本申請對2015年4月28日提出于韓國專利局的韓國專利申請第10-2015-0059648號主張優(yōu)先權(quán)，上述申請的公開內(nèi)容作為參照插入于本說明書。

本發(fā)明涉及具有抗肥胖及抗糖尿病功效的肽及其的用途。

背景技術(shù)：

目前，韓國因經(jīng)濟發(fā)展和飲食生活的西方化，從食物中攝取的脂肪量增加，且因運動不足等原因，而呈現(xiàn)如肥胖、糖尿病、高血脂癥、高血壓、動脈硬化癥及脂肪肝等的代謝性疾病增加的趨勢。并且，肥胖不僅對喜歡消瘦體型的美麗面貌年輕人產(chǎn)生消極影響，而且，因肥胖的持續(xù)，而會患上多種疾病。

目前，治療肥胖的治療劑可大體分為作用于中樞神經(jīng)來對食欲產(chǎn)生影響的藥劑和作用于胃腸管來阻礙吸收的藥物。根據(jù)各個藥物的機制，在市場銷售的作用于中樞神經(jīng)的藥物為抑制5-羥色胺(5-HT)神經(jīng)系統(tǒng)的氟苯丙胺、右芬氟拉明等藥物、通過去甲腎上腺素神經(jīng)系統(tǒng)的麻黃素及咖啡因等藥物及最近的同時作用于5-羥色胺及去甲腎上腺素神經(jīng)系統(tǒng)來抑制肥胖的西布曲明等藥物。此外，作為作用于胃/腸管來抑制肥胖的藥物的代表藥物為作為通過抑制腸管脂肪酶來減少脂肪的吸收的肥胖治療劑授權(quán)的奧利斯特等。但是，在以往使用的藥物中，氟苯丙胺等藥物因存在引起原發(fā)性肺動脈高壓或心臟瓣膜病等副作用，由此最近禁止使用，其他藥物也會引起降壓或乳酸酸中毒等問題，從而存在無法對心力衰竭、腎臟疾病等患者使用的問題。

糖尿病為胰島素的分泌量不足或無法進行正常功能等而導致的代謝性疾病的一種(DeFronzo，1988)，糖尿病的特征為使血液中的葡萄糖的濃度增加的高血糖，是因高血糖，會導致多種癥狀及征兆并從小便中排出葡萄糖的疾病。最近，因肥胖率，尤其，因腹部肥胖的增加，存在糖尿的發(fā)生率急劇增加的趨勢。

在2000年，全世界糖尿病患者的數(shù)量為1億7千萬名，在2030年，糖尿病患者會增加至3億7千萬名，但是，根據(jù)最近的分析，報告中指出，在2008年，全世界糖尿病患者早已達到3億5千萬(Danaei et al..2011)，從而糖尿病擴展比預期更嚴重。據(jù)報告相對于二型糖尿患者的約80％以上為肥胖，肥胖患者中小于10％的患者為糖尿病患者(Harris et al..1987)。上述糖尿病和肥胖的相關(guān)性因脂肪素(adipokine)和游離脂肪酸(free fatty acid)的不規(guī)則分泌，脂肪酸堆積在β-細胞或腎臟、肝臟、心臟等胰島素敏感性組織內(nèi)，由此呈現(xiàn)出脂肪毒性(lipotoxicity)。若未對慢性高血糖狀態(tài)進行適當?shù)闹委?，則會伴隨身體的多種病狀，為了預防具有代表性的性視網(wǎng)膜病、腎功能衰竭、神經(jīng)病、因血管障礙所引起的并發(fā)癥，得必須進行有效地血糖管理。

目前，作為調(diào)整血糖的方法使用生活習慣固定(飲食療法、運動療法)及藥物療法等。但是，飲食療法或運動療法很難進行嚴格的管理及實施，且其效果也存在局限。因此，大部分糖尿患者校正生活習慣，并依賴于胰島素、胰島素分泌促進劑、胰島素敏感性改善劑及降血糖劑等藥物的血糖調(diào)整效果。

通過重組方法生產(chǎn)的胰島素對一型糖尿病患者及無法調(diào)整血糖的二型患者必要的藥物，上述藥物有利于調(diào)整血糖，但是存在對針的反感、給藥方法的難度、低血糖危險及體重增加等缺點。

作為胰島素分泌促進劑的一種的氯茴苯酸類作為藥效極快的制劑，在飯前服用，胰島素分泌促進劑具有諾和龍(瑞格列奈)、Fastic(那格列奈)、Glufast(米格列奈)等。但當單獨服用胰島素敏感性改善劑時，特征在于幾乎沒有低血糖，胰島素敏感性改善劑有作為雙胍(biguanide)類藥物的甲福明二甲雙胍(metformin)和噻唑烷二酮(thiazolidinedione)類的Avaneda(羅西格列酮)、Actoc(匹格列酮)。

作為最近開發(fā)的藥物有利用作為促進胰島素分泌的及激素的胰高血糖素樣肽-1(Glucagon-like peptide-1)的作用來開發(fā)的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)激動劑(agonist)，胰高血糖素樣肽-1激動劑為降糖藥(exenatide)和利拉魯肽(liraglutide)。并且，抑制作為使胰高血糖素樣肽-1惰性的酶的二肽基肽酶-4(DPP-4，Dipeptidyl peptidase-4)的作用的二肽基肽酶-4抑制劑(Inhibitor)也是在最近開發(fā)的新藥，且代表產(chǎn)品為Januvia(成分名：西他列汀(sitagliptin))。但是，上述藥劑具有肝毒性、胃腸障礙、心血管類疾病及致癌性等副作用，且每年治療費用也極高，從而很難通過上述二肽基肽酶-4抑制劑治療糖尿病。實際上，以2007年為基準，糖尿病前期(pre-diabetes)及糖尿病相關(guān)費用僅在美國就接近約200億萬元(Dall et al.,2010)，以2008年為基準，肥胖相關(guān)費用僅在美國也接近150億萬元(Finkelstein et al.,2009)。因此，需要開發(fā)可通過減少體重并有效降低血糖來同時治療糖尿病及肥胖性糖尿病且副作用少的藥劑。

