基于乙型肝炎核心抗原的疫苗的制作方法
本發(fā)明涉及包含具有連接至e1環(huán)的糖的乙型肝炎核心抗原（HBcAg）的蛋白、生產連接有糖的蛋白的方法、含有所述蛋白的藥物組合物和所述蛋白在對象中誘導免疫響應的用途。
背景技術：
乙型肝炎（Hepatitis B）病毒核心（HBc）蛋白具有某種程度上的獨特結構，它由兩個反平行的α螺旋組成，其形成特有的“穗（spike）”結構。然后兩個HBc分子自發(fā)地二聚化形成雙穗束。該雙穗束是病毒樣顆粒（VLP）的構成部件。VLP是具有吸引力的疫苗系統(tǒng)，因為它們的高度重復序列遞送抗原的多個拷貝。進一步地，病毒核酸的缺乏使得它們成為特別安全的載體。HBc作為疫苗載體是特別有趣的，因為它具有幾個可能讓抗原序列插入的位點。然后HBc的極端免疫原性也賦予被插入的序列，因此使得其也具有過度的免疫原性。最佳的插入位點是主要插入區(qū)域（MIR）。然而，先前表明，當較大的或疏水性的序列被插入MIR時，則單體的HBc不能二聚化且VLP沒有形成。這導致免疫原性的大量損失。
目前沒有可用于細菌生物威脅因子類鼻疽伯克霍爾德氏菌（Burkholderia pseudomallei）和鼻疽伯克霍爾德氏菌（Burkholderia mallei）的許可疫苗，它們分別為類鼻疽和鼻疽的致病因子。
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及一種基于乙型肝炎（HBV）核心蛋白的疫苗遞送系統(tǒng)。在遞送之前，糖被連接至HBV核心蛋白，使得能夠引起對糖類的免疫響應。
因此本發(fā)明提供一種包含乙型肝炎核心抗原（HBcAg）的蛋白，其具有被連接至e1環(huán)（e1 loop）的糖。所述蛋白可以包含串聯的HBcAg的第一拷貝和第二拷貝，其中HBcAg的一個或兩個拷貝具有被連接至e1環(huán)的糖。
本發(fā)明還提供：
- 一種包含本發(fā)明的蛋白的多個拷貝的顆粒；
- 一種生產本發(fā)明的蛋白的方法，所述方法包括將一個或多個糖連接至e1環(huán)；
- 一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的蛋白或本發(fā)明的顆粒以及藥學上可接受的載體或稀釋劑；
- 用于在人體或動物體的疫苗接種方法中使用的本發(fā)明的蛋白或本發(fā)明的顆粒；
- 本發(fā)明的蛋白或本發(fā)明的顆粒用于制備用于人體或動物體的疫苗接種的藥物的應用；以及
- 一種在對象中誘導免疫響應的方法，所述方法包括向所述對象施用本發(fā)明的蛋白或本發(fā)明的顆粒。
附圖說明
圖1：SDS-PAGE證實了串聯核心在酵母裂解物的可溶性級分中被發(fā)現。提取粗裂解物（泳道3），在20,000xg下旋降（spun），提取上清液（泳道4）。顆粒（泳道5）中的任何物質都不可用。上清液被稀釋（泳道6），然后通過0.8 μm、0.45 μm和0.2 μm的三個過濾器（泳道7-9）。材料通過橫流過濾器并保留滯留物（泳道10）。將其過濾，然后置于CL4B柱（泳道11）上。然后將空隙體積通過S1000柱（12泳道）。
圖2：從CL4B柱的空隙體積中分離VLP（（B）的左側面板上的較大的峰）。泳道上方的數字是從CL4B柱收集的級分編號。
圖3：然后將CL4B空隙通過S1000柱，從級分12-15分離VLP。通過SDS-PAGE和免疫印跡（western blot）確認純度。數字是從第二S1000柱收集的串聯核心陽性級分。
圖4：（A）使用銀染色的SDS-PAGE證實，存在串聯核心（標有*），但純度低于同等的酵母制劑。（B）電子顯微鏡將主要污染物識別為桿狀病毒病毒粒子本身。
圖5：泳道A：分子量標記物，泳道B：未修飾的VLP，泳道C：修飾的VLP。
圖6：（A）蔗糖墊的示意圖（未按比例）、（B）未結合的FITC和（C）FITC-VLP結合物。
圖7：泳道A：分子量標記物，泳道B：BSA（2 mg/ml），泳道C：BSA（0.5 mg/ml），泳道D：糖結合物（2 mg/ml）和泳道E：糖結合物（0.5 mg/ml）。
圖8：攜帶LolC插入物的VLP在ELISA中被測試，其使用感染了野生型伯克霍爾德氏菌的小鼠中產生的抗體。對應于VLP LolC的線對30 ug/ml的值位于1.6和1.8平均OD之間。對應于空載VLP的線對30 ug/ml的值位于0.4平均OD附近。
序列簡述
SEQ ID NO: 1是ayw亞型的183個氨基酸的蛋白加上HBcAg的29個氨基酸的前序列以及相應的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 2是ayw亞型的183個氨基酸的蛋白加上HBcAg的29個氨基酸的前序列。
SEQ ID NO: 3是HBcAg可以包含來平衡α-螺旋的序列。
SEQ ID NO: 4是構建體CoHo7e的序列。
SEQ ID NO: 5是構建體H3Ho的序列。
SEQ ID NO: 6是空LolC構建體的序列。
SEQ ID NO: 7是LolC-K6構建體的序列。
SEQ ID NO: 8是LolC-K1構建體的序列。
SEQ ID NO: 9是LolC的序列。
發(fā)明詳述
此外，如在本說明書和在附屬的權利要求書中使用的，除非另有明確說明，否則單數形式“一”、“一個”和“該”包括復數引用。因此，例如，對“一個糖”的引用包括兩個或更多個這樣的糖，或者對“一個蛋白表位”的引用包括兩個或更多個這樣的蛋白表位。
本文所引用的所有出版物、專利和專利申請，無論是在上文或下文中引用的，在此通過引用以其整體合并入本文中。
乙型肝炎核心抗原（HBcAg）
根據HBV的亞型，HBcAg具有183或185個氨基酸（aa）。ayw亞型的183個氨基酸的蛋白的序列加上29個氨基酸的前序列顯示于SEQ ID NO:2中。成熟的HBcAg為第30位的Met殘基至最C末端的Cys殘基，第1至29位的序列是前序列。
所述蛋白可以包括形成二聚體的HBcAg的兩個拷貝。HBcAg的二聚體形成VLP的結構性構成部件。該HBcAg單元通常以頭至尾的形式連接在一起，即一個單元的C末端連接至相鄰單元的N末端。這些單元可通過共價鍵（例如肽鍵）直接連接，但優(yōu)選地它們通過接頭連接，所述接頭將相鄰的單元隔開，從而避免破壞相鄰單元的包裝的問題。接頭的性質在下文討論。
所述蛋白中的HBcAg可以是天然的全長HBcAg。所述HBcAg具有連接至e1環(huán)的糖。在所述蛋白包含串聯的HBcAg的第一拷貝和第二拷貝的的情況中，HBcAg的一個拷貝具有連接至e1環(huán)的糖。HBcAg的另一個烤貝可以是天然的HBcAg、可以是如本文所述的HBcAg的經修飾的版本、可以具有連接至e1環(huán)的糖或可以包含e1環(huán)中的蛋白表位?？赡艿奶呛偷鞍妆砦坏睦釉谙挛挠懻摗?/p>
作為總的原則，任何修飾都被選擇得不干擾HBcAg的構象及其組裝成顆粒的能力。這些修飾在蛋白中對于維持其構象不重要的位點進行，例如在e1環(huán)中、C末端和/或N末端。HBcAg的e1環(huán)可耐受例如1至500個氨基酸的插入而不會破壞蛋白的顆粒形成能力。
HBcAg序列可通過取代、插入、缺失或延伸而被修飾。插入、缺失或延伸的尺寸可以是例如1至500個aa、1至400個aa、1至300個aa、1至200個aa、3至100個aa或6至100個aa。取代可以涉及HBcAg序列的長度上的多個氨基酸，多達例如1、2、5、10、20或50個氨基酸。延伸可以在HBcAg的N末端或C末端。缺失可以在蛋白的N末端、C末端或內部位點。取代可以在蛋白序列的任何位置進行。插入也可以在蛋白序列的任何位點進行，但通常在蛋白的表面暴露區(qū)域（例如e1環(huán)）進行。被插入的序列可以攜帶蛋白表位。一個或多個氨基酸可以被插入，使得隨后可以連接一個或多個糖。例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個氨基酸可以被插入。氨基酸可以被連續(xù)地插入。用于連接糖而被插入的任何氨基酸必須能夠連接至糖。這些氨基酸的例子包括賴氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸。例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個賴氨酸可以被插入。一個或多個丙氨酸可以被插入一個或多個氨基酸的任一側，這些氨基酸已經被插入用于連接糖。例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個丙氨酸可以被插入。所述丙氨酸可以被連續(xù)地插入?？梢詫γ總€HBcAg單元進行多于一個的修飾。因此，可以進行末端延伸或缺失并進行內部插入。例如，可以在C末端進行截平并在e1環(huán)中進行插入。
本發(fā)明的蛋白中的HBcAg序列的每個部分優(yōu)選具有與天然的HBcAg蛋白的相應序列的至少70%序列一致性，例如具有如SEQ ID NO:2所示的序列的蛋白。更優(yōu)選地，所述一致性為至少80%、至少90%、至少97%、至少98%或至少99%。測定蛋白同源性的方法在本領域中是熟知的，本領域技術人員將會理解的是，在本說明書中，同源性是基于氨基酸一致性計算的（有時稱為“硬同源性（hard homology）”）。
例如UWGCG軟件包（Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12: 387-395）提供BESTFIT程序，它可以被用來計算同源性（例如使用其默認設置）。PILEUP和BLAST算法可以被用來計算同源性或對齊序列（通常使用它們的默認設置），例如在Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10中描述的。
