專(zhuān)利名稱(chēng)：：丙烯酰胺全抗原的制備及其酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及丙烯酰胺的檢測(cè)方法，尤其是涉及一種丙烯酰胺全抗原的制備方法及相應(yīng)的丙烯酰胺酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)方法，屬于化合物分析檢測(cè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：丙烯酰胺(Acrylamide)是一種廣泛使用的有機(jī)合成單體，大量用于生產(chǎn)聚丙烯酰胺和其它的共聚化合物，并廣泛用于染料、塑膠的合成以及用作建材和日用品中的增稠劑。聚丙烯酰胺可作為助凝劑處理飲用水和污水。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織聯(lián)合食品添加劑專(zhuān)家委員會(huì)對(duì)食品中的丙烯酰胺進(jìn)行了系統(tǒng)的危險(xiǎn)性評(píng)估，其神經(jīng)毒性、生殖發(fā)育毒性和遺傳毒性均得到證實(shí)，并被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為2類(lèi)致癌物(即人類(lèi)可能致癌物)。許多國(guó)家規(guī)定在飲用水中丙烯酰胺單體的濃度不應(yīng)超過(guò)0.25pg/L。2002年4月，瑞典國(guó)家食品管理局和斯德哥爾摩大學(xué)研究人員首次發(fā)現(xiàn)，一些淀粉類(lèi)食品在油炸和燒烤等高溫加工的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生丙烯酰胺。隨后挪威、英國(guó)、瑞士和美國(guó)等國(guó)家也相繼報(bào)道了類(lèi)似結(jié)果，并證明是在加工過(guò)程中通過(guò)梅拉德(Maillard)反應(yīng)生成的一種副產(chǎn)物。由此食品中丙烯酰胺的污染問(wèn)題引起了國(guó)際社會(huì)的高度關(guān)注?；谠搯?wèn)題的普遍性和迫切性，世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織在聯(lián)合舉辦的食品中丙烯酰胺問(wèn)題專(zhuān)家咨詢(xún)會(huì)上建議將建立對(duì)食物中丙烯酰胺較為簡(jiǎn)便、成本低廉的檢測(cè)方法作為各國(guó)今后的一個(gè)重要研究方向，為食品質(zhì)量控制提供方便、可靠的檢測(cè)手段。目前檢測(cè)丙烯酰胺的常用方法主要集中為色譜-質(zhì)譜的分析方法，該類(lèi)方法樣品預(yù)處理要求高、步驟繁瑣，依賴(lài)大型、昂貴的儀器設(shè)備，并且不能同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品，不適合大規(guī)模的樣品檢測(cè)。而免疫分析方法通常對(duì)樣品處理要求低、設(shè)備和操作相對(duì)簡(jiǎn)單、特異性高，并有潛力發(fā)展為現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法。對(duì)于免疫分析方法而言，抗體是決定整個(gè)方法性能的重要基礎(chǔ)，而抗體的效果在很大程度上取決于能引起相應(yīng)動(dòng)物發(fā)生免疫反應(yīng)的抗原的結(jié)構(gòu)。丙烯酰胺作為一類(lèi)小分子化合物，雖然能與抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，即具有抗原性，但卻不能直接引起動(dòng)物機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)，即不具有免疫原性。它只相當(dāng)于抗原分子上的一個(gè)抗原決定簇，被稱(chēng)為半抗原。為此，必須將其與其他載體蛋白偶聯(lián)，如牛血清白蛋白(BSA)、雞卵清白蛋白(OVA)和鑰孔嘁血藍(lán)蛋白(KLH)等，獲得全抗原后，才能用于免疫動(dòng)物。但是丙烯酰胺分子量極低，只有71.09，分子結(jié)構(gòu)非常簡(jiǎn)單(分子式CH2CHCONH2)。一般地，分子越小，能夠產(chǎn)生免疫原性的特征基團(tuán)就越少，即使作為半抗原與蛋白偶聯(lián)后，得到的全抗原用來(lái)免疫動(dòng)物產(chǎn)生抗體的成功率也比大分子要小很多。因此，以丙烯酰胺這樣的"超小分子"作為半抗原去制備特異性的抗體并建立相應(yīng)的免疫檢測(cè)方法，是抗體制備和免疫分析領(lǐng)域的難點(diǎn)之一。到目前為止，國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有關(guān)于丙烯酰胺抗體制備及其免疫分析方法的報(bào)道。