首先，為了找出用于治療肥胖的進一步改善的方法，在最近注重了調(diào)整能量代謝的方法，在這方序列的化合物得具有更高穩(wěn)定性(低毒性)的前提下，當人攝取高脂肪飲食時，對堆積成脂肪的信號和對脂肪堆積產(chǎn)生影響的蛋白質(zhì)進行了研究，抑制上述脂肪堆積的蛋白質(zhì)的表達，通過用于分解已堆積的脂肪的信號研究及相關(guān)蛋白質(zhì)的研究來進行了促進脂肪分解的研究并開發(fā)了肽。并且，本發(fā)明的肽對因糖尿病及肥胖而引起的糖尿病產(chǎn)生卓越的功效。因高脂肪飲食而引發(fā)的脂肪堆積、抑制因肝臟或肌肉等的脂肪堆積而呈現(xiàn)的胰島素的信號、由此引發(fā)的胰島素的耐性成為引發(fā)糖尿病的原因，本發(fā)明的各個肽及復合體對上述糖尿病及肥胖性糖尿病治療產(chǎn)生效果。

本說明書全文中，參照了多篇論文及專利文獻，并表示了其引用。所引用的論文及專利文獻的公開內(nèi)容全部插入于本說明書作為參照，從而更加明確說明本發(fā)明所屬的技術(shù)領(lǐng)域的水平及本發(fā)明的內(nèi)容。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

要解決的問題

本發(fā)明人努力開發(fā)具有生物學上有效的活性的多個優(yōu)秀肽的結(jié)果，查明了具有序列表的序列1至序列表的序列7的氨基酸序列的肽抑制因高脂肪飲食而引起的脂肪堆積，分解已堆積的脂肪來呈現(xiàn)抗肥胖效果，而且，還對糖尿病、肥胖性糖尿病或糖尿病并發(fā)癥具有優(yōu)秀的效果，由此完成了本發(fā)明。

因此，本發(fā)明的目的在于，提供由序列表的序列1至序列表的序列7所記載的氨基酸序列形成的肽。

本發(fā)明的再一目的在于，提供具有抗肥胖或抗糖尿病活性的肽。

本發(fā)明的另一目的在于，提供具有抗肥胖或抗糖尿病活性的肽復合體。

本發(fā)明的還一目的在于，提供肥胖的預防或治療用藥劑組合物。

本發(fā)明的又一目的在于，提供糖尿的預防或治療用藥劑組合物。

本發(fā)明的其他目的及優(yōu)點通過以下發(fā)明的詳細說明、以上發(fā)明要求保護范圍及以下附圖變得更加明確。

解決問題的方案

根據(jù)本發(fā)明的一實施方式，本發(fā)明提供由選自由序列表的序列1至序列表的序列7中所記載的氨基酸序列組成的組中的一種氨基酸序列形成的肽。

根據(jù)本發(fā)明的再一實施方式，本發(fā)明提供由選自由序列表的序列1至序列表的序列7的氨基酸序列組成的組中的一種氨基酸序列形成的具有抗肥胖或抗糖尿病活性的肽。

根據(jù)本發(fā)明的再一實施方式，本發(fā)明提供具有抗肥胖或抗糖尿病活性的肽復合體，上述具有抗肥胖或抗糖尿病活性的肽復合體包含：(a)由序列表的序列1形成的肽；(b)由序列表的序列2或序列表的序列3形成的肽：以及(c)由序列表的序列6或序列表的序列7形成的肽。

本發(fā)明人努力開發(fā)具有生物學有效活性的多個優(yōu)秀肽，結(jié)果，查明了具有序列表的序列1至序列表的序列7的氨基酸序列的肽抑制因高脂肪飲食而引起的脂肪堆積，分解已堆積的脂肪來呈現(xiàn)抗肥胖效果，而且，還對糖尿病、肥胖性糖尿病或糖尿病并發(fā)癥具有優(yōu)秀的效果。

在本說明書中，術(shù)語“肽”是指通過肽鍵來由多個氨基酸殘基互相結(jié)合而成的線性分子。本發(fā)明的肽可通過本領(lǐng)域中公知的化學合成方法，例如，固相合成技術(shù)(solid-phase synthesis techniques:Merrifield,J.Amer.Chem.Soc.85:2149-54(1963)；Stewart,et al.,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd.ed.,Pierce Chem.Co.:Rockford,111(1984))或液相合成技術(shù)(美國登錄專利第5，516，891號)來制備而成。

本發(fā)明的肽選擇氨基酸序列的一部分部位并為了增加其活性而可在N-末端或C-末端誘導變形。通過上述變形，本發(fā)明的肽可具有提高向人體內(nèi)給藥時的半衰期的更高的半衰期。

根據(jù)本發(fā)明的一實例，肽的N-末端或C-末端可變形為羥基(-OH)、氨基(-NH₂)、疊氮化物(-NHNH₂)等。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，上述肽的N-末端結(jié)合有保護基，上述保護基選自包含乙?；?、芴甲氧羰基、甲?；⒆貦磅；⑷舛罐⒒?、硬脂?；熬垡叶?PEG，polyethylene glycol)的組。

上述氨基酸的變形起到大大改善本發(fā)明的肽的穩(wěn)定性的作用。在本發(fā)明中提及的術(shù)語“穩(wěn)定性”不僅是指“體內(nèi)”穩(wěn)定性，還指儲存穩(wěn)定性(例如，常溫儲存穩(wěn)定性)。上述保護基起到從生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)切割酶的攻擊保護本發(fā)明的肽的作用。

