本發(fā)明涉及用于純化免疫球蛋白的方法，更具體地，涉及的用于純化免疫球蛋白的方法包括：透析和濃縮含免疫球蛋白的血漿蛋白質(zhì)組分(fraction)Ⅱ的糊狀物；然后使用陶瓷陽離子交換樹脂通過純化工藝從所述透析和濃縮的組分中除去血栓性物質(zhì)；以及保持鹽濃度在恒定水平的同時(shí)實(shí)施洗脫，以保持免疫球蛋白的聚合物含量在低水平。

背景技術(shù)：

免疫球蛋白是包含抗各種病毒和細(xì)菌抗體的血漿蛋白質(zhì)，通過給藥給天然缺少抗體的受試者或由于病毒性疾病或細(xì)菌性疾病而需要人工補(bǔ)充抗體的患者而被用作預(yù)防或治療疾病的藥物。

為了使這樣的免疫球蛋白用作為藥物，已經(jīng)根據(jù)Cohn和Oncley開發(fā)的冷乙醇分餾法(Cohn E.等，J.Am.Chem.Soc.,68:459,1946)或者Kistler和Nitschmann開發(fā)的改進(jìn)的冷乙醇分餾法(Kistler P,Nitschmann HS,Vox Sang,7:414.1952)制備了用于皮下或肌肉注射的免疫球蛋白。

然而，用于肌肉注射的免疫球蛋白具有下述問題：1)這樣的免疫球蛋白的劑量受限，使得不可能大量施用免疫球蛋白；2)免疫球蛋白在注射免疫球蛋白的位點(diǎn)引起疼痛；3)免疫球蛋白中具有抗體活性的天然免疫球蛋白G(IgG)的含量低；4)注射位點(diǎn)的蛋白酶降低了免疫球蛋白的抗體活性；以及5)達(dá)到峰值血漿濃度的時(shí)間為24小時(shí)或更久。

為了解決肌肉注射的問題，嘗試通過靜脈注射給藥免疫球蛋白。然而，當(dāng)靜脈注射給藥免疫球蛋白制劑時(shí)，由于其與抗補(bǔ)體活性結(jié)合(aggregate)引起的嚴(yán)重的副作用(過敏反應(yīng))，出現(xiàn)了各種直接的副作用，包括呼吸困難和循環(huán)系統(tǒng)休克。這樣的癥狀主要在免疫球蛋白缺陷的患者中出現(xiàn)。特別地，在出現(xiàn)抗IgA抗體的患者中觀察到嚴(yán)重超敏性的副作用。

因此，由于上述問題，不可能靜脈注射免疫球蛋白，所以需要開發(fā)用于靜脈注射的免疫球蛋白制劑，以及開發(fā)在制備過程中能夠除去上述聚集體和/或防止聚集體形成的方法。由于用諸如胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或血纖維蛋白溶酶(Plasmin)的蛋白酶或者諸如β-丙內(nèi)酯的化學(xué)物質(zhì)處理免疫球蛋白以改變它們的結(jié)構(gòu)，從而抑制免疫球蛋白聚集體的形成或破壞免疫球蛋白聚集體，進(jìn)而降低免疫球蛋白的抗補(bǔ)體活性，使得靜脈注射免疫球蛋白變得可能。

通過用胃蛋白酶處理原料(Cohn組分II)以除去免疫球蛋白聚集體而制備第一代靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)產(chǎn)品。制備過程不包括柱色譜步驟，并凍干制得的產(chǎn)物，以便在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間段內(nèi)保持穩(wěn)定，并在使用前立即溶解。然而，發(fā)現(xiàn)一些制造商制造的IVIG產(chǎn)品會(huì)引起病毒性感染，例如C型病毒性肝炎。由于這個(gè)原因，在制備過程中增加滅活和/或除去已知病毒的一個(gè)或多個(gè)步驟。之后，在上世紀(jì)八十年代中期公開了具有低抗補(bǔ)體活性和更高穩(wěn)定性的第二代IVIG產(chǎn)品，并通過數(shù)個(gè)色譜步驟純化IVIG產(chǎn)品。

靜脈注射這樣的制劑，從而克服肌肉注射免疫球蛋白的缺點(diǎn)，包括受限的劑量、注射位點(diǎn)的疼痛以及蛋白酶降低免疫球蛋白的抗體活性，并且還將達(dá)到峰值血漿濃度需要的時(shí)間縮短至幾個(gè)小時(shí)或更短。

然而，由于其結(jié)構(gòu)變化，上述靜脈注射免疫球蛋白產(chǎn)品具有很少的有抗體活性的天然IgG，或者不具有抗體活性的天然IgG，所以補(bǔ)體結(jié)合活性減小，或者不具有補(bǔ)體結(jié)合活性，并且具有短至約4～12天的血液半衰期，因此，表明它們對(duì)預(yù)防和治療疾病呈現(xiàn)不令人滿意的作用。此外，以凍干粉形態(tài)制得的第一代和第二代IVIG產(chǎn)品需要溶解它們的額外過程，并且具有低的溶解速度。由于這個(gè)原因，開發(fā)了液體IVIG產(chǎn)品，并且需要改善的工藝，以獲得更穩(wěn)定且更純的IVIG產(chǎn)品。

