促進(jìn)釀酒酵母菌表達(dá)的乙型肝炎表面抗原共價交聯(lián)顆粒形成的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種促進(jìn)釀酒酵母菌表達(dá)的乙型肝炎表面抗原共價交聯(lián)顆粒形成的方法，包括以下步驟：將釀酒酵母菌表達(dá)的重組乙型肝炎表面抗原在溫度為4～100℃的條件下，放置5-30分鐘時間，使其鏈間非共價結(jié)合的多肽和單個多肽通過二硫鍵結(jié)合形成的二聚體向多肽間二硫鍵共價交聯(lián)轉(zhuǎn)化，形成多肽鏈間共價交聯(lián)抗原顆粒。本發(fā)明無需添加化學(xué)物質(zhì)，以簡便、低成本的處理方式即可促進(jìn)高免疫性抗原顆粒的形成。
【專利說明】促進(jìn)釀酒酵母菌表達(dá)的乙型肝炎表面抗原共價交聯(lián)顆粒形成的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物化學(xué)技術(shù)，尤其涉及一種促進(jìn)釀酒酵母菌表達(dá)的乙型肝炎表面抗原共價交聯(lián)顆粒形成的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]釀酒酵母菌表達(dá)的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)經(jīng)過純化，加佐劑后，制成乙肝疫苗，可預(yù)防乙型肝炎。這種HBsAg在菌體內(nèi)表達(dá)后，自發(fā)地形成球形顆粒，顆粒內(nèi)部為宿主菌的脂類，外部聚集了 100多條HBsAg多肽，這種顆粒的免疫原性很差，HBsAg多肽亞單位通過非共價結(jié)合的疏水作用松散地粘結(jié)在一起，以下稱之為I型抗原。由于HBsAg富含半胱氨酸，在菌體外I型抗原逐步轉(zhuǎn)變成共價結(jié)合的形式，首先單個多肽通過二硫鍵結(jié)合成二聚體，以下稱之為II型抗原，II型抗原比I型抗原的免疫原性高5~10倍，I型抗原和 II型抗原最后通過多肽間二硫鍵交聯(lián)，逐漸轉(zhuǎn)化為高免疫原性的抗原，以下稱之為III型抗原，III型抗原有高度的多肽間二硫鍵，此時顆粒平均直徑為22nm，其形態(tài)、化學(xué)性質(zhì)和免疫原性等方面與天然HBsAg顆粒相似。[0003]為提高釀酒酵母菌表達(dá)的HBsAg的免疫原性，常常采用化學(xué)處理的方式，如尿素法、高PH法、谷胱甘肽法、硫氰酸鹽法等，促使I型和II型抗原亞單位之間形成二硫鍵交聯(lián)，向III型抗原轉(zhuǎn)化。但上述方法如果過于劇烈或時間過長，會對HBsAg多肽鏈的一級結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)造成破壞，反之，又會處理不夠完全，達(dá)不到最佳效果。此外最終需要去除添加的化學(xué)物質(zhì)，去除過程會增加純化工藝的復(fù)雜性，耗用更多的時間和物料成本，并且某些殘留的化學(xué)物質(zhì)可能會對疫苗接種者造成潛在的傷害。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是:提供一種促進(jìn)釀酒酵母菌表達(dá)的乙型肝炎表面抗原共價交聯(lián)顆粒形成的方法，該方法無需添加化學(xué)物質(zhì)，以簡便、低成本的處理方式即可促進(jìn)高免疫性抗原顆粒的形成，安全性高。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0006]一種促進(jìn)釀酒酵母菌表達(dá)的乙型肝炎表面抗原共價交聯(lián)顆粒形成的方法，該方法包括以下步驟:
[0007]將釀酒酵母菌表達(dá)的重組乙型肝炎表面抗原在溫度為4_100°C的條件下，放置3 個月-5分鐘時間，使其鏈間非共價結(jié)合的多肽和單個多肽通過二硫鍵結(jié)合形成的二聚體向多肽間二硫鍵共價交聯(lián)轉(zhuǎn)化，形成多肽鏈間共價交聯(lián)抗原顆粒。
[0008]優(yōu)選地，所述釀酒酵母菌表達(dá)的重組乙型肝炎表面抗原的放置溫度為[60， 100] °C，放置時間為90-30分鐘。
[0009]或者，所述釀酒酵母菌表達(dá)的重組乙型肝炎表面抗原的放置溫度為[37，60)°C，放置時間為96小時-90分鐘。[0010]或者，所述釀酒酵母菌表達(dá)的重組乙型肝炎表面抗原的放置溫度為[25，37)°C，放置時間為90天-96小時。
