專利名稱：抗乙型肝炎病毒s－表面抗原的人源化抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗乙型肝炎病毒(以下作“HBV”)S-表面抗原的人源化抗體、其制備方法、以及用來治療HBV相關(guān)疾病的包含該人源化抗體的藥物組合物。
背景技術(shù)：
眾所周知，作為丹氏顆粒的HBV是一種直徑約為42nm的球形顆粒，由外包膜和核衣殼組成。包裹核衣殼的外包膜含有大量乙型肝炎表面抗原，含有大約180個乙型肝炎核心蛋白亞基的核衣殼包括多種基因，它們編碼HBV蛋白、聚合酶等(Summers et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.724579，1975；Pierre Tiollais et al.，Science213406-411，1981)。
HBV表面抗原的基因編碼區(qū)包含三個閱讀框內(nèi)的起始位點(diǎn)，所有這些位點(diǎn)有共同的S-結(jié)構(gòu)域末端的終止密碼子。因此，HBV表面抗原可以分為三組(i)僅包含S-結(jié)構(gòu)域的小乙型肝炎病毒表面抗原(以下作“S-表面抗原”)；(ii)包含S-結(jié)構(gòu)域和由55個氨基酸組成的前-S2的中乙型肝炎病毒表面抗原(以下作“M-表面抗原”)；以及(iii)包含S-結(jié)構(gòu)域、前-S2和前-S1的大乙型肝炎病毒表面抗原(以下作“L-表面抗原”)。S-表面抗原占約總共表達(dá)的表面蛋白的80％或更多。
干擾素α和拉米夫定已經(jīng)廣泛用于治療慢性肝炎(C.L.Lai和P.C.Wu，H.K.M.J.3289-296，1997)。盡管干擾素表現(xiàn)出抗體內(nèi)病毒的免疫反應(yīng)，但是它毒性高。另一方面，作為核酸衍生物的拉米夫定通過抑制DNA聚合酶從而表現(xiàn)出抗病毒的活性?？诜o藥的拉米夫定制劑表現(xiàn)出高療效，但長時間服用時，存在誘導(dǎo)耐受拉米夫定的突變體的高風(fēng)險(Daryl T.Y.Lau et al，Hepatology 32828-834，2000))))。此外，從人血清當(dāng)中分離的抗-HBV的多克隆抗體已經(jīng)用來預(yù)防由于肝臟移植以及垂直傳播造成的HBV感染。然而，該抗體在如下方面也存在問題，即它的抗原特異性低，并且必須從人血中分離。
最近已經(jīng)發(fā)展了一種使用抗HBV表面抗原的小鼠單克隆抗體的方法，以便解決上述問題，但是長時間使用，會產(chǎn)生抗小鼠單克隆抗體的人抗體(Dimaggio J.J.，et al.，Cancer Chemother.Biol.Response Modif.11177-203，1990)。
為了克服小鼠單克隆抗體令人不滿的性質(zhì)，通過將除抗原結(jié)合位點(diǎn)以外的框架區(qū)替換為人抗體的區(qū)域，已發(fā)展了一種人源化抗體。目前用來制備該人源化抗體的方法包括如下步驟選擇編碼人抗體的基因，該基因表現(xiàn)出和小鼠抗體的序列相似性最接近，通過CDR移植方法僅僅用人抗體的相應(yīng)區(qū)域替換小鼠抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)。人源化抗體有降低體內(nèi)免疫反應(yīng)的優(yōu)勢(Riechmann et al.，Nature 332323，1988；Nakatani et al.，Protein Engineering 7435，1994)。但僅把CDR移植到人抗體上時，也經(jīng)常削弱了其選擇性和反應(yīng)性(Carter P.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 894285-4289，1992)。
本發(fā)明人已努力克服了傳統(tǒng)人源化抗體的該類問題，并且發(fā)展了一種抗HBV的S-表面抗原的新型人源化抗體，它保持了抗HBV S-表面抗原的小鼠單克隆抗體的抗體特異性，卻使對小鼠單克隆抗體的免疫反應(yīng)得以最小化。

發(fā)明內(nèi)容
于是，本發(fā)明的一個目的是提供抗HBV的S-表面抗原的人源化抗體及其制備方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于治療HBV相關(guān)疾病的含有以人源化抗體作為有效成分的藥物組合物。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了抗HBV的S-表面抗原的人源化抗體，該抗體包含a)在互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)具有SEQ ID NO38至40的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；b)在CDR具有SEQ ID NO41至43的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；c)與人抗體重鏈恒定區(qū)相一致的重鏈恒定區(qū)；以及d)與人抗體輕鏈恒定區(qū)相一致的輕鏈恒定區(qū)。
附圖描述從以下對本發(fā)明的描述并結(jié)合附圖，使得本發(fā)明上述以及其他目的和特征顯而易見，附圖分別如下

圖1抗HBV的S-表面抗原的小鼠單克隆抗體A9-11-5、人源化抗體HFW141以及人抗體亞型2(Hh2)的重鏈氨基酸序列；圖2抗HBV的S-表面抗原的小鼠單克隆抗體A9-11-5、人源化抗體LFW22-31和LFW22-312以及人抗體亞型7(hV7)的輕鏈氨基酸序列；圖3構(gòu)建人源化抗體重鏈表達(dá)載體pHAB-HFW141 HF的程序；圖4構(gòu)建人源化抗體輕鏈表達(dá)載體pHAB-LFW22-31 LF和pHAB-LFW22-312LF的程序；圖5由SDS-PAGE分析所確定的人源化抗體YH1110-13和YHB1110-15的表達(dá)模式；以及泳道1小鼠抗體，泳道2YHB-1110-13泳道3YHB-1110-15圖6人源化抗體YH1110-13和YHB1110-15抗HBV S-表面抗原的抗原結(jié)合親和力。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明公開了這樣的人源化抗體，其重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的抗原結(jié)合位點(diǎn)、互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)來自小鼠單克隆抗體，抗體分子的框架區(qū)來自人抗體。優(yōu)選地，該人源化抗體表現(xiàn)從7×107M-1到1×108M-1的抗原結(jié)合親和力(Ka)。
本發(fā)明的人源化抗體可從小鼠單克隆抗體A9-11-5(登記號KCTC 18020P和KCTC 18021P)根據(jù)CDR移植術(shù)制備，其中，小鼠單克隆抗體A9-11-5的重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NOs38至40的三個CDR區(qū)，輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NOs41至43的三個CDR區(qū)。