與此相關(guān)地，德國專利申請(qǐng)No.2,604,759和美國專利申請(qǐng)No.4,124,576公開了通過使用諸如聚乙二醇的非離子型表面活性劑獲得具有抗體活性的純IgG(第三代IVIG)的方法，它們與上述用于靜脈注射的γ免疫球蛋白不同。這樣的IgG制劑具有補(bǔ)體結(jié)合活性，以及提高的血液半衰期，因此顯示出對(duì)預(yù)防和治療疾病的良好效果。然而，這些用聚乙二醇處理而生產(chǎn)的制劑仍然會(huì)引起副作用，因?yàn)殡y以從這些制劑中完全除去具有抗補(bǔ)體活性的聚集體(顯示約0.02U/mg的抗補(bǔ)體活性)。

此外，韓國公開No.1983-0007083公開了一種通過使用聚乙二醇處理從人血漿分離的Cohn組分II或組分II+III而制備靜脈注射免疫球蛋白的方法。然而，該方法存在的有問題為其較復(fù)雜且產(chǎn)量較低。

因此，本發(fā)明人為解決現(xiàn)有技術(shù)中出現(xiàn)的上述問題做出了巨大的努力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)透析和濃縮從血漿分離的組分II的糊狀物，然后在陽離子交換色譜和洗脫期間控制鹽濃度的同時(shí)通過陰離子交換色譜以及陽離子交換色譜純化，有效地除去了血漿組分中的血栓性物質(zhì)，并改善了免疫球蛋白產(chǎn)品的穩(wěn)定性，從而完成了本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

技術(shù)問題

本發(fā)明的目的為提供一種用于純化免疫球蛋白的方法，該方法可有效地除去雜質(zhì)和血栓性物質(zhì)，以生產(chǎn)穩(wěn)定且高純度的免疫球蛋白。技術(shù)方案

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種用于純化免疫球蛋白的方法，包括如下步驟：

(a)溶解含免疫球蛋白的血漿蛋白質(zhì)組分Ⅱ的糊狀物，然后過濾，以獲得組分Ⅱ的溶液；

(b)透析和/或濃縮所述獲得的組分Ⅱ的溶液，使所述透析和/或濃縮的溶液經(jīng)過陰離子交換色譜，然后回收未吸附到所述陰離子交換色譜柱的組分；

(c)用溶劑和/或去污劑處理所述回收的組分，以滅活病毒，然后使所述組分經(jīng)過陽離子交換色譜，以除去所述溶劑和/或所述去污劑以及血栓性物質(zhì)；

(d)透析和/或濃縮從所述陽離子交換色譜獲得的洗脫液；以及

(e)過濾透析和/或濃縮的溶液，從而獲得純化的免疫球蛋白。

附圖說明

圖1為顯示根據(jù)本發(fā)明制備靜脈注射免疫球蛋白的過程的示意圖。

圖2顯示了每個(gè)制備步驟中免疫球蛋白純度(凝血酶/IgG)的測(cè)量結(jié)果。

圖3顯示了通過SDS—PAGE測(cè)量的每個(gè)制備步驟中濾液或者沉淀物含有的FXI(人凝血因子XI)濃度的結(jié)果。

最佳實(shí)施方式

除非另有定義，否則本文所用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語都具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。通常，本領(lǐng)域中已知并且普遍地使用下文將描述的文中使用的術(shù)語及實(shí)驗(yàn)方法。

如文中使用，表述“含免疫球蛋白的血漿蛋白”意思是包括通過從人血漿或人胎盤血漿除去諸如因子IX和抗凝血酶的各種血漿蛋白而獲得的無冷凝蛋白的血漿(cryoprecipitate-free plasma)、各種Cohn組分、以及通過硫酸銨或PEG獲得的組分(Polson等，Biochem Biophys Acta,82:463,1964)；Polson和Ruiz-Bravo,Vox Sang,23:107.1972)。優(yōu)選地，用在本發(fā)明中的血漿蛋白組分可為Cohn組分Ⅱ、Cohn組分Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ或Cohn組分Ⅱ+Ⅲ。

在本發(fā)明中，使用根據(jù)常規(guī)Cohn血漿組分方法從人血漿獲得組分Ⅱ的糊狀物。然后實(shí)施從組分Ⅱ的糊狀物中除去各種脂蛋白、纖維蛋白原、α球蛋白、β球蛋白和各種凝血因子的純化過程。

在本發(fā)明中，人血漿使用FDA批準(zhǔn)且經(jīng)生物檢測(cè)的從美國紅十字協(xié)會(huì)得到的血漿，生物檢測(cè)包括對(duì)人免疫缺陷病毒(HIV)、C型肝炎病毒(HCV)、B型肝炎病毒(HBV)和微小病毒B19進(jìn)行的核酸擴(kuò)增檢測(cè)以及血清學(xué)檢測(cè)。通過在夾套式容器中于1～6℃培養(yǎng)12～72小時(shí)而解凍在﹣20℃或更低溫度下儲(chǔ)存的血漿。