[0011]或者，所述釀酒酵母菌表達(dá)的重組乙型肝炎表面抗原的放置溫度為[4，25) V,放置時間為3個月-90天。
[0012]優(yōu)選地，所述釀酒酵母菌表達(dá)的重組乙型肝炎表面抗原的放置溫度為100°C，放置時間為30分鐘。
[0013]或者，所述釀酒酵母菌表達(dá)的重組乙型肝炎表面抗原的放置溫度為60°C，放置時間為90分鐘。
[0014]或者，所述釀酒酵母菌表達(dá)的重組乙型肝炎表面抗原的放置溫度為37°C，放置時間為96小時。
[0015]或者，所述釀酒酵母菌表達(dá)的重組乙型肝炎表面抗原的放置溫度為25°C，放置時間為90天。
[0016]或者，所述釀酒酵母菌表達(dá)的重組乙型肝炎表面抗原的放置溫度為4°C，放置時間為3個月。
[0017]本發(fā)明的有益效果是:
[0018]本發(fā)明的實施例通過將釀酒酵母菌表達(dá)的重組乙型肝炎表面抗原在適當(dāng)?shù)臏囟葪l件下放置適當(dāng)時間，從而促進(jìn)了其鏈間非共價結(jié)合和低度共價結(jié)合的抗原向二硫鍵鏈間共價交聯(lián)顆粒抗原的轉(zhuǎn)化，達(dá)到了無需添加化學(xué)物質(zhì)，以簡便、低成本的處理方式即可促進(jìn)高免疫性抗原顆粒的形成的效果，且安全性高。
[0019]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1是本發(fā)明提供的方法第一實施例中A批號釀酒酵母菌表達(dá)的重組HBsAg中1、 I1、III型抗原組分含量隨時間變化的示意圖。
[0021]圖2是本發(fā)明提供的方法第一實施例中B批號釀酒酵母菌表達(dá)的重組HBsAg中1、 I1、III型抗原組分含量隨時間變化的示意圖。
[0022]圖3是本發(fā)明提供的方法第一實施例中C批號釀酒酵母菌表達(dá)的重組HBsAg中1、 I1、III型抗原組分含量隨時間變化的示意圖。
[0023]圖4是本發(fā)明提供的方法第二實施例中A批號釀酒酵母菌表達(dá)的重組HBsAg中1、 I1、III型抗原組分含量隨時間變化的示意圖。
[0024]圖5是本發(fā)明提供的方法第二實施例中B批號釀酒酵母菌表達(dá)的重組HBsAg中1、 I1、III型抗原組分含量隨時間變化的示意圖。
[0025]圖6是本發(fā)明提供的方法第二實施例中C批號釀酒酵母菌表達(dá)的重組HBsAg中1、 I1、III型抗原組分含量隨時間變化的示意圖。
[0026]圖7是本發(fā)明提供的方法第三實施例中A批號釀酒酵母菌表達(dá)的重組HBsAg中1、 I1、III型抗原組分含量隨時間變化的示意圖。
[0027]圖8是本發(fā)明提供的方法第三實施例中B批號釀酒酵母菌表達(dá)的重組HBsAg中1、 I1、III型抗原組分含量隨時間變化的示意 圖。
[0028]圖9是本發(fā)明提供的方法第三實施例中C批號釀酒酵母菌表達(dá)的重組HBsAg中1、I1、III型抗原組分含量隨時間變化的示意圖。
[0029]圖10是本發(fā)明提供的方法第四實施例中A批號釀酒酵母菌表達(dá)的重組HBsAg中 1、I1、III型抗原組分含量隨時間變化的示意圖。
[0030]圖11是本發(fā)明提供的方法第四實施例中B批號釀酒酵母菌表達(dá)的重組HBsAg中 1、I1、III型抗原組分含量隨時間變化的示意圖。
[0031]圖12是本發(fā)明提供的方法第四實施例中C批號釀酒酵母菌表達(dá)的重組HBsAg中 1、I1、III型抗原組分含量隨時間變化的示意圖。
[0032]圖13是本發(fā)明提供的方法第五實施例中A批號釀酒酵母菌表達(dá)的重組HBsAg中 1、I1、III型抗原組分含量隨時間變化的示意圖。
[0033]圖14是本發(fā)明提供的方法第五實施例中B批號釀酒酵母菌表達(dá)的重組HBsAg中
1、I1、III型抗原組分含量隨時間變化的示意圖。
[0034]圖15是本發(fā)明提供的方法第五實施例中C批號釀酒酵母菌表達(dá)的重組HBsAg中
1、I1、III型抗原組分含量隨時間變化的示意圖。
【具體實施方式】
[0035]下面詳細(xì)描述 本發(fā)明提供的促進(jìn)釀酒酵母菌表達(dá)的乙型肝炎表面抗原共價交聯(lián)顆粒形成的方法，該方法包括以下步驟:
[0036]將釀酒酵母菌表達(dá)的重組乙型肝炎表面抗原在溫度為4~100°C的條件下，放置 5分鐘-3個月時間，使其鏈間非共價結(jié)合的多肽和單個多肽通過二硫鍵結(jié)合形成的二聚體向多肽間二硫鍵共價交聯(lián)轉(zhuǎn)化，形成多肽鏈間共價交聯(lián)抗原顆粒。在前述范圍內(nèi)，放置溫度與放置時間成反比關(guān)系，即放置溫度越高，放置時間越短。