首先，小鼠單克隆抗體A9-11-5的輕鏈和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫中人序列比較，并且選擇出來的是人重鏈可變區(qū)亞型2(Hh2)，根據(jù)Kabat定義其與小鼠單克隆抗體A9-11-5重鏈具有最大序列相似性，以及人輕鏈可變區(qū)亞型7(7hV)或人Ig lambda生殖系V基因的V3，通過GeneBank Ig blast其與小鼠抗體A9-11-5輕鏈最相似(Kawasaki K.，et al.，Genome Res.，7250-261，1997)。
可以使用如此選擇的人基因作為模板擴(kuò)增編碼人源化抗體重鏈和輕鏈的基因。在此過程中，可以基于公知的遺傳研究和抗體結(jié)構(gòu)分析對每條編碼人源化抗體重鏈和輕鏈的核苷酸序列進(jìn)行修飾。此外，如果小鼠單克隆抗體的某些核苷酸序列編碼的氨基酸殘基影響抗原結(jié)合親和力或者對于抗體結(jié)構(gòu)有重要作用，那么它們將被保留下來而不替換序列(Kabat E.A.，et al.，D.H.H.S.913242，1991；Chothia C5 et al.，Nature342877-883，1989；Gary M.，et al.，Protein Engineering 7805-814，1994；LindaHarris and Bajorath，J.，Protein Science 4306-310，1995)。
通過用人抗體的重鏈亞型2(Hh2)替換特異性識別HBV S-表面抗原的小鼠單克隆抗體A9-11-5的重鏈可變區(qū)中除抗原結(jié)合位點(diǎn)以外的框架區(qū)，可以制備編碼人源化抗體重鏈可變區(qū)的基因。這種編碼人源化抗體重鏈可變區(qū)的基因可以按如下步驟制備以編碼小鼠單克隆抗體A9-11-5重鏈的基因作為模板設(shè)計將小鼠單克隆抗體進(jìn)行人源化的引物；用相應(yīng)的引物進(jìn)行PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))；和用限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶將如此擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物彼此連接起來。按此制備的編碼人源化抗體重鏈可變區(qū)的基因稱為HFW141(SEQ ID NO32)，它編碼具有SEQ ID NO35的氨基酸序列的多肽(見圖1)。
為了制備包括編碼人源化重鏈可變區(qū)的基因在內(nèi)的編碼人源化抗體全長重鏈的基因，將基因HFW141插入PCR載體中來制備表達(dá)載體pCR-HFW141。此時，優(yōu)選在人源化抗體重鏈的前導(dǎo)序列之前插入Kozak序列(Kozak，M.Nuc.Acids Res.158125-8148，1987)，并且將重鏈前導(dǎo)序列中有些密碼子替換為顯示在動物細(xì)胞中高頻率使用的其他密碼子，這將提高人源化抗體重鏈可變區(qū)(SEQ ID NO1)的表達(dá)效率。從表達(dá)載體pCR-HFW141分離編碼人源化抗體重鏈可變區(qū)的基因片段，然后將其插入含有編碼人抗體重鏈恒定區(qū)基因的表達(dá)載體pHAB-HC(登記號KCTC10229BP；Korean Patent Laid-Open NO2004-12266)中，從而獲得人源化抗體重鏈的表達(dá)載體。按此制備的表達(dá)載體稱為pHAB-HFW141 HF(登記號KCTC10533BP)。編碼人源化抗體全長重鏈的基因可以從重鏈表達(dá)載體pHAB-HFW141 HF分離，并將其稱為HFW141 HF。
根據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約的條款，用人源化重鏈表達(dá)載體pHAB-HFW141HF轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(E.coli)TOP10F′轉(zhuǎn)化子于2003年10月29日保藏于Korean Collection for Type Cultures(KCTC)(地址KoreaResearch Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB)，#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，305-333，Republic of Korea)，登記號為KCTC 10533BP。
通過用人抗體的輕鏈亞型7(hV7)或輕鏈lambda生殖系V3替換特異性識別HBV S-表面抗原的小鼠單克隆抗體A9-11-5的輕鏈可變區(qū)中除抗原結(jié)合位點(diǎn)以外的框架區(qū)，可以制備編碼人源化抗體輕鏈可變區(qū)的基因。這種編碼人源化抗體輕鏈可變區(qū)的基因可以按如下步驟制備以編碼小鼠單克隆抗體A9-11-5輕鏈的基因作為模板設(shè)計將小鼠單克隆抗體進(jìn)行人源化的引物；用相應(yīng)的引物進(jìn)行PCR；以及用限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶將如此擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物彼此連接起來。每條按此制備的編碼人源化抗體輕鏈可變區(qū)的基因分別稱為LFW22-31(SEQ ID NO33)和LFW22-312(SEQ ID NO34)，它編碼具有SEQ ID No36和37的核苷酸序列的多肽(見圖2)。
為了制備包括編碼人源化輕鏈可變區(qū)的基因在內(nèi)的編碼人源化抗體全長輕鏈的基因，將基因LFW22-31或LFW22-312插入PCR載體中來制備表達(dá)載體pCR-LFW22-31或pCR-LFW22-312。此時，優(yōu)選在人源化抗體輕鏈的前導(dǎo)序列之前插入Kozak序列(Kozak，M.Nuc.Acids Res.158125-8148，1987)，并且將輕鏈前導(dǎo)序列中有些密碼子替換為顯示在動物細(xì)胞中高頻率使用的其他密碼子，這將提高人源化抗體輕鏈可變區(qū)(SEQ ID NO13)的表達(dá)效率。從表達(dá)載體pCR-LFW22-31或pCR-LFW22-312分離編碼人源化抗體輕鏈可變區(qū)的基因片段，然后將其插入含有編碼人抗體輕鏈恒定區(qū)基因的表達(dá)載體pHAB-LC(登記號KCTC 10231BP；KoreanPatent Laid-Open NO2004-12267)中，從而獲得人源化抗體輕鏈的表達(dá)載體。每個按此構(gòu)建的表達(dá)載體稱為pHAB-LFW22-31 LF(登記號KCTC 10532BP)和pHAB-LFW22-312 LF(登記號KCTC 10553BP)。編碼全長人源化輕鏈的基因可以自輕鏈表達(dá)載體pHAB-LFW22-31 LF和pHAB-LFW22-312 LF分離，并分別稱為LFW22-31 LF和LFW22-312 LF。
根據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約的條款，用人源化輕鏈表達(dá)載體pHAB-LFW22-31 LF和pHAB-LFW22-312 LF轉(zhuǎn)化的大腸桿菌TOP10F′轉(zhuǎn)化子分別于2003年10月29日和2003年11月25日保藏于Korean Collection forType Cultures(KCTC)(地址Korea Research Institute of Bioscience andBiotechnology(KRIBB)，#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，305-333，Republic ofKorea)，登記號分別為KCTC 10532BP和10553BP。