在上述條件下解凍血漿時(shí)，產(chǎn)生包含纖維蛋白原和凝血因子的冷凝蛋白。通過離心除去產(chǎn)生的冷凝蛋白，并回收剩余的不耐冷(cryo-poor)血漿。然后，重復(fù)沉淀和過濾過程，從而獲得組分Ⅱ的糊狀物。

在分離含免疫球蛋白血漿的過濾過程中，加入助濾劑，并與不耐冷血漿混合，然后通過壓濾機(jī)的方式分離成上清液和沉淀物。對(duì)于助濾劑，使用硅藻土(Celite，STD)或Harbolite(膨脹珍珠巖產(chǎn)品)。

本發(fā)明中，可通過以相當(dāng)于所述血漿蛋白組分體積2～10倍的量加入氯化鈉溶液而實(shí)施步驟(a)中所述血漿蛋白組分Ⅱ的糊狀物的溶解。

優(yōu)選地，在基本不變性的溫度和pH下將所述血漿蛋白質(zhì)組分懸浮(溶解)于水和/或緩沖液中。術(shù)語“基本不變性”是指該術(shù)語涉及的環(huán)境基本上不會(huì)造成IgG分子功能活性不可逆的喪失，例如抗原結(jié)合活性的喪失和/或生物Fc功能的喪失。

有利地，用至少一種非變性緩沖液酸化的水以2～5倍、優(yōu)選3～4倍血漿蛋白組分體積的體積溶解所述血漿蛋白組分。優(yōu)選地，保持含免疫球蛋白的懸浮液的pH在小于6，例如在4.0～6.0的范圍內(nèi)，優(yōu)選為4.9～5.1，以確保免疫球蛋白的最佳溶解度?？墒褂帽绢I(lǐng)域中已知的任何酸性緩沖液，但是優(yōu)選可使用磷酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉、乙酸、鹽酸或水(蒸餾水)作為酸性緩沖液。本發(fā)明中，使用氯化鈉溶液。

保持免疫球蛋白懸浮液在低溫，以防止蛋白質(zhì)變性，并且使蛋白酶活性最小，以及保持免疫球蛋白懸浮液、以及加到免疫球蛋白懸浮液中的水或緩沖液在0～12℃溫度范圍內(nèi)，優(yōu)選為0～7℃，更優(yōu)選為1～4℃。

在本發(fā)明中，步驟(a)中獲得組分Ⅱ溶液的過濾可為澄清過濾，并且可包括調(diào)節(jié)pH至4.5～5.5。優(yōu)選地，調(diào)節(jié)pH至4.9～5.1。

在本發(fā)明中，在10℃或更低的溫度下轉(zhuǎn)移組分Ⅱ的糊狀物到夾套式容器中，并通過向其中加入相當(dāng)于組分Ⅱ的糊狀物的4倍體積量的0.6％的氯化鈉溶液而將糊狀物溶解，然后加入1M的乙酸到溶液中，以調(diào)節(jié)pH至5.0±1。然后，使用深濾器使溶液經(jīng)澄清過濾，從而獲得組分Ⅱ的溶液。

本發(fā)明中，可使用超濾/滲濾(UF/DF)系統(tǒng)實(shí)施步驟(b)中的透析和/或濃縮，直至透析及濃縮溶液的滲透壓達(dá)到10mOsmol/kg或更低，然后調(diào)節(jié)pH至5.5～6.5，優(yōu)選至5.9～6.1。

滲濾是通過同時(shí)實(shí)施透析和超濾而從含溶劑和具有不同分子大小的兩種或更多種溶質(zhì)的液體中僅除去某一溶質(zhì)的過程。它可有效地純化聚合物材料，并且由于省時(shí)和性價(jià)比高而優(yōu)于普通透析工藝。

在本發(fā)明的實(shí)施例中，在10mOsmol/kg或更低的滲透壓下，使用超濾/滲濾(UF/DF)系統(tǒng)過濾組分Ⅱ的溶液，并向?yàn)V液中加入1M乙酸鈉至5.0±1.0mM的濃度，然后調(diào)節(jié)pH至6.0±0.1，從而獲得透析和/或濃縮的含免疫球蛋白的溶液。

本發(fā)明中，可在5.5～6.5的pH以95～145cm/hr的流速實(shí)施步驟(b)中的陰離子交換色譜，并且可用1.5～2.0倍的上樣體積(loading volume，LV)回收未吸附到陰離子交換色譜柱上的組分。

用在陰離子交換色譜步驟中的陰離子交換樹脂可為被二乙氨乙基(DEAE)或季銨基取代的陰離子交換樹脂，但并不限于此。優(yōu)選地，陰離子交換樹脂可為選自具有強(qiáng)堿性季銨基或弱堿性二乙氨乙基(DEAE)的陰離子交換樹脂的任意一種。

