使用辛酸進(jìn)行使病毒滅活或去除的蛋白質(zhì)純化。

背景

生物藥物或使用包含治療性蛋白質(zhì)的藥物組合物治療疾病、病癥或狀況是許多制藥和生物技術(shù)公司的戰(zhàn)略要素。生物藥物組合物中使用的許多蛋白質(zhì)通過使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系進(jìn)行重組生產(chǎn)或通過從生物流體中純化而獲得。然而，通過這樣的方法制備的治療性蛋白質(zhì)可能被病毒污染，表面上帶有傳染性致病病毒，這可能對(duì)個(gè)體的健康有害。有必要對(duì)包含治療性蛋白質(zhì)的介質(zhì)進(jìn)行處理以消除任何潛在的污染的病毒的活性。

傳染性致病病毒的滅活可通過熱滅活、溶劑/去污劑(S/D)滅活、pH滅活、化學(xué)滅活和/或輻照滅活來進(jìn)行，其中S/D滅活可能是最廣泛接受的可靠方法。

大多數(shù)人類病原體是有包膜病毒。這些病毒對(duì)由溶劑和去污劑引起的膜破裂敏感。采用熱、酸性pH、化學(xué)品和輻照的滅活方法是有問題的，因?yàn)檫@些手段是刺激性和/或侵入性的，并且傾向于使被純化的治療性蛋白質(zhì)變性或以其它方式失活。

對(duì)于病毒的滅活，作為藥物產(chǎn)品純化過程中病毒清除的一部分，通常通過去污劑或低pH處理步驟將有包膜病毒滅活，在該步驟中向藥物產(chǎn)品的溶液添加去污劑或?qū)⑵鋚H調(diào)節(jié)至約3.7(3.5-3.9)持續(xù)長(zhǎng)達(dá)6小時(shí)或更久。然而，去污劑并不總是對(duì)所有種類的有包膜病毒都有效，它們可能具有環(huán)境問題，或者對(duì)于低pH滅活而言，因?yàn)楫?dāng)pH高于3.8時(shí)滅活效應(yīng)逐漸消失，所以操作窗口非常窄。相反，當(dāng)pH值低于3.5時(shí)，許多蛋白質(zhì)的聚集體形成或變性風(fēng)險(xiǎn)急劇增加。

EP 0 374 625已經(jīng)表明，辛酸在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大多數(shù)有包膜病毒是有效的。US 4,939,176報(bào)道了一種通過使生物活性蛋白質(zhì)的溶液與辛酸接觸來滅活該溶液中的病毒的方法。針對(duì)該方法所記載的優(yōu)選條件是pH 4至pH 8，以及0.07(％w/w)至0.001(％w/w)的非電離形式的辛酸。

利用化學(xué)劑的其它病毒滅活方法是已知的。US 4,540,573教導(dǎo)了使用二烷基磷酸酯或三烷基磷酸酯作為抗病毒劑。US 4,534,972描述了一種使得治療活性或免疫活性蛋白質(zhì)溶液基本上不含病原體的方法。在US 4,534,972中，將蛋白質(zhì)溶液與諸如菲咯啉銅等過渡金屬絡(luò)合物和還原劑接觸，以在基本上不影響蛋白質(zhì)活性的情況下實(shí)現(xiàn)病毒的滅活。

US 5,164,487涉及使用辛酸制備不含聚集體、血管活性物質(zhì)和蛋白水解酶的IgG制劑。該方法包括在用離子交換或疏水性基質(zhì)進(jìn)行層析純化之前使含有IgG的起始材料與0.4％至1.5％的辛酸接觸。

Steinbuch等人顯示了使用辛酸來沉淀存在于Cohn乙醇級(jí)分III中的大多數(shù)蛋白質(zhì)和脂蛋白(除了免疫球蛋白以外)(Steinbuch等人，1973)。已經(jīng)描述了免疫球蛋白從哺乳動(dòng)物血清和腹水中的兩步純化(McKinney等人，1987)。首先使用辛酸來沉淀白蛋白和其它非IgG蛋白質(zhì)，然后將硫酸銨添加至上清液中以使IgG沉淀。

在人免疫球蛋白制備過程中，通常認(rèn)為只要優(yōu)化了諸如溫度和離子強(qiáng)度等參數(shù)，在pH 4.8下辛酸是大多數(shù)血漿蛋白質(zhì)的有效沉淀劑。Steinbuch等人(1969)已經(jīng)描述了用辛酸沉淀大部分血漿蛋白質(zhì)，而不影響IgG、血漿銅藍(lán)蛋白和IgA。Steinbuch等人使用辛酸從哺乳動(dòng)物血清中分離了IgG，并且報(bào)道，在微酸性pH但不低于pH 4.5時(shí)，最佳地獲得了大量的非免疫球蛋白沉淀。將血漿用pH 4.8的0.06M乙酸鹽緩沖液2∶1稀釋，然后用2.5wt.％辛酸鹽處理以啟動(dòng)沉淀。

概述

本發(fā)明提供了一種從樣品中純化目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法，其包括以下步驟：

i.將含有蛋白質(zhì)的樣品加載至固定相上，以使目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合至所述固定相；

ii.使具有結(jié)合的目標(biāo)蛋白質(zhì)的固相接觸辛酸溶液；其中該辛酸溶液處于允許形成游離辛酸的pH下，并且其中如針對(duì)游離辛酸所測(cè)量的，該辛酸溶液是濃度為1至50mM的辛酸緩沖液；以及

iii.洗脫所述目標(biāo)蛋白質(zhì)。

本發(fā)明最終實(shí)現(xiàn)引入辛酸處理作為層析步驟的一部分，以便在沒有不連續(xù)過程并且不需要人員關(guān)注的情況下進(jìn)行病毒滅活，特別是在洗脫物的pH調(diào)節(jié)通過將其洗脫至緩沖液中而自動(dòng)進(jìn)行的情況下。

本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種從樣品中純化目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法，其包括以下步驟：

i.將含有蛋白質(zhì)的樣品加載至固定相上，以使目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合至所述固相；

ii.使所述固相接觸辛酸溶液；以及

iii.洗脫所述目標(biāo)蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的又一方面涉及一種含有蛋白質(zhì)的混合物中的病毒的滅活方法，其包括以下步驟：i.將樣品加載至固定相上，以使目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合至所述固相；ii.使所述固相接觸辛酸溶液，以便滅活并洗掉所述病毒；以及iii.洗脫所述目標(biāo)蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的另一方面涉及一種制備無病毒蛋白質(zhì)溶液的方法，其包括以下步驟：i.將樣品加載至固定相上，以使目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合至所述固相；ii.使所述固相經(jīng)歷辛酸溶液洗滌，以便滅活并洗掉所述病毒；以及iii.洗脫所述目標(biāo)蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的備選方面涉及一種病毒滅活方法，其中將包含a)目標(biāo)蛋白質(zhì)和b)一種或多種病毒類型的樣品加載至固定相上，并用辛酸溶液洗滌。