可通過使用合適的轉(zhuǎn)化溶液如GenePORTER用人源化重鏈表達(dá)載體pHAB-HFW141 HF和人源化輕鏈表達(dá)載體pHAB-LFW22-31 LF轉(zhuǎn)化CHO細(xì)胞系，從而獲得產(chǎn)生特異性識別HBV S-表面抗原的人源化抗體的轉(zhuǎn)化子，該轉(zhuǎn)化子已被稱為CHO-YHB1110-13。此外，根據(jù)上述同樣方法，可用人源化重鏈表達(dá)載體pHAB-HFW141 HF和人源化輕鏈表達(dá)載體pHAB-LFW22-312 LF制備另一個轉(zhuǎn)化子，其已被稱為CHO-YHB1110-15。
為了從轉(zhuǎn)化子細(xì)胞系中純化本發(fā)明的人源化抗體，可以在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子CHO-YHB1110-13或CHO-YHB1110-15，可以將培養(yǎng)上清液使用Protein-A(Amersham Bioscience，Sweden)或羊抗人免疫球蛋白G(Zymed Laboratories Inc.，USA)進(jìn)行柱層析。按此純化的人源化抗體分別稱為YHB1110-13和YHB1110-15。
特異性識別HBV S-表面抗原的人源化抗體YHB1110-13和YHB1110-15表現(xiàn)出從6×107到5×108M-1范圍的抗原結(jié)合親和力，這證明本發(fā)明的人源化抗體保持了和先前報道的小鼠單克隆抗體相似的抗原結(jié)合活性，但卻表現(xiàn)出顯著降低的免疫原性，因此，可以有效用于治療HBV相關(guān)疾病，而不會面臨不利的副作用。
為此，本發(fā)明的人源化抗體可用作治療HBV相關(guān)疾病的藥物組合物的有效成分。藥物組合物可以配制成口服或非口服劑型，用于立即或長時釋放。該組合物可以含有藥物制劑中常用的無活性成分，如稀釋劑、填充劑、崩解劑、增甜劑、潤滑劑以及矯味劑。優(yōu)選將藥物組合物配制成靜脈給藥，經(jīng)快速濃注或持續(xù)滴注，或者配制成可以從植入膠囊中釋放。靜脈給藥的典型制劑用生理鹽水作為稀釋劑。
配制抗體用于治療性施用被認(rèn)為是公知技術(shù)。
患者群體的劑量取決于所用的特定抗體、體重、年齡、性別、健康狀態(tài)、飲食、給藥時間和組合物的制劑、給藥途徑以及待治療的疾病。典型劑量是0.01mg/kg/天至1,000mg/kg/天。更典型地，劑量是0.1mg/kg/天至10mg/kg/天。
本發(fā)明的組合物也可包括印刷品，其描述可作為治療劑施用抗體的臨床適應(yīng)癥、用藥量以及用法、和/或本發(fā)明抗體向患者給藥的禁忌癥。
以下實(shí)施例旨在進(jìn)一步說明本發(fā)明，而不應(yīng)受限于此范圍。
實(shí)施例1編碼人源化抗體重鏈可變區(qū)基因的構(gòu)建用編碼抗HBV S-表面抗原的小鼠單克隆抗體A9-11-5(Accession NOsKCTC18020P和KCTC 18021P)重鏈可變區(qū)的基因作為模板以及SEQ ID NO1和12的引物對進(jìn)行PCR，來擴(kuò)增攜帶有前導(dǎo)序列的編碼人源化抗體重鏈可變區(qū)的基因A。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，并用QIAgel提取試劑盒(Qiagen，USA)將其從凝膠中回收。
按此純化的基因A用SEQ ID NO1和3或SEQ ID NO2和12的引物對進(jìn)行PCR。每個擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用StuI(BioLabs Inc.，USA)在37℃下消化2小時，之后用T4 DNA連接酶(BioLabs Inc，USA)在室溫下處理1小時，制備編碼重鏈可變區(qū)的基因B。
用基因B作為模板以及SEQ ID NO4和12或SEQ ID NO1和5的引物對進(jìn)行PCR。每個擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用PstI(BioLabs Inc.，USA)在37℃下消化2小時，之后用T4 DNA連接酶(BioLabs Inc，USA)在室溫下處理1小時，制備編碼重鏈可變區(qū)的基因C。
按上述同樣方式，用SEQ ID NO6和12或SEQ ID NO1和7的引物對基因C進(jìn)行PCR，按此擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用SalI(BioLabs Inc.，USA)處理，獲得編碼重鏈可變區(qū)的基因D。用SEQ ID NO8和12或SEQ ID NO1和9的引物對基因D進(jìn)行PCR，按此擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用DraI(BioLabs Inc.，USA)處理，獲得編碼重鏈可變區(qū)的基因E。用基因E作為模板以及SEQ ID NO10和12或SEQ ID NO1和11的引物對進(jìn)行PCR。每個PCR產(chǎn)物用XbaI(BioLabs Inc.，USA)在37℃下消化2小時，之后用T4 DNA連接酶(BioLabs Inc，USA)在室溫下處理1小時，獲得編碼重鏈可變區(qū)的基因A9V7FW42HV。
用基因A9V7FW42HV作為模板以及SEQ ID NO23和25或SEQ ID NO1和24的引物對根據(jù)表1所述條件進(jìn)行PCR。兩個PCR產(chǎn)物按等摩爾比混合，用SEQ IDNO1和25的引物對對混合物進(jìn)行搭橋PCR。PCR熱循環(huán)重復(fù)30次，每個循環(huán)由如下步驟組成95℃持續(xù)2分鐘，58℃持續(xù)2分鐘以及72℃持續(xù)2分鐘。將按此擴(kuò)增的編碼人源化抗體重鏈可變區(qū)的最終基因稱為HFW141。
引物的核苷酸序列以及每次PCR反應(yīng)所用的反應(yīng)條件如表1所示。
在95℃下起始變性5分鐘后，在下表1所示條件重復(fù)30個循環(huán)進(jìn)行每次PCR反應(yīng)，最后在72℃下延伸10分鐘。
<表1>

實(shí)施例2人源化抗體全長重鏈基因及其表達(dá)載體的構(gòu)建為了提高編碼人源化抗體重鏈可變區(qū)基因的表達(dá)效率，將引物設(shè)計成把Kozak序列(Kozak，M.Nuc.Acids Res.158125-8148，1987)插入到人源化抗體重鏈前導(dǎo)序列之前，并將編碼重鏈前導(dǎo)序列第四個氨基酸亮氨酸的密碼子TTA替換為動物細(xì)胞中偏好使用的CTG。經(jīng)過修飾的人源化抗體重鏈前導(dǎo)序列如表2所示。
<表2>

將實(shí)施例1制備的編碼人源化抗體重鏈可變區(qū)的基因HFW141克隆到PCR載體中，獲得表達(dá)載體pCR-HFW141。
此外，為了構(gòu)建編碼人源化全長重鏈的基因，使用含有編碼人抗體重鏈恒定區(qū)基因的表達(dá)載體pHAB-HC(KCTC 10229BP，Korean Patent Laid-Open NO2004-12266)。首先，為了將編碼人源化抗體重鏈可變區(qū)的基因HFW141插入表達(dá)載體pHAB-HC中，用HindIII/ApaI(BioLabs，Inc.，USA)在37℃下將表達(dá)載體pCR-HFW141處理兩小時，在1.5％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，溴化乙錠(EtBr)染色，獲得約450bp的該基因片段。