例如，對(duì)于強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂，可使用Q Sepharose Fast Flow、Q Sepharose High Performance、Resource Q、Source 15Q、Source 30Q、Mono Q、Mini Q、Capto Q、Capto Q ImpRes、Q HyperCel、Q Cermic HyperD F、Nuvia Q、UNOsphere Q、Macro-Prep High Q、Macro-Prep 25Q、Fractogel EMD TMAE(S)、Fractogel EMD TMAE Hicap(M)、Fractogel EMD TMAE(M)、Eshmono Q、Toyopearl QAE-550C、Toyopearl SuperQ-650C、Toyopearl GigaCap Q-650M、Toyopearl Q-600C AR、Toyopearl SuperQ-650M、Toyopearl SuperQ-650S、TSKgel SuperQ-5PW(30)、TSKgel SuperQ-5PW(20)、TSKgel SuperQ-5PW等等，但并不限于此，并且可使用本領(lǐng)域中已知的任何陰離子交換樹脂。

柱子的尺寸(即柱子的直徑和樹脂的高度)反映了用于陰離子交換色譜的樹脂的合適體積，并可根據(jù)例如所使用的溶液中的免疫球蛋白的量以及所使用樹脂的結(jié)合性能而變化。在實(shí)施陰離子交換色譜前，優(yōu)選用緩沖液平衡陰離子交換樹脂，使得樹脂結(jié)合其反離子。

本發(fā)明中，所使用的陰離子交換樹脂為DEAE—瓊脂糖凝膠，并且所使用的柱緩沖液可為本領(lǐng)域中已知的平衡緩沖液(例如磷酸鈉緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液等)，洗滌緩沖液以及洗脫緩沖液。

在陰離子交換色譜中，用5±1.0mM的乙酸鈉緩沖液平衡柱子，使得pH為6.0±0.1，并且控制流動(dòng)相的流速至95～145cm/hr。用1.5～2.0倍的上樣體積(LV)回收未吸附到陰離子交換色譜柱上的組分。

本發(fā)明中，步驟(c)為滅活病毒的步驟，該病毒例如為含免疫球蛋白的溶液中潛在的脂包膜病毒(lipid enveloped viruse)，然后除去用于滅活的物質(zhì)。在這個(gè)步驟中，可使用病毒滅活劑，優(yōu)選為溶劑和/或去污劑。最優(yōu)選地，可使用溶劑&去污劑處理所用的溶劑—去污劑的混合物。

通過步驟(c)，可滅活脂包膜病毒(例如HIV1和HIV2，C型肝炎以及非A-B-C型肝炎，HTLV 1和HTLV 2，皰疹病毒家族，包括CMV和人類皰疹病毒4型)，從而提高最終產(chǎn)品的安全性。

步驟(c)中，只要它們具有滅活病毒的性質(zhì)，可無限制地使用任何溶劑和去污劑，尤其是滅活脂包膜病毒。去污劑可選自由非離子型去污劑和離子型去污劑組成的組中，并且優(yōu)選為基本不變性的去污劑。特別地，在易于除去方面優(yōu)先選擇非離子型去污劑。溶劑最優(yōu)選為美國專利申請(qǐng)No.4,764,369中公開的磷酸三正丁酯(TNBP)，但是不限于此。

在本發(fā)明中所用的病毒滅活劑優(yōu)選為TNBP與選自聚山梨醇酯80(Tween 80)、Triton X-100和Triton X-45中的至少一種的混合物，但是不限于此。

加入優(yōu)選的溶劑/去污劑混合物，使得TNBP在含免疫球蛋白的溶液中的濃度為0.2～0.6wt％，優(yōu)選為0.24～0.36wt％，并使得Tween 80的濃度為0.8～1.5wt％，優(yōu)選為0.8～1.2wt％。

在滅活包膜病毒的條件下實(shí)施病毒的滅活步驟，產(chǎn)生基本抗病毒(virus-safe)的含免疫球蛋白的溶液。這樣的條件包括4～30℃、優(yōu)選19～28℃、最優(yōu)選24～26℃的溫度，以及1～24小時(shí)、優(yōu)選4～12小時(shí)，最優(yōu)選約8小時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間，以確保充分滅活病毒。

本發(fā)明中，可在4.5～5.5的pH下以110～130cm/hr的流速實(shí)施步驟(c)中的陽離子交換色譜。優(yōu)選地，調(diào)節(jié)pH至4.9～5.1。裝載到陽離子交換樹脂上的免疫球蛋白的量為90～130mg/每毫升陽離子交換樹脂，優(yōu)選為95～105mg/每毫升樹脂。在吸附免疫球蛋白后，用平衡緩沖液實(shí)施洗滌。用于洗滌的平衡緩沖液的用量可為至少3倍柱體積，優(yōu)選至少5倍柱體積。在洗滌后，用至少8倍柱體積的洗脫緩沖液洗脫免疫球蛋白。

本發(fā)明中所用的陽離子交換色譜可為Sephardex、Sepharose、HyperCell或Source，但是不限于此，還可使用本領(lǐng)域中已知的其它陽離子交換樹脂。本發(fā)明中，優(yōu)選使用陶瓷基陽離子交換樹脂。在本發(fā)明的實(shí)施例中，可將陶瓷基樹脂CM Hyper D凝膠用作陽離子交換樹脂，并將本領(lǐng)域中已知的平衡緩沖液(例如磷酸鈉緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液或乙酸鹽緩沖液)、洗滌緩沖液以及洗脫緩沖液用作柱緩沖液。