一種滅活含有脂質(zhì)外殼的病毒的方法，該方法包括以下步驟：i.將樣品加載至固定相上，以使目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合至所述固相；ii.使所述固相經(jīng)歷辛酸溶液洗滌，以便滅活并洗掉所述病毒；以及iii.洗脫所述目標(biāo)蛋白質(zhì)。

本發(fā)明還涉及從包括以下步驟的方法獲得的、基本上不含含有脂質(zhì)外殼的病毒的蛋白質(zhì)樣品：i.將樣品加載至固定相上，以使目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合至所述固相；ii.使所述固相經(jīng)歷辛酸溶液洗滌，以便滅活并洗掉所述病毒；以及iii.洗脫所述目標(biāo)蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的再一方面涉及含有蛋白質(zhì)的混合物中的支原體的滅活方法，其包括以下步驟：i.將樣品加載至固定相上，以使目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合至所述固相；ii.使所述固相接觸辛酸溶液，以便滅活并洗掉所述支原體；以及iii.洗脫所述目標(biāo)蛋白質(zhì)。

本發(fā)明還可解決從示例性實(shí)施方案的公開內(nèi)容中可以明顯看出的其它問題。

詳述

本發(fā)明的一個(gè)方面涉及層析步驟過程中伴行的病毒滅活和蛋白質(zhì)純化。本發(fā)明的方法不需要技術(shù)人員參與滅活步驟以及單獨(dú)向柱上加載。單一的滅活和捕獲步驟可在沒有技術(shù)人員參與的情況下進(jìn)行。

通常，目標(biāo)蛋白質(zhì)的純化包括對(duì)所述樣品中的潛在病毒的滅活。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及無病毒蛋白質(zhì)溶液的制備和根據(jù)本發(fā)明方法制備的無病毒蛋白質(zhì)溶液。本發(fā)明的方法包括在加載含有蛋白質(zhì)的溶液之后并在蛋白質(zhì)洗脫之前，通過用含有辛酸的洗滌溶劑洗滌層析柱或膜來將病毒滅活。本發(fā)明的方法還滅活支原體并導(dǎo)致更大程度的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(HCP)減少。

對(duì)于本發(fā)明的蛋白質(zhì)純化和病毒滅活，辛酸溶液必須包含處于其游離酸或非電離酸形式的辛酸；也就是說，基本上作為游離辛酸或非電離辛酸。術(shù)語(yǔ)“游離辛酸”和“非電離辛酸”旨在表示處于其非解離形式的辛酸；也就是說，處于其質(zhì)子化形式；即CH₃(CH₂)₆CO₂H。

本發(fā)明涉及從包含蛋白質(zhì)的任何介質(zhì)或樣品中分離或純化一種或多種目標(biāo)蛋白質(zhì)，通常是一種目標(biāo)蛋白質(zhì)，該介質(zhì)或樣品可進(jìn)一步包含、潛在包含或包含一種或多種病毒。該樣品可以是粗介質(zhì)或已經(jīng)以任何方式部分洗滌、過濾、滲濾(diafiltered)或部分純化的介質(zhì)。適當(dāng)?shù)兀摌悠愤x自發(fā)酵液、細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞系培養(yǎng)基、腹水、組織培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)基、人類或動(dòng)物血液、包含血漿成分的人類或動(dòng)物血漿。通常，該樣品選自細(xì)胞系培養(yǎng)基如轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)基以及人類或動(dòng)物血漿。

所述樣品或含有蛋白質(zhì)的混合物是包含蛋白質(zhì)的流體，該蛋白質(zhì)一般是具有生物或治療活性的蛋白質(zhì)。流體可以是具有被病毒污染的可能性的任何流體。流體的非限制性實(shí)例包括組織和細(xì)胞培養(yǎng)提取物，如細(xì)胞裂解物、細(xì)胞上清液、胎盤提取物或腹水；生物流體，如血液、血漿、血清、乳汁、唾液、精液；或者包含具有活性的蛋白質(zhì)的任何其它流體，或任何純化的、部分純化的此類流體，或包括來自先前純化步驟的洗脫液的粗液體或膠體。

如上所述，在本發(fā)明中使用的樣品以細(xì)胞系培養(yǎng)基如轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)基以及人類或動(dòng)物血漿作為其來源。

包含本發(fā)明蛋白質(zhì)的本發(fā)明樣品可以獲自天然表達(dá)該蛋白質(zhì)的生物體，經(jīng)遺傳工程化而表達(dá)該蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因生物體，或重組產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的細(xì)胞系。轉(zhuǎn)基因生物體的非限制性實(shí)例包括本文公開的已被遺傳工程化而表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)的生物體。包含蛋白質(zhì)的本發(fā)明樣品可來自生物體或轉(zhuǎn)基因生物體，可使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法從生物流體、組織或器官提取物或生物體的其它來源獲得。此外，各種原核和/或真核表達(dá)系統(tǒng)也可以是本發(fā)明樣品的來源，例如用于重組表達(dá)本文公開的蛋白質(zhì)。作為本發(fā)明蛋白質(zhì)的來源的表達(dá)系統(tǒng)可以包括但不限于誘導(dǎo)型表達(dá)、非誘導(dǎo)型表達(dá)、組成型表達(dá)、組織特異性表達(dá)、細(xì)胞特異性表達(dá)、病毒介導(dǎo)的表達(dá)、穩(wěn)定整合的表達(dá)和瞬時(shí)表達(dá)。

本發(fā)明的蛋白質(zhì)可由克隆至表達(dá)載體中的多核苷酸編碼。原核表達(dá)載體、真核表達(dá)載體、酵母載體、昆蟲載體、哺乳動(dòng)物載體和其它合適的表達(dá)載體是本領(lǐng)域已知并且可商購(gòu)獲得的。

從生物體、轉(zhuǎn)基因生物體或細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)初始收獲后，包含本發(fā)明蛋白質(zhì)的樣品可經(jīng)歷包括滲濾過程的純化或過濾過程。樣品的這種初始或初步純化可包括樣品中蛋白質(zhì)的濃縮、用于去除雜質(zhì)的中間純化步驟和用于去除其他雜質(zhì)和蛋白質(zhì)變體的精制步驟(polishing)中的一種或多種。

本發(fā)明的一個(gè)目的是滅活含有蛋白質(zhì)的樣品中的病毒。短語(yǔ)“病毒滅活”旨在表示特定樣品中病毒顆粒數(shù)目的降低(“減少”)，和/或特定樣品中病毒顆?；钚缘慕档?，例如但不限于感染性和/或復(fù)制能力的降低。術(shù)語(yǔ)“病毒滅活”是指使在正常情況下能夠復(fù)制的病毒體不能復(fù)制。該術(shù)語(yǔ)進(jìn)一步包括從樣品中去除病毒(至少部分地)或使其數(shù)目降低或減少。該術(shù)語(yǔ)包括在不知道是否存在病毒的情況下實(shí)施所述方法。例如，可將該方法應(yīng)用于來自全血或血漿或細(xì)胞上清液的蛋白質(zhì)，其中沒有對(duì)病毒的存在與否進(jìn)行表征并且不能保證來自血漿和細(xì)胞上清液的蛋白質(zhì)對(duì)于向個(gè)體施用是安全的。本發(fā)明的實(shí)施方案導(dǎo)致但不限于超過6log₁₀的病毒載量降低。也就是說，基于當(dāng)前的檢測(cè)極限，該方法導(dǎo)致病毒復(fù)制與對(duì)照相比減少1,000,000。