進行BLAST分析的軟件可以通過美國國家生物技術信息中心（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）得到。該算法涉及首先識別出高分值序列對（HSP），其通過識別查詢序列中的長度為W的短字段而進行，所述短字段在與數據庫序列中相同長度的字段對齊時匹配或滿足某些正值的閾值分值T。T是指相鄰字段分值閾值（Altschul et al, 同上）。這些初始的相鄰字段匹配用作啟動查找包含它們的HSP的檢索的種子。字段匹配沿各個序列在兩個方向上延伸，只要累積的對齊分值可以被升高。當出現以下情況時字段匹配在每個方向上的延伸停止：累積的對齊分值從其最大達到值下降數量X；由于累積一個或多個負分值的殘基對齊，累積分值達到零或以下；或達到了任一序列的末端。BLAST算法參數W、T和X決定了對齊的靈敏度和速度。BLAST程序的默認值如下：字段長度（W）為11；BLOSUM62分值矩陣（參見Heikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919）對齊（B）為50；期望值（E）為10；M=5；N=4；并且比較雙鏈。
BLAST算法進行兩個序列之間的相似性的統(tǒng)計分析；參見例如，Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787。BLAST算法提供的相似性的一個量度為最小和概率(P(N))，它表示兩個核苷酸序列或氨基酸序列偶然匹配的概率。例如，當第一序列與第二序列比較時，如果最小和概率小于約1、優(yōu)選小于約0.1、更優(yōu)選小于約0.01、最優(yōu)選小于約0.001，則認為一個序列與另一個序列相似。
HBcAg的e1環(huán)位于成熟序列的第68至90位，蛋白表位可以被插入這些位置之間的任何位置。如上文所述的用于連接糖的氨基酸可以被插入這些位置之間的任何位置。優(yōu)選地，用于連接糖的表位或氨基酸被插入到第69至90位、第71至90位或第75至85位的區(qū)域中。最優(yōu)選的是將用于連接糖的表位或氨基酸插入到第79和第80個氨基酸殘基之間或第80和第81個殘基之間。當插入用于連接糖的表位或氨基酸時，HBcAg的整個序列可以被維持，或者替代地e1環(huán)序列的整個或其一部分可以被缺失并被蛋白序列取代。因此，第69至90個、第71至90個或第75至85個氨基酸殘基可以被用于連接糖的表位或氨基酸取代。當用于連接糖的表位或氨基酸取代e1環(huán)序列時，取代序列通常不短于被其取代的序列。
HBcAg的C末端截平通常不超出aa 144，因為如果進行任何進一步的截平，就可能不形成顆粒。因此，被刪除的氨基酸可以包括例如aa 144至C末端aa（aa 183或185）、aa 150至C末端aa、aa 164至C末端aa或aa 172至C末端aa。HBcAg的C末端結合DNA，因此C末端的截平降低或完全從HBcAg和HBcAg雜合蛋白的制劑中移除DNA。
本發(fā)明的蛋白形成顆粒，其優(yōu)選類似于由天然HBcAg形成的顆粒。本發(fā)明的顆粒包含本發(fā)明的蛋白的多個拷貝。所述顆粒可以是VLP的形式。本發(fā)明的顆粒通常直徑為至少10 nm，例如直徑為10至50 nm或20至40 nm，但優(yōu)選地，它們的直徑為約27 nm（這是天然HBcAg顆粒的尺寸）。它們包括多個HBcAg單元，例如150至300個單元，但通常它們被固定至約180或約240個單元（這是天然HBcAg顆粒中單元的數量）。因為本發(fā)明的蛋白可以是二聚體，這意味著顆粒中的蛋白單體的數量可以是75至150個，但通常是約90或約120個。
相鄰的HBcAg拷貝之間的接頭通常為長度至少為1.5 nm（15 ?）的氨基酸的鏈，例如1.5至10 nm、1.5至5 nm或1.5至3 nm。它可以例如包含4至40 aa或10至30 aa，優(yōu)選15至21 aa。接頭通常是柔性的。接頭中的氨基酸可以例如包括甘氨酸、絲氨酸和/或脯氨酸或完全由它們組成。優(yōu)選的接頭包括序列GlynSer (GnS)的一個或多個重復，其中n為2、3、4、5、6、7或8。替代地，接頭可以包括一個或多個GlyPro (GP)二肽重復。重復的次數可以例如是1至18次，優(yōu)選3至12次。在G2S重復的情況中，已經發(fā)現使用5、6或7次重復允許顆粒的形成。接頭可以對應于抗體的鉸鏈區(qū)域；該鉸鏈區(qū)域被認為提供抗體的抗原結合結構域和尾部結構域之間的柔性連接。
組成HBc穗區(qū)域的兩個α螺旋不是對稱的，因此所得到的MIR不會從VLP完全豎直地指向，而是略微偏移。因此分子模型表明已插入的任何抗原可以平行于VLP，而不是成直角。這有可能導致空間位阻和免疫原性的降低。HBcAg可以包含這樣的插入序列，它通過將一個或多個額外的轉向增加至第一螺旋（其位于成熟序列的第50至73位）從而“平衡”α螺旋。這導致出現垂直定向至VLP的被插入的蛋白表位。這可以通過將3至12個氨基酸（例如3、5或7個氨基酸）插入至HBcAg來實現。這些氨基酸優(yōu)選是不帶電荷的氨基酸，例如丙氨酸、亮氨酸、絲氨酸和蘇氨酸。被插入的序列優(yōu)選是AAALAAA（SEQ ID NO: 3）。插入可以在成熟序列的第50和75個氨基酸之間的位點，例如在第60和75個殘基或第70和73個殘基之間的位點。
糖
術語“糖”是指多糖、寡糖和單糖。所述蛋白包含具有連接到e1環(huán)的糖的HBcAg。所述蛋白可以包含串聯的HBcAg的第一拷貝和第二拷貝。在存在串聯的HBcAg的兩個拷貝的情況中，HBcAg的一個或兩個拷貝具有連接到e1環(huán)的糖。
連接到e1環(huán)的糖可以多于一個。所述e1環(huán)可以連接有可以多于一種的糖。e1環(huán)可以連接有不同的糖。在存在串聯的HBcAg的兩個拷貝的情況中，可以有一個或多個不同的糖連接到每個HBcAg中的e1環(huán)。如果所述糖衍生自一個以上的病原體或過敏原，則可能可用于同時誘導對一個以上的病原體或過敏原的免疫響應。所述糖可以是糖蛋白的一部分，使得糖蛋白被連接至e1環(huán)。
糖被連接到e1環(huán)中的一個或多個氨基酸。用于連接糖的一個或多個氨基酸可以被插入進如本文所描述的e1環(huán)。所述用于連接糖的一個或多個氨基酸可以是在HBcAg中自然發(fā)生的氨基酸。這些氨基酸的例子包括賴氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸。糖可以被連接至一個以上的自然發(fā)生的氨基酸。糖可以被連接至自然發(fā)生的氨基酸和被插入的氨基酸。
所述糖可以衍生自任何病原體或過敏原。所述糖可以包括T細胞表位或B細胞表位。如果它是T細胞表位，則它可以是細胞毒性T淋巴細胞（CTL）表位或T輔助（Th）細胞表位（例如，Th1或Th2表位）。可以存在一個以上的表位。如果存在一個以上的表位，則表位中的一個可以是T輔助細胞表位，而另一個可以是B細胞或CTL表位。T輔助細胞表位的存在增強了對B細胞或CTL表位的免疫響應。
糖的選擇取決于期望引起的免疫響應或疫苗接種所針對的疾病。糖可以例如是來自病原性生物、癌癥相關的抗原或過敏原。所述病原性生物可以例如是病毒、細菌或原生動物。所述糖可以來自本文描述的任何來源（例如病原性生物和癌癥），其中蛋白表位可以衍生自該來源，并且該來源包含糖。
優(yōu)選地，病原性生物衍生自細菌。所述細菌可以是伯克霍爾德氏菌（Burkholderia），例如，類鼻疽伯克霍爾德氏菌（B. pseudomallei）或鼻疽伯克霍爾德氏菌（B. mallei）。所述病原性生物可以包含常見的/共同的（common）莢膜多糖（capsule polysaccharide，CPS）。所述糖可以包括來自CPS的抗原。所述糖可以包括來自CPS的一個或多個表位。 CPS可衍生自伯克霍爾德氏菌（Burkholderia），例如，類鼻疽伯克霍爾德氏菌（B. pseudomallei）或鼻疽伯克霍爾德氏菌（B. mallei）。CPS包括1-3個連接的2-O-乙酰基-6-脫氧-β-D-甘露-庚吡喃糖（2-O acetyl-6-deoxy-β-D-manno-heptopyranose）的無支鏈的均聚物。因此，所述糖可以包括1-3個連接的2-O-乙?；?6-脫氧-β-D-甘露-庚吡喃糖的無支鏈的均聚物。CPS已經被鑒別為類鼻疽伯克霍爾德氏菌（B. pseudomallei）和鼻疽伯克霍爾德氏菌（B. mallei）中的主要毒力決定因素，其中類鼻疽伯克霍爾德氏菌（B. pseudomallei）中CPS表達的損失使小鼠中的MLD從70 cfu增加至大于106 cfu。類鼻疽伯克霍爾德氏菌（B. pseudomallei）的CPS已經被證明會提供針對小鼠模型中的后續(xù)挑戰(zhàn)的部分保護，同時針對CPS而引起的抗體的被動轉移也能夠提供了保護。
蛋白表位
本發(fā)明的蛋白可以包含串聯的HBcAg的第一拷貝和第二拷貝，其中第一拷貝具有連接到e1環(huán)的糖，第二拷貝包含在e1環(huán)中的蛋白表位。所述“第一拷貝”可以是N末端拷貝或C末端拷貝。
所述蛋白表位包含引起免疫響應的氨基酸的序列。所述表位可以是構象性的或線性的。它可以例如在6至500個aa、20至500個aa、50至500個aa、100至500個aa、200至500個aa、300至500個aa或300至400個aa的序列中。
較大的和/或疏水性的插入可以被容納而不破壞VLP。被用作插入物的蛋白表位可以是不破壞VLP形成的任何適當的尺寸。其優(yōu)選小于100kDa，例如小于80 kDa、小于60 kDa、小于40 kDa、小于20 kDa、小于10 kDa或小于5 kDa。其可以多于5 kDa、10 kDa、20 kDa或30 kDa。
本發(fā)明的蛋白可以含有多于一個蛋白表位，例如多達2、3、5或8個蛋白表位。表位多于一個的拷貝可以被插入到HBcAg的拷貝中，例如，可以插入2至8個拷貝。當本發(fā)明的蛋白中有兩個或更多個蛋白表位時，它們可以來自于相同或不同的生物體以及來自相同或不同的蛋白。
所述表位可以是T細胞表位或B細胞表位。如果它是T細胞表位，則它可以是細胞毒性T-淋巴細胞（CTL）表位或T輔助細胞（Th）表位（例如Th1或Th2表位）。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，表位中的一個是T輔助細胞表位，另一個是B細胞表位或CTL表位。T輔助細胞表位的存在增強了對B細胞表位或CTL表位的免疫響應。
