專利名稱：：結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子的沉降抑制方法及含其的試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及結(jié)合有抗體或抗原等具有反應(yīng)性的物質(zhì)的微小粒子(以下，稱為結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子)的沉降抑制方法以及使用了該結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子的免疫測(cè)定用試刑.特別是涉及主要在臨床檢查領(lǐng)域中在利用了抗原抗體反應(yīng)的免疫學(xué)測(cè)定中使用的結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子的沉降抑制方法以及使用了該結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子的免疫測(cè)定用試刑.
背景技術(shù)：
近年來(lái)，對(duì)于臨床檢查等各種檢查而言，從自動(dòng)化和縮短測(cè)定時(shí)間的觀點(diǎn)出發(fā)，廣泛使用利用免疫反應(yīng)測(cè)定生物試樣中的物質(zhì)的方法.作為該免疫測(cè)定方法，可以舉出RIA法、EIA法、免疫比濁法、膠乳凝集法、膠體金凝集法、免疫色譜法等.其中，膠乳凝集法、膠體金凝集法等使用了結(jié)合有具有反應(yīng)性的物質(zhì)的微小粒子(結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子)的方法不需要進(jìn)行反應(yīng)液的分離、洗滌搮作，因此特別適用于測(cè)定的自動(dòng)化以及縮短時(shí)間.但是，這些膠乳凝集法、膠體金凝集法由于結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子易于沉降，因此在使用時(shí)或測(cè)定時(shí)必須經(jīng)常攪拌以使得該微小粒子的濃度均勻，具有易于產(chǎn)生測(cè)定誤差的問(wèn)題.例如，在上述方法中使用的試刑通常由2種試刑構(gòu)成，即主要含有輔助試樣的稀釋、試樣在主反應(yīng)前的前處理和主反應(yīng)的成分的第一試刑；含有作為主要參與反應(yīng)的主成分的結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的徵小粒子的笫二試刑.使用自動(dòng)化分析裝置時(shí)，首先將試樣和笫一試劑分注到反應(yīng)池中，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后在反應(yīng)池中分注第二試劑，從而將試樣、笫一試刑和笫二試刑三者混合，得到最終反應(yīng)液，進(jìn)行測(cè)定.此時(shí)，即便將含有結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子試刑(笫二試刑)放置在分析裝置中，也需要每隔一定時(shí)間攪拌笫二試刑，使?jié)舛茸兊镁鶆?以往一直都沒(méi)有進(jìn)行抑制這種結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子的沉降的研究.對(duì)于上述第一試刑、笫二試刑和最終反應(yīng)液的組成而言，僅是為了提高微小粒子反應(yīng)性的穗定性、促進(jìn)反應(yīng)而進(jìn)行了改良(例如專利文獻(xiàn)1和2).在專利文獻(xiàn)1中，作為使致敏金屬膠體的反應(yīng)性穩(wěn)定化的方法，記栽了使含有致敏金屬膠體的溶液含有選自從鈣離子和鎂離子及鈀離子中選擇的金屬離子、疏酸葡聚糖、膽酸、脫氣膽酸、黃尿酸或它們的鹽中的l種或2種以上.在專利文獻(xiàn)2中，記栽了在使結(jié)合有測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的抗體(或抗原)的膠體金粒子與測(cè)定物質(zhì)反應(yīng)的溶液(最終反應(yīng)液)中，含有0.4~2.5(WAV)%的平均分子量約為20,000以上的聚陰離子或其鹽作為反應(yīng)促進(jìn)劑.專利文獻(xiàn)1:日本特開平11-101799號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2:日本特開平6-213891號(hào)公報(bào)
發(fā)明內(nèi)容因此，為了減小測(cè)定值的誤差，需求一種抑制結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子的沉降、長(zhǎng)期且穩(wěn)定地保持試刑或反應(yīng)液中的濃度的技術(shù).特別是在自動(dòng)分子裝置中，在放置試刑后，如果疏于攪拌搮作則有可能產(chǎn)生測(cè)定誤差、導(dǎo)致臨床判斷錯(cuò)誤，因此開發(fā)結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子在溶液中的沉降抑制方法以及使用了方法的測(cè)定試刑非常重要.因此，本發(fā)明的目的在于提供抑制結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子在分散液中該微小粒子沉降的方法.