本發(fā)明的目的在于提供一種丙烯酰胺全抗原的制備方法，以該全抗原免疫動(dòng)物獲得特異性識(shí)別丙烯酰胺的多克隆抗體，由此而建立一種簡(jiǎn)單快速、操作方便、成本低廉，適于水溶液中及食品中丙烯酰胺含量測(cè)定的酶聯(lián)免疫分析方法。為了使最終獲得的抗體與全抗原上的半抗原結(jié)構(gòu)具有良好的結(jié)合性質(zhì)，在丙烯酰胺全抗原合成的過(guò)程中，偶聯(lián)方法的選擇是至關(guān)重要的。本發(fā)明的技術(shù)方案是將N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺(NAS)在中性或弱堿性(pH78)磷酸鹽緩沖溶液中直接與載體蛋白分子表面的氨基進(jìn)行胺解偶聯(lián)反應(yīng)，形成丙烯酰胺的全抗原，如下所示上述磷酸鹽緩沖液的濃度通常為0.01mol/L至0.1mol/L，常用的磷酸鹽如磷酸鈉鹽、磷酸鉀鹽及其與氯化鈉、氯化鉀的混合物。上述胺解偶聯(lián)反應(yīng)通常在室溫至37。C條件下進(jìn)行，反應(yīng)2h至14h，可獲得蛋白氨基偶聯(lián)率為25-45%的丙烯酰胺全抗原。上述載體蛋白例如牛血清白蛋白(BSA)、雞卵清白蛋白(OVA)和鑰孔嘁血藍(lán)蛋白(KLH)，NAS分別與它們偶聯(lián)成全抗原Acr-BSA、Acr-OVA和Acr-KLH。上述方法在合成全抗原過(guò)程中盡量保持了丙烯酰胺分子特征基團(tuán)(a,P-不飽和羰基)的完整性，可以成功獲得免疫反應(yīng)性較好的針對(duì)丙烯酰胺超小分子的多克隆抗體，并能夠
發(fā)明內(nèi)容<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>以該抗體與相應(yīng)的丙烯酰胺包被抗原建立靈敏度較高的免疫分析方法。本發(fā)明的丙烯酰胺酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)方法包括如下步驟(1)將N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺(NAS)在中性或弱堿性磷酸鹽緩沖溶液中分別與不同的載體蛋白進(jìn)行胺解偶聯(lián)反應(yīng)，制成丙烯酰胺免疫全抗原和包被全抗原；(2)用免疫全抗原免疫動(dòng)物，獲得多克隆抗體；(3)用包被全抗原包被酶標(biāo)板；(4)封閉酶標(biāo)板，然后加入上述多克隆抗體與待測(cè)樣品的混合液進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)，同時(shí)以多克隆抗體與標(biāo)準(zhǔn)丙烯酰胺溶液的混合液作為參比；(5)加入生物素標(biāo)記的二抗；(6)加入酶標(biāo)親和素；(7)加底物顯色，終止反應(yīng)后檢測(cè)丙烯酰胺的存在。此外，根據(jù)需要還可以進(jìn)一步包括步驟(8)定量檢測(cè)吸光度值，確定丙烯酰胺的含量。待測(cè)樣品中丙烯酰胺的濃度與吸光度值成反比。該方法基于競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析的原理，以固定于固相載體上的載體蛋白偶聯(lián)的丙烯酰胺與溶液中游離的丙烯酰胺分子競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合反應(yīng)體系中少量的丙烯酰胺抗體，通過(guò)測(cè)量最終與固相丙烯酰胺結(jié)合的抗體數(shù)目來(lái)指示溶液中參與競(jìng)爭(zhēng)的游離丙烯酰胺的含量。這是一種競(jìng)爭(zhēng)抑制的過(guò)程，最終的測(cè)量信號(hào)(吸光度值)與溶液中丙烯酰胺的含量成反比。上述測(cè)定丙烯酰胺含量的酶聯(lián)免疫分析方法中，步驟(1)的載體蛋白選自牛血清白蛋白(BSA)、雞卵清白蛋白(OVA)和鑰孔嘁血藍(lán)蛋白(KLH)，但用于包被的全抗原和免疫的全抗原所選的載體蛋白不同。N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺(NAS)直接與載體蛋白偶聯(lián)合成牛血清白蛋白偶聯(lián)的丙烯酰胺全抗原(Acr-BSA)、雞卵清白蛋白偶聯(lián)的丙烯酰胺全抗原(Acr-OVA)或鑰孔嘁血藍(lán)蛋白偶聯(lián)的丙烯酰胺全抗原(Acr-KLH)。步驟(2)用免疫全抗原免疫動(dòng)物(如家兔)，得到特異性識(shí)別丙烯酰胺的多克隆抗體，為整個(gè)檢測(cè)方法的建立奠定了基礎(chǔ)。針對(duì)丙烯酰胺的抗體可以與包被全抗原上的丙烯酰胺決定簇發(fā)生特異性的結(jié)合，但任何一種物質(zhì)過(guò)量都會(huì)造成步驟(4)的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)無(wú)效，本發(fā)明抗原包被液的濃度應(yīng)在20-100昭/mL之間，50嗎/mL時(shí)最佳；而多克隆抗體工作濃度在1-10pg/mL之間，5嗎/mL時(shí)最佳。