病毒顆粒的數(shù)目和/或活性的所述降低可以是約1％至約100％，優(yōu)選約20％至約100％，更優(yōu)選約30％至約100％，更優(yōu)選約40％至約100％，甚至更優(yōu)選約50％至約100％，甚至更優(yōu)選約60％至約100％，更優(yōu)選至少約70％，如至少約80％，更典型地至少約90％，如約95％至100％，優(yōu)選約95％至約100％，典型地約99％至約100％的量級(jí)。

在某些非限制性實(shí)施方案中，純化的抗體產(chǎn)物中病毒(若存在)的總量低于該病毒的ID50(將感染50％的目標(biāo)群體的病毒量)或PFU(噬斑形成單位)，優(yōu)選比該病毒的ID50/PFU低至少100倍，更優(yōu)選比該病毒的ID50/PFU低至少10,000倍，更優(yōu)選比該病毒的ID50/PFU低至少1,000,000倍。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的方法可滅活樣品中的病毒，該病毒隨后可從樣品中去除，或者該方法既可滅活又可從樣品中去除病毒。

本說明書的各方面部分地公開了含有脂質(zhì)外殼的病毒。被稱為病毒體的完整病毒顆粒由被稱為衣殼的保護(hù)性蛋白質(zhì)外殼所包圍的核酸(DNA或RNA)組成。病毒可以分為無包膜病毒和有包膜病毒。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“含有脂質(zhì)外殼的病毒”是指包含含有脂質(zhì)的膜或包膜的任何病毒，例如有包膜病毒。有包膜病毒的殼體被脂蛋白膜或包膜圍繞。由于病毒從宿主細(xì)胞的表面“芽生”，因此該包膜源自該宿主細(xì)胞并且主要由不被病毒基因組編碼的脂質(zhì)組成。有包膜病毒的大小在約45-55nm至約120-200nm的范圍內(nèi)。能夠感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的含有脂質(zhì)外殼的病毒包括：DNA病毒，如皰疹病毒科(herpesviridae)病毒、痘病毒科(poxviridae)病毒或嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)病毒；RNA病毒，如黃病毒科(fliaviviridae)病毒、披膜病毒科(togaviridae)病毒、冠狀病毒科(coronaviridae)病毒、δ-病毒屬(deltavirus)病毒、正粘病毒科(orthomyxoviridae)病毒、副粘病毒科(paramyxoviridae)病毒、彈狀病毒科(rhabdoviridae)病毒、布尼亞病毒科(bunyaviridae)病毒或纖絲病毒科(filoviridae)病毒；以及逆轉(zhuǎn)錄病毒，如逆轉(zhuǎn)錄病毒科(retroviridae)病毒或嗜肝DNA病毒科病毒。含有脂質(zhì)外殼的病毒的非限制性實(shí)例包括人類免疫缺陷病毒、辛德畢斯病毒(sindbis virus)、單純皰疹病毒、假狂犬病病毒、仙臺(tái)病毒、水泡性口炎病毒、西尼羅河病毒(West Nile virus)、牛病毒性腹瀉病毒、冠狀病毒(corona virus)、馬關(guān)節(jié)炎病毒、嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征病毒、鼠白血病病毒(MuLV)、傳染性牛鼻氣管炎病毒(IBRV)或痘苗病毒。

無包膜病毒是指殼體缺少脂蛋白膜或包膜的病毒。在無包膜病毒中，殼體介導(dǎo)向宿主細(xì)胞的附著和滲透。殼體通常是螺旋形或二十面體的。無包膜病毒的大小在約18-26nm至約70-90nm的范圍內(nèi)。能夠感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的無包膜病毒包括，例如細(xì)小病毒科(parvoviridae)病毒、腺病毒科(adenoviridae)病毒、雙RNA病毒科(birnaviridae)病毒、乳頭瘤病毒科(papillomaviridae)病毒、多瘤病毒科(polyomaviridae)病毒、小RNA病毒科(picornaviridae)病毒、呼腸病毒科(reoviridae)病毒和杯狀病毒科(calciviridae)病毒。

所述病毒可以是但不限于MuLV、IBRV、HIV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、埃博拉病毒(Ebola)、西尼羅河病毒和漢坦病毒(hantavirus)，具有污染血液供應(yīng)和基于血液的產(chǎn)品的潛力。難以在不嚴(yán)重?fù)p害蛋白質(zhì)的質(zhì)量和/或功能性的情況下去除或滅活可能存在于血液產(chǎn)品中的病毒劑。工業(yè)相關(guān)病毒的非限制性實(shí)例是：細(xì)小病毒科、副粘病毒科、正粘病毒科、布尼亞病毒科、彈狀病毒科、呼腸孤病毒科、披膜病毒科、杯狀病毒科、呼腸病毒科和小RNA病毒科。

所述病毒包括但不限于單鏈DNA病毒、雙鏈DNA病毒、雙鏈RNA病毒和單鏈RNA病毒。在進(jìn)一步的方面，該病毒是有包膜病毒。有包膜病毒包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒或嗜肝DNA病毒(hepadnavirus)。在本發(fā)明的任何變化形式中，病毒可以選自腺病毒、非洲豬瘟病毒(African swine fever-line virus)、沙粒病毒(arenavirus)、動(dòng)脈病毒(arterivirus)、星狀病毒(astrovirus)、桿狀病毒(baculovirus)、桿狀DNA病毒(badnavirus)、桿狀RNA病毒(barnavirus)、雙RNA病毒(birnavirus)、雀麥花葉病毒(bromovirus)、布尼亞病毒(bunyavirus)、杯狀病毒(calicivirus)、毛狀病毒(capillovirus)、石竹隱潛病毒(carlavirus)、花椰菜花葉病毒(caulimovirus)、圓環(huán)病毒(circovirus)、線形病毒(closterovirus)、豇豆花葉病毒(comovirus)、冠狀病毒(coronavirus)、被蓋病毒(cotricovirus)、囊狀病毒(cystovirus)、δ-病毒(deltavirus)、石竹病毒(dianthovirus)、耳突花葉病毒(enamovirus)、纖絲病毒(filovirus)、黃病毒(flavivirus)、真菌傳桿狀病毒(furovirus)、福塞爾噬菌體(fusellovirus)、雙粒病毒(geminivirus)、嗜肝DNA病毒(hepadnavirus)、皰疹病毒(herpesvirus)、大麥病毒(hordeivirus)、低毒病毒(hypovirus)、ideaovirus、絲桿病毒(inovirus)、虹彩病毒(iridovirus)、輕小病毒(levivirus)、脂毛病毒(lipothrixvirus)、黃矮病毒(luteovirus)、玉米褪綠斑駁病毒(machlomovirus)、玉米雷亞多非納病毒(marafivovirus)、微小病毒(microvirus)、肌尾病毒(myovirus)、壞死病毒(necrovirus)、野田村病毒(nodavirus)、正粘病毒(orthomyxovirus)、乳多空病毒(papovavirus)、副粘病毒(paramyxovirus)、分病毒(partitivirus)、細(xì)小病毒(parvovirus)、藻DNA病毒(phycodnavirus)、小RNA病毒(picornavirus)、芽生病毒(plamavirus)、短尾病毒(podovirus)、多DNA病毒(polydnavirus)、馬鈴薯X病毒(potexvirus)、馬鈴薯Y病毒(potyvirus)、痘病毒(poxvirus)、呼腸孤病毒(reovirus)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)、彈狀病毒(rhabdovirus)、根前毛菌噬菌體(rhizidiovirus)、sequevirus、長(zhǎng)尾病毒(siphovirus)、南方菜豆花葉病毒(sobemovirus)、覆蓋層病毒(tectivirus)、纖細(xì)病毒(tenuivirus)、四病毒(tetravirus)、煙草花葉病毒(tobamavirus)、煙草脆裂病毒(tobravirus)、披膜病毒(togavirus)、番茄叢矮病毒(tombusvirus)、全病毒(totivirus)、蘋果退綠葉斑病毒(trichovirus)、蕪菁黃花葉病毒(tymovirus)和幽影病毒(umbravirus)。在一些方面，病毒包括但不限于家畜流行性出血性疾病病毒(EHDV)、小鼠微小病毒(MMV)、小鼠細(xì)小病毒-1(MPV)、卡什谷病毒(cache valley virus)、囊病毒(Vesivirus)2117、豬圓環(huán)病毒(PCV1)、豬圓環(huán)病毒2(PCV2)、犬細(xì)小病毒(CPV)、牛細(xì)小病毒(BPV)或藍(lán)舌病病毒(BTV)。