表位的選擇取決于疫苗接種期望對抗的疾病。例如，所述表位可以來自病原性生物、癌癥相關的抗原或過敏原。所述病原性生物可以是例如病毒、細菌或原生動物。
所述表位可以衍生自任何病原體，所述病原體例如但不限于病毒，包括正粘病毒科（orthomyxoviridae）（包括例如流行性感冒A、B和C病毒）、腺病毒科（adenoviridae）（包括例如人腺病毒）、杯狀病毒科（Caliciviridae）（例如諾沃克病毒群（Norwalk virus group））、皰疹病毒科（herpesviridae）（包括例如HSV-1、HSV-2、EBV、CMV和VZV）、乳多空病毒科（papovaviridae）（包括例如人類乳頭狀瘤病毒（HPV））、痘病毒科（poxviridae）（包括例如天花病毒和牛痘病毒）、小DNA病毒科（parvoviridae）（包括例如細小病毒B19）、呼腸孤病毒科（reoviridae）（包括例如輪狀病毒）、冠狀病毒科（coronaviridae）（包括例如SARS）、黃病毒科（flaviviridae）（包括例如黃熱病毒、西尼羅河病毒、登革熱病毒、丙型肝炎病毒和森林腦炎病毒）、小RNA病毒科（picornaviridae）（包括腸道病毒、脊髓灰質炎病毒、鼻病毒和甲型肝炎病毒）、披膜病毒科（togaviridae）（包括例如風疹病毒）、絲狀病毒科（filoviridae）（包括例如馬爾堡病毒和埃博拉病毒）、副粘液病毒科（paramyxoviridae）（包括副流感病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）、流行性腮腺炎病毒和麻疹病毒） 、彈狀病毒科（rhabdoviridae）（包括例如狂犬病病毒）、尼亞病毒科（bunyaviridae）（包括例如漢坦病毒）、逆轉錄病毒（retroviridae ）（包括例如HIV和人類T細胞淋巴瘤病毒（HTLV））和肝病毒科（hepadnaviridae）（包括例如乙型肝炎病毒）的成員。
所述表位可以衍生自細菌，所述細菌包括伯克霍爾德氏菌（Burkholderia）、結核分枝桿菌（M.tuberculosis）、衣原體（Chlamydia）、淋病奈瑟菌（N.gonorrhoeae）、志賀氏桿菌（Shigella）、沙門氏菌（Salmonella）、霍亂弧菌（Vibrio Cholera）、梅毒螺旋體（Treponema pallidua）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、百日咳桿菌（Bordetella pertussis）、布魯氏菌（Brucella）、土拉弗朗西斯菌（Franciscella tulorensis）、幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）、鉤端螺旋體菌（Leptospria interrogaus）、嗜肺軍團菌（Legionella pnumophila）、鼠疫桿菌（Yersinia pestis）、鏈球菌（Streptococcus，A型和B型）、肺炎球菌（Pneumococcus）、腦膜炎球菌（Meningococcus）、流感嗜血桿菌（Hemophilus influenza，b型）、彎曲桿菌?。?i>Complybacteriosis）、卡他莫拉菌（Moraxella catarrhalis）、杜諾凡病（Donovanosis）和放線菌（Actinomycosis）、真菌病原體（包括念珠菌（Candidiasis）和曲霉?。?i>Aspergillosis））、以及寄生蟲病原體（包括弓形蟲（Toxoplasma gondii）、絳蟲（Taenia）、吸蟲（Flukes）、蛔蟲（Roundworms）、扁蟲（Flatworms）、阿米巴?。?i>Amebiasis）、賈第蟲?。?i>Giardiasis）、隱孢子蟲（Cryptosporidium）、血吸蟲（Schitosoma）、卡氏肺孢子蟲（Pneumocystis carinii）、滴蟲?。?i>Trichomoniasis）和旋毛蟲?。?i>Trichinosis））。
所述表位可以衍生自通過a）呼吸道、b）泌尿生殖系統(tǒng)或c）胃腸道進行感染的病原體。此類病原體的例子包括a）腺病毒（adenoviridae）、副粘液病毒科（paramyxoviridae）和痘病毒科（poxviridae）、鼻病毒、流行性感冒、和漢坦病毒的成員；b）解脲支原體（Ureaplasma urealyticum）、淋球菌（Neisseria gonorrhoeae）、陰道加德菌（Gardnerella vaginalis）、陰道毛滴蟲（Trichomonas vaginalis）、梅毒螺旋體（Treponema pallidum）、沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis）、杜克雷嗜血桿菌（Haemophilus ducreyi）、單純皰疹病毒（herpes simplex virus）、HPV、HIV、白色念珠菌（Candida albicans）、梅毒螺旋體（Treponema pallidum）、以及肉芽腫莢膜桿菌（Calmatobacterium）；以及c）志賀氏菌（Shigella）、沙門氏菌（Salmonella）、霍亂弧菌（Vibrio Cholera）、大腸桿菌（E.coli）、溶組織內阿米巴（Entamoeba histolytica）、彎曲桿菌屬（Campylobacter）、梭菌屬（Clostridium）、耶爾森氏菌屬（Yersinia）、輪狀病毒、諾如病毒、腺病毒、星狀病毒、蛔蟲、扁蟲、賈第鞭毛蟲?。?i>Giardiasis）、以及隱孢子蟲（Cryptosporidium）。
本發(fā)明使用的表位可以衍生自癌癥，所述癌癥例如但不限于肺癌、胰腺癌、腸癌、結腸癌、乳房癌、子宮癌、宮頸癌、卵巢癌、睪丸癌、前列腺癌、黑色素瘤、卡波濟氏肉瘤、淋巴瘤（例如EBV誘導的B細胞淋巴瘤）和白血病。腫瘤相關的抗原的具體例子包括但不限于：癌癥睪丸抗原（例如MAGE家族（MAGE 1、2、3等）的成員、NY-ESO-1和SSX-2）、分化抗原（例如酪氨酸酶、gp100、PSA、Her-2和CEA）、突變的自身抗原和病毒性腫瘤抗原（例如來自致癌性HPV類型的E6和/或E7）。特定的腫瘤抗原的進一步的例子包括MART-1、Melan-A、P97、β-HCG、GaINAc、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-4、MAGE-12、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC18、CEA、DDC、P1A、EpCam、黑色素瘤抗原gp75、Hker 8、高分子量的黑色素瘤抗原、K19、Tyrl、Tyr2、pMel 17基因家族的成員、c-Met、PSM（前列腺粘蛋白抗原）、PSMA（前列腺特異膜抗原）、前列腺分泌蛋白、甲胎蛋白、CA125、CA19.9、TAG-72、BRCA-1和BRCA-2抗原。
本發(fā)明使用的其它候選表位的例子包括來自以下抗原的表位：流感抗原HA（血凝素）、NA（神經氨酸酶）、NP（核蛋白/核殼蛋白）、M1、M2、PB1、PB2、PA、NS1和NS2；HIV抗原gp 120、gp 160、gag、pol、Nef、Tat和Ref；瘧疾抗原CS蛋白和子孢子表面蛋白2；皰疹病毒抗原EBV gp 340、EBV gp85、HSV gB、HSV gD、HSV gH、HSV早期蛋白產物、巨細胞病毒gB、巨細胞病毒gH和IE蛋白gP72；人類乳頭狀瘤病毒抗原E4、E6和E7；呼吸道合胞病毒抗原F蛋白、G蛋白和N蛋白；百日咳桿菌（B.pertussis）的百日咳桿菌粘附素抗原、腫瘤抗原癌CEA、癌相關的粘蛋白、癌P53、黑色素瘤MPG、黑色素瘤P97、MAGE抗原、癌Neu的癌基因產物、前列腺特異性抗原（PSA）、前列腺相關的抗原、ras蛋白和myc；以及屋塵螨過敏原。
優(yōu)選地，所述蛋白表位衍生自伯克霍爾德氏菌（Burkholderia），例如類鼻疽伯克霍爾德氏菌（Burkholderia pseudomallei）或鼻疽伯克霍爾德氏菌（Burkholderia pseudomallei）。所述蛋白表位可以衍生自表1中列出的蛋白的任一種。所述蛋白表位可以包含表1中列出的蛋白的任一種或由其組成。所述蛋白表位可以是表1中列出的蛋白的任一種的片段。
表1-蛋白
優(yōu)選地，所述蛋白表位衍生自LolC蛋白。以下段落討論LolC蛋白，但該討論同樣適用于在表1中列出的蛋白的任一種。LolC蛋白可以是天然存在的LolC蛋白或者可以是天然存在的LolC蛋白的變體。所述蛋白質表位可以包括LolC蛋白或由LolC蛋白組成。因此全長LolC或其片段可以被插入進e1環(huán)。
本文所述的LolC蛋白序列為：
ALGVAALIVVLSVMNGFQKEVRDRMLSVLAHVEIFSPTGSMPDWQLTAKEARLNRSVIGAAPYVDAQALLTRQDAVSGVMLRGVEPSLEPQVSDIGKDMKAGALTALAPGQFGIVLGNALAGNLGVGVGDKVTLVAPEGTITPAGMMPRLKQFTVVGIFESGHYEYDSTLAMIDIQDAQALFRLPAPTGVRLRLTDMQKAPQVARELAHTLSGDLYIRDWTQQNKTWFSAVQIEKRMMFIILTLIIAVAAFNLVSSLVMTVTNKQADIAILRTLGAQPGSIMKIFVVQGVTIGFVGTATGVALGCLIAWSIPWLIPMIEHAFGVQFLPPSVYFISELPSELVAGDVIKIGVIAGS (SEQ ID NO: 9)。