根據(jù)本發(fā)明的一實例，本發(fā)明的肽呈現(xiàn)出抑制因高脂肪飲食而引起的脂肪堆積，并分解已堆積的脂肪的效果，減少作為脂質(zhì)生成標記因子的過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)及脂肪特異性脂肪酸結(jié)合蛋白(aP2)的表達，并增加作為脂肪分解因子的磷酸激素敏感性脂肪酶(pHSL)、腺苷酸活化蛋白激酶α1(AMPK-α1)、比較基因鑒定-58(CGI-58)及脂肪甘油三酯脂酶(ATGL)的表達，且減少脂肪細胞的大小及血液中膽固醇數(shù)值。并且，本發(fā)明的肽有效減少血糖。上述結(jié)果意味著本發(fā)明的肽對肥胖、糖尿病及肥胖性糖尿病治療具有極為優(yōu)秀的功效。

在本發(fā)明的肽中，不僅是以序列表的序列1至序列表的序列7的氨基酸序列表示的各個肽呈現(xiàn)出優(yōu)秀的抗肥胖及抗糖尿病活性，而且這些的復合體也呈現(xiàn)出優(yōu)秀的抗肥胖及抗糖尿病活性。

根據(jù)本發(fā)明，由序列表的序列3、序列表的序列5及序列表的序列7形成的肽分別為由以序列表的序列2、序列表的序列4及序列表的序列6形成的肽的Cys被置換成Ser的肽，上述兩個肽的抗肥胖及抗糖尿病活性幾乎相同。

根據(jù)本發(fā)明的一實例，本發(fā)明的具有抗肥胖或抗糖尿病活性的肽復合體由肽的組合形成，上述肽組合包含由序列表的序列1形成的肽、由序列表的序列2或序列表的序列3形成的肽及由序列表的序列6或序列表的序列7形成的肽。

根據(jù)本發(fā)明的另一實例，本發(fā)明的肽復合體由序列表的序列1、序列表的序列3及序列表的序列7的組合形成。

根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式，本發(fā)明提供包含肽或肽復合體作為有效成分的肥胖的預防或治療用藥劑組合物。

本發(fā)明的肽或肽復合體抑制脂肪生成，分解脂質(zhì)的功能卓越，因此可用于肥胖的預防或治療。

根據(jù)本發(fā)明的又一實施方式，本發(fā)明提供包含肽或肽復合體作為有效成分的糖尿的預防或治療用藥劑組合物。

本發(fā)明的肽或肽復合體呈現(xiàn)出在糖尿病動物模型中有效減少增加的血糖的功效，從而可用于糖尿的預防或治療。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，本發(fā)明的組合物為(a)上述本發(fā)明的肽或肽復合體的藥劑學有效劑量；以及(b)包含在藥劑學上接受的載體的藥劑組合物。

在本說明書中使用的術(shù)語“藥劑學有效量”是指達成與上述的白細胞介素-3有關(guān)的肽的功效或活性的充分量。

包含于本發(fā)明的藥劑學組合物的藥劑學上接受的載體作為制劑時通常利用的載體，包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂及礦物油等，但不局限于此。本發(fā)明的藥劑學組合物除了上述成分之外，還可包含潤滑劑、潤濕劑、甜味劑、調(diào)味劑、乳化劑、懸浮劑、保鮮劑等。適當?shù)乃巹W上接受的載體及制劑詳細地記載于Remington’Pharmaceutical Sciences(19th ed.，1995)。

本發(fā)明的藥劑學組合物可進行口服用藥或非口服用藥，并且，在非口服用藥的情況下，可通過靜脈內(nèi)注射、皮下注射、肌肉注射、口腔注射、局部用藥、經(jīng)皮用藥等來用藥。

本發(fā)明的藥劑學組合物的適當用藥量可根據(jù)制劑化方法、用藥方式、患者的年齡、體重、性別、病況、食物、用藥時間、用藥路徑、排泄速度及反應(yīng)感應(yīng)性來以多種方式給予處方。另一方面，本發(fā)明的藥劑學組合物的優(yōu)選的用藥量為每日0.0001-1000μg。

本發(fā)明的藥劑學的組合物是根據(jù)本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員容易實施的方法，利用藥劑學上容許的擔體和/或賦形劑進行制劑化，從而制備成單位容量形態(tài)或者放入大容量容器內(nèi)而進行制備。此時，劑型可以是油或者水性媒質(zhì)中的溶液、懸浮液或者乳化劑形態(tài)，或者也可以是提取物、粉末劑、顆粒劑、片劑、膠囊或者膠狀(例如，水凝膠)形態(tài)，并且可以額外包含分散劑或者穩(wěn)定劑。

發(fā)明的效果

概述歸納本發(fā)明的特征及優(yōu)點如下：

(i)本發(fā)明的肽及肽復合體抑制脂肪堆積，并分解已堆積的脂肪來呈現(xiàn)抗肥胖效果，而且，有效減少血糖，從而對糖尿病呈現(xiàn)優(yōu)秀的效果。

(ⅱ)本發(fā)明的肽及肽復合體減少作為脂質(zhì)生成標記因子的過氧化物酶體增殖物激活受體γ、乙酰輔酶A羧化酶及脂肪特異性脂肪酸結(jié)合蛋白的表達，并增加作為脂肪分解因子的磷酸激素敏感性脂肪酶、腺苷酸活化蛋白激酶α1、比較基因鑒定-58及脂肪甘油三酯脂酶的表達，且減少脂肪細胞的大小及血液中膽固醇數(shù)值。

(ⅲ)本發(fā)明的肽及肽復合體的優(yōu)秀活性及穩(wěn)定性可有效適用于醫(yī)藥及醫(yī)藥外品。

附圖說明

圖1a、圖1b及圖1c為通過油紅O(Oil red O)染色確認當對本發(fā)明的肽進行處理時堆積的脂肪的結(jié)果。(圖1a)序列表的序列1的肽，(圖1b)序列表的序列3的肽，(圖1c)(序列表的序列5的肽)。