按上述同樣方式，用HindIII/ApaI處理表達(dá)載體pHAB-HC獲得約6.5kb的載體片段。此后，每個基因片段用QIAgel提取試劑盒(Qiagen，USA)從凝膠中回收，將其用T4 DNA連接酶(BioLabs Inc，USA)在16℃下處理過夜，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TOP10F′中，從而獲得轉(zhuǎn)化子。在添加有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上將轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)過夜，從培養(yǎng)基中分離質(zhì)粒。用HindIII/ApaI處理分離的質(zhì)粒并在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，從而獲得約1.4kb人源化抗體的全長重鏈。
按此制備的人源化抗體全長重鏈稱為HFW141 HF。此外，插入有人源化抗體全長重鏈HFW141 HF的人源化抗體重鏈表達(dá)載體稱為pHAB-HFW141 HF(圖3)，將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TOP10F′，獲得轉(zhuǎn)化子，該轉(zhuǎn)化子于2003年10月29日保藏到Korean Collection for Type Cultures(KCTC)(地址Korea Research Institute ofBioscience and Biotechnology(KRIBB)，#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，305-333，Republic of Korea)，登記號為KCTC 10533BP。
實(shí)施例3編碼人源化抗體輕鏈可變區(qū)基因的構(gòu)建用編碼特異性識別HBV S-表面抗原的小鼠單克隆抗體A9-11-5輕鏈可變區(qū)的基因作為模板以及SEQ ID NO13和22的引物對進(jìn)行PCR，來擴(kuò)增含有前導(dǎo)序列的編碼人源化抗體輕鏈可變區(qū)的基因A’。基因A’在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，EtBr染色，用QIAgel提取試劑盒(Qiagen，USA)將其從凝膠中回收。
純化的基因A’用SEQ ID NO14和22的引物對或SEQ ID NO13和15的引物對進(jìn)行PCR。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用KpnI(BioLabs Inc.，USA)在37℃下消化2小時，并用T4 DNA連接酶(BioLabs Inc，USA)在室溫下處理1小時，獲得編碼輕鏈可變區(qū)的基因B’。
用基因B’作為模板以及SEQ ID NO16和22的引物對或SEQ ID NO13和17的引物對進(jìn)行PCR。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用MscI(BioLabs Inc.，USA)在37℃下消化2小時，并用T4 DNA連接酶(BioLabs Inc，USA)在室溫下處理1小時，獲得編碼輕鏈可變區(qū)的基因C’。
按上述同樣方式，用SEQ ID NO18和22的引物對或SEQ ID NO13和19的引物對基因C’進(jìn)行PCR，按此擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用ApaLI(BioLabs Inc.，USA)消化，以便獲得編碼輕鏈可變區(qū)的基因D’。此外，用基因D’作為引物以及SEQ ID NO20和22的引物對或SEQ ID NO13和21的引物對進(jìn)行PCR之后，按此擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用SmaI(BioLabs Inc.，USA)消化，并用T4 DNA連接酶(BioLabs Inc，USA)在室溫下處理1小時，獲得編碼輕鏈可變區(qū)的基因A9V7LV。
用基因A9V7LV作為模板以及SEQ ID NO26和22或SEQ ID NO13和27的引物對根據(jù)表3所述條件進(jìn)行PCR。兩種PCR產(chǎn)物按等摩爾比混合，用SEQ ID NO13和22的引物對對混合物進(jìn)行搭橋PCR。PCR熱循環(huán)重復(fù)30次，每個循環(huán)由如下步驟組成95℃持續(xù)2分鐘，58℃持續(xù)2分鐘以及72℃持續(xù)2分鐘。將按此擴(kuò)增的編碼人源化抗體輕鏈可變區(qū)的基因稱為LFW22。
按上述同樣方式，用基因LFW22作為模板以及SEQ ID NO28和22或SEQ IDNO13和29的引物對根據(jù)表3所述條件進(jìn)行PCR。兩種PCR產(chǎn)物按等摩爾比混合，用SEQ ID NO13和22的引物對對混合物進(jìn)行搭橋PCR。PCR熱循環(huán)重復(fù)30次，每個循環(huán)由如下步驟組成95℃持續(xù)2分鐘，58℃持續(xù)2分鐘以及72℃持續(xù)2分鐘。將按此擴(kuò)增的編碼人源化抗體輕鏈可變區(qū)的最終基因稱為LFW22-31。
按上述同樣方式，用基因LFW22-31作為模板以及SEQ ID NO30和22或SEQID NO13和31的引物對根據(jù)表3所述條件進(jìn)行PCR。兩種PCR產(chǎn)物按等摩爾比混合，用SEQ ID NO13和22的引物對對混合物進(jìn)行搭橋PCR。PCR熱循環(huán)重復(fù)30次，每個循環(huán)由如下步驟組成95℃持續(xù)2分鐘，58℃持續(xù)2分鐘以及72℃持續(xù)2分鐘。將按此擴(kuò)增的編碼人源化抗體輕鏈可變區(qū)的最終基因稱為LFW22-312。
引物的核苷酸序列以及上述PCR反應(yīng)所用反應(yīng)條件如表3所述。
95℃下起始變性5分鐘后，在表3所示的30個循環(huán)條件下進(jìn)行每次PCR反應(yīng)，最后在72℃下延伸10分鐘。
<表3>

實(shí)施例4人源化抗體全長輕鏈基因及其表達(dá)載體的構(gòu)建為了增強(qiáng)編碼人源化抗體輕鏈可變區(qū)基因的表達(dá)，將引物設(shè)計成把Kozak序列插入到人源化抗體輕鏈前導(dǎo)序列之前(Kozak，M.Nuc.Acids Res.158125-8148，1987)，并將編碼輕鏈前導(dǎo)序列的基因的核苷酸序列中第八個氨基酸苯丙氨酸替換為動物細(xì)胞中偏好使用的亮氨酸。此外，將編碼第六個亮氨酸的CTT替換為CTG，將編碼第七個異亮氨酸的ATA替換為ATC。經(jīng)過修飾的人源化抗體輕鏈前導(dǎo)序列如表4所示。
<表4>

將實(shí)施例3制備的編碼人源化抗體輕鏈可變區(qū)的基因LFW22-31插入PCR載體中，獲得表達(dá)載體pCR-LFW22-31。
此外，為了制備人源化抗體的全長輕鏈，使用含有編碼人抗體輕鏈恒定區(qū)基因的表達(dá)載體pHAB-LC(KCTC 10231BP，Korean Patent Laid-Open NO2004-12267)。