所述LolC蛋白的序列可以具有與SEQ ID NO: 9或任何天然存在的LolC蛋白的同源性，例如在整個序列或在至少20、例如至少50、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、或至少350或更多個連續(xù)的氨基酸的區(qū)域上，例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的一致性。測定蛋白同源性的方法在本領域中是公知的，并且如上關于HBV核心蛋白進行了描述。
同源蛋白通常通過取代、插入或缺失而不同于天然存在的LolC序列，例如1、2、3、4、5至8個或更多個的取代、缺失或插入。取代優(yōu)選是“保守的”，并且例如可以根據表2進行。在第二列的同一區(qū)塊的氨基酸和優(yōu)選在第三列的同一行的氨基酸可以相互取代。
表 2
被用作插入物的LolC蛋白的片段是全長LolC蛋白的縮短版本，其保留了誘導免疫響應的能力。在一些情況下，片段可以是天然存在的LolC序列或SEQ ID NO:9的序列的長度的至少10％、例如至少20％、至少30％、至少40％或至少50％、優(yōu)選至少60％、更優(yōu)選至少70％、更優(yōu)選至少80％、甚至更優(yōu)選至少90％和更優(yōu)選至少95％。例如片段的長度可以是6至354個aa、6至300個aa、6至200個aa、6至100個aa、6至50個aa或6至25個aa。
將糖連接至蛋白的方法
本發(fā)明提供了一種生產本發(fā)明的蛋白的方法。所述方法包括將一個或多個糖連接至e1環(huán)。如本文所述，糖被連接至e1環(huán)中的一個或多個氨基酸。糖可以通過氧化糖的還原胺化連接到e1環(huán)中的氨基酸。所述氨基酸可以是賴氨酸。高碘酸鈉可以被用來氧化糖。糖的氧化產生末端醛殘基。使用pH 7.5的PBS中的氰基硼氫化鈉，可以將糖的末端醛殘基還原胺化為伯胺。在連接糖之前，所述蛋白可以被純化。
所述方法可以進一步包含在連接糖之前制備蛋白。在連接糖之前的蛋白的生產將在下文更加詳細描述。
在連接糖之前制備蛋白
在連接糖之前，可以通過重組DNA技術制備蛋白。可以利用已知的操縱核酸的技術制備核酸分子。在蛋白包含HBcAg的兩個拷貝的情況中，通常，制備編碼這兩個HBcAg拷貝的兩個獨立的DNA構建體，然后通過重疊PCR連接在一起。
在連接糖之前，可以通過在表達蛋白的條件下，培養(yǎng)包含編碼該蛋白的核酸分子的宿主細胞，以及回收該蛋白來生產蛋白。合適的宿主細胞包括細菌（例如E. coli）、酵母菌、哺乳動物細胞和其他的真核細胞（例如昆蟲Sf9細胞）。
構建根據本發(fā)明的核酸分子的載體可以是例如質粒載體或病毒載體。它們可含有復制的起點、用于表達編碼蛋白的序列的啟動子、啟動子的調節(jié)子（例如增強子）、轉錄終止信號、翻譯起始信號和/或翻譯終止信號。所述載體也可以包含一個或多個選擇性的標記物基因，例如在細菌質粒的情況中的氨芐青霉素抗性基因或在哺乳動物載體的情況中的新霉素抗性基因。載體可以在體外用于例如生產RNA或用來轉化或轉染宿主細胞。所述載體也可以適于在體內被用在例如基因治療或DNA疫苗接種的方法中。
啟動子、增強子和其他表達調節(jié)信號可以被選擇來與表達載體所設計的宿主細胞兼容。例如，可以使用原核啟動子，特別是適用于E.coli菌株（例如E. coli HB101）中的啟動子?？梢允褂闷浠钚皂憫谥車h(huán)境（例如厭氧條件）中的變化而被誘導的啟動子。優(yōu)選地，可以使用htrA或nirB啟動子。這些啟動子可以特別是被用來在減毒細菌中表達蛋白，例如被用作疫苗。當所述蛋白的表達在哺乳動物細胞中進行時，無論是在體外還是在體內進行，都可以使用哺乳動物啟動子。也可以使用組織特異性啟動子，例如肝細胞特異性啟動子。也可以使用病毒啟動子，例如莫洛尼鼠白血病病毒長末端重復序列（MMLV LTR）、勞斯氏肉瘤病毒（RSV）LTR啟動子、SV40啟動子、人巨細胞病毒（CMV）IE啟動子、單純皰疹病毒啟動子和腺病毒啟動子。所有這些啟動子都可從現有技術中容易得到。
本發(fā)明的蛋白可以使用用于純化蛋白的常規(guī)技術來純化。所述蛋白例如可以以純化的、純的或分離的形式提供。對于在疫苗中使用，所述蛋白通常必須以高水平的純度提供，例如以在制劑中包含多于80%、多于90%、多于95%或多于98%的蛋白的水平。但是，在最終疫苗制劑中將所述蛋白與其他蛋白混合也是可取的。
誘導免疫響應
本發(fā)明的蛋白或顆?？梢员挥脕碚T導免疫響應。所述蛋白或顆?？梢员挥米饕呙?。所述蛋白或顆粒可以被用來引起對所有組分（HBcAg和糖）的多個同時的免疫響應。在所述蛋白包含HBcAg的兩個拷貝的情況中，所述多個免疫響應還可以包括進一步的針對額外的糖的免疫響應和/或針對蛋白表位的免疫響應。如果所有的糖、以及任選的蛋白表位都衍生自相同的來源，那么這可以針對該來源（例如病原體）誘導增強的免疫響應。如果所有的糖、以及任選的蛋白表位衍生自一個以上的來源，那么這可以針對不同的來源（例如一種以上的病原體）誘導同時的免疫響應。
所述蛋白或顆?？梢詥为毷褂没蛴米鹘M合物的一部分，所述組合物包括但不限于藥物組合物、疫苗組合物或免疫治療組合物。因此本發(fā)明提供了一種藥物組合物（例如疫苗組合物），其包括本發(fā)明的蛋白或包含本發(fā)明蛋白的多個拷貝的顆粒、以及藥學上可接受的載體或稀釋劑。所述組合物可以進一步包括佐劑。所述組合物可以被用于人體或動物體的疫苗接種。所述組合物可以被用來針對本文描述的任何病原體進行疫苗接種。特別地，所述組合物可以被用來針對伯克霍爾德氏菌（Burkholderia）（例如類鼻疽伯克霍爾德氏菌（Burkholderia pseudomallei）或鼻疽伯克霍爾德氏菌（Burkholderia mallei））進行疫苗接種。
本發(fā)明的蛋白或本發(fā)明的顆?？梢员挥迷谌梭w或動物體的疫苗接種的方法中。本發(fā)明提供了本發(fā)明的蛋白或本發(fā)明的顆粒用于制備用于人體或動物體的免疫接種的藥物的應用。所述蛋白或顆?？梢员挥脕磲槍Ρ疚拿枋龅牟≡w的任一種進行疫苗接種。特別地，所述組合物可以被用來針對伯克霍爾德氏菌（Burkholderia）（例如類鼻疽伯克霍爾德氏菌（Burkholderia pseudomallei）或鼻疽伯克霍爾德氏菌（Burkholderia mallei））進行疫苗接種。
疫苗接種背后的原理是在宿主中誘導免疫應答，從而在宿主中產生免疫記憶。這意味著，當宿主被暴露至有毒病原體時，它引發(fā)有效的（保護性的）免疫響應，即使病原體失活和/或殺死病原體的免疫響應。本發(fā)明形成了針對本文描述的任何病原體（例如伯克霍爾德氏菌（Burkholderia））的疫苗的基礎。所述蛋白可以同時對個體針對多種疾病和病癥進行疫苗接種，所述疾病取決于所述蛋白包含的糖和任選的蛋白表位。這樣的疾病和病癥包括本文描述的任何一種以及HBV、HAV、HCV、口蹄病、脊髓灰質炎、皰疹、狂犬病、AIDS、登革熱、黃熱病、瘧疾、肺結核、百日咳、傷寒、食物中毒、腹瀉、腦膜炎和淋病。對糖和蛋白表位進行選擇，以使其適于該疫苗旨在提供的保護所針對的疾病。
本發(fā)明提供了在對象中誘導免疫響應的方法，所述方法包含向對象施用本發(fā)明的蛋白或顆粒。優(yōu)選地，所述免疫響應是針對伯克霍爾德氏菌（Burkholderia）（例如類鼻疽伯克霍爾德氏菌（Burkholderia pseudomallei）或鼻疽伯克霍爾德氏菌（Burkholderia mallei））的。
術語“個體”和“對象”在本文中可互換使用，是指脊索動物亞門的任何成員，包括但不限于：人和其他靈長類，包括非人靈長類，例如黑猩猩和其他猿類和猴類物種；農場動物，例如牛、綿羊、豬、山羊和馬；家養(yǎng)哺乳動物，例如狗和貓；實驗動物，包括嚙齒動物，例如小鼠、大鼠和豚鼠以及豬；鳥類，包括家養(yǎng)的、野生的和競技的鳥類，例如雞、火雞和其他雞形鳥類、鴨、鵝等。所述術語不指示特定的年齡。因此，成體和新生個體都旨在被包括在內。本發(fā)明所述的方法旨在用于以上脊椎動物物種的任何一種，因為所有這些脊椎動物的免疫系統(tǒng)都以類似方式運作。
在一些情況下，本發(fā)明可以被施用至任何合適的對象，特別是給定物種的任何合適對象，優(yōu)選是合適的人類對象。因此，盡可能多的對象可以例如接受施用，而不強調對象的任何特定的群體。例如，作為整體的或盡可能多的對象的群體可以接受施用。
本發(fā)明的蛋白或顆粒用于施用至對象。它可以與佐劑一起同時施用或按順序施用。因此，包含蛋白或顆粒的本發(fā)明的組合物還可以包含佐劑。本發(fā)明的組合物可以通過注射（例如皮內、皮下、肌內、靜脈內、骨內和腹膜內）、經皮顆粒遞送、吸入、局部地、口服地或經黏膜（例如鼻腔、舌下、陰道或直腸）的方式而遞送。
所述組合物可以被配制為常規(guī)的藥物制劑。這可以使用標準的藥物制劑化學和方法學來實現，這對于本領域技術人員都是可獲得的。例如，包含蛋白或顆粒的組合物（含有或不含有佐劑）可以與一種或多種藥學上可接受的賦形劑或載體組合以提供液體制劑。因此，本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其包含所述蛋白或顆粒以及藥學上可接受的載體或稀釋劑。所述組合物任選地包含佐劑。
可以存在輔助性物質，例如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質等。這些載體、稀釋劑和輔助性物質通常是這樣的藥物試劑，它可以被施用而不引起不適當的毒性，并且在抗原性組合物的情況下在其本身不會誘導在接收該組合物的個體中的免疫響應。藥學上可接受的載體包括但不限于液體，例如水、鹽水、聚乙二醇、透明質酸、甘油和乙醇。藥學上可接受的鹽也可以被包括在其中，例如無機酸鹽，例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等；以及有機酸的鹽，例如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等。雖然不是必需的，但優(yōu)選地，制劑將含有用作穩(wěn)定劑的藥學上可接受的載體，特別是用于肽、蛋白或其他類似的分子（如果它們被包括在組合物中的話）。也用作肽的穩(wěn)定劑的合適的載體的例子包括但不限于藥品級的葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、山梨糖醇、肌糖、葡聚糖等。其他合適的載體包括但不限于淀粉、纖維素、磷酸鈉或磷酸鈣、檸檬酸、酒石酸、甘氨酸、高分子量的聚乙二醇（PEG）及其組合。藥學上可接受的賦形劑、載體和輔助性物質的深入討論在REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991)中可獲得，其通過引用合并至本文中。