本發(fā)明的蛋白質(zhì)通常是具有活性的蛋白質(zhì)；優(yōu)選地具有生物活性。該蛋白質(zhì)可以是希望消除其中任何污染性病毒活性的任何感興趣的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的方法無限制地適用于所有蛋白質(zhì)。如熟練技術(shù)人員所知，含有蛋白質(zhì)的樣品中的蛋白質(zhì)通常是選擇固定相的決定因素，因此不是本發(fā)明方法的限制因素。術(shù)語(yǔ)蛋白質(zhì)旨在表示具有二級(jí)結(jié)構(gòu)并任選地具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的寡肽或多肽鏈。術(shù)語(yǔ)蛋白質(zhì)包括糖基化的寡肽、多肽和蛋白質(zhì)，其包括糖蛋白，或與核酸序列連接的寡肽、多肽和蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)可包含本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何翻譯后修飾。蛋白質(zhì)可包含非蛋白質(zhì)元素、連接或修飾。特別是涉及但不限于來自轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的蛋白質(zhì)時(shí)，本發(fā)明方法的蛋白質(zhì)可包含一種或數(shù)種非天然氨基酸和/或非天然異構(gòu)體。

本發(fā)明的方法無限制地適用于來自所有來源的蛋白質(zhì)。含有蛋白質(zhì)的樣品中的蛋白質(zhì)可選自血液蛋白質(zhì)、乳蛋白質(zhì)、細(xì)胞或細(xì)胞提取物蛋白質(zhì)。含有蛋白質(zhì)的樣品中的蛋白質(zhì)通常是血液蛋白質(zhì)或來自細(xì)胞提取物的蛋白質(zhì)，或激素。更典型地選自抗體或其片段，如Fab或單鏈抗體；受體，如可溶性受體；凝血因子，如FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI和FVIII；或生長(zhǎng)激素。

術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白質(zhì)”能夠可互換地使用，以指代任何長(zhǎng)度的氨基酸的聚合物。該聚合物可以是直鏈或支鏈的，其可以包含修飾的氨基酸，并且其可以被非氨基酸中斷。該術(shù)語(yǔ)還包括已被天然修飾或通過干預(yù)修飾的氨基酸聚合物；例如二硫鍵形成、糖基化、脂化(lipidation)、乙?；⒘姿峄蛉魏纹渌僮骰蛐揎?，如與標(biāo)記組分綴合。該定義中還包括，例如，含有一種或多種氨基酸類似物(包括，例如非天然氨基酸等)以及本領(lǐng)域已知的其它修飾的多肽。

術(shù)語(yǔ)“抗體”以最廣泛的含義使用，并且具體涵蓋例如單個(gè)單克隆抗體(包括激動(dòng)劑、拮抗劑和中和抗體)、具有多表位特異性的抗體組合物、多克隆抗體、單鏈抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、免疫粘附素和抗體片段，只要它們表現(xiàn)出所需的生物或免疫活性即可。術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白”(Ig)在本文中可與抗體互換使用。

術(shù)語(yǔ)“抗體片段”包含全長(zhǎng)抗體的一部分，通常是其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；單鏈抗體分子；雙抗體(diabodies)；線性抗體；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。

如本文使用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”是指從基本均質(zhì)性抗體群體獲得的抗體，即除了可少量存在的可能天然存在的突變之外，組成該群體的單個(gè)抗體均是相同的。本文的單克隆抗體包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與來源于特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而該鏈的其余部分與來源于另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及這些抗體的片段，只要它們表現(xiàn)出生物活性即可。

如上所述，純化的精確定制(tailoring)依賴于對(duì)待純化蛋白質(zhì)的考慮。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離步驟將抗體與一種或多種HCP分離?？墒褂帽疚乃龇椒ǔ晒兓目贵w包括但不限于人IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM抗體。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的純化策略排除蛋白A親和層析的使用，例如IgG3抗體的純化，因?yàn)镮gG3抗體與蛋白A結(jié)合的效率低。允許具體定制純化方案的其它因素包括但不限于：Fc區(qū)的存在與否(例如，在全長(zhǎng)抗體與其Fab片段相比的情況下)，因?yàn)榈鞍譇與Fc區(qū)結(jié)合；在產(chǎn)生感興趣抗體中使用的特定種系序列；以及抗體的氨基酸組成(例如，抗體的一級(jí)序列以及分子的總電荷/疏水性)。共享一種或多種特征的抗體可使用為利用該特征而定制的純化策略進(jìn)行純化。

本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以是血液蛋白質(zhì)，如凝血蛋白、白蛋白和/或免疫球蛋白。血液蛋白質(zhì)的非限制性實(shí)例包括ADAMTS-13、a1-抗纖溶酶、a2-抗纖溶酶、抗凝血酶、抗凝血酶III、癌性促凝物(cancer procoagulant)、促紅細(xì)胞生成素、因子II、因子V、因子VI、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、纖連蛋白、纖維蛋白原、肝素輔因子II、高分子量激肽原、肌內(nèi)免疫球蛋白、靜脈內(nèi)免疫球蛋白、纖溶酶原、纖溶酶原激活物抑制劑-1、纖溶酶原激活物抑制劑-2、前激肽釋放酶、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相關(guān)蛋白酶抑制劑、組織因子、組織纖溶酶原激活物、尿激酶或Von Willebrand因子。

本發(fā)明適合于從樣品中分離和純化抗體。通常，該樣品包含細(xì)胞系收獲物，其中該細(xì)胞系用于產(chǎn)生特異性蛋白質(zhì)，例如本發(fā)明的特異性抗體。