在上述條件下，包被全抗原與多克隆抗體的反應(yīng)曲線符合免疫反應(yīng)的特征，而且包被全抗原的結(jié)合位點(diǎn)略微過(guò)量，保證在抗體的有限結(jié)合位點(diǎn)可以發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。在優(yōu)化的包被和抗體工作濃度下，若樣品中含有丙烯酰胺，則會(huì)與包被全抗原競(jìng)爭(zhēng)有限的抗體結(jié)合位點(diǎn)，造成最終結(jié)合到包被全抗原上的抗體量減少，引起吸光度值的變化。本發(fā)明方法中，最合適的待測(cè)丙烯酰胺濃度范圍是50ng/mL-500叫/mL。上述步驟(6)通常使用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素；步驟(7)經(jīng)酶底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)作用顯藍(lán)色，加終止液硫酸，變成黃色；步驟(8)在450nm處測(cè)吸光度值A(chǔ)450nm。試樣中丙烯酰胺的濃度與A45Gnm值成反比，通過(guò)繪制吸光度值一濃度對(duì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品中丙烯酰胺濃度。本發(fā)明用N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺(NAS)直接與載體蛋白偶聯(lián)合成全抗原。該法與傳統(tǒng)偶聯(lián)方式不同，無(wú)須借助其他活化試劑，兩種反應(yīng)物可以直接進(jìn)行偶聯(lián)，N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺(NAS)的酯鍵斷裂，與載體蛋白的氨基形成酰胺鍵，生成具有丙烯酰胺特征結(jié)構(gòu)的全抗原。該法操作簡(jiǎn)便，無(wú)須加入其他反應(yīng)試劑，在最大程度上保留了丙烯酰胺結(jié)構(gòu)的完整性，并保證偶聯(lián)位置與特征基團(tuán)距離最遠(yuǎn)，使丙烯酰胺分子的特征結(jié)構(gòu)得到充分暴露。本發(fā)明的丙烯酰胺酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)方法適合于水溶液中丙烯酰胺的測(cè)定，該溶液可以是水、含有其他基質(zhì)的血樣、注射液或與水混溶的有機(jī)溶劑的水溶液。本發(fā)明的方法同樣適用于食品類(lèi)樣品中丙烯酰胺的測(cè)定，在檢測(cè)該類(lèi)樣品時(shí)，需要先將樣品中的丙烯酰胺提取到一種合適的溶劑中，如水溶液，一般要求過(guò)濾取清液。對(duì)于溶液的pH值，較佳的是7~8，保證抗原抗體之間的結(jié)合反應(yīng)。選用合適的溶劑和方法能夠從食品樣中提取丙烯酰胺。根據(jù)丙烯酰胺在極性溶劑中溶解度高的特性，用水或含水的甲醇、甲酸等溶液，采用超聲、煮沸等方法均可從這些固體樣品中提出丙烯酰胺。本發(fā)明對(duì)油炸淀粉類(lèi)食品的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，較佳的提取方法是選用0.1-1%的甲酸水溶液，在室溫下攪拌1.5-2小時(shí)即可完成提取，回收率接近100%。為擴(kuò)大該免疫分析方法的檢測(cè)范圍，使之適用于丙烯酰胺含量極低的水溶液或食品樣品的檢測(cè)，本發(fā)明提供一種活性炭SPE柱，用于高效濃縮富集丙烯酰胺，其保留率可達(dá)100%，回收率達(dá)98%。制備活性炭SPE柱，通常將適量粒狀或粉狀的活性炭依次用甲醇和水超聲清洗后填入已除去填料的商品化SPE柱管中，其使用方法同商品化SPE柱。本發(fā)明建立的丙烯酰胺的酶聯(lián)免疫吸附分析法所需全部試劑，組成了一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、操作便利、靈敏度高的測(cè)定丙烯酰胺含量的試劑盒，包括包被有抗原的酶標(biāo)板抗原為N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺(NAS)與載體蛋白胺解偶聯(lián)的全抗原；第一抗體溶液含有針對(duì)丙烯酰胺的特異性抗體，為N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺(NAS)與另一載體蛋白胺解偶聯(lián)的全抗原免疫動(dòng)物得到的多克隆抗體，4'C存儲(chǔ)；生物素標(biāo)記的二抗溶液含有生物素標(biāo)記的二抗，4'C存儲(chǔ)；酶標(biāo)親和素含有酶標(biāo)記的親和素，4'C存儲(chǔ)，可選用的酶包括辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶(AP)和P-D-半乳糖苷酶；丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液作參比，用于繪制吸光度值一濃度對(duì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；洗滌緩沖液含有吐溫20的生理緩沖溶液，用于洗去酶標(biāo)板上未結(jié)合的物質(zhì)以及非特異性吸附的物質(zhì)；樣品稀釋液含0.1mol/LNaHC03,0.5mol/LNaCl的水溶液，或者是具有相近離子強(qiáng)度(/=0.2-0.6mol/L)和pH值(7.2-8.5)的緩沖溶液，用于稀釋待測(cè)樣品或丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液；底物溶液所含底物可被標(biāo)記親和素的酶催化生成有色產(chǎn)物；終止液用于終止酶催化反應(yīng)。