本發(fā)明的目的還在于，提供在靜置保存后或放置在自動(dòng)免疫分析裝置中后不需要再次通過(guò)攪拌操作使其分散的、測(cè)定誤差小的試劑.本發(fā)明人為了達(dá)成上述課題而進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子的分散液中，通過(guò)使選自聚陰離子及其鹽、葡聚糖、環(huán)糊精、聚乙二醇、丙三醇中的至少1種化合物共存，可以抑制結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒于的沉降、可以長(zhǎng)期且穗定地保持分散液中的結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子的濃度，進(jìn)而完成本發(fā)明.本發(fā)明提供結(jié)合有具有反應(yīng)性的物質(zhì)的微小粒子的沉降抑制方法，該方法包括在該微小粒子的分散液中共存有選自聚陰離子及其鹽、葡聚糖、環(huán)糊精、聚乙二醇、丙三醉中的至少l種化合物的工序.對(duì)于l個(gè)實(shí)施方式而言，在上述分散液中含有0.3~5質(zhì)量％的上迷聚陰離子或其鹽、0.1~5質(zhì)重％的上迷葡聚糖、0.1~5質(zhì)重％的上述環(huán)糊精、0.3~5質(zhì)重％的上述聚乙二醇、或5-40質(zhì)量％的上述丙三醇.在其他實(shí)施方式中，上述聚陰離子及其鹽是具有硤酸基的水溶性高分子化合物.在其他實(shí)施方式中，上述聚陰離子是硫酸葡聚糖或肝素.在其他實(shí)施方式中，上述結(jié)合有具有反應(yīng)性的物質(zhì)的微小粒子是結(jié)合有抗體或抗原的膠體金粒子.本發(fā)明的試刑含有結(jié)合有具有反應(yīng)性的物質(zhì)的微小粒子、以及選自聚陰離子及其鹽、葡聚糖、環(huán)糊精、聚乙二醇、丙三醇中至少1種的化合物，抑制該微小粒子的沉降.對(duì)于1個(gè)實(shí)施方式而言，在上述試劑中含有0.3~5質(zhì)量°/。的上述聚陰離子或其鹽、0.3~5質(zhì)量％的上述葡聚糖、0.1~5質(zhì)量％的上述環(huán)糊精、0.5-5質(zhì)量％的上述聚乙二醇、或5~40質(zhì)重％的上述丙三醇.在其他實(shí)施方式中，上述聚陰離子及其鹽是具有硤酸基的水溶性高分子化合物.在其他實(shí)施方式中，上述聚陰離子是硫酸葡聚糖或肝素.在其他實(shí)施方式中，上述結(jié)合有具有反應(yīng)性的物質(zhì)的微小粒子是結(jié)合有抗體或抗原的膠體金粒子.本發(fā)明的試刑盒含有上述試刑.本發(fā)明的自動(dòng)化免疫測(cè)定方法包括將上述試劑與試樣混合的工序.通過(guò)本發(fā)明，可以抑制結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子的沉降.因此，可以提供該微小粒子的沉降被抑制的試刑.該試刑由于該微小粒子的濃度可以被長(zhǎng)期且均勻地保持，因此使用該試刑進(jìn)行免疫測(cè)定時(shí)，即便不在每次測(cè)定時(shí)攪拌該試劑，也可以將結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子等量地分注到最終反應(yīng)液中，因此可以得到誤差小的穗定的測(cè)定值.具體地說(shuō)，當(dāng)將含有結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子的試劑放置在自動(dòng)分析裝置中長(zhǎng)期地連續(xù)測(cè)定時(shí)或者隔一段時(shí)間測(cè)定時(shí)，不需要以往所必需的在每次測(cè)定時(shí)或每隔一段時(shí)間攪拌該含微小粒子試刑使分散液中的濃度變得均勻的搮作，即可得到經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間誤差也很小的正確的測(cè)定值.由此，在不需要對(duì)于測(cè)定者來(lái)說(shuō)是一個(gè)很大負(fù)擔(dān)的繁瑣的挽拌採(cǎi)作的同時(shí)，還可以防止由于疏于攪拌搮作所產(chǎn)生的測(cè)定誤差和由此導(dǎo)致的臨床判斷錯(cuò)誤.附困說(shuō)明困1為顯示特定血清胱抑素c濃度測(cè)定值的經(jīng)時(shí)變化的曲線困.困2為顯示特定鐵蛋白濃度測(cè)定值的經(jīng)時(shí)變化的曲線困.具體實(shí)施方式1.結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子的沉降抑制方法本發(fā)明的結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子的沉降抑制方法包括使該微小粒子的分散液中共存有選自聚陰離子及其鹽、葡聚糖、環(huán)糊精、聚乙二醇、丙三醇中的至少l種化合物的工序.在本發(fā)明的方法中使用的結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子是可以作為免疫測(cè)定試劑使用的微小粒子，優(yōu)選為膠乳粒子和金屬膠體粒子.作為金屬膠體粒子，一般膠體金粒子易于使用，因此優(yōu)選.膠體金粒子可以使用市售品，也可以是實(shí)驗(yàn)者通過(guò)通常使用的方法、例如利用檸檬酸鈉將氣金酸還原的方法配制而成.