撐物結(jié)合的寡核苷酸的游離3′-氨基可用于綴合脂質(zhì)基團(tuán)。這兩種方法在脂質(zhì)與寡核苷酸之間形成酰胺鍵。也可使用在鏈延長(zhǎng)期間偶聯(lián)于寡核苷酸的脂質(zhì)的亞磷酰胺衍生物使脂質(zhì)連接于寡核苷酸。這種方法產(chǎn)生連接脂質(zhì)和寡核苷酸的磷酰胺酯(例如硫代磷酰胺酯)鍵聯(lián)(由丙基-棕櫚?；?-羥基-丙基-棕櫚酰基化合物例示)。另一方法涉及完全受保護(hù)的支撐物結(jié)合的寡核苷酸的游離3′-氨基與適合脂質(zhì)醛反應(yīng)，隨后用氰基硼氫化鈉還原，這產(chǎn)生胺鍵聯(lián)。

對(duì)于連接于5′末端，可使用修飾的含脂質(zhì)固體支撐物，隨后如Pongracz和Gryaznov(1999)中所述在5’至3’方向上合成寡核苷酸來合成寡核苷酸。以下提供修飾的支撐物的實(shí)例。在其中n＝14的實(shí)例中，脂肪酸是棕櫚酸：3-氨基-1,2-丙二醇與棕櫚酰氯反應(yīng)，隨后二甲氧基三苯甲基化和琥珀?；峁┯糜谂悸?lián)于固體支撐物的中間體。R可以是長(zhǎng)鏈烷基胺可控孔徑玻璃。

適用于制備寡核苷酸的二聚體

在制備寡核苷酸的方法的一些實(shí)施方案中，所述方法包括使支撐物結(jié)合的游離3'-端基(例如3'-羥基或3'-氨基)與二核苷酸二聚體亞基接觸以形成亞基間鍵聯(lián)。一般而言，二核苷酸二聚體的3’受保護(hù)，并且包括能夠與3’-端基偶聯(lián)的5’-基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，二核苷酸二聚體包括5’-亞磷酰胺。二核苷酸二聚體可包括3’-受保護(hù)的氨基或3’-受保護(hù)的羥基。在一些實(shí)施方案中，二核苷酸由式X¹X²所描述，其中X¹和X²獨(dú)立地是經(jīng)由任何適宜的核苷間鍵聯(lián)(例如，如本文所述)連接的任何適宜的核苷(例如A、C、G、T或U或其受保護(hù)型式)。二核苷酸可在兩個(gè)核苷之間包括任何適宜的核苷間鍵聯(lián)。適用于二核苷酸二聚體中的目標(biāo)核苷間鍵聯(lián)包括但不限于磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、磷酰胺酯(例如硫代磷酰胺酯)和硫代磷酸酯鍵聯(lián)。

在一些情況下，二核苷酸二聚體時(shí)3’-受保護(hù)的-二核苷酸-5'-亞磷酰胺二聚體或其合成前體，其中所述二核苷酸由式X¹X²描述，其中X¹和X²獨(dú)立地選自A、C、G、T和U或其受保護(hù)型式，并且其中X¹和X²經(jīng)由磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、磷酰胺酯(例如硫代磷酰胺酯)或硫代磷酸酯鍵聯(lián)或其受保護(hù)型式連接。

在制備寡核苷酸的方法的一些實(shí)施方案中，方法包括使支撐物結(jié)合的游離3'-氨基與3'-受保護(hù)的氨基-二核苷酸磷酰胺酯-5'-亞磷酰胺二聚體接觸以形成核苷間N3’→P5’亞磷酰胺鍵聯(lián)。任何適宜的3'-受保護(hù)的氨基-二核苷酸磷酰胺酯-5'-亞磷酰胺二聚體或其合成前體均可適用于主題方法中。在一些情況下，二聚體可由以下序列中的一個(gè)表示：AA、AC、AG、AT、AU、CA、CC、CG、CT或CU、GA、GC、GG、GT或GU、TA或UA、TC或UC、TG或UG以及TT或UU。在一些情況下，二聚體包括受保護(hù)的2’-羥基。

在某些實(shí)施方案中，二核苷酸二聚體是由式(II)所描述的二核苷酸硫代磷酰胺酯化合物：

其中B¹和B²各自獨(dú)立地是嘌呤、受保護(hù)的嘌呤、嘧啶或受保護(hù)的嘧啶或其類似物；R¹¹是氫、保護(hù)基或亞磷酰胺基團(tuán)；R¹²是氫或保護(hù)基；并且R¹³是氫、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基或保護(hù)基。在一些情況下，B¹和/或B²包括核堿基保護(hù)基。應(yīng)理解，當(dāng)R¹³是氫、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基或保護(hù)基時(shí)，由式(II)所描述的一些二核苷酸二聚體也可以鹽形式存在。此類形式只要其可存在就意圖包括在本公開的范圍內(nèi)。

在式(II)的一些實(shí)施方案中，R¹¹是氫。在式(II)的一些實(shí)施方案中，R¹¹是保護(hù)基。任何適宜的保護(hù)基均可適用于式(II)的主題二聚體中。在式(II)的一些實(shí)施方案中，R¹¹是基于乙酰丙酸酯的保護(hù)基。在式(II)的一些實(shí)施方案中，R¹¹是乙酰丙酸酯保護(hù)基(即-COCH₂CH₂COCH₃)。在式(II)的一些實(shí)施方案中，R¹¹是5’-亞磷酰胺基團(tuán)。

在式(II)的一些實(shí)施方案中，R¹²是氫。在式(II)的一些實(shí)施方案中，R¹²是保護(hù)基。在某些實(shí)施方案中，R¹²是三苯甲基(例如三苯基甲基(Trt)、單甲氧基三苯甲基(MMT)或二甲氧基三苯甲基(DMT))。在式(II)的一些實(shí)施方案中，R¹²是Trt保護(hù)基。

在式(II)的一些實(shí)施方案中，R¹²是光可裂解的保護(hù)基。任何適宜的光可裂解的保護(hù)基均可適用于制備主題二核苷酸二聚體及其合成前體。在式(II)的一些實(shí)施方案中，R¹²是取代的甲呱啶(pixyl)保護(hù)基，如硝基、氟、甲基、三氟甲基和/或甲氧基取代的甲呱啶保護(hù)基。在式(II)的一些實(shí)施方案中，R¹²是甲呱啶保護(hù)基(即9-(9-苯基)氧雜蒽基)。

在式(II)的一些實(shí)施方案中，R¹¹是乙酰丙?；Ｗo(hù)基，且R¹²是三苯甲基保護(hù)基。

在式(II)的一些實(shí)施方案中，R¹³是氫。在式(II)的一些實(shí)施方案中，R¹³是保護(hù)基。在某些實(shí)施方案中，R¹³是2-氰基-乙基。

在某些實(shí)施方案中，3'-受保護(hù)的氨基-二核苷酸磷酰胺酯-5'-亞磷酰胺二聚體由式(III)描述：

其中B¹和B²各自獨(dú)立地是嘌呤、受保護(hù)的嘌呤、嘧啶或受保護(hù)的嘧啶或其類似物。在一些情況下，B¹和/或B²包括核堿基保護(hù)基。

在某些實(shí)施方案中，3'-受保護(hù)的氨基-二核苷酸磷酰胺酯-5'-亞磷酰胺二聚體由式(III)描述：

其中B¹和B²各自獨(dú)立地是嘌呤、受保護(hù)的嘌呤、嘧啶或受保護(hù)的嘧啶或其類似物；并且R¹⁸是三苯甲基保護(hù)基(如Trt、DMT或MMT)或甲呱啶保護(hù)基。

在式(II)或(III)的一些實(shí)施方案中，B¹和B²各自獨(dú)立地選自受保護(hù)的腺嘌呤、受保護(hù)的胞嘧啶、受保護(hù)的鳥嘌呤、胸腺嘧啶以及尿嘧啶。在式(II)或(III)的一些實(shí)施方案中，B¹和B²各自獨(dú)立地選自A(Bz)、A(DMF)、C(Bz)、G(異丁?；?、T以及U。在式(II)或(III)的一些實(shí)施方案中，B¹是A(Bz)。在式(II)或(III)的一些實(shí)施方案中，B¹是A(DMF)。在式(II)或(III)的一些實(shí)施方案中，B¹是C(Bz)。在式(II)或(III)的一些實(shí)施方案中，B¹是G(異丁?；?。在式(II)或(III)的一些實(shí)施方案中，B¹是T或U。在式(II)或(III)的一些實(shí)施方案中，B²是A(Bz)或A(DMF)。在式(II)或(III)的一些實(shí)施方案中，B²是C(Bz)。在式(II)或(III)的一些實(shí)施方案中，B²是G(異丁?；?。在式(II)或(III)的一些實(shí)施方案中，B²是T或U。

在式(II)或(III)的一些實(shí)施方案中，B¹是A(Bz)或A(DMF)且B²是A(Bz)或A(DMF)。在式(II)或(III)的一些實(shí)施方案中，B¹是A(Bz)或A(DMF)且B²是C(Bz)。在式(II)或(III)的一些實(shí)施方案中，B¹是A(Bz)或A(DMF)且B²是G(異丁?；?。在式(II)或(III)的一些實(shí)施方案中，B¹是A(Bz)或A(DMF)且B²是T或U。

在式(II)或(III)的一些實(shí)施方案中，B¹是C(Bz)且B²是A(Bz)或A(DMF)。在式(II)或(III)的一些實(shí)施方案中，B¹是C(Bz)且B²是C(Bz)。在式(II)或(III)的一些實(shí)施方案中，B¹是C(Bz)且B²是G(異丁酰基)。在式(II)或(III)的一些實(shí)施方案中，B¹是C(Bz)且B²是T或U。

在式(II)或(III)的一些實(shí)施方案中，B¹是G(異丁?；?且B²是A(Bz)或A(DMF)。在式(II)或(III)的一些實(shí)施方案中，B¹是G(異丁?；?且B²是C(Bz)。在式(II)或(III)的一些實(shí)施方案中，B¹是G(異丁酰基)且B²是G(異丁?；?。在式(II)或(III)的一些實(shí)施方案中，B¹是G(異丁?；?且B²是T或U。

在式(II)或(III)的一些實(shí)施方案中，B¹是T或U且B²是A(Bz)或A(DMF)。在式(II)或(III)的一些實(shí)施方案中，B¹是T或U且B²是C(Bz)。在式(II)或(III)的一些實(shí)施方案中，B¹是T或U且B²是G(異丁?；?。在式(II)或(III)的一些實(shí)施方案中，B¹是T或U且B²是T或U。應(yīng)理解，本文所述的任何式(II)或(III)的實(shí)施方案也可應(yīng)用于式(IV)。

本文所述的任何二聚體均可適合于在主題方法中使用。主題二聚體可根據(jù)任何適宜的方法自任何適宜的核苷單體制備。適用于制備主題核苷二聚體的目標(biāo)核苷單體包括但不限于描繪于本文公開的合成方案中的單體16、17、12和13。目標(biāo)二核苷酸二聚體包括適用于制備主題亞磷?；塑账岫垠w的非亞磷酰化二聚體，如適用于制備如20的亞磷?；塑账岫垠w的二聚體18和19，或適用于制備如15的亞磷酰化二核苷酸二聚體的二聚體14。

在一些實(shí)施方案中，式(III)和(IV)二聚體經(jīng)由以下方案中描繪的方法制備：

其中B¹和B²各自獨(dú)立地是嘌呤、受保護(hù)的嘌呤、嘧啶或受保護(hù)的嘧啶或其類似物；R¹⁵是氫或氨基保護(hù)基；R¹⁷是氨基保護(hù)基；且R¹⁶是羥基保護(hù)基。在某些實(shí)施方案中，R¹⁵是氫。在單體16的某些實(shí)施方案中，R¹⁶是甲硅烷基。在單體16的某些實(shí)施方案中，R¹⁶是TBDMS(叔丁基二甲基甲硅烷基)。在單體17的某些實(shí)施方案中，R¹⁷是三苯甲基(Trt)。在單體17的某些實(shí)施方案中，R¹⁷是單甲氧基三苯甲基(MMT)。

在單體17的某些實(shí)施方案中，R¹⁷是二甲氧基三苯甲基(DMT)。在單體17的某些實(shí)施方案中，R¹⁷是甲呱啶。在二聚體18-20的某些實(shí)施方案中，R¹⁷是三苯甲基(Trt)。在二聚體18-20的某些實(shí)施方案中，R¹⁷是單甲氧基三苯甲基(MMT)。在二聚體18-20的某些實(shí)施方案中，R¹⁷是二甲氧基三苯甲基(DMT)。在二聚體18-20的某些實(shí)施方案中，R¹⁷是甲呱啶。

在一些實(shí)施方案中，式(III)和(IV)二聚體經(jīng)由以下方案中描繪的方法制備，其中單體13經(jīng)由單體12自11制備，且與核苷亞酰胺化物(amidite)偶聯(lián)以產(chǎn)生二聚體14，其轉(zhuǎn)化成二聚體15：

其中B¹和B²各自獨(dú)立地是嘌呤、受保護(hù)的嘌呤、嘧啶或受保護(hù)的嘧啶或其類似物；且R¹³和R¹⁴各自獨(dú)立地是保護(hù)基。在單體12和13的某些實(shí)施方案中，R¹³是三苯甲基。在單體12和13的某些實(shí)施方案中，R¹³是甲呱啶。在二聚體14和15的某些實(shí)施方案中，R¹⁴是三苯甲基。在二聚體14和15的某些實(shí)施方案中，R¹⁴是二甲氧基三苯甲基。在二聚體14和15的某些實(shí)施方案中，R¹⁴是單甲氧基三苯甲基。在二聚體14和15的某些實(shí)施方案中，R¹⁴是甲呱啶。

適用于根據(jù)本文所述的方法制備主題二核苷酸二聚體的目標(biāo)單體包括但不限于：

其中B是嘌呤、受保護(hù)的嘌呤、嘧啶或受保護(hù)的嘧啶或其類似物，且R是氫或烷基(例如甲基)或鹵素(例如溴代)。在某些情況下，B選自A(Bz)、G(iBu)、T、A(DMF)、C(Bz)或U。