上述載體蛋白選自牛血清白蛋白(BSA)、雞卵清白蛋白(OVA)和鑰孔嘁血藍(lán)蛋白(KLH)，但用于包被的全抗原和免疫的全抗原所選的載體蛋白不同。上述第一抗體溶液通常配制成1mg/mL，使用時(shí)用樣品稀釋液稀釋200倍作為第一抗體工作液。生物素標(biāo)記的二抗溶液與酶標(biāo)親和素溶液使用時(shí)應(yīng)稀釋后作為工作液，使最終的吸光度值落入0.5~1.5，稀釋倍數(shù)通常分別為2000倍和400倍。樣品洗滌緩沖液通常配制成IOX溶液，使用時(shí)作IO倍稀釋。試劑盒(包括第一抗體工作液、生物素標(biāo)記二抗工作液和酶標(biāo)親和素工作液)在4°C存儲(chǔ)，1X樣品稀釋液、1X洗滌緩沖液配制后可于常溫保存。應(yīng)用試劑盒檢測(cè)水溶液及食品中丙烯酰胺含量的方法，首先要求對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚砣魳悠窞槿芤海瑒t可直接進(jìn)行檢測(cè)或簡(jiǎn)單過(guò)濾后進(jìn)行檢測(cè)；若樣品為固體食品等，則以水或有機(jī)溶劑配合攪拌、加熱、超聲等方法提取后，過(guò)濾取清液進(jìn)行檢測(cè)；若樣品中丙烯酰胺含量很少，未達(dá)到檢測(cè)下限，則可配合使用活性炭SPE萃取裝置(上述活性炭SPE柱配合SPE真空裝置使用)，先對(duì)樣品或提取液進(jìn)行濃縮后再檢測(cè)。本發(fā)明的有益效果，一是采用了一種全新的合成全抗原的方法，即將N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺(NAS)直接與牛血清白蛋白(BSA)、雞卵清白蛋白(OVA)和鑰孔嘁血藍(lán)蛋白(KLH)通過(guò)一步偶聯(lián)，合成具有丙烯酰胺特征結(jié)構(gòu)的全抗原，方法操作簡(jiǎn)便，無(wú)須加入其他活化試劑，在最大程度上保留了丙烯酰胺結(jié)構(gòu)的完整性，并保證特征基團(tuán)得到充分暴露。二是用上述合成的全抗原免疫動(dòng)物，在國(guó)內(nèi)外首次成功獲得了針對(duì)丙烯酰胺的多克隆抗體，并且以該抗體為基礎(chǔ)，首次建立了用于丙烯酰胺檢測(cè)的酶聯(lián)免疫分析方法。該方法特異性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、靈敏度較高、成本低廉、能夠簡(jiǎn)單快速地用于水樣及食品樣品的大量檢測(cè)，是對(duì)現(xiàn)有丙烯酰胺檢測(cè)方法的一個(gè)重要補(bǔ)充。三是樣品處理相對(duì)簡(jiǎn)單。與傳統(tǒng)的色譜方法相比，免疫分析方法特異性強(qiáng)，基底影響小，因此對(duì)樣品處理要求相對(duì)簡(jiǎn)單。一般基體簡(jiǎn)單的液體樣品可直接檢測(cè)；固體食品樣品則用水或有機(jī)溶劑配合攪拌、加熱、超聲等方法提取后，簡(jiǎn)單過(guò)濾就可用于檢測(cè)。而目前作為丙烯酰胺主流檢測(cè)方法的色譜法，為防止共流出峰的出現(xiàn)、色譜柱的堵塞，以及提高靈敏度，需進(jìn)行各種純化，甚至衍生化處理。四是提供了一種活性炭SPE裝置，可用于高效富集丙烯酰胺，擴(kuò)大了本發(fā)明建立的免疫分析方法的檢測(cè)范圍，使之適用于丙烯酰胺含量低的水溶液或食品樣品的檢測(cè)。目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的商品化SPE柱對(duì)丙烯酰胺均無(wú)明顯保留，只能起到純化作用，不能進(jìn)行富集，而本發(fā)明提供的SPE柱保留率可達(dá)100%,回收率達(dá)98%。五是方法所涉及的儀器和試劑簡(jiǎn)單，通用性好，除全抗原和抗體之外，其它所有試劑、96孔酶標(biāo)板、酶標(biāo)儀及溫箱等均極易獲得，這使得本方法可以被許多檢測(cè)機(jī)構(gòu)及相應(yīng)部門(mén)直接使用，作為檢測(cè)丙烯酰胺的手段。綜上所述，由于本發(fā)明釆用了全新的全抗原合成方法，在國(guó)內(nèi)外首次成功獲得特異性針對(duì)丙烯酰胺的抗體，并首次建立丙烯酰胺的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法。本發(fā)明的方法和試劑盒特異性強(qiáng)、靈敏度較高、，能地檢測(cè)水溶液及食品中丙烯酰胺含量。