實(shí)施例2和3綜合起來表明，本發(fā)明的方法允許不同種類蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)純化，因?yàn)榘殡S著兩種不同蛋白質(zhì)類型(即一個(gè)實(shí)例中的重組人抗體(IgG1)和另一個(gè)實(shí)例中的Fab)的純化，實(shí)現(xiàn)了病毒如eMuLV的完全清除。此外，該實(shí)施例證明了伴行的抗體純化與病毒滅活。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述樣品包含選自抗體或其片段、凝血因子和激素的蛋白質(zhì)。該抗體優(yōu)選選自抗TNF抗體、抗IL-6抗體、抗IL-8抗體、抗IL-12抗體、抗IL-16抗體、抗IL-20抗體、抗IL-21抗體、抗IL-23抗體、抗DR3抗體、抗CD27抗體、抗C5aR-215抗體、抗CD30抗體、抗TREM-1抗體、抗TREM-2抗體、抗uPA抗體、抗uPAR抗體、抗OX40抗體、抗BTLA抗體、抗GLP-1抗體、抗LAIR1抗體、抗LAIR2抗體、抗LILRAl抗體、抗Ly9抗體、抗PD1抗體、抗Siglec-9抗體、抗MMP2抗體、抗MMP6抗體、抗MMP8抗體、抗MMP9抗體和抗TIM3抗體。

所述蛋白質(zhì)可以是激素，如選自hGH、胰高血糖素、kisspeptin和胰島素的激素。

在典型的實(shí)施方案中，向填充有樹脂的柱上加載澄清化的含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的培養(yǎng)液。該柱通常加載約1至50g蛋白質(zhì)/L樹脂，如5-50g蛋白質(zhì)/L樹脂，典型地5至25g蛋白質(zhì)/L樹脂，更典型地10-20g蛋白質(zhì)/L樹脂。用pH在約5至6之間的含有約20-40mmol/kg辛酸鈉的水性溶劑洗滌該柱，在pH穩(wěn)定后持續(xù)約30分鐘。在用含有甲酸的溶劑洗脫蛋白質(zhì)之前，任選地用不同的溶劑進(jìn)一步洗滌該柱以去除雜質(zhì)。

樣品向固定相上的加載可包括下列層析程序中的一種或多種：離子交換層析、親和層析、混合模式層析和疏水相互作用層析。

因此，固定相可包含本領(lǐng)域已知的任何層析介質(zhì)，包括用蛋白質(zhì)結(jié)合配體、蛋白質(zhì)、陰離子交換劑、陽(yáng)離子交換劑固定的惰性基質(zhì)。優(yōu)選地，固定相是用于親和層析的介質(zhì)。

蛋白質(zhì)從其病毒內(nèi)含物中的純化或病毒滅活是本發(fā)明的目的。實(shí)施例1顯示，如通過摻加的eMuLV的清除所確定的，在具有Capto L介質(zhì)的柱上采用辛酸洗滌進(jìn)行的層析步驟完全清除了病毒內(nèi)含物。實(shí)施例2在具有蛋白A介質(zhì)的柱上也看到在實(shí)施例1中所看到的eMuLV的完全清除。因此，如通過病毒載量的清除所確定的蛋白質(zhì)從其病毒內(nèi)含物中的純化或病毒滅活不依賴于柱中的介質(zhì)。

當(dāng)使用重組技術(shù)時(shí)，蛋白質(zhì)可在細(xì)胞內(nèi)、壁膜間隙中產(chǎn)生，或直接分泌到樣品培養(yǎng)基中。在一個(gè)方面，例如如果蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，則在將樣品加載到固相上之前，可任選地通過例如離心或超濾去除顆粒碎片，該碎片為宿主細(xì)胞或裂解的細(xì)胞(例如，由均質(zhì)化產(chǎn)生的)。然而，該方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是這種預(yù)備步驟不是必需的。當(dāng)抗體分泌到培養(yǎng)基中時(shí)，可以首先使用可商購(gòu)獲得的蛋白質(zhì)濃縮過濾器濃縮來自這類表達(dá)系統(tǒng)的上清液。

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分泌到培養(yǎng)基中時(shí)，也可以通過例如切向流過濾將重組宿主細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)基中分離?？梢允褂帽景l(fā)明的方法從培養(yǎng)基中純化本發(fā)明的蛋白質(zhì)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，親和層析步驟包括將樣品加載至包含合適的親和層析載體的柱上。這類層析載體的非限制性實(shí)例包括但不限于蛋白A樹脂、蛋白L樹脂、蛋白G樹脂、包含感興趣的抗體所針對(duì)的抗原的親和載體，以及包含F(xiàn)c結(jié)合蛋白質(zhì)的親和載體。蛋白A樹脂對(duì)抗體如IgG的親和純化和分離是有用的。

在加載至柱上后，可以使用例如平衡緩沖液洗滌該柱一次或多次。在洗脫該柱之前可使用包括采用不同緩沖液進(jìn)行洗滌的其它洗滌?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)監(jiān)測(cè)洗脫物。

合適的陽(yáng)離子交換柱是固定相包含陰離子基團(tuán)的柱子。這種柱子的一個(gè)實(shí)例是SP Sepharose^(TM)柱。

合適的混合模式柱是固定相包含混合模式基團(tuán)的柱子。這種柱子的一個(gè)實(shí)例是Capto MMC^(TM)柱。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，使樣品經(jīng)歷疏水相互作用層析(“HIC”)。合適的柱子是固定相包含疏水基團(tuán)的柱子。這種柱子的一個(gè)實(shí)例是苯基Sepharose(TM)柱。抗體在分離/純化過程期間可能已經(jīng)形成聚集體。該疏水層析步驟有利于這些聚集體的消除。它還有助于雜質(zhì)的去除。

根據(jù)本發(fā)明的方法，將含有蛋白質(zhì)的樣品如細(xì)胞系培養(yǎng)基或血漿加載至固定相上，以使目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合至所述固定相。本發(fā)明的方法不限于任何固定相。實(shí)施例證明，不同的固定相均可在本發(fā)明的方法中使用。層析步驟可包括下列層析程序中的一種或多種：離子交換層析、親和層析和疏水相互作用層析。固定相通常是層析柱的一部分。固定相通常是用于親和層析的介質(zhì)。固定相可選自離子交換層析柱、快速蛋白質(zhì)液相層析柱和膨脹床吸附(EBA)層析柱，優(yōu)選離子交換層析柱。

在一個(gè)實(shí)施方案中，固定相包含用免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)配體如重組蛋白或?qū)贵wκ輕鏈可變區(qū)具有強(qiáng)親和力的任何蛋白質(zhì)固定的瓊脂糖基質(zhì)。這種固定相的一個(gè)實(shí)例是填充有Capto L介質(zhì)(GE-Healthcare)的柱子。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，固定相包含通常固定于樹脂上的蛋白L。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，固定相包含蛋白A衍生的親和介質(zhì)。這種固定相的一個(gè)實(shí)例是填充有Mab Select SuRe介質(zhì)的柱子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，固定相包含與強(qiáng)陽(yáng)離子和/或強(qiáng)陰離子交換劑共同形成基質(zhì)(matrixed)的瓊脂糖。這樣的固定相的實(shí)例包括Capto SP ImpRes和Capto Q ImpRes。