膠體金粒子的粒徑通常為5nm~100nm，優(yōu)選為30nm-60咖的范圍對(duì)于結(jié)合在上述微小粒子上的物質(zhì)而言，只要是特異性結(jié)合在測(cè)定對(duì)象物質(zhì)上的物質(zhì)即可利用.例如可以舉出抗體、抗原、受體、凝集素、脫氣核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)等具有結(jié)合親和性的物質(zhì).在本發(fā)明的方法中，使用聚陰離子及其鹽、葡聚糖、環(huán)糊精、聚乙二醇或者丙三醇.在本說(shuō)明書中，將這些化合物稱為沉降抑制物質(zhì).沉降抑制物質(zhì)可以單獨(dú)使用，也可以組合2種以上使用.作為上述沉降抑制物質(zhì)之一的聚陰離子，可以舉出碟酸葡聚糖、肝素、聚苯乙烯磺酸、透明質(zhì)酸和硤酸軟骨素.作為聚陰離子的鹽，可以舉出葡聚糖硫酸鈉、肝素鈉等.在聚陰離子及其鹽中，從沉降抑制效果髙的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選使用具有硤酸基的水溶性高分子化合物.這種化合物例如有硫酸葡聚糖、肝素、葡聚糖碟酸鈉和肝素鈉.本發(fā)明的方法在上述結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子的分散液中使上述沉降押制物質(zhì)共存.作為使其共存的方法沒(méi)有特別限定.例如可以在結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子的分散液中加入沉降抑制物質(zhì)，可以在沉降抑制物質(zhì)、或者在利用分散介質(zhì)將沉降抑制物質(zhì)稀釋后的稀釋液中，加入結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子，還可以將結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子與沉降抑制物質(zhì)混合并將該混合物加入到分散介質(zhì)中.需要說(shuō)明的是，分散介質(zhì)沒(méi)有特別限定，可以使用水或者使用了后述緩沖刑的緩沖液等.本發(fā)明的方法中，分散液中的結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子濃度可以是在該領(lǐng)城中通常采用的濃度.在本發(fā)明的方法中，共存于分散液中的沉降抑制物質(zhì)的濃度根據(jù)沉降抑制物質(zhì)的種類而適當(dāng)設(shè)定.例如，為聚陰離子或其鹽時(shí)，優(yōu)選為0.3~5質(zhì)量％、更優(yōu)選為0.5-2質(zhì)量％、進(jìn)一步優(yōu)選為0.7-1.1質(zhì)量％.為葡聚糖或環(huán)糊精時(shí)，優(yōu)選為0.1-5質(zhì)重％、更優(yōu)選為0,2~1.8質(zhì)量°/。、進(jìn)一步優(yōu)選為0.5-1.5質(zhì)量％.為聚乙二醇時(shí)，優(yōu)選為0.3~5質(zhì)量％、更優(yōu)選為0，5~3質(zhì)重°/。.為丙三醇時(shí)，優(yōu)選為5~40質(zhì)量％、更優(yōu)選為10~35質(zhì)量％.根據(jù)本發(fā)明的方法，通過(guò)在結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子的分散液中共存沉降抑制物質(zhì)，可以抑制結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的徵小粒子的沉降.因此，通過(guò)使用該方法，可以在分散液中長(zhǎng)期、穗定地保持該微小粒子.2.含有結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子和沉降抑制物質(zhì)的試刑本發(fā)明的試劑含有上述結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子和上述沉降抑制物質(zhì)，根據(jù)需要還含有緩沖劑、糖、糖醇、白蛋白、氣化鈉、防腐劑及其他添加刑.該試劑由于抑制了結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子的沉降，因此長(zhǎng)期地使該微小粒子的濃度保持均勻.本發(fā)明的試刑通常為液體狀，作為使用了結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子的試劑、特別是在該領(lǐng)域中通常使用的免疫測(cè)定用試劑的笫二試劑使用.本發(fā)明試劑中的結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子的濃度和沉降抑制物質(zhì)的濃度沒(méi)有特別限定.從提高抑制結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的徵小粒子沉降的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選為上述方法中所采用的濃度范閨.作為本發(fā)明試刑中所含的緩沖刑，可以舉出辨酸緩沖液；Tris-鹽酸緩沖液；琥珀酸緩沖液；雙甘肽、MES(2-(N-嗎淋代)乙橫酸)、HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸)、TES(N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)、MOPS(3-(N-嗎啉代)丙磺酸)、PIPES(哌喚-1，4-二(2-乙磺酸))、Bis-Tris(二(2-羥乙基)亞氨基三(羥甲基)甲烷)等的Good緩沖液等.