圖2為為了確認當按濃度對本發(fā)明的肽復合體進行處理時堆積的脂肪而通過油紅O染色確認的結(jié)果。

圖3a、圖3b及圖3c為當對本發(fā)明的肽進行處理時測定作為參與脂肪生成的基因的脂肪特異性脂肪酸結(jié)合蛋白2的表達量的結(jié)果。(圖3a)序列表的序列1肽，(圖3b)序列表的序列3的肽，(圖3c)，序列表的序列5的肽。

圖4為當按濃度對本發(fā)明的肽復合體進行處理時，當合成脂質(zhì)時測定作為重要基因的過氧化物酶體增殖物激活受體γ、乙酰輔酶A羧化酶、脂肪特異性脂肪酸結(jié)合蛋白2基因的表達量的結(jié)果。

圖5為當按濃度對本發(fā)明的肽復合體進行處理時，當合成脂質(zhì)時測定作為重要蛋白質(zhì)的過氧化物酶體增殖物激活受體γ、磷酸激素敏感性脂肪酶(phospho-HSL)蛋白質(zhì)的表達量的結(jié)果。

圖6a、圖6b、圖6c及圖6d為測定當對本發(fā)明的肽及肽復合體進行處理時參與分解所堆積的脂肪的過程的作為基因的腺苷酸活化蛋白激酶α1和比較堅定基因-58的表達量的結(jié)果。(圖6a)序列表的序列1的肽，(圖6b)序列表的序列3的肽，(圖6c)序列表的序列5的肽，(圖6d)通過序列表的序列1、序列表的序列3及序列表的序列7的氨基酸序列表示的肽復合體。

圖7為測定當按濃度對本發(fā)明的肽復合體進行處理時，作為參與分解所堆積脂肪的過程的蛋白質(zhì)的脂肪甘油三酯脂酶的表達量的結(jié)果。

圖8a、圖8b、圖8c及圖8d為利用免疫染色測定當對本發(fā)明的肽進行處理時，利用作為參與分解所堆積脂肪的過程的蛋白質(zhì)的磷酸激素敏感性脂肪酶的表達量的結(jié)果。(圖8a)序列表的序列1的肽，(圖8b)序列表的序列3的肽，(圖8c)序列表的序列5的肽，(圖8d)通過序列表的序列1、序列表的序列3及序列表的序列7的氨基酸序列表示的肽復合體。

圖9為測定當按濃度對本發(fā)明的肽復合體進行處理時甘油的生成量的結(jié)果。

圖10a為測定在肥胖小鼠實驗模型中，按濃度對本發(fā)明的肽復合體進行處理后所分解的脂肪組織的結(jié)果。圖10b為測定肥胖小鼠實驗模型中，對本發(fā)明的肽復合體進行處理后所分解的脂肪組織的大小及數(shù)值的結(jié)果。

圖11為利用免疫染色測定當對本發(fā)明的肽復合體進行處理時，作為參與分解所堆積脂肪的過程的蛋白質(zhì)的磷酸激素敏感性脂肪酶的表達量的結(jié)果。

圖12為測定當對本發(fā)明的肽復合體進行處理時在肥胖小鼠中體重的變化(a)及試料攝取變化(b)的結(jié)果。

圖13為測定當對本發(fā)明的肽復合體進行處理時肥胖小鼠的形狀的結(jié)果。

圖14為使作為實驗動物模型的C57BL/6小鼠模型攝取油膩飼料來制作肥胖小鼠模型，并對本發(fā)明的肽復合體進行處理后，通過微計算機斷層掃描技術(shù)拍攝測定脂肪分布的結(jié)果。

圖15為使作為實驗動物模型的C57BL/6小鼠模型攝取油膩飼料來制作肥胖小鼠模型，并對本發(fā)明的肽復合體進行處理之后，采集脂肪細胞組織來觀察的結(jié)果。

圖16a為使作為實驗動物模型的C57BL/6小鼠模型攝取油膩飼料來制作肥胖小鼠模型，并對本發(fā)明的肽復合體進行處理之后，采集脂肪細胞組織來觀察脂肪細胞形狀的結(jié)果。圖16b為使作為實驗動物模型的C57BL/6小鼠模型攝取油膩試料來形成肥胖小鼠模型，并對本發(fā)明的肽復合體進行處理之后，采集脂肪細胞組織來觀察脂肪細胞大小的結(jié)果。

圖17為使作為實驗動物模型的C57BL/6小鼠模型攝取油膩飼料來制作肥胖小鼠模型，并對本發(fā)明的肽復合體進行處理之后，采集脂肪細胞組織來觀察作為作用于脂肪細胞內(nèi)的脂肪分解的蛋白質(zhì)的磷酸激素敏感性脂肪酶的表達量的結(jié)果。

圖18為使作為實驗動物模型的C57BL/6小鼠模型攝取油膩飼料來制作肥胖小鼠模型，并對本發(fā)明的肽復合體進行處理之后，采集血液來測定膽固醇量的結(jié)果。

圖19為使作為實驗動物模型的C57BL/6小鼠模型攝取油膩飼料來制作肥胖小鼠模型，并對本發(fā)明的肽復合體進行處理之后，采取血液來測定血糖的結(jié)果。

圖20a、圖20b為在誘發(fā)糖尿病的DBDB小鼠模型中，對本發(fā)明的肽復合體進行處理之后，采集血液來測定血糖的變化的結(jié)果。

圖21為在誘發(fā)糖尿病的DBDB小鼠模型中，對本發(fā)明的肽復合體進行處理之后，采集血液來測定膽固醇的變化的結(jié)果。

圖22a、圖22b、圖22c為在引發(fā)糖尿病的DBDB小鼠模型中，對本發(fā)明的肽復合體進行處理之后，采集血液來測定血糖的變化的結(jié)果。(圖22a)序列表的序列1的肽，(圖22b)序列表的序列3的肽，(圖22c)序列表的序列5的肽。