替代地，所述蛋白或顆粒和/或佐劑可以被包封、吸附至顆粒載體，或與顆粒載體連接。合適的顆粒載體包括來源于聚甲基丙烯酸甲酯聚合物的顆粒載體、以及來源于聚乳酸和聚乳酸共乙交酯的PLG微顆粒。參見例如Jeffery et al. (1993) Pharm. Res. 10:362-368。也可以使用其他顆粒系統(tǒng)和聚合物，例如聚合物，例如聚賴氨酸、聚精氨酸、聚鳥氨酸、精胺、亞精胺以及這些分子的軛合物。
一旦配制完成，所述組合物可以使用多種已知的途徑和技術在體內遞送至對象。例如，液體制劑可以作為注射溶液、懸浮液或乳劑而提供，并使用常規(guī)的針頭和注射器或使用液體噴射注射系統(tǒng)，經過腸胃外、皮下、皮內、肌內、靜脈內、骨內和腹膜內注射而施用。液體制劑也可以被局部地施用至皮膚或粘膜組織（例如鼻腔、舌下、陰道或直腸），或作為適于吸入施用或肺部施用的細分散噴霧而提供。其他施用方式包括口服施用、栓劑和主動或被動的經皮遞送技術。
通常，本發(fā)明的蛋白或顆粒以將有效地調節(jié)免疫響應的量而被施用至對象。合適的有效量將會落入相對較大的范圍，但可以由本領域技術人員通過常規(guī)的試驗而容易地確定?！搬t(yī)生桌面參考（Physicians Desk Reference）”和“古德曼和吉爾曼的治療藥理基礎（Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics）”可以用于確定所需的量。預防性有效量是防止疾病或病癥的一種或多種癥狀發(fā)作的量。
通常，所述蛋白或顆粒以0.1至200 mg、優(yōu)選1至100 mg、更優(yōu)選10至50 mg體重的劑量施用。疫苗可以以單劑量方案或多劑量方案（例如2至32個劑量或4至16個劑量）給出。上述施用的途徑和劑量僅旨在作為指導，途徑和劑量最終由醫(yī)生決定。
在某些情況下，在初始施用之后，可以進行本發(fā)明的組合物的后續(xù)施用。特別地，在初始施用之后，對象可被給予“加強劑”。所述加強劑可以是例如選自任何以上所述劑量的劑量。所述加強劑施用可以在初始施用之后例如至少一周、兩周、四周、六周、一個月、兩個月或六個月進行。
本發(fā)明的蛋白或顆粒及佐劑可以按順序或同時施用，優(yōu)選同時施用。兩種實體可以在相同或不同的組合物中施用，優(yōu)選相同的組合物。施用所述佐劑，使得觀察到佐劑效應，即，觀察到的免疫響應不同于佐劑沒有與抗原一起施用時的響應。兩種實體可以被施用在相同或不同的位點，優(yōu)選相同的位點。優(yōu)選地，兩種實體在相同的時間在相同的位點被施用在相同的組合物中，并且優(yōu)選經注射施用。
可以使用任何合適的佐劑。當前使用的疫苗佐劑包括：
-無機化合物，例如銨鹽（如氫氧化銨和磷酸鋁）或磷酸鈣。鋁鹽也被稱為礬。
-基于油乳劑和表面活性劑的制劑，例如MF59（微流化的洗滌劑穩(wěn)定化的水包油乳劑）、QS21（純化的皂素）、AS02 [SBAS2]（水包油乳劑+ MPL + QS-21）、Montanide ISA-51和ISA-720（穩(wěn)定化的油包水乳劑）。
-顆粒佐劑，例如病毒顆粒（結合了例如流感血凝素的單層脂質體載體）、AS04（[SBAS4]具有MPL的Al鹽）、ISCOMS（皂素和脂質的結構化復合物）、以及聚乳酸乙交酯共聚物(PLG)。
-微生物衍生物（天然的和合成的），例如單磷酰脂A (MPL)、Detox（MPL + M. Phlei細胞壁骨架）、AGP [RC-529]（合成的酰化單糖）、DC_Chol（能夠自身組織成脂質體的類脂免疫刺激劑）、OM-174（脂質A衍生物）、CpG模體（含有免疫刺激CpG模體的合成寡核苷酸）、以及經修飾的LT和CT（經遺傳修飾的細菌毒素以提供無毒佐劑效應）。
-內源性人免疫調節(jié)劑，例如hGM-CSF或hIL-12（能夠以蛋白或編碼的質粒的形式施用的細胞因子）、以及Immudaptin（C3d串聯陣列）。
-惰性載體，例如金顆粒。
優(yōu)選的佐劑是礬。最優(yōu)選地，所述佐劑是氫氧化鋁和氫氧化鎂的混合物，例如注射用礬（Pierce Laboratories）。
本發(fā)明通過以下實施例來闡釋。
實施例
材料與方法
構建體的設計
所有串聯核心克隆衍生自親本構建體CoHo7e。在串聯核心的該版本中，α螺旋如上所述地被“平衡”，并且HBc的兩個拷貝都移除了核酸結合區(qū)域。因此，因為核心的兩個版本是基本上相同的，所述構建體被指定為同型串聯，唯一的差異是沉默的突變，以允許改變的限制位點。使用的串聯核心CoHo7e的序列為：
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLEGSAGGGRDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVGGSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSTMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLEFAGASDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVL (SEQ ID NO: 4)。
所述H3Ho構建體基于串聯核心的原始CoHo版本，如在國際申請WO2001/077158中所述的。設計了六賴氨酸插入體，它會產生反應的“熱點”，可以使用標準的胺化學將CPS結合至所述熱點上。它們是被綜合地設計的，并且包括含有序列AAALAAA（SEQ ID NO: 3）的重新設計的MIR，以“平衡”如上所述的α螺旋。合成的插入物被連接以產生H3Ho。最終的序列被核實且結果如下：
MSDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVAAALAAAEGSDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVGGSSGGSGGSGGSGGSTMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVAAALAAAESGDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVLE (SEQ ID NO: 5)。
另一種方法是，插入分離自伯克霍爾德氏菌（Burkholderia）的蛋白抗原。所述LolC蛋白先前已顯示是免疫原性的，因此被選擇作為潛在的插入物。然而，為了確保VLP的組裝不被阻礙，同時在N末端和C末端發(fā)現α螺旋折疊的區(qū)域。因此，抗原的插入將是從α螺旋狀的二級結構進入HBc尖峰的α螺旋。目前，不存在LolC的晶體學數據，因此其結構可以使用PSIPRED算法（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）預測。預測的插入區(qū)和側翼區(qū)被化學地合成，并使用標準的連接技術被插入進H3Ho的核心1。最終的測序證實，這是成功的?？誏olC序列：
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVAAALAAAEGSALGVAALIVVLSVMNGFQKEVRDRMLSVLAHVEIFSPTGSMPDWQLTAKEARLNRSVIGAAPYVDAQALLTRQDAVSGVMLRGVEPSLEPQVSDIGKDMKAGALTALAPGQFGIVLGNALAGNLGVGVGDKVTLVAPEGTITPAGMMPRLKQFTVVGIFESGHYEYDSTLAMIDIQDAQALFRLPAPTGVRLRLTDMQKAPQVARELAHTLSGDLYIRDWTQQNKTWFSAVQIEKRMMFIILTLIIAVAAFNLVSSLVMTVTNKQADIAILRTLGAQPGSIMKIFVVQGVTIGFVGTATGVALGCLIAWSIPWLIPMIEHAFGVQFLPPSVYFISELPSELVAGDVIKIGVIAGSDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVGGSSGGSGGSGGSGGSTMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVAAALAAAESGDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVLE (SEQ ID NO: 6)。
然后使用PstI和XhoI，通過切割H3Ho空LolC構建體的核心2，制成LolC插入物的兩種變體。然后連接進合成的插入物，其包括六賴氨酸或側翼有重復的丙氨酸殘基的單個賴氨酸。測序再次確認了它們的特征。LolC-K6序列：