用具有足以有效洗脫IgG的pH和離子強(qiáng)度的基本非變性的緩沖液來實(shí)施從陽離子交換樹脂上洗脫免疫球蛋白，從而回收含免疫球蛋白的洗脫液。文中，“有效洗脫”意思是從陽離子交換樹脂上洗脫至少75％，例如至少80％，例如至少85％的裝載到陽離子交換樹脂上的免疫球蛋白溶液。

本發(fā)明中，可在足以從陽離子交換樹脂上移除免疫球蛋白的洗脫緩沖液的高鹽濃度下實(shí)施步驟(c)中的陽離子交換色譜。可在400～600mM，優(yōu)選在500mM的鹽濃度下實(shí)施。

此外，為了在步驟(d)的透析和/或濃縮期間保持免疫球蛋白的聚合物含量，可加入從陽離子交換色譜柱獲得的洗脫液到計(jì)算的透析和/或濃縮的溶液，從而保持鹽濃度在50～150mM,優(yōu)選為100mM或更低的恒定水平。當(dāng)在蛋白質(zhì)洗脫步驟中使用能保持低鹽濃度的洗脫方法時(shí)，可減小免疫球蛋白的聚合物含量，因此可純化質(zhì)量提高的免疫球蛋白。

本發(fā)明中，可使用超濾/滲濾(UF/DF)系統(tǒng)實(shí)施步驟(d)中的透析和/或濃縮。在10mOsmol/kg或更低的滲透壓下實(shí)施，然后調(diào)節(jié)pH至4.0～5.0。

本發(fā)明中，為了從陽離子交換色譜洗脫液中除去低分子量的離子，可實(shí)施滲濾，并可控制UF/DF系統(tǒng)中的滲透壓為10mOsmol/kg或更低。然后，向?yàn)V液中加入鹽酸(HCl)，以調(diào)節(jié)pH至4.5±0.1。

本發(fā)明中，可使用納米過濾系統(tǒng)實(shí)施步驟(e)中的過濾?？稍?.5～2.5巴的壓力下實(shí)施納米過濾。

本發(fā)明的方法可進(jìn)一步包括在步驟(e)之后加入穩(wěn)定劑的步驟，以制備用于靜脈注射的免疫球蛋白。

在完成納米過濾后，可加入本領(lǐng)域中已知的至少一種蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，其實(shí)例包括各種糖醇和糖類(例如山梨糖醇、甘露糖、葡萄糖、海藻糖、麥芽糖)，蛋白質(zhì)(例如白蛋白)，氨基酸(例如賴氨酸、甘氨酸等)，以及有機(jī)試劑(例如PEG和Tween 80)。

本發(fā)明中，步驟(e)后，加入的穩(wěn)定劑可為選自糖醇、麥芽糖、山梨糖醇、甘露糖、葡萄糖、海藻糖、白蛋白、賴氨酸、甘氨酸、PEG和Tween 80中的至少一種。優(yōu)選地，將麥芽糖用作穩(wěn)定劑。

可以加入穩(wěn)定劑至90～110g/l的濃度。在加入穩(wěn)定劑后，可調(diào)節(jié)免疫球蛋白溶液的pH至3.5～4.0。優(yōu)選地，可通過加入酸，優(yōu)選硫酸或鹽酸，調(diào)節(jié)pH至3.7～3.9。

納米過濾是重要的除去病毒步驟。本發(fā)明中，在2.0±0.5巴的壓力下通過Pall DVD預(yù)濾器和DV20病毒濾器過濾已透析和濃縮的免疫球蛋白溶液，而從免疫球蛋白溶液中除去病毒。然后，加入麥芽糖到已納米過濾的溶液中至100g/l的終濃度，以穩(wěn)定免疫球蛋白。通過加入鹽酸調(diào)節(jié)穩(wěn)定的免疫球蛋白溶液的pH至3.8±0.1。然后，使用0.2μm濾器滅菌并儲(chǔ)存。

可稀釋或濃縮用于靜脈注射的滅菌的免疫球蛋白制劑，使得蛋白質(zhì)(已純化的免疫球蛋白)的濃度為1～30wt％。本發(fā)明中，用WFI稀釋或者通過超濾濃縮滅菌的免疫球蛋白制劑，使得蛋白質(zhì)濃度為40～60g/l，優(yōu)選為45～55g/l，更優(yōu)選為49.5～50.5g/l。然后，將麥芽糖加到免疫球蛋白溶液中至100g/l的終濃度，并充分混合，然后測(cè)定免疫球蛋白制劑的pH，并將鹽酸加到免疫球蛋白溶液中，以調(diào)節(jié)pH至3.8±0.1，從而制備靜脈注射免疫球蛋白制劑。

在本發(fā)明的實(shí)施例中，測(cè)定每個(gè)制備步驟中免疫球蛋白溶液的純度(凝血酶/IgG)以及每個(gè)制備步驟中濾液或沉淀物中的FXI(人凝血因子XI)的濃度。因此，可看到純化了具有99％或更高純度的免疫球蛋白溶液(圖2)，并且除去了大部分的凝血因子FXI(表2和圖3)。