寡核苷酸組合物

除靶寡核苷酸之外，可在寡核苷酸合成期間產(chǎn)生多種非靶寡核苷酸合成產(chǎn)物?？纱嬖谟诠押塑账嶂苿┲械拇我a(chǎn)物包括但不限于缺失產(chǎn)物(例如缺乏一個(gè)或多個(gè)核苷殘基的產(chǎn)物)、包括一種或多種保護(hù)基的產(chǎn)物、終止產(chǎn)物(例如包括加帽寡核苷酸鏈的產(chǎn)物)、缺乏一個(gè)或多個(gè)核堿基的產(chǎn)物、包括部分氧化的亞磷酰胺鍵聯(lián)的產(chǎn)物和包括部分硫化鍵聯(lián)的產(chǎn)物。如本文所用，靶寡核苷酸是指目標(biāo)寡核苷酸序列，其是制備方法的靶產(chǎn)物。如本文所用，術(shù)語“非靶產(chǎn)物”和“次要產(chǎn)物”可互換使用，并且是指不是靶產(chǎn)物且可在靶寡核苷酸合成的循環(huán)期間和之后存在的任何含寡核苷酸產(chǎn)物。

主題方法提供包含純度提高的靶寡核苷酸的組合物。在一些實(shí)施方案中，組合物包含50重量％或更多的靶寡核苷酸，如約55重量％或更多、約60重量％或更多、約65重量％或更多、約70重量％或更多、約75重量％或更多、約80重量％或更多、約85重量％或更多、約90重量％或更多，或甚至約95重量％或更多的靶寡核苷酸。在某些實(shí)施方案中，所述組合物包含50重量％或更多的靶寡核苷酸。在某些實(shí)施方案中，所述組合物包含55重量％或更多的靶寡核苷酸。在某些實(shí)施方案中，所述組合物包含60重量％或更多的靶寡核苷酸。在某些實(shí)施方案中，所述組合物包含65重量％或更多的靶寡核苷酸。在某些實(shí)施方案中，所述組合物包含70重量％或更多的靶寡核苷酸。在某些實(shí)施方案中，所述組合物包含75重量％或更多的靶寡核苷酸。在某些實(shí)施方案中，所述組合物包含80重量％或更多的靶寡核苷酸。在某些實(shí)施方案中，所述組合物包含85重量％或更多的靶寡核苷酸。在某些實(shí)施方案中，所述組合物包含90重量％或更多的靶寡核苷酸。在某些實(shí)施方案中，所述組合物包含95重量％或更多的靶寡核苷酸。

在一些實(shí)施方案中，主題方法提供95％或更高，如96％或更高、97％或更高、98％或更高，或甚至98％或更高的偶聯(lián)效率。

在一些實(shí)施方案中，主題方法提供比僅使用單體亞基進(jìn)行的對(duì)照合成的平均偶聯(lián)效率高0.5％或更大，如0.75％或更大、1.0％或更大、1.25％或更大、1.5％或更大、1.75％或更大、2.0％或更大、2.5％或更大，或甚至3.0％或更大的平均偶聯(lián)效率。在某些實(shí)施方案中，主題方法提供96％或更大的偶聯(lián)效率。在某些實(shí)施方案中，主題方法提供比僅使用單體亞基進(jìn)行的對(duì)照合成的偶聯(lián)效率高2％或更大的偶聯(lián)效率。

在合成之后，主題組合物可經(jīng)受一個(gè)或多個(gè)純化步驟(例如HPLC色譜、親和色譜、離子交換色譜、凝膠過濾等)例如以從靶寡核苷酸移除一種或多種次要產(chǎn)物。應(yīng)理解，在主題組合物中，通過主題制備方法提供的次要產(chǎn)物的量降低和/或靶寡核苷酸的量增加可指在合成后立即以及在已進(jìn)行任何進(jìn)一步純化或分離步驟(例如HPLC色譜)之前獲得的這類量和純度。因此，在一些情況下，主題組合物可稱為合成制劑，例如未純化的合成制劑。未純化意指未已對(duì)組合物進(jìn)行色譜純化步驟。色譜純化是指包括使靶多核苷酸吸附于色譜支撐物，以及隨后洗脫靶多核苷酸的任何適宜的純化方法。在一些情況下，色譜純化是指反相色譜純化。

主題方法提供包含降低量的一種或多種次要產(chǎn)物的組合物。降低量意指相對(duì)于對(duì)照合成，例如其中寡核苷酸僅使用單體偶聯(lián)制備的合成，次要產(chǎn)物相對(duì)于靶寡核苷酸，在組合物中的以重量計(jì)的量得以降低。在一些實(shí)施方案中，降低量的次要產(chǎn)物是靶寡核苷酸的以重量計(jì)的量的約20％或更少，如靶寡核苷酸的以重量計(jì)的量的約15％或更少、約10％或更少，或約5％或更少。在某些實(shí)施方案中，降低量的次要產(chǎn)物是靶寡核苷酸的以重量計(jì)的量的20％或更少，如靶寡核苷酸的以重量計(jì)的量的15％或更少、10％或更少、9％或更少、8％或更少、7％或更少、6％或更少、5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少，或甚至1％或更少。在某些實(shí)施方案中，次要產(chǎn)物是(N-x)產(chǎn)物。

主題制備方法可提供一種或多種(N-x)產(chǎn)物相對(duì)于目標(biāo)靶寡核苷酸的量降低的組合物，其中x是1至N-1的整數(shù)，且N是靶寡核苷酸中的核苷殘基的數(shù)目。因此，(N-1)產(chǎn)物可指相對(duì)于靶寡核苷酸(例如N產(chǎn)物)缺乏任一核苷酸殘基的任何和所有寡核苷酸產(chǎn)物。因此，(N-2)產(chǎn)物是指相對(duì)于靶寡核苷酸(例如，N產(chǎn)物)缺乏任何兩個(gè)核苷酸殘基的任何和所有寡核苷酸產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，次要產(chǎn)物是(N-1)產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，次要產(chǎn)物是(N-2)產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，次要產(chǎn)物是(N-3)產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，次要產(chǎn)物是(N-4)產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，次要產(chǎn)物是(N-5)產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，次要產(chǎn)物是(N-6)產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，次要產(chǎn)物是(N-7)產(chǎn)物。

在某些實(shí)施方案中，本文所述的相對(duì)于目標(biāo)靶寡核苷酸具有降低量的一種或多種(N-x)產(chǎn)物的任何組合物都是未純化的。

在一些實(shí)施方案中，主題組合物包含低比率的(N-1)產(chǎn)物與靶寡核苷酸產(chǎn)物。在一些情況下，低比率是相對(duì)于靶寡核苷酸少于(N-1)產(chǎn)物的(2.0x N)重量份至100重量份，其中N是指靶寡核苷酸序列中的核苷酸殘基的數(shù)目。在某些實(shí)施方案中，所述比率是相對(duì)于靶寡核苷酸少于(N-1)產(chǎn)物的(1.9x N)重量份至100重量份，如相對(duì)于靶寡核苷酸少于(N-1)產(chǎn)物的(1.8x N)重量份至100重量份、少于(1.7x N)重量份至100重量份、少于(1.6x N)重量份至100重量份、少于(1.5x N)重量份至100重量份、少于(1.4x N)重量份至100重量份、少于(1.3x N)重量份至100重量份、少于(1.2x N)重量份至100重量份、少于(1.1x N)重量份至100重量份、少于(1.0x N)重量份至100重量份、少于(0.9x N)重量份至100重量份、少于(0.8x N)重量份至100重量份、少于(0.7x N)重量份至100重量份、少于(0.6x N)重量份至100重量份、少于(0.5x N)重量份至100重量份、少于(0.4x N)重量份至100重量份、少于(0.3x N)重量份至100重量份、少于(0.2x N)重量份至100重量份，或甚至少于(0.1x N)重量份至100重量份。在某些實(shí)施方案中，主題組合物包括相對(duì)于靶寡核苷酸少于(N-1)產(chǎn)物的(1.5x N)重量份至100重量份的低比率。在某些實(shí)施方案中，主題組合物包括相對(duì)于靶寡核苷酸少于(N-1)產(chǎn)物的(1.2x N)重量份至100重量份的低比率。在某些實(shí)施方案中，主題組合物包括相對(duì)于靶寡核苷酸少于(N-1)產(chǎn)物的(1.0x N)重量份至100重量份的低比率。在某些實(shí)施方案中，主題組合物包括相對(duì)于靶寡核苷酸少于(N-1)產(chǎn)物的(0.5x N)重量份至100重量份的低比率。

在一些實(shí)施方案中，主題組合物包含低比率的(N-2)產(chǎn)物與靶寡核苷酸產(chǎn)物。在一些情況下，低比率是相對(duì)于靶寡核苷酸少于(N-2)產(chǎn)物的(2.0x N)重量份至100重量份，其中N是指靶寡核苷酸序列中的核苷酸殘基的數(shù)目。在某些實(shí)施方案中，所述比率是相對(duì)于靶寡核苷酸少于(N-2)產(chǎn)物的(1.9x N)重量份至100重量份，如相對(duì)于靶寡核苷酸少于(N-2)產(chǎn)物的(1.8x N)重量份至100重量份、少于(1.7x N)重量份至100重量份、少于(1.6x N)重量份至100重量份、少于(1.5x N)重量份至100重量份、少于(1.4x N)重量份至100重量份、少于(1.3x N)重量份至100重量份、少于(1.2x N)重量份至100重量份、少于(1.1x N)重量份至100重量份、少于(1.0x N)重量份至100重量份、少于(0.9x N)重量份至100重量份、少于(0.8x N)重量份至100重量份、少于(0.7x N)重量份至100重量份、少于(0.6x N)重量份至100重量份、少于(0.5x N)重量份至100重量份、少于(0.4x N)重量份至100重量份、少于(0.3x N)重量份至100重量份、少于(0.2x N)重量份至100重量份，或甚至少于(0.1x N)重量份至100重量份。在某些實(shí)施方案中，主題組合物包括相對(duì)于靶寡核苷酸少于(N-2)產(chǎn)物的(1.5x N)重量份至100重量份的低比率。在某些實(shí)施方案中，主題組合物包括相對(duì)于靶寡核苷酸少于(N-2)產(chǎn)物的(1.2x N)重量份至100重量份的低比率。在某些實(shí)施方案中，主題組合物包括相對(duì)于靶寡核苷酸少于(N-1)產(chǎn)物的(1.0x N)重量份至100重量份的低比率。在某些實(shí)施方案中，主題組合物包括相對(duì)于靶寡核苷酸少于(N-2)產(chǎn)物的(0.5x N)重量份至100重量份的低比率。

在一些實(shí)施方案中，主題組合物包括的(N-1)產(chǎn)物的量是組合物中的總非靶寡核苷酸的20％或更少，如總非靶寡核苷酸的15％或更少、10％或更少，或甚至5％或更少。

可使用本文所述的方法制備多種多樣的寡核苷酸組合物中的任一種。多種類別和類型的寡核苷酸是使用主題方法(例如如本文所述)制備所關(guān)注。適于根據(jù)主題方法制備的寡核苷酸包括但不限于反義寡核苷酸、RNA寡核苷酸、siRNA寡核苷酸、RNAi寡核苷酸、DNA適體、微小RNA等。

與端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的寡核苷酸

本公開的方面包括包含與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的寡核苷酸的化合物和組合物及其制備方法?；衔锟梢愿咝芤种萍?xì)胞中的端粒酶活性，且具有細(xì)胞攝取特征。

如上所概述，主題方法提供合成的非靶寡核苷酸產(chǎn)物的量降低。在某些情況下，主題方法提供合成的靶寡核苷酸產(chǎn)物的量增加。在一些實(shí)施方案中，主題方法提供制備相對(duì)于目標(biāo)靶寡核苷酸具有降低量的一種或多種(N-x)產(chǎn)物的組合物。表1闡述一些非靶寡核苷酸產(chǎn)物的目標(biāo)量。

在某些實(shí)施方案中，本文所述的相對(duì)于目標(biāo)靶寡核苷酸具有降低量的一種或多種(N-x)產(chǎn)物的任何組合物都是未純化的。

表1.目標(biāo)組合物中的寡核苷酸產(chǎn)物水平。主題組合物可包含在表1中指示的一種水平下的一種或多種以下組分。

在某些實(shí)施方案中，所述組合物具有相對(duì)于化合物少于(2.0x N)重量份至100重量份的(N-1)產(chǎn)物，其中所述化合物包括具有N個(gè)與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的核苷亞基的序列的多核苷酸，其中至少兩個(gè)核苷亞基通過N3′→P5′硫代磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)連接。在某些實(shí)施方案中，所述比率是相對(duì)于N產(chǎn)物少于(N-1)產(chǎn)物的(1.9x N)重量份至100重量份，如相對(duì)于N產(chǎn)物少于(N-1)產(chǎn)物的(1.8x N)重量份至100重量份、少于(1.7x N)重量份至100重量份、少于(1.6x N)重量份至100重量份、少于(1.5x N)重量份至100重量份、少于(1.4x N)重量份至100重量份、少于(1.3x N)重量份至100重量份、少于(1.2x N)重量份至100重量份、少于(1.1x N)重量份至100重量份、少于(1.0x N)重量份至100重量份、少于(0.9x N)重量份至100重量份、少于(0.8x N)重量份至100重量份、少于(0.7x N)重量份至100重量份、少于(0.6x N)重量份至100重量份、少于(0.5x N)重量份至100重量份、少于(0.4x N)重量份至100重量份、少于(0.3x N)重量份至100重量份、少于(0.2x N)重量份至100重量份，或甚至少于(0.1x N)重量份至100重量份。