優(yōu)選含有上述緩沖刑使試劑中的pH達(dá)到5~9或者濃度達(dá)到1~100mM.作為本發(fā)明試刑中所含有的糖和糖醇，可以舉出葡萄糖、甘露糖、砂糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇等.上述糖或糖醇在試刑中的濃度優(yōu)選為0.01~10質(zhì)量％.作為本發(fā)明試刑中可以含有的白蛋白，可以舉出牛血清白蛋白(BSA)等.白蛋白在試劑中的濃度優(yōu)選為0.001~1質(zhì)量％.作為本發(fā)明試刑中可以含有的防腐刑，可以舉出疊氮化鈉等.防腐劑在試劑中的濃度優(yōu)選為0.01~0.5質(zhì)重％.作為本發(fā)明試刑中可以含有的其他添加刑，可以舉出吐溫20、聚乙二醇月桂基醚、5-溴水楊酸鈉、水楊酸鈉、安息香酸鈉、苯磺酸鈉、苯盼、廉香萆盼等.本發(fā)明的試劑如上所述，由于結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子的沉降被抑制，因此該微小粒子的濃度長(zhǎng)期地保持均勻.因此，例如當(dāng)使用該試刑進(jìn)行免疫測(cè)定時(shí)，即便在每次測(cè)定時(shí)不撹拌該試刑，也可以將結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子等量地分注到最終反應(yīng)液中，可以得到誤差小的穩(wěn)定的測(cè)定值.3.試刑盒本發(fā)明的試劑盒包含含有上述結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子和沉降抑制物質(zhì)的試刑(本發(fā)明的試刑)，該試刑盒例如可以用在使用了膠乳凝集法、膠體金凝集法等的免疫測(cè)定、特別是自動(dòng)化免疫測(cè)定中.本發(fā)明的試刑盒作為免疫測(cè)定用試刑盒使用時(shí)，該試劑盒通常可以由以下物質(zhì)構(gòu)成含有輔助試樣的稀釋、試樣在免疫反應(yīng)前的前處理和免疫反應(yīng)的成分等的笫一試劑，本發(fā)明的試刑(笫二試刑)以及根據(jù)需要制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品.本發(fā)明的試刑盒可以根據(jù)結(jié)合在本發(fā)明試刑中橄小粒子上的反應(yīng)性物質(zhì)，將試樣中的各種物質(zhì)作為測(cè)定對(duì)象.作為可以成為測(cè)定對(duì)象的物質(zhì)(測(cè)定對(duì)象物質(zhì))，例如可以舉出白蛋白、血紅蛋白、血紅蛋白Alc、肌紅蛋白、鐵傳遞蛋白、乳鐵傳遞蛋白、血清胱抑素C、鐵蛋白、ot-胎蛋白、癌胚抗原、CA19-9、前列腺特異抗原、C反應(yīng)性蛋白質(zhì)(CRP)、纖維素分解產(chǎn)物(FDP)、胃蛋白酶原I和II、膠原等蛋白質(zhì)；高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、超低密度脂蛋白等脂蛋白；脫氣核糖核酸、核糖核酸等核酸；堿性褲酸蘇、乳酸脫氣酶、脂肪蘇、淀粉醉等醉；IgG、IgM、IgA、IgD、IgE等免疫球蛋白；B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、人免疫不全病毒、幽門螺旋桿菌以及與它們的抗體等導(dǎo)致的感染癥相關(guān)的抗原或抗體；象噥啶醇、溴哌利多等藥物；性激素等激素等.作為含有供測(cè)定的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的試樣，可以舉出血液、血漿、血清、尿、糞便(懸濁液)、骨tt液、腹水等生物試樣，從環(huán)境中獲得的樣品或其提取物等.4.自動(dòng)化免疫測(cè)定方法本發(fā)明的自動(dòng)化免疫測(cè)定方法使用本發(fā)明的試劑進(jìn)行.該自動(dòng)化免疫測(cè)定方法由于在試刑中結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子的沉降被抑制、其濃度長(zhǎng)期地保持均勻，因此即便在每次測(cè)定時(shí)不攪拌該試刑，也可以將結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子等量地分注到最終反應(yīng)液中，可以得到誤差小的穩(wěn)定的測(cè)定值.本發(fā)明的自動(dòng)化免疫測(cè)定方法，具體地說(shuō)，將試樣、笫一試劑和本發(fā)明的試劑(笫二試刑)放置在自動(dòng)分析裝置中，在試樣中依次自動(dòng)混合第一試劑和第二試劑，從而進(jìn)行.第一試刑和第二試劑的比例可以適當(dāng)設(shè)定.本發(fā)明的試劑(第二試刑)優(yōu)選稀釋2~9倍、更優(yōu)選稀釋3~5倍.本發(fā)明的自動(dòng)化免疫測(cè)定方法在長(zhǎng)期間地連續(xù)測(cè)定時(shí)或者隔一定期間測(cè)定時(shí)，也不需要以往所必須的在每次測(cè)定時(shí)或每隔一定期間撹拌該含微小粒子試劑使溶液中的濃度均勻的操作，即可得到經(jīng)長(zhǎng)期誤差也很小的、正確的測(cè)定值.