相對(duì)于主流的色譜法對(duì)于樣品處理的較高要求以及檢測(cè)成本與低通量的檢測(cè)模式，本方法更適于實(shí)現(xiàn)成本低廉、快速簡(jiǎn)單的大量樣品檢測(cè)。這一方法不僅適于廣大生產(chǎn)及檢測(cè)部門(mén)對(duì)丙烯酰胺的產(chǎn)生及含量進(jìn)行監(jiān)測(cè)、控制，而且可以進(jìn)一步制成試劑盒實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)、及時(shí)的檢測(cè)，這對(duì)于及時(shí)監(jiān)控生產(chǎn)過(guò)程，以及現(xiàn)場(chǎng)食品監(jiān)督都具有極其重要的意義。具體實(shí)施方法下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例l:丙烯酰胺全抗原的制備及相應(yīng)多克隆抗體的獲取1)Acr-OVA全抗原的合成將2mgNAS超聲溶解于1mLDMSO溶劑中；然后將100pL該溶液逐滴加至1mL0.01mol/LpH8.0的磷酸鹽緩沖溶液(含1mgOVA)中，36°C攪拌反應(yīng)2-3hr;最后將所得溶液除鹽凍干，得約lmg產(chǎn)物，-201:保存。2)免疫動(dòng)物用步驟1所獲得的全抗原按表1過(guò)程對(duì)家兔進(jìn)行免疫；然后采血，4000ipm離心20min，取血清，-20匯凍存。3)多克隆抗體的純化取1mL血清，用0.06mol/L，pH4.8的HAc-NaAc緩沖液稀釋4倍，逐滴加入120^L辛酸，攪拌30min;于室溫12,000rpm離心20min，取上清；然后加入體積為上清1/10的0.1mol/L，pH7.4的PBS溶液，并用1.0mol/LNaOH調(diào)pH為7.4;攪拌下，滴加等體積pH7.4的飽和硫酸銨溶液，靜置2hr:于4'C12,000rpm離心30min，棄上清，并將沉淀溶于1mL0.01mol/L，pH7.4的PBS中透析，最后測(cè)定該抗體溶液的濃度，置于-20'C凍存待用。表l.丙烯酰胺全抗原免疫家兔的完整流程<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實(shí)施例2:本發(fā)明檢測(cè)方法的最低檢出限及線性范圍在96孔酶標(biāo)板中，每孔用100uL50ng/mL的Acr-BSA包被，于4。C過(guò)夜或37'C溫育2小時(shí)；以5%脫脂奶粉溶液在37'C封閉2小時(shí)后，每孔中加入5010ng/mL的純化抗體溶液和50tiL梯度稀釋的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液(濃度分別為0，0.1,1,10，100，1000pg/mL),37'C溫育1小時(shí)，然后每孔先后加入100的合適濃度的生物標(biāo)記的二抗溶液和酶標(biāo)親和素溶液，使最終的吸光度值在0.51.5(通常商購(gòu)的生物標(biāo)記二抗需1:2000稀釋?zhuān)笜?biāo)親和素需1:400稀釋)，經(jīng)過(guò)同樣的溫育過(guò)程后加入底物顯色，10-15分鐘后以2mol/L硫酸終止。每個(gè)試樣同時(shí)做6份平行。采用logit-k)g法對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行線性回歸。本發(fā)明方法的工作曲線的線性范圍為0.05-500嗎/mL;回歸方程為ln[A/(Ao-A)]=4.4095-1.4777lgcAcr(R=0.993,n=6)。以競(jìng)爭(zhēng)丙烯酰胺含量為0的測(cè)定結(jié)果作為空白參比，計(jì)算其6份平行樣品的吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)偏差o，得出該方法的最低檢測(cè)限為0.03pg/mL(定義為三倍信噪比)。實(shí)施例3:本發(fā)明與標(biāo)準(zhǔn)的高效液相色譜(HPLC)方法的比較以市售油炸薯?xiàng)l加標(biāo)提取液(加標(biāo)量為100ng/mL提取液)為測(cè)量物，用本發(fā)明的方法和HPLC分別測(cè)量該提取液的濃度。)HPLC測(cè)量用色譜進(jìn)行測(cè)量的操作條件如下色譜柱C18反相柱(DikmaTechonologiesDiamonsil，5(j,150X4.6mm);流動(dòng)相甲醇-H20(5:95v/v),流速0.6mL/min;柱溫25°C檢測(cè)器紫外檢測(cè)器(UVD)，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm;進(jìn)樣器10樣品環(huán)。以O(shè).l、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10、12、15、20、30嗎/mL丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液作為工作曲線，采用峰面積積分，線性回歸，確定HPLC對(duì)于丙烯酰胺的工作曲線為A(mAu)=~1.7595+83.043cAcr(R=0.9999，n=3)，線性范圍為0.02-50ng/mL，檢測(cè)限為0.008ng/mL(定義為三倍信噪比)。