在一些實(shí)施方案中，所述組合物具有相對(duì)于化合物少于4重量份中1重量份的(N-1)產(chǎn)物(如相對(duì)于化合物少于5重量份中1重量份、少于6重量份中1重量份、少于7重量份中1重量份、少于8重量份中1重量份、少于9重量份中1重量份、少于10重量份中1重量份、少于15重量份中1重量份、少于20重量份中1重量份、少于25重量份中1重量份、少于50重量份中1重量份、少于100重量份中1重量份的(N-1)產(chǎn)物)，其中所述化合物包含具有10個(gè)或更多個(gè)與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的核苷亞基的序列的多核苷酸，其中至少兩個(gè)核苷亞基通過N3′→P5′硫代磷酰胺酯或氧代磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)連接。在某些實(shí)施方案中，多核苷酸具有10個(gè)或更多個(gè)與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的核苷亞基，如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個(gè)或更多個(gè)核苷亞基的序列。

在某些情況下，多核苷酸包括13個(gè)或更多個(gè)與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的核苷亞基，如15個(gè)或更多個(gè)、20個(gè)或更多個(gè)、30個(gè)或更多個(gè)、50個(gè)或更多個(gè)與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的核苷亞基的序列。

在某些實(shí)施方案中，多核苷酸包括具有7個(gè)或更多個(gè)與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的核苷亞基，如7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個(gè)與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的核苷亞基的序列。在某些實(shí)施方案中，多核苷酸包括具有在11個(gè)與18個(gè)之間的與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的核苷亞基，如在11個(gè)與16個(gè)之間的與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的連續(xù)核苷亞基的序列。

在一些實(shí)施方案中，多核苷酸包括在3個(gè)與50個(gè)之間的與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的連續(xù)核苷亞基，如在5個(gè)與40個(gè)之間、在10個(gè)與40個(gè)之間、在10個(gè)與30個(gè)之間、在10個(gè)與25個(gè)之間、在10個(gè)與20個(gè)之間或在12個(gè)與15個(gè)之間的核苷亞基。在某些實(shí)施方案中，寡核苷酸包括具有10個(gè)或更多個(gè)與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的連續(xù)核苷亞基的序列。在某些實(shí)施方案中，組合物具有相對(duì)于化合物少于10重量份中1重量份的(N-1)產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，組合物具有相對(duì)于化合物少于20重量份中1重量份的(N-1)產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，組合物具有相對(duì)于化合物少于25重量份中1重量份的(N-1)產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，組合物具有相對(duì)于化合物少于30重量份中1重量份的(N-1)產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，組合物具有相對(duì)于化合物少于50重量份中1重量份的(N-1)產(chǎn)物。

在一些實(shí)施方案中，組合物具有相對(duì)于化合物少于4重量份中1重量份的任何(N-x)產(chǎn)物，如相對(duì)于化合物少于5重量份中1重量份、少于6重量份中1重量份、少于7重量份中1重量份、少于8重量份中1重量份、少于9重量份中1重量份、少于10重量份中1重量份、少于20重量份中1重量份、少于25重量份中1重量份、少于30重量份中1重量份，或甚至少于50重量份中1重量份的任何(N-x)產(chǎn)物。

在一些實(shí)施方案中，組合物具有相對(duì)于化合物少于總共100重量份中40重量份的(N-x)含多核苷酸產(chǎn)物，如相對(duì)于化合物少于100重量份中35重量份、少于100重量份中30重量份、少于100重量份中25重量份、少于100重量份中20重量份，或甚至少于100重量份中15重量份的(N-x)含多核苷酸產(chǎn)物。

在一些實(shí)施方案中，組合物具有相對(duì)于化合物至少100重量份中5重量份的(N-2)和(N-3)產(chǎn)物，如相對(duì)于化合物至少100重量份中10重量份、至少100重量份中12重量份、至少100重量份中14重量份、至少100重量份中15重量份、至少100重量份中20重量份、至少100重量份中30重量份，或至少100重量份中40重量份的(N-2)和(N-3)產(chǎn)物。

在一些實(shí)施方案中，組合物具有(N-x)含多核苷酸產(chǎn)物的以下概況：

相對(duì)于N產(chǎn)物少于4重量份中1重量份的(N-1)產(chǎn)物；以及相對(duì)于N產(chǎn)物至少100重量份中10重量份的(N-2)和(N-3)產(chǎn)物。

在某些實(shí)施方案中，寡核苷酸N產(chǎn)物包含在(N-1)產(chǎn)物中不存在的3’-末端核苷亞基。

寡核苷酸化合物可描述為下式：

O-(x′-L′)_n

其中O表示包含具有與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的核苷亞基的序列的寡核苷酸，x′是任選的接頭基團(tuán)，L′表示脂質(zhì)部分，并且n是1-5的整數(shù)。

因此，化合物的設(shè)計(jì)需要選擇兩種實(shí)體O和L′，以及確定這些實(shí)體之間的結(jié)構(gòu)鍵聯(lián)，這可涉及任選的接頭基團(tuán)x′。

在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸化合物可描述為下式：

O-(x′-L′)_n

其中O表示包含具有與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的核苷亞基的序列的寡核苷酸，x′是任選的接頭基團(tuán)，L′表示脂質(zhì)部分，并且n是1，如式(I)寡核苷酸或其鹽，其中在式(I)中，Z是脂質(zhì)部分，L是任選的接頭，并且B基團(tuán)對(duì)應(yīng)于具有與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的核苷亞基的序列。

寡核苷酸組分O可視為化合物的“效應(yīng)物”組分，因?yàn)榇私M分通過結(jié)合端粒酶的RNA組分來實(shí)現(xiàn)對(duì)端粒酶的抑制。因此，選擇O的序列以使其包含與端粒酶RNA的序列(其示于SEQ ID NO:1中)互補(bǔ)的區(qū)域。在理論上可使與端粒酶RNA組分互補(bǔ)的區(qū)域靶向端粒酶RNA的任何部分，但端粒酶RNA的特定區(qū)域是抑制性寡核苷酸的優(yōu)選靶標(biāo)。一個(gè)優(yōu)選靶區(qū)域是跨越SEQ ID NO:1的核苷酸30-67的區(qū)域，其包括“模板區(qū)域”，即具有跨越SEQ ID NO:1的核苷酸46-56的序列5′-CUAACCCUAAC-3′(SEQ ID NO:2)的11個(gè)核苷酸的區(qū)域。模板區(qū)域起指定端粒酶添加至染色體末端且是端粒酶的活性所必需的端粒重復(fù)序列的作用(參見Chen等人,Cell 100:503-514,2000；Kim等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 98(14):7982-7987,2001)。因此，含有包含與模板區(qū)域的全部或一部分互補(bǔ)的序列的寡核苷酸部分的本發(fā)明化合物是特別優(yōu)選的。另一優(yōu)選靶區(qū)域是跨越hTR的核苷酸137-179的區(qū)域(參見Pruzan等人,Nucl.Acids Research,30:559-588,2002)。在此區(qū)域內(nèi)，跨越141-153的序列是優(yōu)選靶標(biāo)。PCT公布WO 98/28442描述長(zhǎng)度是至少7個(gè)核苷酸的寡核苷酸抑制端粒酶的用途，其中寡核苷酸被設(shè)計(jì)為與hTR序列的在模板區(qū)域外部的可及部分互補(bǔ)，包括hTR的核苷酸137-196、290-319和350-380。

O的靶向hTR序列的區(qū)域優(yōu)選精確互補(bǔ)于相應(yīng)hTR序列。盡管可容忍錯(cuò)配，但在某些實(shí)例中，預(yù)期其會(huì)降低所得寡核苷酸綴合物的特異性和活性。在具體實(shí)施方案中，因此選擇寡核苷酸O的堿基序列以包括具有至少5個(gè)與端粒酶RNA精確互補(bǔ)的核苷酸的序列，并且如果采用長(zhǎng)度增加的互補(bǔ)序列，如至少8個(gè)、至少10個(gè)、至少12個(gè)、至少13個(gè)或至少15個(gè)與端粒酶RNA精確互補(bǔ)的核苷酸，則可獲得增強(qiáng)的端粒酶抑制。在其他實(shí)施方案中，寡核苷酸的序列包括具有至少5個(gè)至20個(gè)、至少8個(gè)至20個(gè)、至少10個(gè)至20個(gè)或至少10個(gè)至15個(gè)與端粒酶RNA序列精確互補(bǔ)的核苷酸的序列。當(dāng)寡核苷酸O的全長(zhǎng)被選擇為與端粒酶RNA互補(bǔ)時(shí)，可獲得最佳端粒酶抑制活性。然而，寡核苷酸組分的全長(zhǎng)不必精確互補(bǔ)于靶序列，并且寡核苷酸序列可包括不互補(bǔ)于靶序列的區(qū)域?？商砑舆@些區(qū)域例如以對(duì)化合物賦予其他性質(zhì)，所述區(qū)域如有助于純化的序列。如果寡核苷酸組分O欲包括不與靶序列互補(bǔ)的區(qū)域，則此類區(qū)域可位于5′末端或3′-末端中的一者或兩者。在使具有精確互補(bǔ)性的區(qū)域靶向模板區(qū)域的情況下，可用在5′末端連接有端粒酶樣(富含G)序列的具有精確互補(bǔ)性的短(5-8個(gè)核苷酸)區(qū)域?qū)崿F(xiàn)有效端粒酶抑制。

與人端粒酶RNA互補(bǔ)且可作為寡核苷酸組分O的一部分包括或可用作整個(gè)寡核苷酸組分O的示例性序列包括以下：

hTR互補(bǔ)序列(美國公布2012329858的寡核苷酸序列SEQ ID NO:1的區(qū)域)

GGGUUGCGGAGGGUGGGCCU GGGAGGGGUG GUGGCCAUUU UUUGUCUAACCCUAACUGAG AAGGGCGUAG GCGCCGUGCU UUUGCUCCCC GCGCGCUGUUUUUCUCGCUG ACUUUCAGCG GGCGGAAAAG CCUCGGCCUG CCGCCUUCCACCGUUCAUUC UAGAGCAAAC AAAAAAUGUC AGCUGCUGGC CCGUUCGCCCCUCCCGGGGA CCUGCGGCGG GUCGCCUGCC CAGCCCCCGA ACCCCGCCUGGAGGCCGCGG UCGGCCCGGG GCUUCUCCGG AGGCACCCAC UGCCACCGCGAAGAGUUGGG CUCUGUCAGC CGCGGGUCUC UCGGGGGCGA GGGCGAGGUUCAGGCCUUUC AGGCCGCAGG AAGAGGAACG GAGCGAGUCC CCGCGCGCGGCGCGAUUCCC UGAGCUGUGG GACGUGCACC CAGGACUCGG CUCACACAUGC(SEQ ID NO:1)

GCTCTAGAATGAACGGTGGAAGGCGGCAGG 137-166(SEQ ID NO:6)

GTGGAAGGCGGCAGG 137-151(SEQ ID NO:7)

GGAAGGCGGCAGG 137-149(SEQ ID NO:8)

GTGGAAGGCGGCA 139-151(SEQ ID NO:9)

GTGGAAGGCGG 141-151(SEQ ID NO:10)

CGGTGGAAGGCGG 141-153(SEQ ID NO:11)

ACGGTGGAAGGCG 142-154(SEQ ID NO:12)

AACGGTGGAAGGCGGC 143-155(SEQ ID NO:13)

ATGAACGGTGGAAGGCGG 144-158(SEQ ID NO:14)

ACATTTTTTGTTTGCTCTAG 160-179(SEQ ID NO:15)

TAGGGTTAGACAA 42-54(SEQ ID NO:3)

GTTAGGGTTAG 46-56(SEQ ID NO:4)

GTTAGGGTTAGAC 44-56(SEQ ID NO:16)

GTTAGGGTTAGACAA 42-56(SEQ ID NO:17)

GGGTTAGAC 44-52

CAGTTAGGG 50-58

CCCTTCTCAGTT 54-65(SEQ ID NO:18)

CGCCCTTCTCAG 56-67(SEQ ID NO:19)

在一些實(shí)施方案中，多核苷酸包含選自由以下組成的組的序列：GTTAGGGTTAG(SEQ ID NO:4)；TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO:3)；以及CAGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO:5)。

O組分的合成中使用的核苷間鍵聯(lián)的類型可選自任何可用的寡核苷酸化學(xué)，包括但不限于磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、P3′→N5′磷酰胺酯、N3′→P5′磷酰胺酯、N3′→P5′硫代磷酰胺酯以及硫代磷酸酯鍵聯(lián)。

在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸組分O具有至少一個(gè)N3′→P5′磷酰胺酯(例如N3′→P5′硫代磷酰胺酯)鍵聯(lián)。在某些實(shí)施方案中，與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的核苷亞基均通過N3′→P5′磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)連接。在某些情況下，N3′→P5′磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)是N3′→P5′硫代磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)。在某些情況下，N3′→P5′磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)是N3′→P5′氧代-磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)。

在某些情況下，N3′→P5′硫代磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)具有以下結(jié)構(gòu)：

3′—NH—P(S)(OR)—O—5’

其中R選自由以下組成的組：氫、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基和磷酸酯保護(hù)基。應(yīng)理解包含通過上式所述的亞基間鍵聯(lián)的一些寡核苷酸組分O也可以鹽形式存在，其中R選自由氫、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基和磷酸酯保護(hù)基組成的組。此類形式只要其可存在就意圖包括在本公開的范圍內(nèi)。

在一些實(shí)例中，N3′→P5′硫代磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)描述為以下結(jié)構(gòu)：

3′—NH—P(S)(OR)—O—5’

其中R是氫。應(yīng)理解對(duì)于本文所述的包含這種亞基間鍵聯(lián)的任何寡核苷酸組分O，此類寡核苷酸組分O也可包括鍵聯(lián)的任何適宜的鹽形式。因此，亞基間鍵聯(lián)可呈包括任何適宜的抗衡離子的鹽形式。