樣品暴露于辛酸溶液的持續(xù)時(shí)間可隨著多種因素而變化，包括但不限于游離辛酸的濃度、pH、病毒類型和溫度。表A示出了在不同辛酸鹽濃度下獲得樣品向辛酸溶液的優(yōu)選暴露時(shí)間所需的pH。對(duì)于大多數(shù)實(shí)用目的，步驟ii.使固相接觸辛酸溶液，或使樣品接觸辛酸溶液進(jìn)行少于2小時(shí)，通常少于1小時(shí)，如0.05分鐘至50分鐘，更典型地0.10分鐘至30分鐘，優(yōu)選0.25分鐘至15分鐘。

從表6和表7可以看出，病毒滅活通常在少于5分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)。然而，根據(jù)條件(如游離辛酸的濃度、pH、病毒類型和溫度)，為了實(shí)際目的需要長(zhǎng)達(dá)1小時(shí)，如長(zhǎng)達(dá)45分鐘，如30分鐘。

在本發(fā)明的典型實(shí)施方案中，用含有辛酸的水性溶劑將填充有樹脂并加載目標(biāo)蛋白質(zhì)的柱子洗滌約30分鐘。在用去除目標(biāo)蛋白質(zhì)的溶劑洗脫蛋白質(zhì)之前，任選地用不同的溶劑進(jìn)一步洗滌該柱以去除雜質(zhì)。

辛酸溶液具有將病毒滅活而不使目標(biāo)蛋白質(zhì)變性的pH。辛酸溶液具有允許形成非離子型或游離辛酸的pH。因此，辛酸溶液的pH通常為酸性。

因此，辛酸溶液的pH為7.0或更低，如在2至7之間的pH，如低于6.5，如低于6.1，如2至6的pH，如pH為2＜pH≤6，優(yōu)選3＜pH≤6，更優(yōu)選4＜pH≤6，如4.5＜pH≤6，最優(yōu)選2＜pH＜6，優(yōu)選3＜pH＜6，更優(yōu)選4＜pH＜6，如4.5＜pH＜6，如4.6≤pH＜6，如約4.6、約4.7、約4.8、約4.9、約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4、約5.5、約5.6、約5.7、約5.8和約5.9，例如4.9＜pH＜6。

從實(shí)施例2可以看出，低濃度的游離辛酸對(duì)于病毒如eMuLV的完全滅活仍然有效。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，辛酸本身是緩沖液(pKa＝4.9)。通常，辛酸溶液是一種辛酸緩沖液，其濃度為1至100mM，通常為1至50mM，包括10至80mM，如30至70mM或30至50mM。優(yōu)選地，非電離辛酸的濃度為1至10mM，如2至10mM，如2至8mM，如2至6mM。在典型的實(shí)施方案中，通過將35mmol/kg的辛酸鈉與4.1mmol/kg的HCl混合，產(chǎn)生約5.6-6.7的pH，來制備所使用的緩沖液?？赏ㄟ^Henderson-Hasselbach方程式確定非電離辛酸的濃度：pH＝pKa+log([辛酸鹽]/[辛酸])。

表A：在不同濃度和pH的辛酸鹽緩沖液下，游離辛酸的濃度

表A示出了不同辛酸鹽濃度下所需的pH，或者相反，不同pH水平下所需的濃度，以便實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的蛋白質(zhì)純化所需的1mM游離辛酸的最小濃度。陰影區(qū)域描述了這樣的實(shí)施方案，其中游離辛酸的濃度對(duì)于實(shí)際目的而言過低，于是為了根據(jù)本發(fā)明滅活可接受量的病毒，病毒滅活將會(huì)需要過長(zhǎng)的暴露時(shí)間。

所述辛酸溶液通常是一種辛酸緩沖液，如針對(duì)游離辛酸所測(cè)量的，其濃度為1至500mM，通常為1至50mM，包括1至20mM，如2至20mM或1至10mM，更優(yōu)選2至10mM，如2至8mM，如2至6mM。

所述辛酸溶液通常包含一定比例的i)辛酸鹽和ii)無機(jī)或有機(jī)酸的組合，從而提供這樣一種溶液：其pH低于7.0，如6.5或更低，如pH 1至6.2，并且如針對(duì)游離辛酸所測(cè)量的，其辛酸濃度為至少1mM，如至少2mM，如2至100mM，如2.5至100mM的濃度。

含有蛋白質(zhì)的樣品的加載和/或采用辛酸緩沖液的洗滌可在多個(gè)溫度下進(jìn)行，通常1至40℃，如1至30℃，如2至25℃。與實(shí)施例3中使用的溫度相比，實(shí)施例4中使用的低溫表明，在低溫(2至8℃)和更高溫度(15至25℃)下均實(shí)現(xiàn)了病毒滅活步驟。

可以通過常規(guī)技術(shù)，如通常采用有機(jī)酸的洗脫緩沖液，如酸性洗脫緩沖液，進(jìn)行蛋白質(zhì)的洗脫。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該洗脫緩沖液是甲酸。在合適的實(shí)施方案中，通過將10mmol/kg的甲酸與3.4mmol/kg的NaOH混合，產(chǎn)生約3.5的pH，來制備洗脫緩沖液。該洗脫步驟也可通過高鹽緩沖液進(jìn)行。

在本發(fā)明的典型實(shí)施方案中，向填充有樹脂的柱子上加載澄清化的含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的培養(yǎng)液；該柱通常加載約10-40g蛋白質(zhì)/L樹脂，如20-40g蛋白質(zhì)/L樹脂，并且在2至25℃下，在約5至6之間的pH下，用含有約20-40mmol/kg辛酸鈉的水性溶劑洗滌該柱，在pH穩(wěn)定后持續(xù)約30分鐘。在用含有甲酸的溶劑洗脫蛋白質(zhì)之前，任選地用不同的溶劑進(jìn)一步洗滌該柱以去除雜質(zhì)。

本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明方法獲得的固體或溶液形式的蛋白質(zhì)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種或多種藥物組合物，其包含蛋白質(zhì)，如通過本發(fā)明方法獲得的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，以及可接受的載體。

下列非限制性實(shí)例僅為了說明性目的而提供，以便促進(jìn)對(duì)當(dāng)前設(shè)想的代表性實(shí)施方案的更全面理解。不應(yīng)將這些實(shí)例解釋為限制本說明書中描述的任何實(shí)施方案，包括與本文公開的含有脂質(zhì)外殼的病毒的滅活方法和使用這些方法處理的產(chǎn)物有關(guān)的那些實(shí)施方案。