圖23為當對本發(fā)明的序列表的序列7的肽進行處理時，測定胰島素樣生長因子1(IGF-1)和胰島素的表達量的結(jié)果。

圖24為在誘發(fā)糖尿病的DBDB小鼠模型中，對本發(fā)明的序列表的序列7的肽進行處理之后，采集血液來測定血糖的變化的結(jié)果。

圖25a、圖25b、圖25c、圖25d為在血糖高的糖尿病患者中，對本發(fā)明的肽復合體進行處理之后，采集血液來測定血糖的變化的結(jié)果。

具體實施方式

以下，通過實施例對本發(fā)明進行更為詳細的說明。這些實施例僅用于更加具體地說明本發(fā)明，本發(fā)明的范圍并不根據(jù)本發(fā)明的要旨而受這些實施例的限制，這對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。

實施例

合成例1:肽合成

將700mg的氯三苯甲基氯樹脂(Chloro trityl chloride resin；CTL resin，Nova biochem Cat No.01-64-0021)放入反應(yīng)容器，并添加10ml的亞甲基氯(MC，methylene chloride)來攪拌3分鐘。除去溶液，并放入10ml的二甲基甲酰胺(D MF，Dimethyl Formamide)來攪拌3分鐘之后，再次除去溶劑。向反應(yīng)器放入10ml的二氯甲烷(DCM，Dichloromethane)溶液，并放入200mmole的芴甲氧羰基-Fmoc-Asn(Trt)-OH)(巴亨公司(Bachem)，瑞士(Swiss))及400mmole的N，N-二異丙基乙胺(DIEA，N，N-Diisopropylethylamine)之后進行攪拌使它們均勻溶解，再攪拌1小時并進行反應(yīng)。反應(yīng)后進行清洗，將甲醇和DIEA(2:1)溶解在DCM進行10分鐘反應(yīng)，并用過量的DCM/DMF(1:1)進行清洗。除去溶液，并放入10ml的DMF攪拌3分鐘之后，再次除去溶劑。將10ml的脫保護溶液(20％的哌啶(Piperidine)/DMF)放入反應(yīng)容器，在常溫下攪拌10分鐘之后除去溶液。放入相同量的脫保護溶液，再維持10分鐘的反應(yīng)之后去除溶液，并分別隔3分鐘用DMF清洗2次，用MC清洗1次，并用DMF清洗1次，來制備了Arg(pbf)-氯三苯甲基氯樹脂(Asn-CTL Resin)。向新的反應(yīng)器放入10ml的DMF溶液，并放入200mmole的芴甲氧羰基-γ-三苯甲基-L-谷氨酰胺(Fmoc-Arg(Pbf)-OH)(Bachem，Swiss)、200mmole的羥基苯并三唑(HoBt)及200mmole的苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸鹽(Bop)之后進行攪拌來使它們均勻溶解。以分餾的方式向反應(yīng)器分兩次放入400mmole的N，N-二異丙基乙胺(DIEA，N，N-Diisopropylethylamine)2次之后，最小限度地攪拌5分鐘，直到所有固體溶解為止。將溶解的氨基酸混合溶液放入有脫保護的樹脂的反應(yīng)容器，并在常溫下攪拌1小時并進行反應(yīng)。除去反應(yīng)液，用DMF溶液隔5分鐘攪拌3次之后進行除去。取出少量的反應(yīng)樹脂，并利用茚三酮試驗(Nihydrin test)檢查反應(yīng)程度。與上述方法相同地，用脫保護溶液進行2次脫保護反應(yīng)，來制備了Arg-Asn-CTL樹脂。用DMF和MC充分清洗，再次執(zhí)行一次茚三酮試驗之后，與上述方法相同地，執(zhí)行了以下的氨基酸附著實驗。通過選定的氨基酸序列，以Fmoc-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH及Fmoc-Leu-OH順序進行了鏈式反應(yīng)。用脫保護溶液使Fmoc-保護基隔10分鐘反應(yīng)2次之后，通過均勻清洗來進行除去。放入乙酸酐和DIEA、羥基苯并三唑(HoBt，Hydroxybenzotriazole)執(zhí)行1小時乙?；?，用DMF、MC及甲醇分別將制成的肽基樹脂清洗3次，慢慢將氮空氣流出來進行干燥之后，在五氧化二磷(P₂O₅，Phosphorus pentoxide)條件下用真空進行減壓，等完全干燥之后，放入30ml的泄漏溶液[三氟乙酸(TFA，Trifluroacetic acid)81.5％、蒸餾水5％、茴香硫醚(Thioanisole)5％,苯酚(Phenol)5％,EDT 2.5％及TIS 1％]之后，在常溫下偶爾搖晃，并維持2小時反應(yīng)。對樹脂進行過濾，并用少量的溶液清洗樹脂之后將其與母液合起來。利用減壓來蒸餾，使得整體容積剩一半左右，并添加50ml的涼的醚誘導沉淀之后，進行離心分離來收集沉淀，并用更涼的醚清洗2次。除去母液，并在氮條件下充分干燥，提純之前合成了0.85g的NH₂-Leu-Lys-Thr-Arg-Asn-COOH肽1(收率：92％)。由序列2及序列3合成了0.78g的NH₂-Lys-Gly-Ala-Cys(Ser)-Thr-Gly-Trp-Met-Ala-COOH(收率：82％)，序列4及序列5合成了0.92g的NH₂-Ala-Cys(Ser)Thr-Leu-Pro-His-Pro-Trp-Phe-Cys(Ser)-COOH(收率：85％)。由序列6及序列7合成了0.76g的NH₂-Cys(Ser)-Asp-Leu-Arg-Arg-Leu-Glu-Met-Tyr-Cys(Ser)-COOH(收率：88％)。利用分子量測定器進行測定時，序列1的肽的分子量為630.7(理論值：630.7)，序列2的分子量為924.5(理論值：924.1)，序列4的分子量為1263(理論值：1236.5)，序列6肽的分子量為1301.5(理論值1301.5)。