在測(cè)量油炸薯?xiàng)l加標(biāo)提取液的過(guò)程中，進(jìn)行了3次平行測(cè)定，最終測(cè)得加標(biāo)提取液中丙烯酰胺的濃度為99ng/mL。2)本發(fā)明方法(ELISA法)的測(cè)量ELISA操作過(guò)程及試劑量同實(shí)施例2中工作曲線的測(cè)定部分，對(duì)提取液進(jìn)行了6份平行測(cè)量，最終測(cè)得加標(biāo)提取液中丙烯酰胺的濃度為102pg/mL。兩種方法的測(cè)量結(jié)果顯示，HPLC和本發(fā)明方法的測(cè)量結(jié)果基本一致，本發(fā)明是一種可靠的測(cè)定丙烯酰胺的方法。實(shí)施例4:本發(fā)明方法的回收率測(cè)定以油炸薯?xiàng)l提取液樣品為基體，加入標(biāo)準(zhǔn)丙烯酰胺，使樣品中丙烯酰胺的最終濃度分別為20pg/mL，66嗎/mL，200pg/mL，666ug/mL然后按實(shí)施例2中的過(guò)程與抗體混合進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)點(diǎn)作6份平行，結(jié)果見(jiàn)表2。表2.油炸薯?xiàng)l提取液樣品的回收率測(cè)定(n-6)加入的標(biāo)準(zhǔn)丙烯酰胺含量測(cè)得丙烯酰胺含量回收率(％)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(pg/mL)(pg/mL)(RSD,%)10.010.71071033.035.5107710098.9998333315956相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示測(cè)量的精密度，用多次測(cè)量后的標(biāo)準(zhǔn)差與測(cè)量平均值的比值百分?jǐn)?shù)表示。結(jié)果表明該方法的回收率很好，且樣品溶液中基體的干擾對(duì)方法影響小。實(shí)施例5:市售油炸薯?xiàng)l樣品的試劑盒檢測(cè)一個(gè)檢測(cè)實(shí)際樣品的丙烯酰胺檢測(cè)試劑盒，盒內(nèi)包括一塊96孔酶標(biāo)板，第一抗體溶液(含lmg/mL抗體)，生物素標(biāo)記二抗溶液(50pL，1:2000稀釋為工作液)，酶標(biāo)親和素溶液(100^L，1:400稀釋為工作液)，丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液(lmL,20mg/mL)，IOX洗滌緩沖液(20mL，0.1mol/LPBST),樣品稀釋液(20mL，0.1mol/LNaHC03,0.5mol/LNaCl)，顯色液A(15mL)，顯色液B(1mL30%H2O2)，終止液(15mL,2mol/LH2S04)以及操作流程一份。其中酶標(biāo)板包被有抗原，抗原為N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺(NAS)與載體蛋白偶聯(lián)的全抗原；第一抗體溶液含有針對(duì)丙烯酰胺的特異性抗體(lmg/mL)，為通過(guò)上述全抗原免疫動(dòng)物得到的多克隆抗體，4'C存儲(chǔ)；生物素標(biāo)記二抗溶液生物素標(biāo)記的二抗，4'C存儲(chǔ)；酶標(biāo)親和素溶液辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素，4'C存儲(chǔ)；丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液作參比，用于繪制吸光度值-濃度對(duì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；IOX洗滌緩沖液0.1mol/L的含吐溫20的磷酸緩沖液，具體每升含有2.89gNa2HP0412H20，80gNaCl，2gKCl,2gKH2P04和0.05%(v/v)吐溫20(Tween20),用于洗去酶標(biāo)板上未結(jié)合的物質(zhì)以及非特異性吸附的物質(zhì)；樣品稀釋液0.1mol/LNaHCO3，0.5mol/LNaCl，用于稀釋待測(cè)樣品或丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液；顯色液A:含0.6mg3,3，,5,5，-四甲基聯(lián)苯胺(3,3，，5,5，-tetramethylbenzidine,TMB)，44mgNa2HP04〗2H20，137mgNaH2P042H20，100二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)和10mL的去離子水，與顯色液B配合使用，并由辣根過(guò)氧化物酶作為催化劑，加速反應(yīng)顯色；顯色液B:30e/。