本發(fā)明化合物在于細(xì)胞中產(chǎn)生端粒酶抑制方面比未綴合于脂質(zhì)組分的相應(yīng)寡核苷酸更有效。據(jù)信脂質(zhì)組分L′起增強(qiáng)化合物的細(xì)胞攝取的作用，特別是在促進(jìn)穿過細(xì)胞膜方面。盡管這種情況發(fā)生的機(jī)制尚未完全闡明，但一種可能性是脂質(zhì)組分可促進(jìn)化合物與細(xì)胞膜結(jié)合成單一分子或聚集體(微胞)形式，隨后進(jìn)行內(nèi)化。然而，將要利用的發(fā)明并不需要對(duì)精確機(jī)制的理解。

脂質(zhì)組分可以是相對(duì)于未修飾的寡核苷酸，提供增強(qiáng)的細(xì)胞攝取的任何脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物。優(yōu)選的脂質(zhì)是烴、脂肪(例如甘油酯、脂肪酸和脂肪酸衍生物，如脂肪酰胺)和固醇。當(dāng)脂質(zhì)組分是烴時(shí)，L′組分可以是取代的或未取代的環(huán)烴或脂族直鏈或支鏈烴，所述烴可以是飽和或不飽和的。優(yōu)選的實(shí)例是完全飽和或多不飽和的直鏈未分支烴。烴鏈的長(zhǎng)度可自C2-C30變化，但最佳端粒酶抑制可用C8-C22碳鏈獲得。以下列出飽和烴(烷烴)的優(yōu)選實(shí)例：

系統(tǒng)名稱/碳鏈

十四烷C₁₄H₃₀

十五烷C₁₅H₃₂

十六烷C₁₆H₃₄

十七烷C₁₇H₃₆

十八烷C₁₈H₃₈

十九烷C₁₉H₄₀

二十烷C₂₀H₄₂

還可選擇烴的單不飽和及多不飽和形式(烯烴和多烯，如二烯烴和三烯烴)，其中具有一個(gè)至三個(gè)雙鍵的化合物是優(yōu)選的，但可采用具有更多雙鍵的化合物。也可利用炔烴(含有一個(gè)或多個(gè)三鍵)和烯炔(三鍵和雙鍵)。

烴的取代的形式可用于本發(fā)明化合物中，其中在體內(nèi)和在體外為惰性的取代基是優(yōu)選的。特別優(yōu)選的取代基是氟。多氟化烴的示例性通用結(jié)構(gòu)包括：CF₃(CF₂)_n—(CH₂)_m-其中m是至少1，優(yōu)選至少2，并且n＝1-30，如氟十三烷：CF₃(CF₂)₉(CH₂)₃；以及CH₃(CH₂)_n(CF₂)_b(CH₂)_c-其中a、b和c獨(dú)立地是1-30。

其他適合的脂質(zhì)組分包括簡(jiǎn)單脂肪酸和脂肪酸衍生物、甘油酯以及更復(fù)雜的脂質(zhì)，如固醇，例如膽固醇。脂肪酸及其衍生物可以是完全飽和的或單不飽和或多不飽和的。碳鏈的長(zhǎng)度可自C2-C30變化，但最佳端粒酶抑制可用C8-C22碳鏈獲得。以下列出飽和脂肪酸的優(yōu)選實(shí)例：

系統(tǒng)名稱/俗名/碳鏈

十四烷酸肉豆蔻酸14:0

十六烷酸棕櫚酸16:0

十八烷酸硬脂酸18:0

二十烷酸花生酸20:0

也可采用脂肪酸的單不飽和及多不飽和形式，其中具有一個(gè)至三個(gè)雙鍵的化合物是優(yōu)選的，但也可采用具有更多雙鍵的化合物。可采用的常見單不飽和及多不飽和脂肪酸的實(shí)例包括：

系統(tǒng)名稱/俗名/碳鏈

順式-9-十六烷酸棕櫚油酸16:1(n-7)

順式-6-十八烷酸巖芹酸18:1(n-12)

順式-9-十八烷酸油酸18:1(n-9)

9,12-十八碳二烯酸亞油酸18:2(n-6)

6,9,12-十八碳三烯酸γ-亞油酸18:3(n-6)

9,12,15-十八碳三烯酸α-亞油酸18:3(n-3)

5,8,11,14-二十碳四烯酸花生四烯酸20:4(n-6)

在碳鏈中具有一個(gè)或多個(gè)三鍵的脂肪酸以及分支脂肪酸也可用于本發(fā)明化合物中。脂肪酸的取代形式可用于本發(fā)明化合物中。如同烴基團(tuán)，在體內(nèi)和在體外為惰性的取代基是優(yōu)選的，其中氟是特別優(yōu)選的。適用于本發(fā)明中的脂肪酸的多氟化衍生物的示例性通用結(jié)構(gòu)是：CF₃(CF₂)_n—(CH₂)_mCO—其中m是至少1，優(yōu)選至少2，且n＝1-30；以及CH₃(CH₂)_a(CF₂)_b(CH₂)_cCO—，其中a、b和c獨(dú)立地是1-30

在一些情況下，在一個(gè)與五個(gè)之間的L′組分(n＝1-5)任選地經(jīng)由接頭共價(jià)連接于O組分。更通常地，利用1個(gè)或2個(gè)L′組分(n＝1或2)。當(dāng)多于一個(gè)L′組分連接于O組分時(shí)，各L′組分獨(dú)立地加以選擇。

應(yīng)理解描述為具有指定烴作為L(zhǎng)′部分的本發(fā)明化合物和描述為具有指定脂肪酸(具有與指定烴相同的碳原子數(shù)目)的化合物是密切相關(guān)的，并且僅在使L′部分連接于寡核苷酸的鍵的性質(zhì)方面而在結(jié)構(gòu)上不同，這進(jìn)而是用于產(chǎn)生化合物的合成程序的結(jié)果。例如，并且如以下更詳細(xì)所描述，當(dāng)合成具有結(jié)合于寡核苷酸(具有磷酰胺酯或硫代磷酰胺酯核苷間鍵聯(lián))的3′-氨基末端的L′部分的化合物時(shí)，使用脂肪酸的醛形式(脂肪醛)作為起始物質(zhì)導(dǎo)致在脂質(zhì)鏈與寡核苷酸之間形成胺鍵聯(lián)，以使脂質(zhì)基團(tuán)以烴形式呈現(xiàn)。相反，使用相同脂肪酸的羧酸、酸酐或酰氯形式導(dǎo)致形成酰胺酯鍵聯(lián)，以使脂質(zhì)基團(tuán)以脂肪酸衍生物形式呈現(xiàn)，具體地在此實(shí)例中以脂肪酰胺形式呈現(xiàn)(如以上定義章節(jié)中所指示，為簡(jiǎn)單起見，術(shù)語“脂肪酸”在描述綴合的L′基團(tuán)時(shí)在本文中廣泛用于包括脂肪酸衍生物，包括脂肪酰胺)。這說明于描繪磷酰胺酯寡核苷酸的3′-氨基末端連接于C14脂質(zhì)組分的以下示意圖中。在示意圖A中，L′是十四烷酸(肉豆蔻酸)，其中L′基團(tuán)與O基團(tuán)之間的連接是酰胺。在示意圖B中，L′是十四烷，且L′基團(tuán)與O基團(tuán)之間的連接是胺。

O組分與L′組分之間的鍵聯(lián)可以是直接鍵聯(lián)，或可經(jīng)由任選的接頭部分，例如x′或式(I)的任選接頭。接頭基團(tuán)可用于促進(jìn)化合物的化學(xué)合成。無論接頭基團(tuán)是否用于介導(dǎo)O組分和L′組分的綴合，在寡核苷酸組分O上均存在L′組分可適宜地綴合的多個(gè)位點(diǎn)。適合鍵聯(lián)點(diǎn)包括寡核苷酸的5′和3′末端、一個(gè)或多個(gè)糖環(huán)、核苷間主鏈和核堿基。在一些情況下，L′部分連接于寡核苷酸的3′或5′末端。

如果L′組分待連接于3′末端，則可直接連接于3′取代基，在優(yōu)選磷酰胺酯和硫代磷酰胺酯寡核苷酸的情況下，所述3′取代基是3′-氨基，并且在如常規(guī)磷酸二酯寡核苷酸的其他實(shí)例中，所述3′取代基是3-羥基?；蛘撸琇′部分可經(jīng)由3′-連接的磷酸酯基團(tuán)連接，其中十六烷烴通過O-烷基接頭連接于硫代磷酰胺酯寡核苷酸的3′磷酸酯。如果L′部分待連接于5′末端，則其可通過5′-連接的磷酸酯基團(tuán)連接。與O部分上的堿基連接可通過任何適合的原子實(shí)現(xiàn)，例如與鳥苷的N2氨基連接。當(dāng)n>1以使得多個(gè)脂質(zhì)部分待連接于O組分時(shí)，單獨(dú)選擇的L′組分可連接在任何適合的位點(diǎn)處。例如，一個(gè)L′基團(tuán)可連接于各末端，各種L′基團(tuán)可連接于堿基，或兩個(gè)或更多個(gè)L′基團(tuán)可連接在一個(gè)末端。

任選的接頭組分x′可用于連接化合物的O組分和L′組分。應(yīng)理解任選的接頭(例如，x′或式(I)的L)可通過末端磷酸酯基團(tuán)，例如3’-連接的或5’-連接的磷酸酯基團(tuán)連接于多核苷酸(例如O)。如果待采用接頭，則將其并入如本文所述的合成程序中。適合接頭基團(tuán)的實(shí)例包括分別可由以下通用結(jié)構(gòu)描繪的氨基甘油和O-烷基甘油型接頭：

其中R′＝H、OH、NH₂或SH；Y＝O、S或NR；R＝H、烷基或取代的烷基；并且n和m獨(dú)立地是1-18之間的整數(shù)。

適合接頭的具體實(shí)例是氨基甘油接頭，其中R′＝OH，Y＝O，并且m和n各自是1：

雙-氨基甘油接頭，其中R′＝OH，Y＝NH，并且m和n各自是1：

以及O-烷基甘油接頭，其中R＝H：

可根據(jù)主題方法制備的示例性脂質(zhì)修飾的寡核苷酸包括Gryaznov等人的美國申請(qǐng)US20120329858“Modified oligonucleotides for telomerase inhibition”的圖1(例如圖1A-1DD)中所述的那些化合物，所述申請(qǐng)的公開內(nèi)容以引用的方式整體并入本文。

在某些實(shí)施方案中，所述組合物包含描述為以下結(jié)構(gòu)的化合物：

其中“nps”表示使一個(gè)核苷的3'-碳連接于相鄰核苷的5'-碳的硫代磷酰胺酯鍵聯(lián)(例如—NH—P(＝O)(SH)—O—)。

應(yīng)理解關(guān)于化合物的所有實(shí)施方案均可適用于所述化合物的鹽形式。

在某些實(shí)施方案中，所述組合物包含描述為以下結(jié)構(gòu)的化合物：

或其鹽；

其中“nps”表示使一個(gè)核苷的3'-碳連接至相鄰核苷的5'-碳的硫代磷酰胺酯鍵聯(lián)(例如—NH—P(＝O)(SH)—O—或其互變異構(gòu)體或其鹽)。在某些實(shí)施方案中，所述組合物包含所述化合物的藥學(xué)上可接受的鹽。在某些實(shí)例中，所述組合物包含所述化合物的鈉鹽。在某些實(shí)施方案中，所述組合物包含所述化合物的二價(jià)陽離子鹽，如所述化合物的鎂鹽。在某些實(shí)施方案中，所述組合物包含所述化合物的三價(jià)陽離子鹽，如所述化合物的鋁鹽。

在某些實(shí)施方案中，所述組合物包含描述為以下結(jié)構(gòu)的寡核苷酸，其中各M^x+獨(dú)立地是氫或鹽的任何適宜的抗衡離子，各x獨(dú)立地是1、2或3，且n是5至13的整數(shù)，如5、6、7、8、9、10、11、12或13，如n是13：

在某些實(shí)例中，各x是1。在某些實(shí)例中，各x獨(dú)立地是1或2。在某些實(shí)例中，各x獨(dú)立地是1或3。在某些實(shí)例中，M^x+是氫。

在某些實(shí)施方案中，所述組合物包含描述為以下結(jié)構(gòu)的寡核苷酸，并且可包含鹽的任何適宜的陽離子抗衡離子：

在某些實(shí)施方案中，所述組合物包含描述為以下結(jié)構(gòu)的化合物：

還提供包括含寡核苷酸化合物的化合物活性藥物成分組合物。如本文所用，活性藥物成分是指使用主題制備方法產(chǎn)生的組合物，其中所述組合物可任選地在合成后經(jīng)受一個(gè)或多個(gè)進(jìn)一步純化步驟。一般而言，活性藥物成分是適于配制成藥物組合物的組合物。在一些情況下，在合成后不純化化合物活性藥物成分組合物，以使得所述組合物的含寡核苷酸組分反映在寡核苷酸合成期間產(chǎn)生的那些產(chǎn)物。

在一些實(shí)施方案中，化合物活性藥物成分具有少于9重量％的(N-1)產(chǎn)物，其中化合物包含具有10個(gè)或更多個(gè)與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的核苷亞基的序列的多核苷酸，其中至少兩個(gè)核苷亞基通過N3′→P5′硫代磷酰胺酯或氧代磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)(例如如本文所述)連接。

在一些實(shí)施方案中，化合物活性藥物成分具有少于9重量％的(N-1)產(chǎn)物，其中化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽包含具有10個(gè)或更多個(gè)與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的核苷亞基的序列的多核苷酸，其中至少兩個(gè)核苷亞基通過N3′→P5′硫代磷酰胺酯或氧代磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)(例如如本文所述)連接。

在所述化合物活性藥物成分的一些實(shí)施方案中，與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的核苷亞基均通過N3′→P5′硫代磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)連接。

在所述化合物活性藥物成分的一些實(shí)施方案中，N3′→P5′硫代磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)具有以下結(jié)構(gòu)：

3′—NH—P(S)(OR)—O—5’