實(shí)施例以下根據(jù)實(shí)施例進(jìn)一步具體地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于此.在以下實(shí)施例中，只要沒(méi)有特別說(shuō)明，％均表示質(zhì)重/容量％(w/v%).實(shí)施例l:膠體金液的配制在1L951C的蒸餾水中一邊攪拌一邊加入2mL10%的氯金酸溶液，l分鐘后加入10mL2。/o檸樣酸鈉溶液，再攪拌20分鐘，之后冷卻到30TC.冷卻后，用0.1%碳酸鈣將pH調(diào)整到7.1.實(shí)施例2:血清胱抑素C測(cè)定用笫一試刑的配制在含有5%氯化鈉、0.2%EDTA、0.2%烷基苯基二磺酸鈉鹽、0.35%聚氣乙烯月桂基醚的0.5MBis-Tris(pH6.7)溶液中加入1.0~2.5%左右的聚乙二醇作為反應(yīng)促進(jìn)刑，制成血清胱抑素C測(cè)定用笫一試刑.實(shí)施例3:結(jié)合抗血清胱抑素C抗體的膠體金試劑(第二試劑)的配制用含有0.05%疊氮化鈉的10mMHEPES(pH7.1)稀幹抗血清胱抑素C抗體(夂3.'-Y:x株式會(huì)社)，使?jié)舛冗_(dá)到50pg/ml.將100mL該抗血清胱抑素C抗體溶液加入到約1L在實(shí)施例1中配制的膠體金液中，在冷藏的狀態(tài)下攪拌2小時(shí).進(jìn)而，添加110mL舍有5.46%甘露醉、0.5%BSA和0.05%疊氮化鈉的10mMHEPES(pH7.1)，在37r下攪拌90分鐘.接著，以8000轉(zhuǎn)離心分離40分鐘，除去上清后，再加入約1L的含有3%甘露醇、0.1。/。BSA和0.05°/。疊氮化鈉的5mMHEPES(pH7.5)(A溶液)，使結(jié)合抗體的膠體金分散.進(jìn)而，在8000轉(zhuǎn)離心分離糾分鐘，除去上清，使抗體致敏膠體金分散在A溶液中，使總量達(dá)到210mL，得到結(jié)合抗血清胱抑素C抗體的膠體金試刑(第二試刑).實(shí)施例4:丙三醇或聚乙二醇的添加效果探討(1)血清胱抑素C濃度約為8mg/L的試樣(試樣1)的測(cè)定在結(jié)合抗血清胱抑素C抗體的膠體金試刑(笫二試刑)中加入丙三醇，使丙三醇含童達(dá)到33%，配制含有丙三醇的笫二試劑.在曰立7070自動(dòng)分析裝置中分別放置血清胱抑素C濃度約為8mg/L的試樣(試樣1)、在實(shí)施例2中配制的笫一試刑和上述含有丙三醉的笫二試刑，在以下條件下測(cè)定放置時(shí)的吸光度變化重.(測(cè)定條件)在3pL試樣l中分注240nL第一試劑，在371C下加熱約5分鐘，接著分注60nL含有丙三醇的笫二試刑，在37"下反應(yīng).之后，在主波長(zhǎng)546nm和副波長(zhǎng)660nm下進(jìn)行從測(cè)光點(diǎn)18到31的兩點(diǎn)測(cè)定，測(cè)定兩點(diǎn)間的吸光度變化量.需要說(shuō)明的是，吸光度變化量是在分注上述笫二試刑時(shí)，分別對(duì)未拔拌的情況(未攪拌吸光度變化量)和預(yù)先挽拌過(guò)的情況(挽拌吸光度變化量)進(jìn)行測(cè)定的.測(cè)定后，經(jīng)過(guò)1天后，與上述同樣地?fù)呑?，測(cè)定經(jīng)過(guò)1天后的吸光度變化量(未攪拌吸光度變化量和撹拌吸光度變化量).由所得的放置時(shí)和經(jīng)過(guò)1天后的未攪拌吸光度變化量以及攪拌吸光度變化量，計(jì)算各個(gè)測(cè)定值之差.結(jié)果示于表l中.另外，除了使用含有2。/。聚乙二醇(PEG)的第二試劑(含有PEG的笫二試劑)、含有33%丙三醇和2%PEG的笫二試刑(含有混合物的笫二試刑)或直接使用笫二試刑來(lái)代替含有丙三醇的笫二試刑之外，與上述同樣地操作，測(cè)定吸光度變化量，計(jì)算測(cè)定值之差.結(jié)果一并示于表l中.表l<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(2)血清胱抑素C濃度約為4mg/L的試樣(試樣2)的測(cè)定除了使用血清胱抑素C濃度約為4mg/L的試樣(試樣2)代替試樣1之外，與上述(l)同樣地操作，計(jì)算測(cè)定值之差.結(jié)果示于表2中.表2<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>*1…測(cè)定前攪拌笫二試劑(3)血清胱抑素C濃度約為lmg/L的試樣(試樣3)的測(cè)定除了使用血清胱抑素C濃度約為1mg/L的試樣(試樣3)代替試樣1之外，與上述(l)同樣地操作，計(jì)算測(cè)定值之差.結(jié)果示于表3中.表3<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>*1...測(cè)定前攪拌第二試劑由上述表1~3的結(jié)果可知，在第二試劑中加有沉降抑制物質(zhì)(丙三醇、聚乙二醇或丙三醇與聚乙二醇的混合物)時(shí)，與不加沉降抑制物質(zhì)時(shí)相比，經(jīng)過(guò)1天后的測(cè)定值差別很小.不加沉降抑制物質(zhì)時(shí)，如果經(jīng)過(guò)1天，則結(jié)合抗體的膠體金粒子由于重力而沉降，因此試刑液上層部分的濃度變稀.因而，如果在測(cè)定前不進(jìn)行攪拌，則在自動(dòng)分析裝置中試劑會(huì)從濃度稀的上層區(qū)域被分注到反應(yīng)池中，因此直接參與反應(yīng)的結(jié)合抗體的膠體金粒子量減少，吸光度變化量大幅度增加.