首先，為了將編碼人源化抗體輕鏈可變區(qū)的基因LFW22-31插入表達(dá)載體pHAB-LC中，用HindIII/AvrII在37℃下將表達(dá)載體pCR-LFW22-31處理兩小時，在1.5％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，EtBr染色，獲得約400 bp的基因片段。
按上述同樣方式，用HindIII/AvrII處理表達(dá)載體pHAB-LC獲得約6.5 kb的載體片段。每個基因片段用QIAgel提取試劑盒(Qiagen，USA)從凝膠中回收，并用T4 DNA連接酶(BioLabs Inc，USA)在16℃下處理過夜，之后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10F′中獲得轉(zhuǎn)化子。在添加有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上將轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)過夜，從培養(yǎng)溶液中分離質(zhì)粒。用HindIII/NotI(BioLabs，Inc.，USA)處理分離的質(zhì)粒，在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，從而獲得約0.7kb人源化抗體的全長輕鏈。
按此制備的編碼人源化抗體的全長輕鏈的基因稱為LFW22-31 LF。此外，含有基因LFW22-31 LF的人源化抗體輕鏈表達(dá)載體稱為pHAB LFW22-31 LF(圖4)，將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TOP10F′獲得轉(zhuǎn)化子，該轉(zhuǎn)化子于2003年10月29日保藏于Korean Collection for Type Cultures(KCTC)(地址Korea Research Institute ofBioscience and Biotechnology(KRIBB)，#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，305-333，Republic of Korea)，登記號為KCTC 10532BP。
根據(jù)上述相同方法，用基因LFW22-312制備人源化抗體的另一個全長輕鏈，稱為LFW22-312 LF。此外，含有基因LFW22-312 LF的人源化抗體輕鏈表達(dá)載體稱為pHAB LFW22-312 LF(圖4)，將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TOP10F′獲得轉(zhuǎn)化子，該轉(zhuǎn)化子于2003年11月25日保藏于Korean Collection for Type Cultures(KCTC)(地址Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology(KRIBB)，#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，305-333，Republic ofKorea)，登記號為KCTC 10553BP。
實(shí)施例5人源化抗體轉(zhuǎn)化入CHO細(xì)胞系為了測量人源化抗體在動物細(xì)胞中活性，將實(shí)施例2制備的重鏈表達(dá)載體pHAB-HFW141 HF以及實(shí)施例4制備的輕鏈表達(dá)載體pHAB-LFW22-31 LF轉(zhuǎn)化到CHO細(xì)胞(ATCC CRL-9096，USA)中。
首先，在增濕CO2培養(yǎng)箱中，在添加有1.5g/l碳酸氫鈉(Sigma，USA)和10％熱滅活FBS(Gibco BRL，USA)的DMEM/F12培養(yǎng)基(JRH Inc.，USA)中37℃下培養(yǎng)CHO細(xì)胞2到3天。將培養(yǎng)溶液在1,200rpm下室溫(25℃)離心5分鐘，收獲細(xì)胞沉淀。用0.4％臺盼藍(lán)(Gibco BRL，USA)給細(xì)胞染色，用血細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)。將細(xì)胞按照約6×106個細(xì)胞的量轉(zhuǎn)移到T-225培養(yǎng)瓶(或T-75培養(yǎng)瓶)中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
傳代培養(yǎng)的CHO細(xì)胞繼續(xù)增殖，直到它們大約覆蓋了培養(yǎng)瓶表面的60到90％。10μg待轉(zhuǎn)化基因和40μl GenePORTER轉(zhuǎn)化溶液(GTS，USA)與5ml DMEM/F12(無血清)培養(yǎng)基相混合?；旌衔镏糜谑覝?0到45分鐘后，從中移除培養(yǎng)基，增殖細(xì)胞在增濕CO2培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)3到5天來獲得轉(zhuǎn)化子，將其稱為CHO-YHB1110-13。
根據(jù)上述相同方法，將實(shí)施例2制備的重鏈表達(dá)載體pHAB-HFW141 HF以及實(shí)施例4制備的輕鏈表達(dá)載體pHAB-LFW22-312 LF轉(zhuǎn)化到CHO細(xì)胞中，獲得另一個轉(zhuǎn)化子，將其稱為CHO-YHB1110-15。
實(shí)施例6人源化抗體的純化將實(shí)施例5獲得的轉(zhuǎn)化子CHO-YHB 1110-13細(xì)胞按照2×106個細(xì)胞的量接種到含有DMEM/F12培養(yǎng)基的T-75培養(yǎng)瓶中，其中DMEM/F12培養(yǎng)基中添加有10％胎牛血清，37℃下孵育5小時。離心培養(yǎng)溶液分離出上清，過濾上清獲得無細(xì)胞的培養(yǎng)溶液。
為了從培養(yǎng)溶液中純化人源化抗體，使用偶聯(lián)有Protein-A以及羊抗人免疫球蛋白G(Zymed Laboratories Inc.，USA)的sepharose 4B柱(Pharmacia)。培養(yǎng)上清上樣到偶聯(lián)有Protein-A的sepharose 4B柱層析中，讓人源化抗體和Protein-A結(jié)合，將甘氨酸緩沖液(pH2.5)引入柱中，洗脫人源化抗體。然后，按照1∶10的體積比與1M Tris-Cl(pH8.0)相混合來中和洗脫液。被中和的洗脫液上樣到偶聯(lián)有羊抗人IgG的sepharose 4B柱層析中來特異性捕獲人源化抗體蛋白。
根據(jù)上述用Protein-A柱層析相同的方法對人源化抗體進(jìn)一步純化，并稱為YHB1110-13。
根據(jù)上述相同方法，通過培養(yǎng)實(shí)施例5制備的轉(zhuǎn)化子CHO-YHB1110-15，并從培養(yǎng)上清中純化抗體，獲得純化的人源化抗體YHB1110-15。
用SDS-PAGE分析純化的人源化抗體的結(jié)果為，觀察到了大小約50 kDa和約25 kDa的帶，分別被鑒定為人源化抗體重鏈和輕鏈(圖5)。
實(shí)施例7測量抗HBV S-表面抗原的人源化抗體的抗原結(jié)合親和力用夾心ELISA對實(shí)施例6純化的人源化抗體進(jìn)行定量，用S-表面抗原(International Enzyme Inc.，USA)adr型分析其抗原結(jié)合活性。為了定量抗體，100ng羊抗人免疫球蛋白G.A.M(Zymed Laboratories Inc.，USA)分配到微量培養(yǎng)板(Dynatech Laboratories Inc.，USA)每個孔中，孔板置于4℃下過夜，用此免疫球蛋白包被。此時，小鼠單克隆抗體A9-11-5用作對照。