實(shí)施例

下文，將參考實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的是：這些實(shí)施例僅為描述的目的，而不能解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。因此，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍將由所附權(quán)利要求書及其等價(jià)方式所限定。

實(shí)施例1：制備靜脈注射免疫球蛋白

1-1:制備血漿

對(duì)于血漿，使用經(jīng)過生物檢測(cè)的FDA批準(zhǔn)的血漿，該生物檢測(cè)包括對(duì)人免疫缺陷病毒(HIV)、C型肝炎病毒(HCV)、B型肝炎病毒(HBV)和微小病毒B19進(jìn)行的核酸擴(kuò)增檢測(cè)以及血清學(xué)檢測(cè)。

本發(fā)明中，使用從紅十字協(xié)會(huì)得到的血漿(批號(hào)600A9008)。血漿儲(chǔ)存在﹣20℃或更低的溫度下直至使用。用瓶子切割機(jī)打開裝有血漿的瓶子，并通過在夾套式容器中1～6℃培養(yǎng)12～72小時(shí)而解凍血漿。

在上述條件下解凍血漿時(shí)，產(chǎn)生包含纖維蛋白原和凝血因子的冷凝蛋白。通過離心除去產(chǎn)生的冷凝蛋白，并回收剩余的不耐冷血漿。

1-2：沉淀Ⅰ步驟

為了進(jìn)一步從不耐冷血漿中除去凝血因子，實(shí)施沉淀Ⅰ步驟。

將96％乙醇加到實(shí)施例1-1中回收的不耐冷血漿中，使得在﹣3±1℃下的乙醇終濃度為8±0.8％，然后使用乙酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)溶液的pH至7.2±0.2。通過離心除去沉淀物，并回收上清液(添加Ⅰ上清液)。為了總活菌計(jì)數(shù)，取樣一部分上清液并儲(chǔ)存。

1-3：沉淀Ⅱ+Ⅲ步驟和過濾

為了沉淀實(shí)施例1-2中回收的上清液中含有的免疫球蛋白，實(shí)施沉淀Ⅱ+Ⅲ步驟。

另外將96％乙醇加到實(shí)施例1-2中回收的上清液中，使得在﹣5±1.0℃下的乙醇終濃度為20±2％。然后，使用乙酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)溶液的pH至6.9±0.1。

然后，以每千克血漿0.0284千克的量將助濾劑(Celite(STD)或Harbolite(膨脹珍珠巖產(chǎn)品))加到溶液中，并混合30±10分鐘?；旌衔镌诒３?～8℃溫度的冷藏室中的壓濾機(jī)(DG800K)上分離為上清液和沉淀物。

命名上清液為“上清液Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ(或Ⅱ+Ⅲ)”，并命名沉淀物為“組分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲw(或Ⅱ+Ⅲw)”(w；洗滌)。立即使用組分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲw(或Ⅱ+Ⅲw)，或在﹣20℃或更低的溫度下儲(chǔ)存。

1-4：沉淀Ⅲ步驟和過濾

為了進(jìn)一步從含免疫球蛋白的組分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲw(或Ⅱ+Ⅲw)中除去白蛋白、脂蛋白、凝血酶和其它不需要的蛋白質(zhì)，實(shí)施沉淀Ⅲ步驟。

在冷蒸餾水中溶解實(shí)施例1-3中回收的組分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲw(或Ⅱ+Ⅲw)，取樣并存儲(chǔ)一部分溶液，用于總活菌計(jì)數(shù)。然后，將96％乙醇加到已溶解的組分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ(或Ⅱ+Ⅲw)中，使得在﹣5±1.0℃下的乙醇終濃度為18±1.8％。然后，通過加入在﹣6℃下制備的乙酸鹽緩沖液而調(diào)節(jié)溶液的pH至5.2±0.1。

然后，通過壓濾機(jī)(DG800K)的方式分離混合物成上清液和沉淀物。命名上清液為“組分Ⅰ+Ⅲ(或Ⅲ)”，并且命名沉淀物為“組分Ⅰ+Ⅲ(或Ⅲ)”。丟棄組分Ⅰ+Ⅲ(或Ⅲ)，并取樣和存儲(chǔ)一部分濾液Ⅰ+Ⅲ(或Ⅲ)，用于總活菌計(jì)數(shù)。

1-5：沉淀Ⅱ步驟和過濾

為了沉淀實(shí)施例1-4中獲得的濾液Ⅰ+Ⅲ(或Ⅲ)中的免疫球蛋白，實(shí)施沉淀Ⅱ步驟。

將96％乙醇加到濾液Ⅰ+Ⅲ(或Ⅲ)中，使得在﹣10±2.0℃下的乙醇終濃度為25±2.5％。然后，通過加入1M的碳酸氫鈉調(diào)節(jié)溶液的pH至7.4±0.2。