因而，在靜置1天后，如果比較測(cè)定前攪拌了結(jié)合抗體的膠體金試劑的愔況和未攪拌情況的吸光度變化量，無(wú)論是否測(cè)定相同試樣，都有很大差別.由此可知，通過(guò)在結(jié)合抗體的膠體金試刑中添加丙三醇和/或聚乙二醉，可以抑制靜罝保存時(shí)結(jié)合抗體的膠體金粒子的沉降、可以保持結(jié)合抗體的膠體金試劑的均勻性.實(shí)施例5:葡聚糖或葡聚糖硫酸鈉的添加效杲探討(1)血清胱抑素C濃度約為8mg/L的試樣(試樣1)的測(cè)定在結(jié)合抗血清胱抑素C的抗體的膠體金試劑(第二試劑)中加入葡聚糖，使其含量達(dá)到1%,配制含有葡聚糖的笫二試劑.除了使用含有葡聚糖的笫二試刑代替含有丙三醇的笫二試刑、測(cè)定放置時(shí)經(jīng)過(guò)3天后的吸光度變化量代替放置時(shí)經(jīng)過(guò)1天后的吸光度變化重之外，與實(shí)施例4的(1)同樣地?fù)呑鳎瑴y(cè)定吸光度變化量，求出測(cè)定值之差.結(jié)果示于表4中.另外，除了使用含有1%葡聚糖碟酸鈉的笫二試刑(含有葡聚糖硫酸鈉的笫二試刑)或直接使用第二試刑來(lái)代替含有葡聚糖的笫二試刑之外，與上述同樣地?fù)呑鳎瑴y(cè)定吸光度變化量，計(jì)算測(cè)定值之差.結(jié)果一并示于表4中.表4<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>M…測(cè)定前攪拌第二試劑(2)血清胱抑素C濃度約為4mg/L的試樣(試樣2)的測(cè)定除了使用血清胱抑素C濃度約為4mg/L的試樣(試樣2)代替試樣1之外，與上迷實(shí)施例5的(1)同樣地?fù)呑?，?jì)算測(cè)定值之差.結(jié)果示于表5中.表5<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>*1...測(cè)定前攪拌笫二試刑由上述表4和5的結(jié)果可知，在第二試刑中加有沉降抑制物質(zhì)(葡聚糖或葡聚糖硤酸鈉)時(shí)，與不加沉降抑制物質(zhì)時(shí)相比，經(jīng)過(guò)3天后的測(cè)定值的差別很小.由此可知，通過(guò)在結(jié)合抗體的膠體金試刑中添加沉降抑制物質(zhì)(葡聚糖或葡聚糖硤酸鈉)，可以抑制靜置保存時(shí)結(jié)合抗體的膠體金粒子的沉降、可以保持結(jié)合抗體的膠體金試刑的均勻性.實(shí)施例6:肝素鈉的添加效果探討(1)血清胱抑素C濃度約為8mg/L的試樣(試樣1)的測(cè)定在結(jié)合抗血清胱抑素C的抗體的膠體金試刑(笫二液)中加入肝素鈉，使肝素鈉含量達(dá)到1%，配制含有肝素的笫二試劑.除了使用含有肝素的第二試劑代替含有丙三醇的第二試劑、測(cè)定放置時(shí)經(jīng)過(guò)2天后的吸光度變化量代替放置時(shí)經(jīng)過(guò)1天后的吸光度變化量之外，與實(shí)施例4的(1)同樣地?fù)呑鳎瑴y(cè)定吸光度變化重，求出測(cè)定值之差.結(jié)果示于表6中.表6<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>"...測(cè)定前撹拌第二試刑(2)血清胱抑素C濃度約為4mg/L的試樣(試樣2)的測(cè)定除了使用血清胱抑素C濃度約為4mg/L的試樣(試樣2)代替試樣1之外，與上述實(shí)施例6的(1)同樣地操作，計(jì)算測(cè)定值之差.結(jié)果示于表7中.表7<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>*1...測(cè)定前撹拌笫二試刑由上述表6和7的結(jié)果可知，在笫二試刑中加有沉降抑制物質(zhì)(肝素鈉)時(shí)，與不加沉降抑制物質(zhì)時(shí)相比，經(jīng)過(guò)2天后的測(cè)定值的差別很小.由此可知，通過(guò)在結(jié)合抗體的膠體金試劑中添加沉降抑制物質(zhì)(肝素鈉)，可以抑制靜里保存時(shí)結(jié)合抗體的膠體金粒子的沉降、可以保持結(jié)合抗體的膠體金試刑的均勻性.實(shí)施例7:葡聚糖硫酸鈉的添加效果探討(經(jīng)時(shí)變化)(1)血清胱抑素C濃度約為8mg/L的試樣(試樣1)的測(cè)定在結(jié)合抗血清胱抑素C的抗體的膠體金試刑(笫二試刑)中加入葡聚糖碟酸鈉，使葡聚糖硫酸鈉含量達(dá)到1%，配制含有葡聚糖硤酸鈉的笫二試刑.除了使用含有葡聚糖的笫二試刑代替含有丙三醇的笫二試劑、測(cè)定放置時(shí)經(jīng)過(guò)2天后、3天后、6天后和7天后的吸光度變化量代替放置時(shí)經(jīng)過(guò)1天后的吸光度變化量之外，與實(shí)施例4的(1)同樣地操作，測(cè)定吸光度變化量.由所得的吸光度變化量、使用通過(guò)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)液制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清胱抑素C濃度.結(jié)果示于表8和困1中.表8<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>(2)血清胱抑素C濃度約為4mg/L的試樣(試樣2)的測(cè)定除了使用血清胱抑素C濃度約為4邁g/L的試樣(試樣2)代替試樣1之外，與上述實(shí)施例7的(1)同樣地?fù)呑?，測(cè)定吸光度變化重，求出血清胱抑素C濃度.結(jié)果示于表9和困1中.