表1

另一方面，混合相同量的序列表的序列1、序列表的序列3及序列表的序列7的肽來形成肽復合體，并對復合體的功效進行了評價。

實施例1：評價脂質(zhì)生成抑制活性

1-1.利用前脂肪細胞的脂質(zhì)堆積抑制(油紅O染色(Oil red O staining)

將作為前脂肪細胞(pre-adipocyte)的3T3-L1細胞培養(yǎng)至匯合(Confluent)狀態(tài)之后，交換成包含10μg/ml胰島素、0.1μM地塞米松及0.5μM的1-甲基-3-異丁基黃嘌呤(IBMX)的分化培養(yǎng)基以及按濃度對肽進行處理并培養(yǎng)2天，在之后每2天交換了包含10μg/ml胰島素的培養(yǎng)基，在分化誘導10日之后，為了確認細胞內(nèi)小滴(droplet)而實施油紅O染色。通過磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗準備的3T3-L1前脂肪細胞之后，利用3.7％的福爾馬林固定1小時，利用60％的異丙醇進行洗滌之后，對油紅O溶液進行處理并在室溫中染色了20分鐘。染色之后，去除油紅O溶液，用蒸餾水進行三次洗滌之后，利用相差顯微鏡觀察了被染色的細胞。并且，為了定量分析，利用100％的異丙醇提取脂肪之后，向96孔板每次移動200μl，并通過酶聯(lián)免疫檢測儀在500nm中測定了吸光度。

實驗結(jié)果，當對序列表的序列1、序列3及序列5的肽進行處理時，可通過染色油紅O確認細胞內(nèi)脂肪堆積程度的減少(圖1a-圖1c)。

并且，當按濃度對序列表的序列1、序列3及序列7的肽復合體進行處理時，可確定細胞內(nèi)脂肪堆積程度的減少(圖2)。

1-2.參與脂質(zhì)生成的基因的表達抑制

按3×10⁵細胞/孔的細胞密度，在6孔板種植了3T3-L1(前脂肪細胞)。培養(yǎng)24小時之后，按濃度(0.1、1、10μg/ml)對肽進行處理，并在37℃的培養(yǎng)基中培養(yǎng)了14天。在回收結(jié)束培養(yǎng)的細胞之后，對核糖核酸(RNA)提取溶液(Easy Blue，內(nèi)含子(Intron))進行處理來準備核糖核酸之后，使用RT預混合液(內(nèi)含子)合成了互補脫氧核糖核酸(cDNA)。使用對于各個標記因子(過氧化物酶體增殖物激活受體γ、乙酰輔酶A羧化酶、脂肪特異性脂肪酸結(jié)合蛋白2)的引物和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)預混合液(內(nèi)含子)進行了聚合酶鏈反應(yīng)。

用于脂質(zhì)生成指標因子聚合酶鏈式反應(yīng)的靶-特異性引物序列如下：過氧化物酶體增殖物激活受體γ正向引物序列，5’-TTTTCAAGGGTGCCAGTTTC-3’及過氧化物酶體增殖物激活受體γ逆向引物，5’-AATCCTTGGCCCTCTGAGAT-3’(退火溫度，60℃)；乙酰輔酶A羧化酶正向引物序列，5’-ACCTTACTGCCATCCCATGTGCTA-3’及ACC逆向引物，5’-GTGCCTGATGATCGCACGAACAAA-3’(退火溫度，60℃)；脂肪特異性脂肪酸結(jié)合蛋白2正向引物序列，5’-CATCAGCGTAAATGGGGATT-3’及脂肪特異性脂肪酸結(jié)合蛋白2逆向引物，5’-ACACATTCCACCACCAGCTT-3’(退火溫度，60℃)。

向1％的瓊脂糖凝膠每次裝載5μl的聚合酶鏈式反應(yīng)產(chǎn)物并進行電泳之后，在Gel-Doc中確認了條帶。

在小鼠骨細胞株3T3-L1中，對序列表的序列1、序列3或序列5的肽進行處理并培養(yǎng)3天，結(jié)果，可觀察作為脂質(zhì)生成標記因子的脂肪特異性脂肪酸結(jié)合蛋白2的表達減少(圖3a-圖3c)。

在小鼠骨細胞株3T3-L1中，以0.1μg/ml、1μg/ml及10μg/ml的濃度對序列表的序列1、序列表的序列3及序列表的序列7的肽復合體進行處理并培養(yǎng)3天，結(jié)果，可觀察作為脂質(zhì)生成標記因子的過氧化物酶體增殖物激活受體γ、乙酰輔酶A羧化酶、脂肪特異性脂肪酸結(jié)合蛋白2的表達均在作為陽性對照組100ng/ml的腫瘤壞死因子-α(TNFα)處理組和肽復合體處理組中減少(圖4)。

1-3.利用前脂肪細胞的脂質(zhì)生成及分解誘導蛋白質(zhì)表達觀察

按3×10⁵細胞/孔的細胞密度，在6孔板種植了3T3-L1(前脂肪細胞)。培養(yǎng)24小時之后，按濃度(0.1μg/ml、1μg/ml及10μg/ml)對肽復合體進行處理，并在37℃培養(yǎng)基中培養(yǎng)了14天。通過處理細胞溶解緩沖液來確保溶解物之后，進行蛋白質(zhì)的定量，利用作為脂肪生成因子的抗過氧化物酶體增殖物激活受體γ抗體(Santa Cruz Biotechnology，USA)和作為脂肪分解因子的抗磷酸激素敏感性脂肪酶抗體(Santa Cruz Biotechnology，USA)進行了免疫印跡分析。