為了測量抗HBV S-表面抗原的人源化抗體的抗原結(jié)合親和力，濃度從10-11到10-6M不等的抗原溶液(各100μl)分別和5 ng小鼠單克隆抗體A9-11-5、人源化抗體YHB1110-13以及人源化抗體YHB1110-15相混合，37℃下反應(yīng)1小時。每份反應(yīng)物加入到包被有0.5μg抗原的孔板中，孔板置于37℃下約2小時。偶聯(lián)辣根過氧化物酶的羊抗人多克隆抗體(BioRad，USA)按照1∶1000的比例稀釋，將100μg稀釋的抗體溶液加入到每個孔中。孔板置于37℃下約1小時。反應(yīng)完成后，用辣根過氧化物酶底物試劑盒(BioRad，USA)測量各孔吸光度。
根據(jù)測量的吸光度計算與抗原結(jié)合的抗體以及未結(jié)合抗體的濃度，從而確定人源化抗體的抗原結(jié)合親和力(Friguet，et al.，J.Immunol.Meth.77305-319，1985)。結(jié)果如表5所示。
<表5>

由表5可見，人源化抗體YHB1110-13和YHB1110-15的抗原結(jié)合親和力與小鼠單克隆抗體A9-11-5的相似(圖6)。
盡管已經(jīng)結(jié)合上述具體實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但必須意識到本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對發(fā)明進(jìn)行各種修飾和改變，這些同樣落在權(quán)利要求限定的發(fā)明范圍內(nèi)。



序列表<110>株式會社柳韓洋行<120>抗乙型肝炎病毒S-表面抗原的人源化抗體<130>PCA50314/YUH<150>KR10-2004-25573<151>2004-04-14<160>43<170>Kopatentln 1.71<210>1<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重鏈可變區(qū)的正向引物<400>1caccatggct gtcctgttcc tgctcctctg cctg34<210>2<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重鏈可變區(qū)的正向引物<400>2caggcctagt gaagccctca cagaccctgt ccctcacctg cacag45
<210>3<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重鏈可變區(qū)的反向引物<400>3taggcctggt ccgctctctt gcagctgcac ctg33<210>4<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重鏈可變區(qū)的正向引物<400>4gctgcagaca cagccgtgta ttattgtgcc ag 32<210>5<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重鏈可變區(qū)的反向引物<400>5tctgcagcag tcacactgga cagtttcagg aaaacttggc 40<210>6<211>39<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>重鏈可變區(qū)的正向引物<400>6cgtcgacacc tccaagaacc aattctcact gaaactgtc39<210>7<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重鏈可變區(qū)的反向引物<400>7tgtcgacgct gatggtcact ctggatatg 29<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重鏈可變區(qū)的正向引物<400>8ttctctttaa aactgtccag tg 22<210>9<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重鏈可變區(qū)的反向引物
<400>9ttttaaagag aattggttct tggaggtgtc cttgctgatg 40<210>10<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重鏈可變區(qū)的正向引物<400>10atctagagtg accatcagca aggacacctc caagaaccaa gtttcactga aa52<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重鏈可變區(qū)的反向引物<400>11ctctagatat gaaagctgca tt 22<210>12<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重鏈可變區(qū)的反向引物<400>12agagctcacg gtgaccgtgg tcccagcgcc cc 32
<210>13<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>輕鏈可變區(qū)的正向引物<400>13caccatggcc tggatttcac tgatcctctc tctcctg37<210>14<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>輕鏈可變區(qū)的正向引物<400>14ggtggtaccg tcacactcac ttgtc 25<210>15<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>輕鏈可變區(qū)的反向引物<400>15cggtaccgcc aggtgagacg gtgagtgaag gttcctg37<210>16<211>35<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>輕鏈可變區(qū)的正向引物<400>16ctggccaggc tcctagaact ctaatatatg atacc35<210>17<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>輕鏈可變區(qū)的反向引物<400>17ctggccaggt ttctgttgga accagttggc 30<210>18<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>輕鏈可變區(qū)的正向引物<400>18ggtgcacagc ctgaagatgc agaatattat tgtgc35<210>19<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>輕鏈可變區(qū)的反向引物
<400>19tgtgcaccga gtagggtgag ggcagccttg tttccgagca ggg43<210>20<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>輕鏈可變區(qū)的正向引物<400>20tcccgggtgt tcctgacaga ttctc25<210>21<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>輕鏈可變區(qū)的反向引物<400>21acccgggact cggttgttgg tatc 24<210>22<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>輕鏈可變區(qū)的反向引物<400>22cccaagctta gctcttcagt ggagggtgga aa32