<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>n…測(cè)定前攪拌第二試劑由上述表8和9以及困i的結(jié)果可知，在第二試刑中加有沉降抑制物質(zhì)(葡聚糖硤酸鈉)時(shí)，即便不進(jìn)行特別地?cái)嚢?，與攪拌后的測(cè)定值相比也無(wú)變化，直至7日后都可以得到穗定的測(cè)定值.相反，不加入沉降抑制物質(zhì)時(shí)，如果不在測(cè)定前進(jìn)行攪拌使結(jié)合抗體的膠體金粒子濃度均勻，則結(jié)合抗體的膠體金粒子會(huì)慢慢沉降，試劑上部的結(jié)合抗體的膠體金粒子濃度變稀，從而分注到反應(yīng)體系中的結(jié)合抗體的膠體金粒子重減少、隨著天數(shù)的增加測(cè)定值降低.由此可知，通過(guò)在結(jié)合抗體的膠體金試劑中添加沉降抑制物質(zhì)(葡聚糖硫酸鈉)，可以抑制結(jié)合抗體的膠體金粒子的沉降、可以使結(jié)合抗體的膠體金粒子濃度在試劑中長(zhǎng)期地保持均勻.因而，在靜置在自動(dòng)分析裝置上的狀態(tài)下不進(jìn)行攪拌，也可以得到穗定的測(cè)定值.實(shí)施例9:鐵蛋白測(cè)定用笫一試劑的配制在含有5%氟化鈉、0.2%EDTA和0.35%聚氣乙秌月桂基酸的0.5MPIPES(pH6,5)溶液中加入1.5~2，0%左右的聚乙二醇作為反應(yīng)促進(jìn)劑，制作鐵蛋白測(cè)定用第一試劑.實(shí)施例10:結(jié)合抗鐵蛋白抗體的膠體金試劑(鐵蛋白測(cè)定用第二試劑)的配制用含有0.05%疊氮化鈉的10mMHEPES(pH7,1)稀釋抗鐵蛋白抗體7弋W》抹式會(huì)社)，使?jié)舛冗_(dá)到50叫/mL.將100mL該溶、夜加入到約1L在實(shí)施例1中配制的膠體金液中，在冷藏條件下擾拌2小時(shí).進(jìn)而，加入110mL含有5.46°/。甘露醇、0.5。/。BSA和0.05%疊氮化鈉的10mMHEPES(pH7.1)，在37TC下攪拌卯分鐘.接著，以8000轉(zhuǎn)離心分離40分鐘，除去上清后，再加入約1L的含有3%甘露醇、0.1%BSA和0.05%疊氮化鈉的5mMHEPES(pH7.5)(A溶液)，使結(jié)合抗體的膠體金分散.進(jìn)而，在8000轉(zhuǎn)離心分離40分鐘，除去上清，使抗體致敏膠體金分散在A溶液中，使總量達(dá)到280mL，得到結(jié)合抗鐵蛋白抗體的膠體金試劑。實(shí)施例ll:葡聚糖疏酸鈉的添加效果探討(1)鐵蛋白濃度約為760ng/L的試樣(試樣4)的測(cè)定在結(jié)合抗鐵蛋白抗體的膠體金試劑(第二試劑)中加入葡聚糖硫酸鈉，使葡聚糖硫酸鈉含重達(dá)到0.2%,配制含有0.2%硫酸葡聚糖的笫二試劑.在日立7070自動(dòng)分析裝置中放置鐵蛋白濃度約為760ng/L的試樣(試樣4)、在實(shí)施例9中配制的笫一試刑和上述含有0.2%硫酸葡聚糖的笫二試刑，在以下條件下測(cè)定放置時(shí)的吸光度變化量.(測(cè)定條件)在10pL試樣4中分注iiL第一試刑，在"1C下加熱約5分鐘，接著分注80^L含有0.2。/。硫酸葡聚糖的笫二試劑，在3^7TC下反應(yīng).之后，在主波長(zhǎng)505nm和副波長(zhǎng)700nm下進(jìn)行從測(cè)光點(diǎn)l8到31的兩點(diǎn)測(cè)定，測(cè)定兩點(diǎn)間的吸光度變化量。需要說(shuō)明的是，吸光度變化量是在分注上述笫二試劑時(shí)，分別對(duì)未攪拌的情況(未攪拌吸光度變化量)和預(yù)先撹拌過(guò)的情況(攪拌吸光度變化重)進(jìn)行測(cè)定的.與上述同樣地操作，測(cè)定從測(cè)定當(dāng)天開始經(jīng)過(guò)2天后、4天后和7天后的吸光度變化量(未攪拌吸光度變化重和攪拌吸光度變化量).由得到的放置時(shí)、經(jīng)過(guò)2天后、經(jīng)過(guò)4天后和經(jīng)過(guò)7天后的未攪拌吸光度變化量以及攪拌吸光度變化童，使用通過(guò)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)液制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算鐵蛋白濃度.結(jié)果示于表IO中.另外，除了使用含有1.0%破酸葡聚糖的第二試刑、含有2.0%破酸葡聚糖的笫二試刑或直接使用笫二試劑來(lái)代替含有0.2%碟酸葡聚糖的笫二試刑之外，與上述同樣地採(cǎi)作，測(cè)定吸光度變化量，計(jì)算鐵蛋白濃度.結(jié)果一并示于表IO中.需要說(shuō)明的是，使用含有2.0%碟酸葡聚糖時(shí)和直接使用笫二試刑時(shí)(對(duì)照)的鐵蛋白濃度一并示于田2中.表10<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>*1."測(cè)定前攪拌笫二試刑(2)鐵蛋白濃度約為520ng/inL的試樣(試樣5)的測(cè)定除了使用鐵蛋白濃度約為520ng/mL的試樣(試樣5)代替試樣1之外，與上迷實(shí)施例11的(1)同樣地?fù)呑鳎瑴y(cè)定吸光度變化量，求出鐵蛋白濃度.結(jié)果示于表ll中.需要說(shuō)明的是，使用含有2.0%硤酸葡聚糖時(shí)和直接使用笫二試劑時(shí)(對(duì)照)的鐵蛋白濃度一并示于困2中.