當作為脂肪生成標記的過氧化物酶體增殖物激活受體γ蛋白質(zhì)的表達按濃度對肽復合體進行處理時，可觀察肽復合體以濃度依賴性地均減少，當觀察作為脂肪分解標記的磷酸激素敏感性脂肪酶蛋白質(zhì)的表達量時，可觀察在肽復合體處理組中，肽復合體均增加(圖5)。

實施例2：脂質(zhì)分解活性評價

2-1.參與脂質(zhì)分解的基因的表達增加

按3×10⁵細胞/孔的細胞密度，在6孔板種植了3T3-L1(前脂肪細胞)。培養(yǎng)24小時之后，按濃度(0.1μg/ml、1μg/ml及10μg/ml)對肽進行處理，并在37℃培養(yǎng)基中培養(yǎng)了14天(陽性對照組：100ng/ml腫瘤壞死因子-α(西格瑪公司(SIGMA)))。在回收培養(yǎng)完成的細胞之后，對核糖核酸提取溶液(Easy Blue，Intron)進行處理來準備核糖核酸之后，使用RT預混合液(Intron)合成了互補脫氧核糖核酸(cDNA)。使用對于各個標記因子(腺苷酸活化蛋白激酶α1、比較堅定基因-58)的引物和聚合酶鏈反應(yīng)預混合液(Intron)來進行了聚合酶鏈反應(yīng)。

用于脂質(zhì)生成標記因子聚合酶鏈反應(yīng)的靶-特異性引物序列如下：腺苷酸活化蛋白激酶α1正向引物序列，5’-TGACCGGACATAAAGTGGCTGTGA-3’及腺苷酸活化蛋白激酶α1逆向引物，5’-TGATGATGTGAGGGTGCCTGAACA-3’(退火溫度，60℃)；比較堅定基因-58正向引物序列，5’-TGTGCAGGACTCTTACTTGGCAGT-3’及比較堅定基因-58逆向引物，5’-GTTTCTTTGGGCAGACCGGTTTCT-3’(退火溫度，60℃)。

向1％瓊脂糖凝膠每次裝載5μl的聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物并進行電泳之后，在Gel-Doc中確認了帶。

在前脂肪細胞(3T3-L1)中，對肽進行處理并培養(yǎng)，結(jié)果，可觀察作為脂質(zhì)分解標記的腺苷酸活化蛋白激酶α1和比較基因鑒定-58的表達在各個肽處理組中均增加(圖6a～圖6c)。并且，在對肽復合體進行處理的情況下，可確認腺苷酸活化蛋白激酶α1和比較基因鑒定-58的表達以依賴濃度的方式增加，當與作為陽性對照組的100ng/ml的腫瘤壞死因子-α處理組進行比較時，可觀察脂肪分解因子的表達急劇增加(圖6d)。

2-2.利用前脂肪細胞的脂質(zhì)分解誘導蛋白質(zhì)表達觀察

按3×10⁵細胞/孔的細胞密度，在6孔板種植了3T3-L1(前脂肪細胞)。培養(yǎng)24小時之后，按濃度(0.1μg/ml、1μg/ml及10μg/ml)對肽進行處理，并在37℃培養(yǎng)基中培養(yǎng)了14天(陽性對照組：100ng/ml的腫瘤壞死因子-α(西格瑪公司))。對細胞溶解緩沖液進行處理來確保溶解物之后，對蛋白質(zhì)進行定量，利用作為脂肪分解因子的抗脂肪甘油三酯脂酶抗體進行免疫印跡分析。

可確認作為脂肪分解因子的脂肪甘油三酯脂酶的表達通過肽復合體增加(圖7)。

2-3.利用前脂肪細胞的脂質(zhì)分解誘導蛋白質(zhì)表達熒光顯微鏡觀察

按3×10⁵細胞/孔的細胞密度，在6孔板種植了3T3-L1(前脂肪細胞)。培養(yǎng)24小時之后，對肽或肽復合體(1μg/ml)進行處理，并在37℃培養(yǎng)基中培養(yǎng)了14天(陽性對照組：100ng/ml的腫瘤壞死因子-α(西格瑪公司))。利用70％乙醇固定結(jié)束培養(yǎng)的細胞之后，利用抗磷酸激素敏感性脂肪酶抗體(Santa Cruz Biotechnology，USA)，通過細胞免疫染色法觀察作為脂肪分解誘導因子的磷酸激素敏感性脂肪酶的細胞內(nèi)表達。

實驗結(jié)果，可確認通過各個肽(圖8a～圖8c)及肽復合體(圖8d)，作為脂肪分解誘導因子的磷酸激素敏感性脂肪酶的表達會增加。

2-4.作為脂肪分解產(chǎn)物的甘油的量測定

從肥胖誘導小鼠的腹部采集脂肪組織之后，在24孔培養(yǎng)板中，在每個孔放入100mg的脂肪組織之后，在培養(yǎng)基(1ml的Krebs-Ringer緩沖液(buffer)包含25mM的4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，5.5mM的葡萄糖(glucose)和2％的(w/v)牛血清白蛋白(bovine serum albumin))中進行了培養(yǎng)。當培養(yǎng)時，以0.1μg/ml、1μg/ml及10μg/ml的濃度對復合體進行處理，作為陽性對照組，處理了100ng/ml的腫瘤壞死因子-α，培養(yǎng)48小時之后，測定了從脂肪分解出的甘油的量。

實驗結(jié)果，當按濃度對肽復合體進行處理時，可觀察脂肪在脂肪分解的過程中所產(chǎn)生的甘油的量以依賴于肽復合體處理濃度的方式增加。確認了與作為陽性對照組的腫瘤壞死因子-α處理組相比，檢測到更多量的甘油(圖9)。