非限制性地，下列實(shí)施方案是本發(fā)明的優(yōu)選方式。

1.一種從樣品中純化目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法，其包括以下步驟：

i.將含有蛋白質(zhì)的樣品加載至固定相上，以使目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合至所述固定相；

ii.使具有結(jié)合的目標(biāo)蛋白質(zhì)的固相接觸辛酸溶液；其中該辛酸溶液處于允許形成游離辛酸的pH下，并且其中如針對(duì)游離辛酸所測(cè)量的，該辛酸溶液是濃度為1至50mM的辛酸緩沖液；以及

iii.洗脫所述目標(biāo)蛋白質(zhì)。

2.根據(jù)實(shí)施方案1所述的方法，其中目標(biāo)蛋白質(zhì)的純化包括所述樣品中病毒的滅活。

3.根據(jù)實(shí)施方案1或2中任一項(xiàng)所述的方法，其用于無病毒蛋白質(zhì)溶液的制備。

4.根據(jù)實(shí)施方案1至3所述的方法，其中所述辛酸溶液包含一定比例的i)辛酸鹽和ii)無機(jī)或有機(jī)酸的組合，從而提供一種酸性溶液，以及如針對(duì)游離辛酸所測(cè)量的，大于1mM，如至少2mM，如至少2.2mM，通常至少2.5mM的辛酸濃度。

4.根據(jù)實(shí)施方案1至3所述的方法，其中所述辛酸溶液包含一定比例的i)辛酸鹽和ii)無機(jī)或有機(jī)酸的組合，從而提供這樣一種溶液：其pH低于7.0，如6.5或更低，并且如針對(duì)游離辛酸所測(cè)量的，其辛酸濃度為至少1mM，如至少2mM，如2至10mM的濃度。

5.根據(jù)實(shí)施方案1至4所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)選自抗體或其片段，凝血因子如FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI和FVIII，以及生長(zhǎng)激素。

6.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品選自發(fā)酵液、細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞系培養(yǎng)基、腹水、組織培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)基、包含血漿成分的人類或動(dòng)物血漿。

7.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述固定相是層析柱。

8.根據(jù)實(shí)施方案7所述的方法，其中將所述樣品加載至選自離子交換層析柱、親和層析柱、混合模式層析柱、快速蛋白質(zhì)液相層析柱和膨脹床吸附(EBA)層析柱的固定相上。

9.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述辛酸溶液具有將所述病毒滅活而不使所述目標(biāo)蛋白質(zhì)變性的pH。

10.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其中辛酸溶液的pH為6.1或更低，如2-6，如pH為2＜pH≤6，優(yōu)選3＜pH≤6，更優(yōu)選4＜pH≤6，如4.5＜pH≤6，如4.6≤pH＜6，如約4.6、約4.7、約4.8、約4.9、約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4、約5.5、約5.6、約5.7、約5.8和約5.9.如4.9＜pH＜6。

11.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其中辛酸溶液是一種辛酸緩沖液，如針對(duì)游離辛酸所測(cè)量的，其濃度為1至20mM，如2至20mM或1至10mM，更優(yōu)選2至10mM如2至8mM，如2至6mM。

12.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品包含有包膜病毒、無包膜病毒，或無包膜病毒和有包膜病毒兩者。

13.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其為自動(dòng)化的，或是自動(dòng)化蛋白質(zhì)純化過程的一部分。

14.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步將支原體滅活。

15.一種用于純化選自凝血因子、抗體或其Fab的蛋白質(zhì)的方法，其包括以下步驟：

i.將包含一種或多種所述蛋白質(zhì)的樣品加載至用于親和層析的固定相上；

ii.使固相接觸pH為4.9＜pH＜6.2的、如針對(duì)游離辛酸所測(cè)量的2至10mM如2至8mM，如2至6mM的辛酸溶液，以便滅活并洗掉病毒；

iii.洗脫所述目標(biāo)蛋白質(zhì)。

本發(fā)明方法的另一優(yōu)點(diǎn)是提供了病毒滅活的樣品或不含病毒的樣品，以及其中支原體被滅活的樣品。此外，本發(fā)明方法提供了雜質(zhì)如宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(HCP)的量降低的樣品。

實(shí)施例

實(shí)施例1

將含有重組人Fab片段的細(xì)胞系培養(yǎng)基通過0.22μm過濾器過濾，然后摻加eMuLV病毒。將摻加病毒的培養(yǎng)基加載至填充有Capto L介質(zhì)(GE-Healthcare)的柱子上。加載后，首先用平衡緩沖液(20mM磷酸鹽，150mM NaCl，pH 7.2)洗滌該柱，然后用pH 5.5的35mM辛酸緩沖液(5.8mM游離辛酸)洗滌。用辛酸緩沖液洗滌30分鐘后，用pH 3.5的20mM甲酸從該柱上洗脫Fab片段。工藝溫度為15-25℃。Fab片段的收率為97％，并且在含有Fab片段的洗脫級(jí)分中未檢測(cè)到eMuLV(表1)。

表1

*該試驗(yàn)的檢測(cè)極限

這表明在具有Capto L介質(zhì)的柱子上使用辛酸洗滌進(jìn)行的層析步驟完全清除了摻加的eMuLV，LRV大于6.0log₁₀。

實(shí)施例2

將含有重組人抗體(IgG₁)的細(xì)胞系培養(yǎng)基通過0.22μm過濾器過濾，并摻加eMuLV病毒。將摻加病毒的培養(yǎng)基加載至填充有蛋白A(Mab Select SuRe，Ge Healthcare)的柱子上。加載后，首先用平衡緩沖液(50mmol/kg磷酸鹽，300mmol/kg NaCl，pH 7.0)洗滌該柱，然后用pH 5.8的32mmol/kg辛酸鹽緩沖液(2.9mM游離辛酸)洗滌。使用低濃度的辛酸鹽和高pH來說明該步驟在最差條件(低辛酸濃度)下的有效性。pH穩(wěn)定后，繼續(xù)洗滌30分鐘。在另外3次洗滌(平衡緩沖液，50mmol/kg磷酸鹽、1mol/kg NaCl，然后平衡緩沖液)之后，用pH 3.5的甲酸鹽緩沖液從該柱上洗脫mAb。mAb的收率為100％，并且在含有mAb的洗脫級(jí)分中未檢測(cè)到eMuLV(表2)。工藝溫度為15-25℃。

表2

*該試驗(yàn)的檢測(cè)極限

在具有蛋白A介質(zhì)的柱子上也看到在實(shí)施例1中所看到的eMuLV的完全清除。因此，摻加的病毒載量的清除不依賴于柱中的介質(zhì)。而且，低濃度的游離辛酸對(duì)eMuLV的完全清除仍然有效。

實(shí)施例3

將含有重組人抗體(IgG₄)的細(xì)胞系培養(yǎng)基通過0.22μm過濾器過濾，并摻加eMuLV病毒。將摻加病毒的培養(yǎng)基加載至填充有蛋白A(Mab Select SuRe，Ge Healthcare)的柱子上。加載后，首先用平衡緩沖液(50mmol/kg磷酸鹽，300mmol/kg NaCl，pH 7.0)洗滌該柱，然后用pH 5.8的32mmol/kg辛酸鹽緩沖液(2.9mM游離辛酸)洗滌。在pH穩(wěn)定后，繼續(xù)洗滌30分鐘。在另外3次洗滌(平衡緩沖液，(50mmol/kg磷酸鹽、1mol/kg NaCl)，然后平衡緩沖液)之后，用pH 3.5的甲酸鹽緩沖液從該柱上洗脫mAb。mAb的收率為90％，并且在含有mAb的洗脫級(jí)分中未檢測(cè)到eMuLV(表3)。工藝溫度為15-25℃。