的H2O2水溶液，與顯色液A配合，并由辣根過(guò)氧化物酶作為催化劑，加速反應(yīng)顯色終止液2mol/L的H2S04溶液，用于終止酶催化反應(yīng)。試劑盒的檢測(cè)過(guò)程通過(guò)以下步驟得以實(shí)現(xiàn)1.加樣將標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白及待測(cè)樣50nl與50^第一抗體工作液混合，加入酶標(biāo)板的各孔內(nèi)，置于37'C溫育1小時(shí)。2.洗板用1X洗滌液將酶標(biāo)板洗滌3次，每次3分鐘，在濾紙上拍干。3.每孔加入生物素標(biāo)記二抗工作液100^，37。C溫育l小時(shí)。4.洗板，同前5.每孔加入酶標(biāo)親和素工作液100nl，37'C溫育30min。6.洗板，同前。7.顯色底物A與底物B按1000:1.5比例混合，每孔加入上述底物混合液100^L，暗處反應(yīng)10-15分鐘。8.終止每孔加入終止液60在450nm處測(cè)吸光值。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的比較，得出樣品中丙烯酰胺的含量。將市售油炸薯?xiàng)l攪碎混勻，平行稱(chēng)取3份樣品，每份10g，分別進(jìn)行不加標(biāo)，加標(biāo)0.5mg,1mg的處理。再以100mL1%甲酸水溶液室溫?cái)嚢杼崛?.5小時(shí)，離心過(guò)濾，經(jīng)活性炭SPE柱富集，甲醇洗脫，蒸發(fā)至近干，用樣品稀釋液定容至適當(dāng)體積。然后將上述提取液50與50nL10pg/mL的第一抗體溶液混合，加入96孔酶標(biāo)板內(nèi)，置于37°C溫育1小時(shí)；以1X洗滌緩沖液洗滌3次后，于每個(gè)孔內(nèi)加入100pL生物素標(biāo)記二抗溶液(l:2000稀釋)，37°C溫育1小時(shí)；以1X洗滌緩沖液洗滌3次，再于每個(gè)孔內(nèi)加入IOOpL酶標(biāo)親和素溶液(1:400稀釋)，37°C溫育30min;接著以1X洗滌緩沖液洗滌3次，每孔加入100pL顯色液A與顯色液B按1000:1.5比例混合的顯色液，置于暗處反應(yīng)15分鐘；最后于每孔內(nèi)加入60nL終止液結(jié)束反應(yīng)，測(cè)量450nm處的吸光值。其中每個(gè)試樣同時(shí)做6份平行，并以0，0.05，0.5，5，50，500pg/mL丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液為工作曲線，樣品的測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表3。表3.油炸薯?xiàng)l測(cè)定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表3中較好的加標(biāo)回收率表明本試劑盒適合于檢測(cè)實(shí)際油炸薯?xiàng)l樣品中丙烯酰胺含量，并能給出較準(zhǔn)確的測(cè)定結(jié)果。另外，配合活性炭SPE富集裝置的使用，可根據(jù)實(shí)際樣品中丙烯酰胺的大致含量確定濃縮倍數(shù)，使待測(cè)液的濃度落入試劑盒的線性范圍內(nèi)。因此該試劑盒的準(zhǔn)確度和靈敏度能夠滿(mǎn)足食品中丙烯酰胺的實(shí)際檢測(cè)的需求。權(quán)利要求1.一種丙烯酰胺全抗原的制備方法，N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺在pH7～8磷酸鹽緩沖溶液中直接與載體蛋白分子表面的氨基進(jìn)行胺解偶聯(lián)反應(yīng)，形成丙烯酰胺的全抗原。2.如權(quán)利要求1所述的丙烯酰胺全抗原的制備方法，其特征在于，所述載體蛋白選自牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白和鑰孔嘁血藍(lán)蛋白。3.如權(quán)利要求1或2所述的丙烯酰胺全抗原的制備方法，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.010.1mol/L，反應(yīng)溫度為室溫至37°C，反應(yīng)時(shí)間為214h。4.一種丙烯酰胺酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)方法包括，如下步驟(1)將N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺在pH78磷酸鹽緩沖溶液中分別與不同的載體蛋白進(jìn)行胺解偶聯(lián)反應(yīng)，制成丙烯酰胺免疫全抗原和包被全抗原；(2)用免疫全抗原免疫動(dòng)物，獲得多克隆抗體；(3)用包被全抗原包被酶標(biāo)板,-(4)封閉酶標(biāo)板，然后加入所述多克隆抗體與待測(cè)樣品的混合液進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)，同時(shí)以多克隆抗體與標(biāo)準(zhǔn)丙烯酰胺溶液的混合液作為參比；(5)加入生物素標(biāo)記的二抗；(6)加入酶標(biāo)親和素；(7)加底物顯色，終止反應(yīng)后檢測(cè)丙烯酰胺的存在。