[0037]具體實現(xiàn)時，作為本發(fā)明的一個較佳實施方式，所述釀酒酵母菌表達(dá)的重組乙型肝炎表面抗原的放置溫度為可在[60，100] °C，放置時間可為90-30分鐘。
[0038]或者，在上述方法中，所述釀酒酵母菌表達(dá)的重組乙型肝炎表面抗原的放置溫度也可在[37，60) °C范圍，放置時間相應(yīng)地調(diào)整為96小時-90分鐘。
[0039]或者，所述釀酒酵母菌表達(dá)的重組乙型肝炎表面抗原的放置溫度也可為[25， 37) °C范圍，放置時間相應(yīng)地調(diào)整為90天-96小時。
[0040]或者，所述釀酒酵母菌表達(dá)的重組乙型肝炎表面抗原的放置溫度也可在[4，25)°C 范圍，放置時間相應(yīng)地調(diào)整為3個月-90天。
[0041]下面參考附圖1-圖3詳細(xì)描述本發(fā)明提供的促進(jìn)釀酒酵母菌表達(dá)的乙型肝炎表面抗原共價交聯(lián)顆粒形成的方法的第一實施例。
[0042]實施例1:4°C處理
[0043]本實施例中，取3批濃度為20 U g/ml的經(jīng)純化的釀酒酵母菌表達(dá)的重組乙型肝炎表面抗原(r-HBsAg)，在4°C的溫度下放置3個月，并在開始0、1、2、3個月的時間點，分別用分子排阻高效液相色譜法分析樣品，計算各型抗原吸收峰面積百分率，其結(jié)果見表1、圖1-圖 3。
[0044]表14°C處理不同時間各型抗原吸收峰的面積百分率(％)
【權(quán)利要求】
1.一種促進(jìn)釀酒酵母菌表達(dá)的乙型肝炎表面抗原共價交聯(lián)顆粒形成的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟:將釀酒酵母菌表達(dá)的重組乙型肝炎表面抗原在溫度為4-100°C的條件下，放置3個月-5分鐘時間，使其鏈間非共價結(jié)合的多肽和單個多肽通過二硫鍵結(jié)合形成的二聚體向多肽間二硫鍵共價交聯(lián)轉(zhuǎn)化，形成多肽鏈間共價交聯(lián)抗原顆粒。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述釀酒酵母菌表達(dá)的重組乙型肝炎表面抗原的放置溫度為[60，100] °C，放置時間為90-30分鐘。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述釀酒酵母菌表達(dá)的重組乙型肝炎表面抗原的放置溫度為[37,60) °C，放置時間為96小時-90分鐘。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述釀酒酵母菌表達(dá)的重組乙型肝炎表面抗原的放置溫度為[25，37) °C，放置時間為90天-96小時。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述釀酒酵母菌表達(dá)的重組乙型肝炎表面抗原的放置溫度為[4,25) °C,放置時間為3個月-90天。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述釀酒酵母菌表達(dá)的重組乙型肝炎表面抗原的放置溫度為100°C,放置時間為30分鐘。
7.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述釀酒酵母菌表達(dá)的重組乙型肝炎表面抗原的放置溫度為60°C,放置時間為90分鐘。
8.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述釀酒酵母菌表達(dá)的重組乙型肝炎表面抗原的放置溫度為37°C,放置時間為96小時。
9.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述釀酒酵母菌表達(dá)的重組乙型肝炎表面抗原的放置溫度為25°C,放置時間為90天。
10.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述釀酒酵母菌表達(dá)的重組乙型肝炎表面抗原的放置溫度為4°C，放置時間為3個月。
【文檔編號】C07K14/02GK103524604SQ201310455366
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】朱征宇, 饒洪沖, 段琰 申請人:深圳康泰生物制品股份有限公司