然后，通過壓濾機(jī)(DG800K)的方式分離混合物成上清液和沉淀物。命名沉淀物為“組分Ⅱ的糊狀物”，并取樣和存儲(chǔ)一部分沉淀物，用于測(cè)量細(xì)菌內(nèi)毒素和蛋白質(zhì)的含量及其成分。

1-6：溶解組分Ⅱ的糊狀物并澄清過濾

為了提高從血漿中分離免疫球蛋白的含量并除去血栓性物質(zhì)，實(shí)施分離/純化工藝。

首先，溶解實(shí)施例1-5中分離的含免疫球蛋白的組分Ⅱ的糊狀物，以具有適于透析的條件。轉(zhuǎn)移組分Ⅱ的糊狀物到10℃或更低溫度的夾套式容器中，并通過向其中加入相當(dāng)于組分Ⅱ的糊狀物體積的4倍量的0.6％氯化鈉溶液而溶解，取樣并存儲(chǔ)一部分溶液，以測(cè)定蛋白質(zhì)含量及其成分。

然后，通過加入1M的乙酸調(diào)節(jié)溶液的pH至5.0±1，然后使用深濾器(BecodiskBP01)使溶液經(jīng)澄清過濾，從而獲得組分Ⅱ的溶液。

1-7：滲濾

滲濾實(shí)施例1-6中獲得的含免疫球蛋白的組分Ⅱ的溶液，以除去乙醇和低分子量離子，調(diào)節(jié)其pH，使得溶液具有適于陰離子交換色譜的條件。

在10mOsmol/kg或更低的滲透壓下使用超濾/滲濾系統(tǒng)(Millipore Pellicon2(50K))滲濾含免疫球蛋白的組分Ⅱ的溶液，取樣并存儲(chǔ)一部分獲得的濾液，以測(cè)量其蛋白質(zhì)含量及其成分，并計(jì)數(shù)活細(xì)胞。

通過加入1M乙酸鈉至5.0±1.0mM的濃度而調(diào)節(jié)濾液的pH至6.0±0.1，從而獲得透析和/或濃縮的免疫球蛋白溶液。

1-8：陰離子交換色譜

為了從實(shí)施例1-7中獲得的透析和/或濃縮的免疫球蛋白溶液中除去聚合物及其它血漿蛋白，實(shí)施陰離子交換色譜。

將陰離子交換樹脂DEAE-Sepharose凝膠(GE Healthcare,目錄號(hào)17-0709)裝入柱子中，然后用平衡緩沖液平衡，使得pH為6.0±0.1。然后，以120±25cm/hr的流速裝載實(shí)施例1-7中獲得的透析和/或濃縮的免疫球蛋白溶液到柱子中。然后，用1.5～2.0倍的上樣體積(LV)回收未吸附到陰離子交換色譜柱上的組分。

1-9：溶劑/去污劑處理以滅活病毒

為滅活含免疫球蛋白溶液中潛在的脂質(zhì)包膜病毒，實(shí)施用溶劑和去污劑處理溶液的步驟。

首先，調(diào)節(jié)所述組分的pH至5.0±0.1，將乙酸加到實(shí)施例1-8中未吸附到陰離子交換色譜柱并回收的組分中。然后，加入磷酸三正丁酯(TNBP)和聚山梨醇酯80(Tween 80)到所述組分分別至0.3±0.06％和1±0.2％的濃度，然后在200±50RPM下攪拌20～30分鐘。為了確定TNBP和Tween 80在溶液中是否均勻混合，取樣并分析一部分溶液。然后，在25±1.0℃、200±50RPM下連續(xù)攪拌溶液8小時(shí)。通過硬管轉(zhuǎn)移含免疫球蛋白的溶液到另一罐中(即病毒安全區(qū)(VSA))。

1-10：陽離子交換色譜

為了從經(jīng)溶劑/去污劑處理的免疫球蛋白溶液中除去TNBP、Tween 80和其它血栓性物質(zhì)，例如凝血因子，實(shí)施陽離子交換色譜。

陽離子交換樹脂CM Hyper D凝膠(Pall Corporation；目錄號(hào)20050)為陶瓷材料，將其裝入柱中，然后用平衡緩沖液平衡，使得pH為5.0±0.1。然后，以120±10cm/hr的流速裝載實(shí)施例1-9中用溶劑/去污劑處理的免疫球蛋白溶液到柱子中。然后，用至少5個(gè)柱子體積的洗滌緩沖液洗滌后，用洗脫緩沖液洗脫免疫球蛋白(洗脫緩沖液的組成：20mM NaOAc pH 4.5w/0.5M NaCl)，并回收(吸附速率：每毫升陽離子交換樹脂100毫克的免疫球蛋白)。

1-11：滲濾

為了從陽離子交換色譜洗脫液中除去低分子量離子，實(shí)施滲濾。

在10mOsmol/kg或更低的滲透壓下使用超濾/滲濾系統(tǒng)(Millipore Pellicon2(50K))滲濾實(shí)施例1-10中獲得的洗脫液。為了保持免疫球蛋白的聚合物含量，將陽離子交換色譜洗脫液加到計(jì)算的透析濃縮物中，并在保持100mM或更低的氯化鈉濃度的同時(shí)連續(xù)實(shí)施超濾/滲濾(UF/DF)。