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVAAALAAAEGSALGVAALIVVLSVMNGFQKEVRDRMLSVLAHVEIFSPTGSMPDWQLTAKEARLNRSVIGAAPYVDAQALLTRQDAVSGVMLRGVEPSLEPQVSDIGKDMKAGALTALAPGQFGIVLGNALAGNLGVGVGDKVTLVAPEGTITPAGMMPRLKQFTVVGIFESGHYEYDSTLAMIDIQDAQALFRLPAPTGVRLRLTDMQKAPQVARELAHTLSGDLYIRDWTQQNKTWFSAVQIEKRMMFIILTLIIAVAAFNLVSSLVMTVTNKQADIAILRTLGAQPGSIMKIFVVQGVTIGFVGTATGVALGCLIAWSIPWLIPMIEHAFGVQFLPPSVYFISELPSELVAGDVIKIGVIAGSDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVGGSSGGSGGSGGSGGSTMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVAAALAAAESGGSGSKKKKKKGSGSSGDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVLE (SEQ ID NO: 7)。
LolC-K1序列：
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVAAALAAAEGSALGVAALIVVLSVMNGFQKEVRDRMLSVLAHVEIFSPTGSMPDWQLTAKEARLNRSVIGAAPYVDAQALLTRQDAVSGVMLRGVEPSLEPQVSDIGKDMKAGALTALAPGQFGIVLGNALAGNLGVGVGDKVTLVAPEGTITPAGMMPRLKQFTVVGIFESGHYEYDSTLAMIDIQDAQALFRLPAPTGVRLRLTDMQKAPQVARELAHTLSGDLYIRDWTQQNKTWFSAVQIEKRMMFIILTLIIAVAAFNLVSSLVMTVTNKQADIAILRTLGAQPGSIMKIFVVQGVTIGFVGTATGVALGCLIAWSIPWLIPMIEHAFGVQFLPPSVYFISELPSELVAGDVIKIGVIAGSDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVGGSSGGSGGSGGSGGSTMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVAAALAAAESGGSGSGGGKGGGSGSSGDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVLE (SEQ ID NO: 8)。
質粒的設計
使用兩個系統(tǒng)進行蛋白表達；畢赤酵母（Pichia pastoris）和桿狀病毒（baculovirus）載體。這需要使用兩種不同的質粒，具體地，pPICz（Invitrogen）用于酵母和pOET1（Oxford Expression Technologies）用于桿狀病毒。使用MfeI和pspOMI將H3Ho序列插入進 pPICz的多克隆位點，而使用pspOMI和BclI插入pOET1。
酵母中串聯核心的蛋白表達
使用300 ng的線性化的質粒DNA通過電穿孔轉化酵母。然后將該酵母劃線到含有100μg/ml博來霉素（Zeocin）的YPD平板上，并選擇最大的克隆。這些克隆然后單獨地接受濃度增加的博來霉素，選擇最耐抗的克隆來通過電穿孔進行第二次轉化。使用含有更高水平的博來霉素的選擇平板來重復該過程，以進行克隆選擇。通過這種方式，產生了高拷貝數的克隆，其具有大大改善了的VLP表達水平。將大規(guī)模酵母培養(yǎng)物設置在200 ml的YPD中。大約4天之后，將培養(yǎng)基替換為誘導培養(yǎng)基，并使用甲醇（0.8％，72小時）誘導酵母。在該時間段之后，通過1500g的離心收取酵母細胞，并在純化前將顆粒保存于-80℃。
桿狀病毒中串聯核心的蛋白表達
通過在Sf9昆蟲細胞中的共轉染產生重組病毒。將重復的反應混合物（每個都含有flashBACPRIME病毒DNA（100ng）和轉移載體DNA（500ng; pOET1-K6-lolc））、以及形成Lipofectin脂質體的試劑（baculoFECTIN），一起加入至35mm2的培養(yǎng)皿中，以1×106個細胞/皿的密度接種Sf9昆蟲細胞。然后將培養(yǎng)皿在28℃培養(yǎng)5天，然后將含有每種病毒的培養(yǎng)基收獲到無菌管中。從50毫升的Sf9細胞中產生大量病毒，其密度為2×106個細胞/ ml，感染有0.5ml的共轉染混合物。被感染的搖床培養(yǎng)物在28℃培養(yǎng)5天，然后通過在4℃在500xg離心20分鐘進行收集。對于蛋白的表達，以1×106個細胞/皿的密度將Sf9細胞接種到35mm2的培養(yǎng)皿，而Tni細胞以0.5×106細胞個/皿的密度接種。每個培養(yǎng)皿在moi 5感染病毒。在28℃溫育72小時之后，從每個培養(yǎng)皿中收獲細胞顆粒和上清液。
蛋白的純化
不管使用的表達載體、或插入的性質如何，純化都以類似的方式進行。收獲被誘導的細胞并進行旋降（300xg），隨后以2.5g濕重/10ml裂解液的比例將其重懸在裂解液（20mM Tris pH 8.4，5mM EDTA，5mM MDTT，2mM AEBSF）中。然后將所得溶液穿過設定在500psi的微粉機（AVP Gaulin LAB 40）三次。加入洗滌劑（Triton X100），以形成0.5％溶液并將裂解物離心30分鐘（25,000xg），然后收獲上清液。將澄清的上清液穿過0.8um的死端過濾器（Nalgene），隨后穿過0.45um并最后穿過0.2um過濾器。該物質被稀釋10倍（20mM Tris pH8.4，5mM EDTA），然后穿過具有1MDa分子量截止（Pellicon）的切向流裝置。這一步既除去低分子量的污染物又將體積減少至25ml。
然后將濃縮的溶胞產物施加到由Akta Pure FPLC系統(tǒng)驅動的填充有瓊脂糖CL4B樹脂的XK26/ 92柱中。緩沖液是20mM Tris pH 8.4，5mM EDTA。在260、280和350nm處監(jiān)測級分。收集空隙體積，因為這含有包括VLP的大蛋白。丟棄在柱上分離的蛋白的其余部分。匯集空隙體積級分，并使用切向流裝置（Pellicon）將其濃縮回落到10ml。然后將該物質通過填充有Sephacryl S1000樹脂的XK26/ 55柱。該樹脂具有大得多的孔徑，并能夠從其它大的蛋白中解析VLP。此前，我們已經使用重組單體HBc（Biospacific Inc）校準了所述柱，因此知道裝配的VLP何時會流出。收集這些級分并在切向流裝置上濃縮最后一次。
蛋白的識別與定性
在純化過程的每一個步驟都常規(guī)地存儲樣品，因此允許在過程中監(jiān)控。已知的是，雖然每個表達系統(tǒng)都毫無疑問地會形成VLP，但并不是所有串聯核心蛋白都形成該最終構型。因此，需要被除去的最重要的污染物實際上是處于單體或錯誤折疊的狀態(tài)的串聯核心蛋白本身。然而，SDS-PAGE和免疫印跡按照定義是變性技術，因此這些技術必須與蛋白尺寸的了解相結合，蛋白尺寸可以使用在FPLC柱上的保留時間來估計。
通過在所述過程的所有階段在12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝膠（Laemmli，1970）上進行電泳，并隨后進行考馬斯藍染色，來表征包含串聯核心的樣品。如所述地進行免疫印跡分析（Konig，et al.，1998），其使用針對HBc蛋白的單克隆初級抗體（10E11[Abcam]），以及隨后的被結合至辣根過氧化物酶和化學發(fā)光底物ECLplus（Amersham Pharmacia）的小鼠次級抗體。通過Bradford方法（BioRad）測定蛋白濃度。
電子顯微鏡
所有樣品都在20mM Tris HCl pH 8中被稀釋至0.1mg/ml，并且在水浴超聲波儀中超聲處理45秒，隨后立即吸附至網格。將涂覆有聚醋酸甲基乙烯脂/碳的銅網格（400目）含碳一側朝下地放置在石蠟膜上的稀釋樣品的液滴上。材料被允許吸附10分鐘。然后將網格在更換4次的1％乙酸雙氧鈾中洗滌。使用最后一次更換的乙酸雙氧鈾溫育網格20秒，然后進行印跡和空氣干燥。在FEI Tecnai G2 TEM上觀察網格并數字成像。在87,000x、 43,000x和26,000x的放大倍率下獲得圖像。
LolC的抗原性的ELISA方法
將96孔微量滴定板在4℃涂覆24小時，其中100微升/孔的純化LolC（標準，2-0.03 μg/mL）、VLP（陰性對照，30-0.2 μg/mL）和VLP-LolC（測試樣品，30-0.2 μg/mL）。所有樣品都在磷酸鹽緩沖鹽水（1x Dulbecco’s PBS，Invitrogen）中連續(xù)稀釋兩倍。每孔用PBS-0.05% Tween 20洗滌三次，并用200μL的含有5％（w/v）脫脂奶粉的PBS在37℃封閉1小時。然后每孔用PBS-0.05% Tween 20洗滌三次，添加疫苗接種有不含內毒素的LolC蛋白的來自小鼠的血清的1:1000稀釋液（100微升/孔），并在37℃溫育1小時。在用PBS-Tween 20洗滌3次之后，將IgG山羊抗小鼠辣根過氧化物酶結合物的1:2000稀釋液加入到每孔（100μL），并在37℃溫育1小時。每孔在PBS-Tween 20中再洗滌6次，使用ABTS/過氧化氫底物（100μL/孔）檢測結合的結合物并室溫下溫育20分鐘，隨后在414nm進行光密度測量。
CPS至VLP的化學結合
將高碘酸鈉（6 mg, 0.3 mmol）和CPS（5 mg）溶解于PBS（1 ml）中，并將反應混合物置于室溫下1小時。使用利用PBS來平衡的PD-10脫鹽柱（GE Healthcare）除去過量的偏高碘酸鈉。氧化的CPS被加入到在PBS中的5mg/ml（1 ml）的蛋白的溶液中。將20 μl的NaBH3CN（在10 mM NaOH中有1M）加入到該溶液，并在黑暗中室溫放置四天。將20μl的NaBH4（在10 mM NaOH中有1M NaBH4）加入到該溶液，攪拌后反應物靜置40分鐘。該溶液被稀釋在MQ-H2O中，并針對碳酸氫銨緩沖液（20mM, pH7.8）充分透析并在vacuousing speed??-vac（Thermo Scientific）中濃縮。