其中R選自由以下組成的組：氫、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基和磷酸酯保護(hù)基。當(dāng)R選自由氫、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基和磷酸酯保護(hù)基組成的組時(shí)，應(yīng)理解由上式所述的一些亞基間鍵聯(lián)也可以鹽形式存在。此類形式只要其可存在就意圖包括在本公開的范圍內(nèi)。

在所述化合物活性藥物成分的一些實(shí)施方案中，N3′→P5′硫代磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)具有以下結(jié)構(gòu)：

3′—NH—P(S)(OR)—O—5’

其中R是氫。應(yīng)理解對(duì)于本文所述的包含這種亞基間鍵聯(lián)的任何化合物活性藥物成分，這種化合物活性藥物成分也可包括鍵聯(lián)的任何適宜的藥學(xué)上可接受的鹽形式。因此，亞基間鍵聯(lián)可呈包括鹽的任何適宜的抗衡離子的藥學(xué)上可接受的鹽形式。

在所述化合物活性藥物成分的一些實(shí)施方案中，多核苷酸包含在10個(gè)與50個(gè)之間的與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的連續(xù)核苷亞基(例如如本文所述)。

在所述化合物活性藥物成分的一些實(shí)施方案中，多核苷酸包含選自由以下組成的組的序列：GTTAGGGTTAG(SEQ ID NO:4)；TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO:3)；以及CAGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO:5)。

在所述化合物活性藥物成分的一些實(shí)施方案中，多核苷酸包含3’氨基或3’-羥基端基。在所述化合物活性藥物成分的某些實(shí)施方案中，多核苷酸包含3’氨基端基。在所述化合物活性藥物成分的某些實(shí)施方案中，多核苷酸包含3’-羥基端基。

在所述化合物活性藥物成分的一些實(shí)施方案中，所述化合物具有結(jié)構(gòu)：

其中“nps”表示使一個(gè)核苷的3'-碳連接于相鄰核苷的5'-碳的硫代磷酰胺酯鍵聯(lián)—NH—P(＝O)(SH)—O—。

應(yīng)理解關(guān)于化合物活性藥物成分的所有實(shí)施方案也可適用于所述化合物活性藥物成分的鹽形式。

在所述化合物活性藥物成分的一些實(shí)施方案中，所述化合物具有結(jié)構(gòu)：

或其藥學(xué)上可接受的鹽；

其中“nps”表示使一個(gè)核苷的3'-碳連接于相鄰核苷的5'-碳的硫代磷酰胺酯鍵聯(lián)—NH—P(＝O)(SH)—O—(或其互變異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受的鹽，如本文所述)。在所述化合物活性藥物成分的某些實(shí)施方案中，組合物包含化合物的鈉鹽。在某些實(shí)施方案中，所述組合物包含所述所述化合物的二價(jià)陽離子鹽，如化合物的鎂鹽。在某些實(shí)施方案中，所述組合物包含所述化合物的三價(jià)陽離子鹽，如所述化合物的鋁鹽。

在所述化合物活性藥物成分的某些實(shí)施方案中，化合物描述為以下結(jié)構(gòu)，其中各M^x+獨(dú)立地是氫或鹽的任何適宜的抗衡離子，各x獨(dú)立地是1、2或3，且n是5至13的整數(shù)，如5、6、7、8、9、10、11、12或13，如n是13：

在某些實(shí)例中，各x是1。在某些實(shí)例中，各x獨(dú)立地是1或2。在某些實(shí)例中，各x獨(dú)立地是1或3。在某些實(shí)例中，M^x+是氫。

在所述化合物活性藥物成分的某些實(shí)施方案中，化合物描述為以下結(jié)構(gòu)，并且可包括鹽的任何適宜的陽離子抗衡離子：

在所述化合物活性藥物成分的一些實(shí)施方案中，化合物描述為以下結(jié)構(gòu)：

在一些實(shí)施方案中，化合物活性藥物成分具有少于9重量％的(N-1)產(chǎn)物，如少于8重量％、少于7重量％、少于6重量％、少于5重量％、少于4重量％、少于3重量％、少于2重量％，或甚至少于1重量％的(N-1)產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，化合物活性藥物成分具有少于5重量％的(N-1)產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，化合物活性藥物成分具有少于2重量％的(N-1)產(chǎn)物。

在一些實(shí)施方案中，活性藥物成分具有少于9重量％的任何(N-x)產(chǎn)物，如少于8重量％、少于7重量％、少于6重量％、少于5重量％、少于4重量％、少于3重量％、少于2重量％，或甚至少于1重量％的任何(N-x)產(chǎn)物。

在一些實(shí)施方案中，化合物活性藥物成分具有少于總共9重量％的(N-x)含多核苷酸產(chǎn)物，如少于總共8重量％、少于總共7重量％、少于總共6重量％、少于總共5重量％、少于總共4重量％、少于總共3重量％、少于總共2重量％，或甚至少于總共1重量％的(N-x)含多核苷酸產(chǎn)物。

在一些實(shí)施方案中，化合物活性藥物成分具有(N-x)含多核苷酸產(chǎn)物的以下概況：

相對(duì)于N產(chǎn)物少于4重量份中1重量份的(N-1)產(chǎn)物；以及

相對(duì)于N產(chǎn)物至少100重量份中10重量份的(N-2)和(N-3)產(chǎn)物。

制劑

還提供包括寡核苷酸組合物(例如如本文所述)的藥物組合物。寡核苷酸組合物(例如如本文所述)也可配制成藥物組合物以抑制與靶基因的過度表達(dá)相關(guān)的疾病病狀中的細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄或翻譯。

在一些實(shí)施方案中，藥物組合物包括于藥學(xué)上可接受的賦形劑中配制的寡核苷酸組合物(例如如本文所述)。在某些實(shí)施方案中，寡核苷酸組合物是具有少于9重量％的(N-1)產(chǎn)物的化合物活性藥物成分，其中所述化合物包含具有10個(gè)或更多個(gè)與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的核苷亞基的序列的多核苷酸，其中至少兩個(gè)核苷亞基通過N3′→P5′硫代磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)連接。

本發(fā)明提供可特異性且有效抑制端粒酶活性并且可因此用于抑制如腫瘤細(xì)胞的端粒酶陽性細(xì)胞的增殖的化合物。非常廣泛的癌細(xì)胞已顯示呈端粒酶陽性，包括來自以下癌癥的細(xì)胞：皮膚癌、結(jié)締組織癌、脂肪癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮癌、腎癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)癌、視網(wǎng)膜癌以及血液學(xué)腫瘤(如骨髓瘤、白血病和淋巴瘤)。目標(biāo)癌癥包括但不限于骨髓纖維化、血小板增多癥、脊髓發(fā)育不良綜合征和骨髓性白血病。

主題化合物可用于治療血液學(xué)惡性腫瘤和骨髓增生性病癥，包括但不限于特發(fā)性血小板增多癥(ET)、真性紅細(xì)胞增多癥(PV)、慢性骨髓性白血病(CML)、骨髓纖維化(MF)、慢性嗜中性粒細(xì)胞白血病、慢性嗜酸性白血病以及急性骨髓性白血病(AML)。主題化合物可用于治療骨髓發(fā)育不良綜合征，其包括如以下的疾?。弘y治性貧血、伴有母細(xì)胞過量的難治性貧血、伴有多譜系發(fā)育不良的難治性血細(xì)胞減少癥、伴有單譜系發(fā)育不良的難治性血細(xì)胞減少癥以及慢性骨髓單核細(xì)胞性白血病(CMML)。主題化合物可用于治療血液學(xué)疾病，如2013年11月15日提交的PCT專利申請(qǐng)第PCT/US13/070437號(hào)中所述的那些疾病，所述申請(qǐng)的公開內(nèi)容以引用的方式整體并入本文。

因此，本文提供的化合物廣泛適用于治療廣泛范圍的惡性腫瘤。更重要地，本發(fā)明化合物可有效提供在較高程度上區(qū)分惡性細(xì)胞與正常細(xì)胞的治療，從而避免伴隨依賴于不加區(qū)分地殺死分裂細(xì)胞的藥劑的大多數(shù)當(dāng)前化學(xué)治療方案存在的許多有害副作用。此外，本發(fā)明化合物比等效未綴合的寡核苷酸更有效，這意味著其可在較低劑量下施用，從而提供安全性增強(qiáng)和治療成本顯著降低。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是一種治療患者的癌癥的方法，所述方法包括向所述患者施用治療有效劑量的本發(fā)明化合物。包括本發(fā)明化合物的端粒酶抑制劑可連同包括手術(shù)移除原發(fā)性腫瘤、化學(xué)治療劑和放射治療的其他癌癥治療方法一起采用。因此，本發(fā)明涉及本文提供的用作藥劑的化合物和組合物。本發(fā)明還涉及本文提供的用于治療或預(yù)防上文提及的任一惡性腫瘤的化合物和組合物。

對(duì)于治療應(yīng)用，本發(fā)明化合物以治療有效量與藥學(xué)上可接受的載體一起配制。一種或多種本發(fā)明化合物(例如具有不同L′或O組分)可包括在任何給定制劑中。藥物載體可以是固體或液體。液體載體可用于制備溶液、乳液、懸浮液和加壓組合物。將化合物溶解或懸浮于藥學(xué)上可接受的液體賦形劑中。用于胃腸外施用寡核苷酸制劑的液體載體的適合實(shí)例包括水(其可含有添加劑，例如纖維素衍生物，優(yōu)選羧甲基纖維素鈉溶液)、磷酸鹽緩沖鹽水溶液(PBS)、醇(包括一元醇和多元醇，例如二醇)及其衍生物、以及油(例如分餾椰子油和花生油)。液體載體可含有其他適合的藥物添加劑，包括但不限于以下：增溶劑、懸浮劑、乳化劑、緩沖劑、增稠劑、著色劑、粘度調(diào)節(jié)劑、防腐劑、穩(wěn)定劑和滲透壓調(diào)節(jié)劑。

對(duì)于胃腸外施用化合物，載體也可以是油性酯，如油酸乙酯和肉豆蔻酸異丙酯。無菌載體適用于供胃腸外施用的無菌液體形式組合物中。

無菌液體藥物組合物、溶液或懸浮液可通過例如腹膜內(nèi)注射、皮下注射、靜脈內(nèi)或以局部方式來利用。寡核苷酸也可血管內(nèi)或經(jīng)由血管支架來施用。

用于加壓組合物的液體載體可以是鹵素化烴或其他藥學(xué)上可接受的推進(jìn)劑。這類加壓組合物也可進(jìn)行脂質(zhì)封裝以經(jīng)由吸入進(jìn)行遞送。對(duì)于通過鼻內(nèi)或支氣管內(nèi)吸入或吹入進(jìn)行的施用，寡核苷酸可配制成可接著以氣霧劑形式利用的水溶液或部分水溶液。

化合物可通過與藥學(xué)上可接受的含有活性化合物的媒介物一起配制以溶液、乳膏劑或洗劑形式局部施用。

本發(fā)明的藥物組合物可以任何可接受的劑型經(jīng)口施用，包括但不限于呈膠囊、片劑、散劑或顆粒劑形式以及呈于水或非水性介質(zhì)中的懸浮液或溶液形式的制劑。包含本發(fā)明的寡核苷酸的藥物組合物和/或制劑可包含載體、潤(rùn)滑劑、稀釋劑、增稠劑、調(diào)味劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑。在供經(jīng)口使用的片劑的情況下，通常使用的載體包括乳糖和玉米淀粉。還可添加潤(rùn)滑劑，如硬脂酸鎂。對(duì)于以膠囊形式進(jìn)行的經(jīng)口施用，適用稀釋劑包括乳糖和干燥玉米淀粉。當(dāng)需要用于口服使用的水性混懸液時(shí)，活性成分與乳化劑和混懸劑組合。必要時(shí)，還可添加某些甜味劑、調(diào)味劑或著色劑。

盡管本發(fā)明化合物具有優(yōu)異的細(xì)胞和組織滲透特征，但其可配制以提供甚至更大益處，例如于脂質(zhì)體載體中配制。使用脂質(zhì)體來促進(jìn)細(xì)胞攝取例如描述于美國專利第4,897,355號(hào)和美國專利第4,394,448號(hào)中。眾多出版物描述脂質(zhì)體的配制和制備?；衔镆部赏ㄟ^與其他滲透增強(qiáng)劑，如上述脂質(zhì)部分的未綴合形式，包括脂肪酸和其衍生物混合來配制。實(shí)例包括油酸、月桂酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、蓖麻醇酸酯、單油酸甘油酯(也稱為1-單油?；?外消旋-甘油)、二月桂酸甘油酯、辛酸、花生四烯酸、1-單癸酸甘油酯、1-十二基氮雜環(huán)庚-2-酮、?；鈮A、?；憠A、單甘油酯和二甘油酯以及其生理可接受的鹽(即油酸鹽、月桂酸鹽、癸酸鹽、肉豆蔻酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、亞油酸鹽等)。

可使用包含一種或多種滲透增強(qiáng)劑的復(fù)合制劑。例如，膽鹽可與脂肪酸組合用于制備復(fù)合制劑。示例性組合包括通常在約0.5％至2％的濃度下使用的鵝脫氧膽酸(CDCA)與通常在約0.5％至5％的濃度下使用的癸酸鈉或月桂酸鈉組合。

包含本發(fā)明的寡核苷酸的藥物組合物和/或制劑還可包含螯合劑、表面活性劑和非表面活性劑。螯合劑包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)二鈉、檸檬酸、水楊酸鹽(例如水楊酸鈉、5-甲氧基水楊酸鹽和高香草酸鹽)、膠原蛋白的N-?；苌?、月桂醇聚醚-9(laureth-9)和β-二酮的N-氨基酰基衍生物(烯胺)。表面活性劑包括例如月桂基硫酸鈉、聚氧化乙烯-9-月桂基醚和聚氧化乙烯-20-十六基醚；以及全氟化學(xué)乳液，如FC-43。非表面活性劑包括例如不飽和環(huán)脲、1-烷基-氮雜環(huán)-烷酮和1-烯基氮雜環(huán)-烷酮衍生物、以及非類固醇消炎劑，如雙氯芬酸鈉、吲哚美辛和苯基丁氮酮。