取樣并儲(chǔ)存一部分獲得的濾液，以測(cè)量其蛋白含量及組成，并計(jì)數(shù)活細(xì)胞，通過加入鹽酸(HCl)而調(diào)節(jié)剩余濾液的pH至4.5±0.1。

1-12：納米過濾以及加入穩(wěn)定劑

納米過濾是重要的除菌步驟。在2.0±0.5巴的壓力下，通過FlorodyneⅡ預(yù)濾器(AB1DJL7PH4)過濾實(shí)施例1-11中獲得的透析/濃縮的免疫球蛋白溶液，并通過病毒濾器(DV20,AB3DV207PH4)過濾，從而除去免疫球蛋白溶液中的病毒。

為了穩(wěn)定免疫球蛋白，將麥芽糖加到納米過濾液中至100g/l的終濃度，并充分混合。然后測(cè)量穩(wěn)定的免疫球蛋白溶液的pH，通過加入鹽酸調(diào)節(jié)免疫球蛋白溶液的pH至3.8±0.1。

然后使用0.2μm的濾器滅菌濾液，并儲(chǔ)存在不銹鋼儲(chǔ)存罐中。

1-13：制備用于靜脈注射的免疫球蛋白制劑的最終制劑及無菌填充

用WFI稀釋或通過超濾濃縮生成的用于靜脈注射的免疫球蛋白制劑，使得蛋白質(zhì)濃度為50±1g/l。然后，向其中加入麥芽糖至100g/l的終濃度，并充分混合。然后測(cè)量穩(wěn)定的免疫球蛋白制劑的pH，并通過加入鹽酸調(diào)節(jié)pH至3.8±0.1。

在調(diào)節(jié)pH后，滅菌免疫球蛋白制劑，并轉(zhuǎn)移至包裝間，以制備產(chǎn)品，然后在2～8℃的溫度下儲(chǔ)存所述產(chǎn)品。

實(shí)施例2：測(cè)量每個(gè)制備步驟中免疫球蛋白溶液中產(chǎn)生的凝血酶/IgG(血栓栓塞風(fēng)險(xiǎn))

測(cè)量實(shí)施例1的每個(gè)制備步驟中取樣的免疫球蛋白制劑中產(chǎn)生的凝血酶/IgG(血栓栓塞風(fēng)險(xiǎn))。

2-1：實(shí)驗(yàn)方法

本發(fā)明中，根據(jù)FDA的六個(gè)附屬分析機(jī)構(gòu)之一的CBER(生物制品評(píng)價(jià)和研究中心)提供的Thrombin Generation方案(CBER Thrombin Generation protocol 01 Experiment(100916)a)實(shí)施實(shí)施例1的每個(gè)步驟中免疫球蛋白溶液的血栓栓塞風(fēng)險(xiǎn)的測(cè)量。

2-2：實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)本發(fā)明的免疫球蛋白純化工藝包括Cohn血漿分級(jí)方法和離子交換色譜純化技術(shù)。如下面的圖2和表1所示，可看到在色譜純化工藝的陽離子交換色譜中，與初期相比，有效地減少了產(chǎn)生的凝血酶(即血栓性物質(zhì))的量至大約95％。

表1：每個(gè)制備過程中獲得產(chǎn)物的分析

上面表1中的結(jié)果顯示了可減小靜脈注射免疫球蛋白引起的血栓形成，因此可有效地防止血栓形成引起的血栓栓塞，從而提高免疫球蛋白的安全性。

實(shí)施例3：在每個(gè)制備步驟中測(cè)量濾液或沉淀物中FXI(人凝血因子XI)的濃度

為了檢測(cè)除去凝結(jié)劑的程度，通過ELISA(AssayMax Human Factor XI(FXI)ELISA Kit；ssaypro,目錄號(hào)EF1011-1)和SDS—PAGE測(cè)量實(shí)施例1的每個(gè)制備步驟中取樣的濾液和沉淀物中的FXI(人凝血因子XI)的濃度。

表2：純化過程產(chǎn)品的FXI含量

可通過ELISA和SDS—PAGE測(cè)量根據(jù)本發(fā)明的純化過程產(chǎn)物的FXI含量。因此，從上面的表2和圖3可以看出，凝血酶和FXI的量在陰離子交換色譜過程中未變化，但是凝血酶和FXI在從陽離子交換色譜過程獲得的洗脫液中的量低于檢測(cè)限，并且在陽離子交換色譜過程中完全回收了FXI。

工業(yè)實(shí)用性

當(dāng)使用根據(jù)本發(fā)明的純化免疫球蛋白的方法時(shí)，可提高除去雜質(zhì)和血栓性物質(zhì)的效率，并且可保持免疫球蛋白的聚合物含量，所以可生產(chǎn)提高質(zhì)量的穩(wěn)定的免疫球蛋白。

盡管已經(jīng)參考具體的特征詳細(xì)描述了本發(fā)明，但是對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是：該描述僅用于優(yōu)選的實(shí)施方式，而非限制本發(fā)明的范圍。因此，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍將由所附權(quán)利要求及其等價(jià)方式所限定。