被濃縮的蛋白樣品在?KTA Xpress FPLC純化系統(tǒng)上進行純化。將該結合物溶液注射到S500瓊脂糖SEC柱XK 26/60（GE Healthcare）上，并以1 ml /分鐘使用碳酸氫銨緩沖液（20mM, pH7.8）稀釋。收集所有的級分（2.5ml）并使用苯酚：硫酸分析法和通過TEM和點印跡分析法來分析碳水化合物。收集的級分在真空中濃縮（Speed??-Vac, Thermo Scientific）并透析到PBS中。
結果
從酵母樣品中分離蛋白
在整個過程中收集樣品，因此有可能隨著過程進行跟蹤純度富集。最重要的是，不管存在的插入物如何，大多數的串聯核心都被發(fā)現于在最初的離心后裂解之后的可溶性級分中。只有少數的核心蛋白被發(fā)現于來自該旋降的顆粒中，這表明盡管它們含有復雜的組分，但嵌合的VLP仍保持可溶。
從酵母或桿狀病毒裂解物分離VLP不怎么常見，因為已經發(fā)現親和層析不易與串聯核心兼容。因此，進步的方法是基于樣品中尺寸分類的逐步細化。最初，通過過濾除去非常大的碎片，留下小于200nm及其以下的顆粒。然后將樣品通過具有1MDa分子量截止的切向流過濾器。這作用來保留大的VLP，但除去一些低分子量的污染物。
然后使用CL4B尺寸排阻層析（SEC）分離樣品。該矩陣具有相對小的孔徑，并且非常大的材料（包括VLP）將不會進入樹脂。因此，較大的材料直接穿過柱并在空隙體積中找到。然而，相當數量的小分子蛋白確實進入樹脂并且被延遲。因此，通過僅保留空隙體積，所述樣品被有效地富集。SDS-PAGE和免疫印跡再次表明，大多數的串聯核心的確是在CL4B空隙體積中被發(fā)現。
然后將CL4B空白樣品穿過S1000 SEC柱。這通常用于分離大分子（例如核酸），但也能夠從其他大的碎片中解析VLP。所述柱先前已使用重組HBc校準，該HBc已知是具有與串聯核心VLP相似大小（34.6nm）的VLP。因此，有可能確定串聯核心VLP應該在柱洗脫的最后1/3中被發(fā)現。當然是這樣的，并且純的VLP從這些組分中分離。這已通過電子顯微鏡證實。
圖1至圖3含有從酵母樣品中分離的蛋白的數據。SDS-PAGE證實了串聯核心在酵母溶胞產物的可溶級分中被發(fā)現（圖1）。圖2示出了VLP從CL4B柱的空隙體積中被分離（圖2B的左側面板上的較大的峰）。然后CL4B空隙通過S1000柱，并從12-15級分中分離VLP。通過SDS-PAGE和免疫印跡（圖3）證實了純度。
從桿狀病毒樣品中分離蛋白
串聯核心蛋白也被發(fā)現來自最初的25,000xg旋降的上清液中，這再次表明VLP是可溶的。SDS-PAGE和免疫印跡證實非常少的蛋白被丟失至不溶性顆粒。在大多數方面，從桿狀病毒中分離VLP與從酵母中分離 VLP非常相似。然而，有一個主要的區(qū)別，因為通常發(fā)現桿狀病毒與串聯核心共純化。這不僅在SDS-PAGE中作為50kDa的條帶（圖4A）被檢測到，也在電子顯微圖中作為長管（圖4B）清晰可見。
盡管反復多次純化，但是將在桿狀病毒中產生的VLP純化到同質性是不可能的。因此，對于VLP優(yōu)選的表達系統(tǒng)是酵母系統(tǒng)。
結合至CPS
為了證明結合方法的可行性，使用先前概述的技術將異硫氰酸熒光素（FITC）結合到VLC。
應當注意，因為SDS-PAGE按照定義是一種變性技術，這些數據表明，串聯核心構成部件已經被有效地修飾，因為其分子量已經增加（圖5）。然而，當這些結合顆粒在蔗糖墊上跑動時，熒光帶被見于VLP區(qū)域，從而支持了已經實現結合而沒有破壞VLP的事實（圖6）。
類似地，我們進一步證明，通過將其結合至牛血清白蛋白（圖7），CPS自身的結合也是可能的。因此，我們已經表明，使用我們所定義的化學方法，CPS的結合是可能的，也存在結合到VLP。因此，CPS直接連接至VLP也應該是可行的。
抗原性和免疫原性
CPS至VLP的結合應該不會從根本上改變糖蛋白的三級結構。該結合物的體內測試正在進行。
然而，另一種方法是將抗原直接插入進串聯核心分子。雖然有可能引導至VLP，其高度地裝飾有被插入的抗原，但是它潛在地對插入物的折疊施加嚴重的空間限制，因為它被栓系在兩端。為了檢驗這一點，在ELISA中測試攜帶LolC插入物的VLP，其使用感染了野生型伯克霍爾德氏菌的小鼠中產生的抗體。值得注意的是，攜帶LolC的VLP被識別為具有幾乎與野生型Lolc蛋白本身一樣高的親和力。對空載VLP存在較小的響應，但該響應對于插入物明顯是主要的（圖8）。對于圖8，對應于VLP LolC的線對30 ug/ml的值位于1.6和1.8平均OD之間。對應于空載VLP的線對30ug/ml的值位于0.4平均OD附近。
討論
單體核心蛋白的免疫原性被良好地確立，其接受抗原插入物進入其MIR的能力也一樣。然而，同樣被記載的是，該技術具有主要的弱點，因為當加入較大的或疏水性的插入物時，核心二聚體不再形成，導致VLP的形成失敗。串聯核心構建體的發(fā)展克服了這一主要限制。
雖然串聯核心作為被插入的蛋白抗原的遞送系統(tǒng)的效用已在別處被證明，在化學結合模式中使用該系統(tǒng)也是可能的。在這種情況中，非特異性的接頭氨基酸被插入進MIR，并且疾病特異性來源于抗原與上述這些靶標氨基酸的化學結合。此技術進一步擴大了串聯核心可攜帶的抗原，因為可以結合糖蛋白，這使用常規(guī)的克隆方法是不可能加入的。VLP的多聚性質意味著目標結合物的多個拷貝被加入到每個VLP。鑒于在每個VLP中存在90-120個HBc二聚體，可以達到非常高的抗原遞送密度。當然，將化學結合物與特定性抗原插入物進行組合是可能的，因此使得嵌合的分子同時具有特異性的蛋白和特異性的糖蛋白。
對于VLP優(yōu)選的表達系統(tǒng)是畢赤酵母（Pichia pastoris）。然而，可以使用多個系統(tǒng)，其包括細菌、桿狀病毒和甚至是基于植物的表達。這些數據證明，該系統(tǒng)的特異性完全來自于初級蛋白序列，并且和可能存在于特定的表達系統(tǒng)中的翻譯后修飾是不相關的。進一步地，我們已經證明，所使用的純化策略適用于任何表達系統(tǒng)，因此很可能可擴展至工業(yè)方法。
序列表
<110> IQUR有限公司
<120> 基于乙型肝炎核心抗原的疫苗
<130> N402200WO
<150> GB1402890.6
<151> 2014-02-18
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 639
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(639)
<400> 1
atg caa ctt ttt cac ctc tgc cta atc atc tct tgt tca tgt cct act 48
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1 5 10 15
gtt caa gcc tcc aag ctg tgc ctt ggg tgg ctt tgg ggc atg gac atc 96
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
20 25 30
gac cct tat aaa gaa ttt gga gct act gtg gag tta ctc tcg ttt ttg 144
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
35 40 45
cct tct gac ttc ttt cct tca gta cga gat ctt cta gat acc gcc tca 192
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
50 55 60
gct ctg tat cgg gaa gcc tta gag tct cct gag cat tgt tca cct cac 240
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65 70 75 80
cat act gca ctc agg caa gca att ctt tgc tgg ggg gaa cta atg act 288
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
85 90 95
cta gct acc tgg gtg ggt gtt aat ttg gaa gat cca gcg tct aga gac 336
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
100 105 110
cta gta gtc agt tat gtc aac act aat atg ggc cta aag ttc agg caa 384
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
115 120 125
ctc ttg tgg ttt cac att tct tgt ctc act ttt gga aga gaa aca gtt 432
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
130 135 140
ata gag tat ttg gtg tct ttc gga gtg tgg att cgc act cct cca gct 480
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145 150 155 160
tat aga cca cca aat gcc cct atc cta tca aca ctt ccg gag act act 528
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
165 170 175
gtt gtt aga cga cga ggc agg tcc cct aga aga aga act ccc tcg cct 576