<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重鏈可變區(qū)的正向引物<400>23gctgaaacag agcggaccag g 21<210>24<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重鏈可變區(qū)的反向引物<400>24gcctggtccg ctctgtttca gct23<210>25<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重鏈可變區(qū)的反向引物<400>25tgggcccttg gtggaggcag agctcacggt gacc34<210>26<211>33<212>DNA
<213>人工序列<22D>
<223>輕鏈可變區(qū)的正向引物<400>26caggctttca gaggtctaat aggtgatacc aac33<210>27<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>輕鏈可變區(qū)的反向引物<400>27tggtatcacc tattagacct ctgaaagcct gg 32<210>28<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>輕鏈可變區(qū)的正向引物<400>28gttccgggtg ttcctgccag attctcaggc tccctg 36<210>29<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>輕鏈可變區(qū)的反向引物
<400>29ggagcctgag aatctggcag gaacacc 27<210>30<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>輕鏈可變區(qū)的正向引物<400>30tcaggctccc tgattggaga caaggctg 28<210>31<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>輕鏈可變區(qū)的反向引物<400>31gagggcagcc ttgtctccaa tcaggga 27<210>32<211>342<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人源化重鏈的可變區(qū)HFW141<400>32caggtgcagc tgaaacagag cggaccaggc ctagtgaagc cctcacagac cctgtccctc 60
acctgcacag tctctggttt ctcattaagt acctatggtg tacagtgggt tcgccagcct120ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtg atatggagtg gtggaaacac agactataat180gcagctttca tatccagagt gaccatcagc aaggacacct ccaagaacca agtttcactg240aaactgtcca gtgtgactgc tgcagacaca gccgtgtatt attgtgccag agcacggtac300ttcgatgtct ggggcgctgg gaccacggtc accgtgagct ct 342<210>33<211>327<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人源化輕鏈的可變區(qū)LFW22-31<400>33caggctgttg tgactcagga accttcactc accgtctcac ctggtggtac cgtcacactc 60acttgtcgct caagtactgg ggctattaca actaataact ttgccaactg gttccaacag120aaacctggcc aggctttcag aggtctaata ggtgatacca acaaccgagt tccgggtgtt180cctgccagat tctcaggctc cctgctcgga aacaaggctg ccctcaccat cacaggtgca240cagcctgaag atgaggcaga atattattgt gctctatggt acaacaactg ggtgttcggt300ggaggaacca aactgactgt cctaggc327<210>34<211>327<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人源化輕鏈的可變區(qū)LFW22-312
<400>34caggctgttg tgactcagga accttcactc accgtctcac ctggtggtac cgtcacactc 60acttgtcgct caagtactgg ggctattaca actaataact ttgccaactg gttccaacag120aaacctggcc aggctttcag aggtctaata ggtgatacca acaaccgagt tccgggtgtt180cctgccagat tctcaggctc cctgattgga gacaaggctg ccctcaccat cacaggtgca240cagcctgaag atgaggcaga atattattgt gctctatggt acaacaactg ggtgttcggt300ggaggaacca aactgactgt cctaggc327<210>35<211>114<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化重鏈的可變區(qū)HFW141<400>35Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln1 5 10 15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr20 25 30Gly Val Gln Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu35 40 45Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile50 55 60Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu65 70 75 80Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95