因此，在本發(fā)明的另一方面中，提供一種配制藥物組合物的方法，所述方法包括提供如本文所述的化合物，以及組合所述化合物與藥學(xué)上可接受的賦形劑。優(yōu)選地，化合物在如下定義的藥物純度下提供。方法可進(jìn)一步包括在添加賦形劑之前或之后向化合物中添加滲透增強(qiáng)劑。

藥物組合物可符合藥物純度標(biāo)準(zhǔn)。在一些情況下，對(duì)于用作藥物制劑中的活性成分，主題化合物進(jìn)行純化以離開于其中制備其的混合物中存在的反應(yīng)性或潛在免疫原性組分。

藥物組合物可以單劑量單位或多劑量單位等分和包裝。用寡核苷酸化合物治療的劑量要求隨所采用的特定組合物、施用途徑、呈現(xiàn)的癥狀的嚴(yán)重性、化合物的形式以及所治療的特定受試者而變化。

本發(fā)明的藥物組合物可以有效實(shí)現(xiàn)在臨床上合乎需要的結(jié)果的制劑和量向受試者施用。對(duì)于治療癌癥，合乎需要的結(jié)果包括腫瘤團(tuán)塊減小(如通過觸診或成像所確定；例如通過射線照相術(shù)、放射核苷酸掃描、CAT掃描或MRI)、腫瘤生長(zhǎng)速率降低、轉(zhuǎn)移形成速率降低(如例如通過對(duì)活檢試樣的組織化學(xué)分析所確定)、生物化學(xué)標(biāo)記物減少(包括如ESR的一般性標(biāo)記物和如血清PSA的腫瘤特異性標(biāo)記物)、以及生活品質(zhì)改善(如通過例如Karnofsky計(jì)分的臨床評(píng)估所確定)、進(jìn)展時(shí)間增加、無疾病存活和總體存活。

為實(shí)現(xiàn)這類作用所需的每劑量化合物的量和劑量的數(shù)目將取決于許多因素而變化，所述因素包括疾病適應(yīng)癥、所治療的患者的特征和施用模式。在一些情況下，制劑和施用途徑將提供在疾病部位處的化合物局部濃度在1μM與1nM之間。

一般而言，化合物在提供有效結(jié)果而不導(dǎo)致任何有害或不良副作用的濃度下施用。這種濃度可通過施用單一單位劑量，或通過全天在適合間隔下施用分成適宜次單位的劑量來實(shí)現(xiàn)。

效用

本發(fā)明的例如如上所述的方法和組合物適用于多種應(yīng)用中。目標(biāo)應(yīng)用包括但不限于：治療應(yīng)用、診斷應(yīng)用、研究應(yīng)用和篩檢應(yīng)用，如以下更詳細(xì)所評(píng)述。

主題化合物適用于多種治療應(yīng)用中。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生寡核苷酸的方法應(yīng)用于制備提供治療益處的寡核苷酸?？墒褂帽景l(fā)明組合物治療的疾病的類型是無限的。例如，所述組合物可用于治療許多遺傳性疾病。在一些實(shí)施方案中，主題方法和組合物具有反義應(yīng)用。在一些實(shí)施方案中，主題方法和組合物具有抗基因應(yīng)用。在某些實(shí)施方案中，主題方法和組合物具有端粒酶抑制應(yīng)用，如美國專利6,835,826和美國公布20120329858中所述的應(yīng)用，所述專利和所述公布的公開內(nèi)容以引用的方式整體并入本文。

主題化合物和方法可用于多種診斷應(yīng)用中，包括但不限于開發(fā)臨床診斷劑，例如體外診斷劑或體內(nèi)腫瘤成像劑。這些應(yīng)用適用于診斷或確認(rèn)對(duì)疾病病狀或其易感性的診斷。所述方法還適用于監(jiān)測(cè)先前已診斷有疾病的患者的疾病進(jìn)展和/或?qū)χ委煹姆磻?yīng)。

實(shí)施例

提出以下實(shí)施方案以便向本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供如何制備和使用本發(fā)明的完全公開和說明，并不意欲限制本發(fā)明人看待其發(fā)明的范圍，也不意欲表示以下實(shí)驗(yàn)是進(jìn)行的全部或僅有的實(shí)驗(yàn)。已經(jīng)努力確保相對(duì)于所用數(shù)字(例如量、溫度等)的精確性，但一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差應(yīng)加以說明。除非另外指示，否則份是重量份，分子量是重均分子量，溫度以攝氏度計(jì)，并且壓力是在大氣壓下或接近大氣壓。“平均”意指算術(shù)平均值?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)縮寫，例如，bp，堿基對(duì)；kb，千堿基；pl，微微升；s或sec，秒；min，分鐘；h或hr，小時(shí)；aa，氨基酸；kb，千堿基；bp，堿基對(duì)；nt，核苷酸；i.m.，肌肉內(nèi)(肌肉內(nèi)地)；i.p.，腹膜內(nèi)(腹膜內(nèi)地)；s.c.，皮下(皮下地)等。

一般合成程序

提供適用于合成所公開的化合物的通常已知的化學(xué)合成方案和條件的許多通用參考文獻(xiàn)是可獲得的(參見，例如Smith和March,March’s Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure,第五版,Wiley-Interscience,2001；或Vogel,A Textbook of Practical Organic Chemistry,Including Qualitative Organic Analysis,第四版,New York:Longman,1978)。

如本文所述的化合物可通過本領(lǐng)域中已知的任何純化方案純化，包括色譜，如HPLC、制備型薄層色譜、快速柱色譜和離子交換色譜?？墒褂萌魏芜m合的固定相，包括正相和反相以及離子樹脂。在某些實(shí)施方案中，公開的化合物經(jīng)由硅膠和/或氧化鋁色譜純化。參見，例如Introduction to Modern Liquid Chromatography,第2版,編輯L.R.Snyder和J.J.Kirkland,John Wiley and Sons,1979；以及Thin Layer Chromatography,E.Stahl編輯,Springer-Verlag,New York,1969。

在用于制備主題化合物的任何方法期間，可能有必要和/或需要保護(hù)所涉及的任何分子上的敏感性或反應(yīng)性基團(tuán)。這可通過如標(biāo)準(zhǔn)著作中所述的常規(guī)保護(hù)基來實(shí)現(xiàn)，所述著作如J.F.W.McOmie,“Protective Groups in Organic Chemistry”,Plenum Press,London and New York 1973；T.W.Greene和P.G.M.Wuts,“Protective Groups in Organic Synthesis”,第3版,Wiley,New York 1999；“The Peptides”；第3卷(編輯：E.Gross和J.Meienhofer),Academic Press,London and New York 1981；“Methoden der organischen Chemie”,Houben-Weyl,第4版,第15/l卷,Georg Thieme Verlag,Stuttgart 1974；H.-D.Jakubke和H.Jescheit,“Aminosauren,Peptide,Proteine”,Verlag Chemie,Weinheim,Deerfield Beach,and Basel 1982；和/或Jochen Lehmann,“Chemie der Kohlenhydrate:Monosaccharide and Derivate”,Georg Thieme Verlag,Stuttgart 1974。保護(hù)基可在適宜的隨后階段使用本領(lǐng)域中已知的方法來移除。

主題化合物可使用可商購的起始物質(zhì)和/或通過常規(guī)合成方法制備的起始物質(zhì)，經(jīng)由多種不同合成途徑來合成。在以下方案中描述可用于合成本文公開的化合物的合成途徑的多個(gè)實(shí)施例。

實(shí)施例1

使用二聚亞磷酰胺合成伊美司他鈉。

伊美司他鈉使用固體支撐物(可控孔徑玻璃或聚合物固體支撐物)和單體亞磷酰胺(如A^Bz或A^dmf、C、G^iBu和T亞磷酰胺)按以下序列合成：

5’R-TAGGGTTAGACAA-NH₂-3’(SEQ ID NO:3)，其中R＝脂質(zhì)接頭基團(tuán)

表2：亞酰胺化物和固體支撐物的結(jié)構(gòu)

伊美司他主鏈?zhǔn)穷愃朴谄鹗紒喠柞０返腘PS，且因此偶聯(lián)效率是約92％。利用二聚體亞磷酰胺使得偶聯(lián)步驟較少，這可導(dǎo)致在合成之后在中間階段的產(chǎn)率和純度較高。使用如合成方案1中所述的方法如以下所示來制備以下二聚體亞磷酰胺：

TA、AA、GA、GG和GT。

合成二聚體亞磷酰胺需要A、G和T核苷的三種單體酰胺化物(4a至4c，方案1)和三種5’-TBDMS-3’氨基核苷中間體(3a至3c，方案1)。TBDMS是叔丁基二甲基甲硅烷基。自以下兩個(gè)種類的起始物質(zhì)制備中間體(3a至3c，方案1)：5’-OH-3’-NH-Tr-2’-脫氧-N-苯甲?；佘?1a)、5’-OH-3’-NH-Tr-2’-脫氧-N-異丁?；B苷(1b)和5’-OH-3’-氨基-胸苷(2)。Tr或Trt是指三苯甲基。

使用叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物和咪唑在DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中用TBDMS基團(tuán)保護(hù)1a和1b的5’-羥基，接著通過用乙酸在水中處理來使在3’-氨基位置處的三苯甲基脫保護(hù)。使用芐基巰基四唑(BMT)作為活化劑在二甲基甲酰胺中使所得中間體3a至3c與相應(yīng)酰胺化物4a至4c偶聯(lián)，且隨后使用蒼耳烷氫化物和吡啶進(jìn)行硫化(P III至P V)(方案1)。一般而言，硫化反應(yīng)易于完成。偶聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果根據(jù)水分、反應(yīng)時(shí)間和酰胺化物的當(dāng)量而變化。使用氮?dú)饣驓鍤夂涂焖倥悸?lián)反應(yīng)的無水條件是合乎需要的，因?yàn)檩^長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間會(huì)產(chǎn)生更多副產(chǎn)物，如P(V)氧化產(chǎn)物。二聚體的P(III)中間體具有不同穩(wěn)定性。TA中間體足夠穩(wěn)定用以通過TLC和HPLC來監(jiān)測(cè)反應(yīng)完成。其他P(III)中間體不足夠穩(wěn)定用以監(jiān)測(cè)偶聯(lián)反應(yīng)，且在硫化完成之后檢查反應(yīng)完成(方案1)。二聚體AA、GA、GG和GT的P(V)物質(zhì)更穩(wěn)定。對(duì)于TA二聚體(5e)，1.3當(dāng)量的酰胺化物(4c)用于偶聯(lián)，而其他四種二聚體(5a～5d)需要約3當(dāng)量的酰胺化物(4a和4b)(方案1)。酰胺化物單體4a-4c通過修改美國專利5,859,233中所述的方法來制備。

方案1.二聚體酰胺化物的合成方案

(P-試劑是氰基乙氧基-雙(N,N-二異丙基氨基)膦)

使用HF·吡啶在乙腈中使在5’-羥基處的TBDMS保護(hù)基脫保護(hù)，且在BMT和N-甲基咪唑(NMI)存在下用亞磷?；噭┻M(jìn)行最終亞磷?；灾苽涠垠w硫代磷酰胺酯7a至7e(方案1)。通過柱色譜純化最終產(chǎn)物(7)和三種中間體(3、5、6)。用各種量的所得最終酰胺化物進(jìn)行的反應(yīng)的步驟產(chǎn)率和總體產(chǎn)率列于表3中。五種二聚體酰胺化物的分析結(jié)果的概述示于表4中。

表3.二聚體合成的產(chǎn)率

表4.二聚體分析的概述

二聚體硫代磷酰胺酯的合成程序

1)制備5’-TBDMS-3’-氨基核苷(針對(duì)腺苷和鳥苷)。

a)將5’-OH-3’-NH-Tr-2’-脫氧核苷(1.0當(dāng)量)和咪唑(5.0當(dāng)量)溶解于DMF中，并加熱至60℃。

b)添加TBDMSCl(1.2當(dāng)量)至加熱溶液中，接著在60℃下攪拌1小時(shí)。

c)添加飽和NaHCO₃水溶液至反應(yīng)混合物中，接著用乙酸乙酯萃取。

d)將有機(jī)層用飽和NaHCO₃水溶液和鹽水溶液洗滌。

e)添加無水Na₂SO₄至分離的有機(jī)層中以進(jìn)行干燥，接著過濾。

f)濃縮濾液。

g)添加80％乙酸水溶液至濃縮反應(yīng)混合物中，接著在環(huán)境溫度下攪拌1小時(shí)。

h)通過過濾移除產(chǎn)物固體，接著添加飽和NaHCO₃水溶液至濾液中，接著通過乙酸乙酯萃取四次。

i)有機(jī)層經(jīng)無水Na₂SO₄干燥，接著通過過濾移除固體。

j)濃縮濾液，接著通過柱色譜(洗脫劑：乙酸乙酯:甲醇＝9:1→5:1)純化。

k)獲得呈白色固體狀的5’-TBDMS-3’-氨基-2’-脫氧核苷。

2)制備5’-TBDMS-3’-氨基核苷(針對(duì)胸苷)

a)將5’-OH-3’-氨基-2’-脫氧核苷(1.0當(dāng)量)和咪唑(5.0當(dāng)量)溶解于DMF中，并加熱至60℃。

b)添加TBDMSCl(1.2當(dāng)量)至加熱溶液中，接著在60℃下攪拌1小時(shí)。

c)添加飽和NaHCO₃水溶液至反應(yīng)混合物中，接著用乙酸乙酯萃取四次。

d)添加無水Na₂SO₄至有機(jī)層中以進(jìn)行干燥，且過濾。

e)濃縮濾液。

f)濃縮的粗混合物通過柱色譜(洗脫劑:乙酸乙酯:甲醇＝15:1→5:1)純化。

g)獲得呈白色固體狀的5’-TBDMS-3’-氨基胸苷。

3)制備5’-TBDMS-3’-NH-Tr二聚體

a)為移除水分，使5’-TBDMS-3’-氨基核苷(1.0當(dāng)量)和BMT(芐基巰基四唑，1.0至5.0當(dāng)量)與乙腈共沸三次，接著在環(huán)境溫度下在N₂氛圍下溶解于DMF中。