5.如權(quán)利要求4所述的丙烯酰胺酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)方法，其特征在于步驟(1)所用的載體蛋白選自牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白和鑰孔嘁血藍(lán)蛋白。6.如權(quán)利要求4或5所述的丙烯酰胺酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟(6)使用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素；步驟(7)中所述的底物為四甲基聯(lián)苯胺，加硫酸終止反應(yīng)。7.如權(quán)利要求6所述的丙烯酰胺酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)方法，其特征在于，該方法還包括步驟(8)測(cè)吸光度值A(chǔ)450^以確定待測(cè)樣品中丙烯酰胺的含量。8.—種測(cè)定丙烯酰胺含量的試劑盒，包括包被有抗原的酶標(biāo)板抗原為N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺在pH78磷酸鹽緩沖溶液中直接與載體蛋白胺解偶聯(lián)得到的丙烯酰胺全抗原；第一抗體溶液含有針對(duì)丙烯酰胺的特異性抗體，該特異性抗體是用N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺在pH78磷酸鹽緩沖溶液中與另一載體蛋白胺解偶聯(lián)得到的丙烯酰胺全抗原免疫動(dòng)物獲得的多克隆抗體，4'C存儲(chǔ)；生物素標(biāo)記的二抗溶液含有生物素標(biāo)記的二抗，4t:存儲(chǔ)；酶標(biāo)親和素含有酶標(biāo)記的親和素，4'C存儲(chǔ)；丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液作參比，用于繪制吸光度值一濃度對(duì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；洗滌緩沖液含有吐溫20的生理緩沖溶液，用于洗去酶標(biāo)板上未結(jié)合的物質(zhì)以及非特異性吸附的物質(zhì)；樣品稀釋液含0.1mol/LNaHC03,0.5mol/LNaCl的水溶液，或者是其他離子強(qiáng)度/=0.2-0.611101/1^和？117.2-8.5的緩沖溶液，用于稀釋待測(cè)樣品或丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液；底物溶液所含底物可被標(biāo)記親和素的酶催化生成有色產(chǎn)物；終止液用于終止酶催化反應(yīng)。9.如權(quán)利要求8所述的測(cè)定丙烯酰胺含量的試劑盒，其特征在于，所述載體蛋白選自牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白和鑰孔嘁血藍(lán)蛋白。10.如權(quán)利要求8或9所述的測(cè)定丙烯酰胺含量的試劑盒，其特征在于，標(biāo)記親和素的酶選自辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶和P-D-半乳糖苷酶。全文摘要本發(fā)明提供了一種丙烯酰胺全抗原的制備方法，將N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺在中性或弱堿性磷酸鹽緩沖溶液中直接與載體蛋白分子表面的氨基進(jìn)行胺解偶聯(lián)反應(yīng)，形成丙烯酰胺的全抗原。以該全抗原免疫動(dòng)物獲得特異性識(shí)別丙烯酰胺的多克隆抗體，由此而建立一種適于水溶液中及食品中丙烯酰胺含量測(cè)定的酶聯(lián)免疫分析方法，并提供了相應(yīng)的試劑盒。本發(fā)明制備丙烯酰胺全抗原的方法操作簡(jiǎn)便，無(wú)需加入其他反應(yīng)試劑，在最大程度上保留了丙烯酰胺結(jié)構(gòu)的完整性，并保證偶聯(lián)位置與特征基團(tuán)距離最遠(yuǎn)，使丙烯酰胺分子的特征結(jié)構(gòu)得到充分暴露。所建立的丙烯酰胺的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法和試劑盒特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作方便，適于實(shí)現(xiàn)成本低廉、快速簡(jiǎn)單的大量樣品檢測(cè)。文檔編號(hào)G01N33/53GK101285836SQ20071009039公開(kāi)日2008年10月15日申請(qǐng)日期2007年4月10日優(yōu)先權(quán)日2007年4月10日發(fā)明者爽周,宓捷波,趙美萍申請(qǐng)人:北京大學(xué)