Arg Ala Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val100 105 110Ser Ser<210>36<211>109<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化輕鏈的可變區(qū)LFW22-31<400>36Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly1 5 10 15Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Ile Thr Thr Asn20 25 30Asn Phe Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly35 40 45Leu Ile Gly Asp Thr Asn Asn Arg Val Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe50 55 60Ser Gly Ser Leu Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala65 70 75 80Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Asn Asn85 90 95Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly100 105<210>37<211>109<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>人源化輕鏈的可變區(qū)LFW22-312<400>37Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly1 5 10 15Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Ile Thr Thr Asn20 25 30Asn Phe Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly35 40 45Leu Ile Gly Asp Thr Asn Asn Arg Val Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe50 55 60Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala65 70 75 80Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Asn Asn85 90 95Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly100 105<210>38<211>5<212>PRT<213>人工序列<210>
<211>重鏈CDR1<400>38Thr Tyr Gly Val Gln1 5<210>39
<211>16<212>PRT<213>人工序列<210>
<211>重鏈CDR2<400>39Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser1 5 10 15<210>40<211>6<212>PRT<213>人工序列<210>
<211>重鏈CDR3<400>40Ala Arg Tyr Phe Asp Val1 5<210>41<211>14<212>PRT<213>人工序列<210>
<211>輕鏈CDR1<400>41Arg Ser Ser Thr Gly Ala Ile Thr Thr Asn Asn Phe Ala Asn1 5 10
<210>42<211>7<212>PRT<213>人工序列<210>
<211>輕鏈CDR2<400>42Asp Thr Asn Asn Arg Val Pro1 5<210>43<211>8<212>PRT<213>人工序列<210>
<211>輕鏈CDR3<400>43Ala Leu Trp Tyr Asn Asn Trp Val1 權(quán)利要求
1.抗乙型肝炎病毒(HBV)S-表面抗原的人源化抗體，其包含a)在互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)具有SEQ ID NO38至40的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；b)在CDR具有SEQ ID NO41至43的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；c)與人抗體重鏈恒定區(qū)相一致的重鏈恒定區(qū)；以及d)與人抗體輕鏈恒定區(qū)相一致的輕鏈恒定區(qū)。
2.權(quán)利要求1的人源化抗體，其中重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)中除CDR以外的框架區(qū)被人抗體的重鏈區(qū)或輕鏈區(qū)替換。
3.權(quán)利要求1的人源化抗體，其抗原結(jié)合親和力(Ka)在從6×107至5×108M-1范圍。
4.權(quán)利要求1的人源化抗體，其中重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO35的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求4的人源化抗體，其中重鏈可變區(qū)由具有SEQ ID NO32的核苷酸序列的多核苷酸所編碼。
6.權(quán)利要求1的人源化抗體，其中輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO36或37的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求6的人源化抗體，其中輕鏈可變區(qū)由具有SEQ ID NO33或34的核苷酸序列的多核苷酸所編碼。
8.乙型肝炎病毒S-表面抗原特異性人源化抗體的重鏈可變區(qū)的表達(dá)載體，其包含編碼SEQ ID NO35的重鏈可變區(qū)的多核苷酸。
9.權(quán)利要求8的表達(dá)載體，其是pHAB-HFW141 HF。
10.乙型肝炎病毒S-表面抗原特異性人源化抗體的輕鏈可變區(qū)的表達(dá)載體，其包含編碼SEQ ID NO36或37的輕鏈可變區(qū)的多核苷酸。
11.權(quán)利要求10的表達(dá)載體，其是pHAB-LFW22-31 LF或pHAB-LFW22-312 LF。
12.用權(quán)利要求8或權(quán)利要求10的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞。
13.權(quán)利要求12的大腸桿菌細(xì)胞，其是TOP10F’/pHAB-HFW141 HF(登記號KCTC10533 BP)、TOP10F’/pHAB-LFW22-31 LF(登記號KCTC 10532 BP)、或TOP10F’/pHAB-LFW22-312 LF(登記號KCTC 10553 BP)。
14.包含權(quán)利要求1到7中任一項的人源化抗體用于治療乙型肝炎病毒相關(guān)疾病的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明的人源化抗體表現(xiàn)出對小鼠單克隆抗體相似的抗原結(jié)合親和力和顯著的低免疫原性。因此，本發(fā)明的人源化抗體能夠有效用來治療慢性乙型肝炎和預(yù)防接受肝臟移植患者的HBV感染以及從感染有HBV的母親向嬰兒的垂直傳播。
文檔編號A61P31/20GK1980956SQ200580011182
公開日2007年6月13日 申請日期2005年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月14日
發(fā)明者姜熙日, 李秉圭, 樸世哲, 宋戊泳, 柳泰亨, 李載善, 金昶碩, 樸相久, 羅康仁 申請人:株式會社柳韓洋行