表3

*該試驗(yàn)的檢測(cè)極限

使用與實(shí)施例2不同的另一種人抗體的該實(shí)施例說明，eMuLV的完全清除與細(xì)胞系培養(yǎng)基中的單克隆抗體無關(guān)。

實(shí)施例4

將含有重組人抗體(IgG₁)的細(xì)胞系培養(yǎng)基通過0.22μm過濾器過濾并摻加eMuLV病毒。將摻加病毒的培養(yǎng)基加載至填充有蛋白A(Mab Select SuRe，Ge Healthcare)的柱子上。加載后，首先用平衡緩沖液(50mmol/kg磷酸鹽，300mmol/kg NaCl，pH 7.0)洗滌該柱，然后用pH 5.7的35mmol/kg辛酸鹽緩沖液(3.9mM游離辛酸)洗滌。pH穩(wěn)定后，繼續(xù)洗滌30分鐘。在另外3次洗滌(平衡緩沖液，50mmol/kg磷酸鹽、1mol/kg NaCl，然后平衡緩沖液)之后，用pH 3.5的甲酸鹽緩沖液從該柱上洗脫mAb。

mAb的收率為90％，并且在含有mAb的洗脫級(jí)分中未檢測(cè)到eMuLV(表4)。工藝溫度為2-8℃。

表4

*該試驗(yàn)的檢測(cè)極限

與實(shí)施例3中使用的溫度相比，該實(shí)施例中使用的低溫表明，在低溫(2-8℃)和更高溫度下均實(shí)現(xiàn)了eMuLV的完全清除。

實(shí)施例5

將中試裝置(pilot plant)中的含有重組人抗體(IgG₁)的170升細(xì)胞系培養(yǎng)基分成兩等份，然后分別在自動(dòng)化層析系統(tǒng)(pilot，GE Healthcare)上通過具有蛋白A(Mab Select SuRe，Ge Healthcare)的柱子運(yùn)行。

將一份加載至蛋白A柱(7.1升Mab Select SuRe，Ge Healthcare)上，之后用3個(gè)緩沖液(平衡緩沖液，(50mmol/kg磷酸鹽、1mol/kg NaCl)，然后平衡緩沖液)洗滌該柱。用pH 3.5的甲酸鹽緩沖液從該柱上洗脫mAb。在低pH(3.7)下手動(dòng)處理洗脫物60分鐘。

另一份如實(shí)施例4一樣處理，其中在蛋白A層析(7.1升Mab Select SuRe，Ge Healthcare)期間使用程序化的辛酸洗滌步驟，并且未在低pH下處理洗脫物。

然后將洗脫物分別加載至陽(yáng)離子交換柱(2.2升Poros 50HS，Life Technologies)。在用平衡緩沖液(37.4mM乙酸緩沖液，pH 5)洗滌該柱之后，通過pH 5的乙酸緩沖液中0至300mM NaCl的線性梯度洗脫該柱。

兩種洗脫物中的HMWP水平約為2％，但在低pH處理后增加至3％(參見表格)。在陽(yáng)離子交換之后，用低pH處理的等份和在蛋白A層析期間用辛酸洗滌處理的等份中，HMWP的水平均為約2％。與用低pH處理的洗脫物中的CHO-HCP水平相比，來自用辛酸洗滌的蛋白A柱的洗脫物中的CHO-HCP水平僅為其大約一半(參見表格)。在陽(yáng)離子交換之后，在蛋白A層析期間用辛酸洗滌處理的等份中的CHO-HCP水平仍然是用低pH處理的等份中的CHO-HCP量的一半。

在蛋白A層析期間采用辛酸洗滌的過程比采用低pH處理來自蛋白A的洗脫物的過程快約45分鐘。在陽(yáng)離子交換之后，兩份中單克隆抗體的收率幾乎相同(表5)。

表5

*N/A：未進(jìn)行低pH處理

該實(shí)施例顯示，通過在蛋白A柱上層析期間使用辛酸洗滌步驟，獲得了較低濃度的CHO-HCP。在下一個(gè)層析步驟(陽(yáng)離子交換)之后仍然觀察到較低量的CHO-HCP。此外，避免了低pH步驟后的HMWP增加。與具有低pH步驟的過程相比，使用具有辛酸洗滌的過程節(jié)省了45分鐘的工藝時(shí)間。

實(shí)施例6

在不同辛酸濃度和不同pH下研究了MuLV的滅活(表6)。在5.0至6.0的pH范圍內(nèi)，如果在pH升高的同時(shí)提高辛酸濃度，使得游離辛酸濃度保持在至少約4mM，則在5分鐘后實(shí)現(xiàn)了MuLV的完全滅活。在約2mM的辛酸濃度下反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，這些最困難的病毒在30分鐘之后部分滅活。低于1mM時(shí)，沒有觀察到滅活。

表6：用不同濃度和pH的辛酸滅活后的MuLV病毒滴度

*病毒噬斑太多而無法計(jì)數(shù)

辛酸的濃度取決于pH，并且只有游離辛酸才滅活有包膜病毒。因此，在5.9至6.3的pH范圍內(nèi)進(jìn)一步研究了60mM辛酸的效果。在該pH范圍內(nèi)，在5分鐘內(nèi)有超過5.4log 10的MuLV完全滅活(表7)。在pH 6.3下，辛酸濃度為2.2mM，并且該濃度在該測(cè)試中也是有效的。

當(dāng)辛酸的總濃度為60mM時(shí)，在5.9至6.2的pH下，MuLV滅活是高度有效的。對(duì)于60mM辛酸，當(dāng)pH保持在6.1或更低時(shí)，獲得最佳結(jié)果。

表7：用不同pH水平的60mM辛酸滅活MuLV后的MuLV滴度

結(jié)果顯示，為了成為有效的，游離辛酸的濃度應(yīng)該為至少1mM，優(yōu)選至少約2mM，如約2.2mM，如至少約2.5mM或至少2.8mM。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)容易地認(rèn)識(shí)到，高濃度的其它鹽，如CaCl₂或NaCl，可能降低辛酸的溶解度。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)容易地認(rèn)識(shí)到，應(yīng)該避免非辛酸鹽的鹽的濃度超過500mM，如超過100mM或超過50mM，因?yàn)檫@會(huì)影響生成游離辛酸的能力。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)容易地認(rèn)識(shí)到，辛酸的濃度應(yīng)當(dāng)不高于其溶解度。

已經(jīng)表明，包括使用辛酸滅活病毒的蛋白質(zhì)純化方法在高于1mM的游離辛酸濃度下，通常對(duì)包括MuLV病毒在內(nèi)的有包膜病毒的滅活是非常有效且快速的。雖然本文已經(jīng)說明并描述了本發(fā)明的某些特征，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)想到許多修改、替換、改變和等同方案。因此，應(yīng)當(dāng)理解，所附權(quán)利要求旨在涵蓋落在本發(fā)明的真正精神內(nèi)的所有這些修改和改變。