b)逐滴添加含單體酰胺化物(3.0當(dāng)量)的DMF(使用最小量以溶解單體酰胺化物)至反應(yīng)溶液中，接著在環(huán)境溫度下在氮?dú)夥諊聰嚢?小時(shí)。根據(jù)美國專利5,859,233中所述的方法制備單體酰胺化物。

c)添加蒼耳烷氫化物(2.0當(dāng)量)和吡啶(4.0當(dāng)量)至反應(yīng)溶液中，接著在環(huán)境溫度下在氮?dú)夥諊聰嚢?小時(shí)。

d)添加飽和NaHCO₃水溶液至反應(yīng)混合物中，接著用乙酸乙酯萃取。

e)水層用乙酸乙酯萃取。

f)合并分離的有機(jī)層，接著用飽和NaHCO₃水溶液和鹽水溶液洗滌。

g)添加無水Na₂SO₄至有機(jī)層中以進(jìn)行干燥，且過濾，接著濃縮濾液。

h)濃縮的粗混合物通過柱色譜(洗脫劑:乙酸乙酯:甲醇＝1.5:1→僅EA)純化。

i)獲得呈淺黃色固體狀的5’-TBDMS-3’-NH-Tr二聚體。

4)制備5’-OH-3’-NH-Tr二聚體

a)在氮?dú)夥諊聦?’-TBDMS-3’-NH-Tr二聚體(1.0當(dāng)量)溶解于ACN(20mL)中，接著在環(huán)境溫度下在攪拌下添加HF-吡啶溶液，持續(xù)1.5小時(shí)。

b)添加飽和NaHCO₃水溶液至反應(yīng)混合物中，接著用乙酸乙酯萃取。

c)將分離的有機(jī)層用飽和NaHCO₃水溶液和鹽水溶液洗滌。

d)添加無水Na₂SO₄至有機(jī)層中以進(jìn)行干燥和過濾，接著濃縮濾液。

e)濃縮的粗混合物通過柱色譜(洗脫劑：乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷共溶劑)純化

f)獲得呈白色固體狀的5’-OH-3’-NH-Tr二聚體。

5)制備二聚體硫代磷酰胺酯(二聚體酰胺化物)

A)為移除任何水分，使5’-羥基-3’-NH-Tr二聚體與乙腈共沸三次，接著在環(huán)境溫度下在氮?dú)夥諊氯芙庥贏CN中。

b)添加BMT(1.3當(dāng)量)、NMI(N-甲基咪唑，0.3當(dāng)量)和亞磷?；噭?2.0當(dāng)量)至反應(yīng)溶液中，接著在環(huán)境溫度下攪拌1小時(shí)。

c)添加飽和NaHCO₃水溶液至反應(yīng)混合物中，接著用乙酸乙酯萃取。

d)將分離的有機(jī)層用鹽水溶液洗滌。

e)添加無水Na₂SO₄至有機(jī)層中以進(jìn)行干燥和過濾，接著濃縮濾液。

f)將濃縮的反應(yīng)混合物溶解于二氯甲烷(10mL)中，接著添加己烷以沉淀固體。

g)傾析上層溶液以移除過量亞磷?；噭?重復(fù)傾析過程5次)。

h)剩余固體通過柱色譜(洗脫劑：乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷共溶劑)純化

i)獲得呈白色固體狀的二聚體。

利用二聚體酰胺化物進(jìn)行的伊美司他合成

五種二聚體酰胺化物替代單體酰胺化物用作用于合成伊美司他的構(gòu)筑嵌段，且將結(jié)果與自單體的酰胺化物獲得的結(jié)果進(jìn)行比較。對(duì)于C核苷偶聯(lián)至伊美司他中，如以下序列中所描繪使用單體構(gòu)筑嵌段。使用Akta Oligopilot 100在140μmol規(guī)模下進(jìn)行合成。

5’R-TAGGGTTAGA C AA-NH₂ 3’(SEQ ID NO:3)

二聚體酰胺化物用作用以制備伊美司他的構(gòu)筑嵌段。使用表5A和5B中所列的試劑和合成參數(shù)，使如上所示的五種二聚體酰胺化物(AA、TA、GG、GA和GT)和一種單體酰胺化物(C)偶聯(lián)以在低負(fù)載CPG(PALM 0051，64.6μmol/g)上制備伊美司他序列。偶聯(lián)時(shí)間是500秒，且使用10當(dāng)量的亞酰胺化物。在固相合成之后，支撐物用乙醇銨溶液(NH₄OH:EtOH＝3:1(v/v))在65℃下處理15小時(shí)。粗產(chǎn)物通過蒸發(fā)溶劑進(jìn)行分離，且通過UV光譜術(shù)和HPLC進(jìn)行分析。

表5.用于寡核苷酸合成的示例性合成參數(shù)(A)和試劑組成(B)。ACN是乙腈。DCA是二氯乙酸。PADS是苯基乙?；蚧?。ETT是5-乙硫基-1H-四唑。

使用Akta Oligopilot 100，利用單體嵌段方法和二聚體嵌段方法在140μmol規(guī)模上進(jìn)行合成操作。用于合成操作的合成條件類似于表5A-B中所列的條件。

表6.用于140μmol規(guī)模合成的合成參數(shù)(AKTA Oligopilot 100)

通過HPLC-MS對(duì)寡核苷酸分析顯示當(dāng)五種二聚體嵌段用于合成時(shí)，F(xiàn)LP(全長(zhǎng)產(chǎn)物)純度得以顯著提高，根據(jù)HPLC得到72％純度，如表7和8中所概述。使用單體嵌段制備的粗寡聚物僅顯示45％FLP純度。此外，總OD(光密度)自5,299增加超過兩倍達(dá)到11,623，從而得到粗產(chǎn)量3.34g/mmol。(N-1)產(chǎn)物含量和PO含量分別自11.2％和20％降低至2.4％和5％。

使用二聚體嵌段的優(yōu)點(diǎn)包括產(chǎn)生時(shí)間縮短，且在固相合成期間使用的溶劑的量降低。

表7. 140μmol規(guī)模合成的分析結(jié)果

自5’-羥基-3’-氨基核苷或5’-羥基-3’-三苯甲基氨基核苷成功完成五種二聚體酰胺化物的合成，其中產(chǎn)率是9％至19％，從而得到1.7克至3.4克。未充分研究各步驟的反應(yīng)條件的最佳化。在140μmol規(guī)模上進(jìn)行伊美司他的二聚體嵌段合成，且將結(jié)果與自使用單體酰胺化物進(jìn)行的合成獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。顯示用于制備伊美司他的二聚體嵌段策略會(huì)提供實(shí)質(zhì)性改進(jìn)，因?yàn)槔缭?40μmol規(guī)模上，純度和產(chǎn)率得以顯著改進(jìn)(HPLC純度：二聚體74.0％(圖8)，單體44.4％(圖7)，根據(jù)TOD(總光密度)的粗產(chǎn)量：二聚體468mg，單體213mg)。此外，產(chǎn)生較低量的npo鍵聯(lián)，因?yàn)樵谑褂枚垠w進(jìn)行的合成中存在較少偶聯(lián)步驟。

二聚體的偶聯(lián)效率(140μmol規(guī)模合成)顯示二聚體合成具有96％偶聯(lián)效率，而單體合成是94％。因?yàn)閷?duì)于二聚體，僅存在七次偶聯(lián)，所以二聚體的FLP是71.6％，這接近于在72％下的理論計(jì)算的全長(zhǎng)產(chǎn)物，且偶聯(lián)13次的單體報(bào)道FLP 45.6％對(duì)在44％下的理論預(yù)測(cè)值。

表8. 140μmol規(guī)模合成的結(jié)果的分析

“+苯基乙?；北硎居捎醚趸噭┻M(jìn)行的反應(yīng)獲得的產(chǎn)物

利用較少偶聯(lián)步驟進(jìn)行的伊美司他合成提供的全長(zhǎng)產(chǎn)物純度與產(chǎn)率兩者均實(shí)質(zhì)上較高。對(duì)雜質(zhì)的解析提供較易于純化伊美司他，其中在HPLC中存在較小量的緊密接近于主峰流動(dòng)的次要產(chǎn)物以產(chǎn)生伊美司他的純度較高的組合物。該提高合乎降低用于制造伊美司他鈉的商品成本的需要，例如當(dāng)在制造規(guī)模下執(zhí)行時(shí)，商品成本可減少30-40％。

方案2.GA二聚體酰胺化物的合成方案

根據(jù)本文所述的方法，經(jīng)由方案2中所示的步驟，自300g APG2制備85g TBAG。

方案3.AA二聚體酰胺化物的合成方案

根據(jù)本文所述的方法，經(jīng)由方案3中所示的步驟，自800g粗APA1(純度：46％)獲得430g TBAPA1。

方案4.TA二聚體酰胺化物的合成。

已根據(jù)本文所述的方法，經(jīng)由方案4中所示的步驟，在自100mg至1g的合成規(guī)模下制備TA二聚體酰胺化物(5)。

方案5.在二聚體酰胺化物合成期間的偶聯(lián)和硫化

表9.在二聚體酰胺化物合成期間的偶聯(lián)和硫化

根據(jù)本文描述的用于制備二聚體化合物的方法制備多種核苷單體。

方案6：合成乙酰丙酸酯保護(hù)的單體

方案7：合成雙DMF A亞酰胺化物

方案8：用于MMT、DMT和甲呱啶單體(A亞酰胺化物)的合成方案：

雖然本發(fā)明已經(jīng)參考其特定實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可以進(jìn)行各種改變以及可進(jìn)行等效物替換而不脫離本發(fā)明的真實(shí)精神和范圍。此外，為了使特定的場(chǎng)合、材料、物質(zhì)的組合物、方法、方法步驟或步驟適應(yīng)本發(fā)明的目的、精神和范圍，可以進(jìn)行許多改進(jìn)。所有此類修改意圖處于所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。

實(shí)施方案

本公開提供一種組合物，其具有相對(duì)于化合物或其鹽少于4重量份中1重量份的(N-1)產(chǎn)物，其中所述化合物包括具有10個(gè)或更多個(gè)核苷亞基的序列的多核苷酸，并且至少兩個(gè)所述核苷亞基通過N3′→P5′磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)連接。在所述組合物的一些實(shí)施方案中，N3′→P5′磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)是具有結(jié)構(gòu)：3′—NH—P(S)(OR)—O—5’的N3′→P5′硫代磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)，其中R選自由氫、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基和磷酸酯保護(hù)基組成的組；或其鹽。

在所述組合物的一些實(shí)施方案中，所述化合物包含具有10個(gè)或更多個(gè)與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的核苷亞基的序列的多核苷酸。在所述組合物的一些實(shí)施方案中，所述多核苷酸包含含有13個(gè)或更多個(gè)與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的核苷亞基的序列。在所述組合物的一些實(shí)施方案中，所述多核苷酸包含在3個(gè)與50個(gè)之間的與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的連續(xù)核苷亞基。在所述組合物的一些實(shí)施方案中，與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的核苷亞基均通過N3′→P5′磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)連接。在所述組合物的一些實(shí)施方案中，多核苷酸包含選自由以下組成的組的序列：GTTAGGGTTAG(SEQ ID NO:4)、TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO:3)和CAGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO:5)。在所述組合物的一些實(shí)施方案中，所述多核苷酸包含3’氨基或3’-羥基端基。

在所述組合物的一些實(shí)施方案中，所述化合物具有結(jié)構(gòu)：

或其鹽；其中“nps”表示使一個(gè)核苷的3'-碳連接于相鄰核苷的5'-碳的硫代磷酰胺酯鍵聯(lián)—NH—P(＝O)(SH)—O—。在所述組合物的一些實(shí)施方案中，所述鹽是藥學(xué)上可接受的鹽。

在所述組合物的一些實(shí)施方案中，所述化合物具有結(jié)構(gòu)：

其中各M^x+獨(dú)立地是氫或鹽的抗衡離子，各x獨(dú)立地是1、2或3，且n是5至13的整數(shù)。在某些實(shí)例中，M^x+是氫。

在所述組合物的一些實(shí)施方案中，所述化合物具有結(jié)構(gòu)：

在一些實(shí)施方案中，所述組合物具有相對(duì)于化合物少于6重量份中1重量份的(N-1)產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，所述組合物具有相對(duì)于化合物少于10重量份中1重量份的(N-1)產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，所述組合物具有相對(duì)于化合物少于20重量份中1重量份的(N-1)產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，所述組合物具有相對(duì)于化合物少于4重量份中1重量份的任何(N-x)產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，所述組合物具有相對(duì)于化合物少于100總重量份中40重量份的(N-x)含多核苷酸產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，所述組合物具有(N-x)含多核苷酸產(chǎn)物的以下概況：相對(duì)于產(chǎn)物少于4重量份中1重量份的(N-1)產(chǎn)物；相對(duì)于化合物至少100重量份中10重量份的(N-2)和(N-3)產(chǎn)物。

本公開提供一種具有少于11重量％的(N-1)產(chǎn)物的化合物活性藥物成分，其中所述化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽包含具有10個(gè)或更多個(gè)與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的核苷亞基的序列的多核苷酸，其中至少兩個(gè)核苷亞基通過N3′→P5′磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)連接。

在所述化合物活性藥物成分的一些實(shí)施方案中，與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的核苷亞基均通過N3′→P5′硫代磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)連接。在所述化合物活性藥物成分的一些實(shí)施方案中，N3′→P5′磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)是具有結(jié)構(gòu)：3′—NH—P(S)(OR)—O—5’的硫代磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)，其中R選自由氫、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基和磷酸酯保護(hù)基組成的組；或其藥學(xué)上可接受的鹽。