表ll<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>"…測(cè)定前攪拌笫二試刑由上迷表IO、11以及閨2的結(jié)果可知，在笫二試刑中加有沉降抑制物質(zhì)(葡聚糖硤酸鈉)時(shí)，與不加入沉降抑制物質(zhì)時(shí)相比，在經(jīng)過(guò)2天后、經(jīng)過(guò)4天后和經(jīng)過(guò)7天后的測(cè)定值差別很小.特別是使用含有1.0%葡聚糖碟酸鈉的笫二試劑和含有2.0%葡聚糖碟酸鈉的笫二試刑時(shí)，即便經(jīng)過(guò)7天后，經(jīng)過(guò)攪拌時(shí)的測(cè)定值與在測(cè)定前未攪拌結(jié)合抗體的膠體金試刑時(shí)的測(cè)定值完全沒(méi)有差別.不添加沉降抑制物質(zhì)時(shí)，如果不在測(cè)定前進(jìn)行攪拌使結(jié)合抗體的膠體金粒子濃度均勻，則結(jié)合抗體的膠體金粒子會(huì)慢慢沉降，試刑上部的結(jié)合抗體的膠體金粒子濃度變稀，從而分注到反應(yīng)體系中的結(jié)合抗體的膠體金粒子量減少、隨著天數(shù)的增加測(cè)定值降低.由此可知，通過(guò)在結(jié)合抗體的膠體金試劑中添加沉降抑制物質(zhì)(葡聚糖硫酸鈉)，可以抑制結(jié)合抗體的膠體金粒子的沉降、可以使結(jié)合抗體的膠體金粒子濃度在試刑中長(zhǎng)期地保持均勻.因而，在靜置在自動(dòng)分析裝置上的狀態(tài)下不進(jìn)行攪拌，也可以得到穗定的測(cè)定值.產(chǎn)業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明可以抑制結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子的沉降.因此，可以提供該微小粒子的沉降被抑制的試刑.該試刑可以將該微小粒子的濃度長(zhǎng)期地保持均勻.因而，使用該試劑進(jìn)行免疫測(cè)定時(shí)，即便不攪拌該試劑也可以將結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子等量地分注到最終反應(yīng)液中，因此可以得到誤差小的穗定的測(cè)定值.由此，在不需要對(duì)于測(cè)定者是個(gè)較大負(fù)擔(dān)的繁瑣的攪拌操作的同時(shí)，還可以防止由于疏于挽拌搮作所產(chǎn)生的測(cè)定誤差和由此導(dǎo)致的臨床判斷錯(cuò)誤.該試刑和含有該試劑的試劑盒對(duì)于自動(dòng)化免疫裝里特別有用.權(quán)利要求1.一種結(jié)合有具有反應(yīng)性的物質(zhì)的微小粒子的沉降抑制方法，該方法包括在該微小粒子的分散液中使選自聚陰離子及其鹽、葡聚糖、環(huán)糊精、聚乙二醇和丙三醇中的至少1種共存的工序。2.權(quán)利要求l的方法，其中，在所述分散液中含有0.3~5質(zhì)重％的所述聚陰離子及其鹽、0.1~5質(zhì)量％的所述葡聚糖、0.1-5質(zhì)量％的所述環(huán)糊精、0.3~5質(zhì)量％的所述聚乙二醇或5~40質(zhì)量°/。的所述丙三醇.3.權(quán)利要求1或2的方法，其中，所述聚陰離子或其鹽為具有疏酸基的水溶性高分子化合物.4.權(quán)利要求3的方法，其中，所述聚陰離子為碟酸葡聚糖或肝素.5.權(quán)利要求l-4任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述結(jié)合有具有反應(yīng)性的物質(zhì)的微小粒子是結(jié)合有抗體或抗原的膠體金粒子.6.—種試刑，該試刑含有結(jié)合有具有反應(yīng)性的物質(zhì)的微小粒子和選自聚陰離子及其鹽、葡聚糖、環(huán)糊精、聚乙二醇和丙三醇中的至少1種化合物，抑制該微小粒子的沉降.7.權(quán)利要求6的試刑，在所述試刑中含有0.3~5質(zhì)量％的所述聚陰離子及其鹽、0,1~5質(zhì)量％的所述葡聚糖、0.1~5質(zhì)量％的所述環(huán)糊精、0.5~5質(zhì)量％的所述聚乙二醇或5~40質(zhì)量％的所述丙三醇.8.權(quán)利要求6或7的試刑，所述聚陰離子或其鹽是具有硤酸基的水溶性高分子化合物.9.權(quán)利要求8的試劑，所述聚陰離子為碟酸葡聚糖或肝素.10.權(quán)利要求6~9任一項(xiàng)所述的試刑，其中所述結(jié)合有具有反應(yīng)性的物質(zhì)的微小粒子是結(jié)合有抗體或抗原的膠體金粒子.11.一種試刑盒，該試刑盒含有權(quán)利要求6~10任一項(xiàng)所述的試刑.12.—種自動(dòng)化免疫測(cè)定方法，該方法包括將權(quán)利要求6~10任一項(xiàng)所述的試劑與試樣混合的工序.全文摘要本發(fā)明提供通過(guò)抑制結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子在分散液中的沉降使分散液中的結(jié)合反應(yīng)性物質(zhì)的微小粒子濃度保持均勻的方法。本發(fā)明提供結(jié)合有具有反應(yīng)性的物質(zhì)的微小粒子的沉降抑制方法。該方法包括在該微小粒子的分散液中使選自聚陰離子及其鹽、葡聚糖、環(huán)糊精、聚乙二醇和丙三醇中的至少1種共存的工序。文檔編號(hào)G01N33/553GK101266244SQ20071008639公開日2008年9月17日申請(qǐng)日期2007年3月15日優(yōu)先權(quán)日2007年3月15日發(fā)明者田中睦申請(qǐng)人:愛芙樂(lè)賽制藥株式會(huì)社