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
180 185 190
cgc aga cga agg tct caa tcg ccg cgt cgc aga aga tct caa tct cgg 624
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
195 200 205
gaa tct caa tgt tag 639
Glu Ser Gln Cys
210
<210> 2
<211> 212
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 2
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1 5 10 15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
20 25 30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
35 40 45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
50 55 60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65 70 75 80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
85 90 95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
100 105 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
115 120 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
130 135 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145 150 155 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
165 170 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
180 185 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
195 200 205
Glu Ser Gln Cys
210
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HBcAg可以包含的序列
<400> 3
Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala
1 5
<210> 4
<211> 334
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CoHo7e構建體
<400> 4
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Gly Ser Ala
65 70 75 80
Gly Gly Gly Arg Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val
85 90 95
Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile
100 105 110
Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser
115 120 125
Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala
130 135 140
Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Gly Gly Ser Ser
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
165 170 175
Gly Ser Thr Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val
180 185 190
Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp
195 200 205
Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro
210 215 220
Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys
225 230 235 240
Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu
245 250 255
Phe Ala Gly Ala Ser Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr
260 265 270
Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His
275 280 285
Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val
290 295 300
Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn
305 310 315 320
Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Leu
325 330
<210> 5
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H3Ho構建體
<400> 5
Met Ser Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu
1 5 10 15
Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu
20 25 30
Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His
35 40 45
Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly
50 55 60
Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala
65 70 75 80
Glu Gly Ser Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn
85 90 95
Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser
100 105 110
Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe
115 120 125
Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro
130 135 140
Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Gly Gly Ser Ser Gly
145 150 155 160
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Thr Met Asp Ile Asp
165 170 175
Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro
180 185 190
Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala
195 200 205
Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His
210 215 220
Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu
225 230 235 240
Ala Thr Trp Val Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala Glu Ser Gly Asp Pro
245 250 255
Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu
260 265 270
Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly
275 280 285
Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg
290 295 300
Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu
305 310 315 320
Pro Glu Thr Thr Val Val Leu Glu
325
<210> 6
<211> 682
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 空LolC構建體
<400> 6
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
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