在所述化合物活性藥物成分的一些實(shí)施方案中，多核苷酸包含在10個(gè)與50個(gè)之間的與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的連續(xù)核苷亞基。在所述化合物活性藥物成分的一些實(shí)施方案中，多核苷酸包含選自由以下組成的組的序列：GTTAGGGTTAG(SEQ ID NO:4)；TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO:3)；和CAGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO:5)。在所述化合物活性藥物成分的一些實(shí)施方案中，多核苷酸包含3’氨基或3’-羥基端基。

在所述化合物活性藥物成分的一些實(shí)施方案中，所述化合物具有結(jié)構(gòu)：

或其藥學(xué)上可接受的鹽；其中“nps”表示使一個(gè)核苷的3'-碳連接于相鄰核苷的5'-碳的硫代磷酰胺酯鍵聯(lián)—NH—P(＝O)(SH)—O—。

在所述化合物活性藥物成分的一些實(shí)施方案中，所述化合物具有結(jié)構(gòu)：

其中各M^x+獨(dú)立地是氫或藥學(xué)上可接受的鹽的抗衡離子，各x獨(dú)立地是1、2或3，且n是5至13的整數(shù)。在某些實(shí)例中，M^x+是氫。

在所述化合物活性藥物成分的一些實(shí)施方案中，所述化合物具有結(jié)構(gòu)：

在一些實(shí)施方案中，所述化合物活性藥物成分具有少于9重量％的(N-1)產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，所述化合物活性藥物成分具有少于5重量％的(N-1)產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，所述化合物活性藥物成分具有少于11％的任何(N-x)產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，所述化合物活性藥物成分具有少于45總重量％的(N-x)含多核苷酸產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，所述化合物活性藥物成分具有(N-x)含多核苷酸產(chǎn)物的以下概況：少于5重量％的(N-1)產(chǎn)物；以及至少10重量％的(N-2)和(N-3)產(chǎn)物。

還提供一種藥物組合物，其包含于藥學(xué)上可接受的賦形劑中配制的組合物(例如本文所述的任一實(shí)施方案的組合物)。還提供一種藥物組合物，其包含于藥學(xué)上可接受的賦形劑中配制的化合物活性藥物成分(例如本文所述的任一實(shí)施方案的化合物活性藥物成分)。

本公開提供一種合成多核苷酸的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟：(a)將連接于固相支撐物的末端核苷的受保護(hù)的3'氨基脫保護(hù)，所述脫保護(hù)形成游離3'氨基；(b)使所述游離3'氨基與3'-受保護(hù)的氨基-二核苷酸磷酰胺酯-5'-亞磷酰胺二聚體在親核催化劑存在下接觸以形成核苷間N3’→P5’亞磷酰胺鍵聯(lián)；以及(c)使所述鍵聯(lián)氧化。

在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括：(a)將連接于固相支撐物的末端核苷的受保護(hù)的3'氨基脫保護(hù)，所述脫保護(hù)形成游離3'氨基；(b)使所述游離3'氨基與3'-受保護(hù)的氨基核苷-5'-亞磷酰胺單體在親核催化劑存在下接觸以形成核苷間N3’→P5’亞磷酰胺鍵聯(lián)；以及(c)使所述鍵聯(lián)氧化。在所述方法的一些實(shí)施方案中，使鍵聯(lián)氧化包括硫化以產(chǎn)生硫代磷酰胺酯鍵聯(lián)。在所述方法的一些實(shí)施方案中，使鍵聯(lián)氧化產(chǎn)生氧代磷酰胺酯鍵聯(lián)。

在所述方法的一些實(shí)施方案中，3'-受保護(hù)的氨基-二核苷酸磷酰胺酯-5'-亞磷酰胺二聚體具有式：

其中X是O或S，且B¹和B²各自獨(dú)立地是嘌呤、受保護(hù)的嘌呤、嘧啶或受保護(hù)的嘧啶或其類似物。在所述方法的一些實(shí)施方案中，B¹和B²各自獨(dú)立地選自受保護(hù)的腺嘌呤、受保護(hù)的胞嘧啶、受保護(hù)的鳥嘌呤、胸腺嘧啶以及尿嘧啶。在所述方法的一些實(shí)施方案中，B¹和B²各自獨(dú)立地選自A(Bz)、A(DMF)、C(Bz)、G(異丁?；?、T以及U。在所述方法的一些實(shí)施方案中，X是S。

在所述方法的一些實(shí)施方案中，多核苷酸具有式：

其中：各B獨(dú)立地是嘌呤、受保護(hù)的嘌呤、嘧啶或受保護(hù)的嘧啶或其類似物；各X獨(dú)立地是氧或硫；各R³是氫、氟基或羥基、烷氧基、取代的烷氧基或受保護(hù)的羥基；L是任選的接頭；Z是H、脂質(zhì)、支撐物、載體、寡核苷酸、PEG、多肽、可檢測(cè)標(biāo)記或標(biāo)簽；R⁶是氨基、羥基、受保護(hù)的氨基、受保護(hù)的羥基、-O-L-Z或–NH-L-Z；R是氫、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基和磷酸酯保護(hù)基；且n是1至1000的整數(shù)；或其鹽；并且所述方法包括以下步驟：(a)將連接于固相支撐物的末端核苷的受保護(hù)的3'氨基脫保護(hù)，所述脫保護(hù)形成游離3'氨基；(b)使所述游離3'氨基與(i)3'-受保護(hù)的氨基-二核苷酸磷酰胺酯-5'-亞磷酰胺二聚體；或

(ii)3'-受保護(hù)的氨基核苷-5'-亞磷酰胺單體兩者之一在親核催化劑存在下反應(yīng)以形成核苷間N3’→P5’亞磷酰胺鍵聯(lián)；(c)使所述鍵聯(lián)氧化；以及(d)重復(fù)步驟(a)至(c)直至合成所述多核苷酸，其中重復(fù)步驟(a)至(c)包括進(jìn)行步驟(b)(i)至少一次。

在所述方法的一些實(shí)施方案中，使鍵聯(lián)氧化包括硫化以產(chǎn)生硫代磷酰胺酯鍵聯(lián)。在所述方法的一些實(shí)施方案中，使鍵聯(lián)氧化產(chǎn)生氧代磷酰胺酯鍵聯(lián)。在所述方法的一些實(shí)施方案中，多核苷酸包含具有與人端粒酶的RNA組分互補(bǔ)的核苷亞基的序列，并且其中至少兩個(gè)核苷亞基通過N3′→P5′磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)連接。在所述方法的一些實(shí)施方案中，N3′→P5′磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)是具有結(jié)構(gòu)：3′—NH—P(S)(OR)—O—5’的N3′→P5′硫代磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)，其中R選自由氫、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基和磷酸酯保護(hù)基組成的組；或其鹽。

在所述方法的一些實(shí)施方案中，多核苷酸包含序列TAGGGTTAGACAA。在所述方法的一些實(shí)施方案中，TAGGGTTAGACAA序列的所有核苷酸間亞基間鍵聯(lián)均是N3'→P5'磷酰胺酯亞基間鍵聯(lián)。在所述方法的一些實(shí)施方案中，多核苷酸具有結(jié)構(gòu)：

或其鹽；其中“nps”表示使一個(gè)核苷的3'-碳連接于相鄰核苷的5'-碳的硫代磷酰胺酯鍵聯(lián)—NH—P(＝O)(SH)—O—。

在所述方法的一些實(shí)施方案中，多核苷酸具有結(jié)構(gòu)：

其中各M^x+獨(dú)立地是氫或藥學(xué)上可接受的鹽的抗衡離子，各x獨(dú)立地是1、2或3，且n是5至13的整數(shù)。在某些實(shí)例中，M^x+是氫。

在所述方法的一些實(shí)施方案中，多核苷酸具有結(jié)構(gòu)：

在所述方法的一些實(shí)施方案中，TAGGGTTAGACAA序列的C11核苷酸殘基由3'-受保護(hù)的氨基核苷-5'-亞磷酰胺單體獲得。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括使以下3'-受保護(hù)的氨基-二核苷酸硫代磷酰胺酯-5'-亞磷酰胺二聚體TA、GG、GT、TA、GA和AA以及3'-受保護(hù)的氨基核苷-5'-亞磷酰胺單體C依次偶聯(lián)于固相支撐物。在所述方法的一些實(shí)施方案中，3'-受保護(hù)的氨基-二核苷酸亞磷酰胺-5'-亞磷酰胺二聚體由式X¹X²所述，其中X¹和X²獨(dú)立地選自受保護(hù)的腺嘌呤、受保護(hù)的胞嘧啶、受保護(hù)的鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。在所述方法的一些實(shí)施方案中，3'-受保護(hù)的氨基核苷-5'-亞磷酰胺二聚體選自受保護(hù)的腺嘌呤、受保護(hù)的胞嘧啶、受保護(hù)的鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。

本公開提供一種由式(II)描述的二核苷酸硫代磷酰胺酯化合物：

其中：B¹和B²各自獨(dú)立地是嘌呤、受保護(hù)的嘌呤、嘧啶或受保護(hù)的嘧啶或其類似物；R¹¹是氫、保護(hù)基或亞磷酰胺基團(tuán)；且R¹²和R¹³各自獨(dú)立地是氫或保護(hù)基；或其鹽。

在所述化合物的一些實(shí)施方案中，B¹和B²各自獨(dú)立地選自受保護(hù)的腺嘌呤、受保護(hù)的胞嘧啶、受保護(hù)的鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。在所述化合物的一些實(shí)施方案中，B¹和B²各自獨(dú)立地選自A(Bz)、A(DMF)、C(Bz)、G(異丁?；?、T和U。在所述化合物的一些實(shí)施方案中，R¹¹是5’-亞磷酰胺；R¹²是保護(hù)基，且R¹³是保護(hù)基。在所述化合物的一些實(shí)施方案中，B¹是A(Bz)或A(DMF)，且B²是A(Bz)或A(DMF)。在所述化合物的一些實(shí)施方案中，B¹是A(Bz)或A(DMF)，且B²是C(Bz)。在所述化合物的一些實(shí)施方案中，B¹是A(Bz)或A(DMF)，且B²是G(異丁?；?。在所述化合物的一些實(shí)施方案中，B¹是A(Bz)或A(DMF)，且B²是T。在所述化合物的一些實(shí)施方案中，B¹是A(Bz)或A(DMF)，且B²是U。在所述化合物的一些實(shí)施方案中，B¹是C(Bz)，且B²是A(Bz)或A(DMF)。在所述化合物的一些實(shí)施方案中，B¹是C(Bz)，且B²是C(Bz)。在所述化合物的一些實(shí)施方案中，B¹是C(Bz)，且B²是G(異丁酰基)。在所述化合物的一些實(shí)施方案中，B¹是C(Bz)，且B²是T。在所述化合物的一些實(shí)施方案中，B¹是C(Bz)，且B²是U。在所述化合物的一些實(shí)施方案中，B¹是G(異丁酰基)，且B²是A(Bz)或A(DMF)。在所述化合物的一些實(shí)施方案中，B¹是G(異丁?；?，且B²是C(Bz)。在所述化合物的一些實(shí)施方案中，B¹是G(異丁?；?，且B²是G(異丁?；?。在所述化合物的一些實(shí)施方案中，B¹是G(異丁酰基)，且B²是T。在所述化合物的一些實(shí)施方案中，B¹是G(異丁酰基)，且B²是U。在所述化合物的一些實(shí)施方案中，B¹是T或U，且B²是A(Bz)或A(DMF)。在所述化合物的一些實(shí)施方案中，B¹是T或U，且B²是C(Bz)。在所述化合物的一些實(shí)施方案中，B¹是T或U，且B²是G(異丁?；?。在所述化合物的一些實(shí)施方案中，B¹是T或U，且B²是T。在所述化合物的一些實(shí)施方案中，B¹是T或U，且B²是U。

以上指示的實(shí)施方案的所有可能的組合均被認(rèn)為包括于本發(fā)明的范圍內(nèi)。

序列表

<110> P·H·拉米亞

<120> 寡核苷酸組合物及其制備方法

<130> GERN-185WO

<150> US 61/987,396

<151> 2014-05-01

<150> US 62/151,909

<151> 2015-04-23

<160> 19

<170> FastSEQ Windows版本4.0

<210> 1

<211> 451

<212> RNA

<213> 智人

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 1

ggguugcgga gggugggccu gggaggggug guggccauuu uuugucuaac ccuaacugag 60

aagggcguag gcgccgugcu uuugcucccc gcgcgcuguu uuucucgcug acuuucagcg 120

ggcggaaaag ccucggccug ccgccuucca ccguucauuc uagagcaaac aaaaaauguc 180

agcugcuggc ccguucgccc cucccgggga ccugcggcgg gucgccugcc cagcccccga 240

accccgccug gaggccgcgg ucggcccggg gcuucuccgg aggcacccac ugccaccgcg 300

aagaguuggg cucugucagc cgcgggucuc ucgggggcga gggcgagguu caggccuuuc 360

aggccgcagg aagaggaacg gagcgagucc ccgcgcgcgg cgcgauuccc ugagcugugg 420

gacgugcacc caggacucgg cucacacaug c 451

<210> 2

<211> 11

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 2

cuaacccuaa c 11

<210> 3

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 3

tagggttaga caa 13

<210> 4

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 4

gttagggtta g 11

<210> 5

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 5

cagttagggt tag 13

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 6

gctctagaat gaacggtgga aggcggcagg 30

<210> 7

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 7

gtggaaggcg gcagg 15

<210> 8

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 8

ggaaggcggc agg 13

<210> 9

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 9

gtggaaggcg gca 13

<210> 10

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 10

gtggaaggcg g 11

<210> 11

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 11

cggtggaagg cgg 13

<210> 12

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 12

acggtggaag gcg 13

<210> 13

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 13

aacggtggaa ggcggc 16

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 14

atgaacggtg gaaggcgg 18

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 15

acattttttg tttgctctag 20

<210> 16

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 16

gttagggtta gac 13

<210> 17

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 17

gttagggtta gacaa 15

<210> 18

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 18

cccttctcag tt 12

<210> 19

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 19

cgcccttctc ag 12