2-5.對于肥胖小鼠分離脂肪組織的分解效果確認

根據(jù)顏色，脂肪組織分為白色脂肪(White Fat)、褐色脂肪(Brown Fat)，根據(jù)部位，脂肪組織分為皮下脂肪、腹部脂肪、腸間膜脂肪(內(nèi)臟脂肪)及附睪脂肪。在解剖之后，摘除各個脂肪并分離白色脂肪之后，以各100mg/孔的重量，在24孔板中，按復合劑濃度進行處理之后，在培養(yǎng)基(1ml的Krebs-Ringer緩沖液包含25mM的4-羥乙基哌嗪乙磺酸，5.5mM的葡萄糖和2％的(w/v)牛血清白蛋白)中培養(yǎng)72小時之后，切片組織并利用蘇木精和曙紅進行染色，通過200倍顯微鏡(TS100，尼康(Nicon)公司)進行觀察來比較了脂肪細胞的大小。

實驗結(jié)果，當按濃度對肽復合體進行處理時，與對照組相比，比較脂肪細胞的大小，結(jié)果，確認了脂肪細胞的大小變小(圖10a)。并且，在進行染色之后，為了測定脂肪細胞的大小而使用程序來測定脂肪細胞的大小，最終，觀察了在肽復合體處理組中，具有明顯細胞膜劃分的脂肪組織內(nèi)細胞大小的減少(圖10b)。

2-6.對于脂肪組織的脂肪分解因子觀察

從肥胖誘導小鼠的腹部采集脂肪組織之后，在24孔培養(yǎng)板中，在每個孔放入100mg的脂肪組織之后，在培養(yǎng)基(1ml的Krebs-Ringer buffer包含25mM的4-羥乙基哌嗪乙磺酸，5.5mM的葡萄糖和2％的(w/v)牛血清白蛋白)中進行了培養(yǎng)。在進行培養(yǎng)時，對肽復合體進行處理，作為陽性對照組，處理了100ng/ml的腫瘤壞死因子-α，培養(yǎng)48小時之后，確認了作為脂肪分解因子的磷酸激素敏感性脂肪酶(綠色熒光物質(zhì))的表達。

實驗結(jié)果，確認作為在脂肪組織中的脂肪分解因子的磷酸激素敏感性脂肪酶的表達，結(jié)果，當對肽復合體進行處理時，可確認作為脂肪分解因子的磷酸激素敏感性脂肪酶的表達的增加(圖11)。

實施例3：通過實驗動物的脂肪生成抑制及脂肪分解促進效果

基于高脂肪飲食的體重減少及脂肪生成抑制

利用通過使正常C57BL/6小鼠攝取高脂肪飲食來誘導的肥胖誘導模型飲食誘導肥胖(DIO，Diets induced obesity)進行抗肥胖功效實驗，作為陽性對照組藥物，使用了5μg/ml的腫瘤壞死因子-α。對照組以一般食物進行，而并非以高脂肪飲食進行，實驗攝取12周的高脂肪飲食，并對肽復合體進行處理，并對陽性對照組進行處理來確認了體重的減少。

在12周內(nèi)，在每天下午3點～4點，將腫瘤壞死因子-α及抗肥胖功效化合物強制腹腔注射84天，在第一次給藥之前測定體重和飲食量，之后，以一周為間隔，測定了體重和食物量。血糖在結(jié)束給藥實驗后，從尾部靜脈采血之后，利用羅氏活力型血糖儀(Accu-Check Active)(Roche)來測定，膽固醇(Cholesterol)也通過從尾部靜脈采取的血清，利用膽固醇計算試劑盒(Cholesterol calculation Kit)(BioVision)來進行了分析。根據(jù)顏色，脂肪組織分為白色脂肪、褐色脂肪，根據(jù)部位，脂肪組織分為皮下脂肪、腹部脂肪、腸間膜脂肪(內(nèi)臟脂肪)及附睪脂肪。在解剖之后，摘除各個脂肪來進行觀察，為了進行組織學檢查，將脂肪固定在10％的中性緩沖福爾馬林之后，種植在石蠟塊并分成5μm并進行了蘇木(Hematoxylin)和伊紅(eosin)染色。作為脂質(zhì)分解因子的激素敏感性脂肪酶的磷酸化程度通過利用抗磷酸激素敏感性脂肪酶抗體的熒光染色來進行。制作組織樣品之后，通過甘油膠安裝媒介(glycerine Jell mounting Media)進行安裝，并蓋住玻璃蓋后，通過顯微鏡(尼康公司，TS100)進行觀察，并通過內(nèi)置于顯微鏡的數(shù)碼攝像頭拍攝了組織。

如下確認：攝取一般食物12周的小鼠的體重從實驗初期20.9g在12周之后上升至28.74g，攝取高脂肪飲食的小鼠的體重從初期的20.99g在12周后上升至49.5g。但是，在與高脂肪飲食并用并處理的肽復合體組中，從初期21.1g在12周后上升至36.76g，與僅攝取高脂肪飲食的對照組(235.8％)相比，可確認有高的體重減少(174.2％)(表2及圖12)。

表2

對肥胖小鼠模型處理肽復合體之后測定體重

并且，在12周內(nèi)，測定實驗結(jié)束的動物照片，結(jié)果，與僅攝取高脂肪飲食的組相比，在肽復合體處理組中，可觀察小鼠的身體的大小與正常小鼠(一般食物)的大小類似(圖13)。

對進行12周實驗的小鼠進行微計算機斷層掃描技術(shù)拍攝來確認了整個身體的脂肪分布。確認分布在整個身體的脂肪(呈黃色)，結(jié)果，與攝取一般食物的對照組相比，可確認在攝取高脂肪飲食的對照組的小鼠中，分布在整個身體的脂肪的量急劇增加，在與高脂肪攝取一同處理肽復合體的組中，可確認分布在整個身體的脂肪的量急劇下降(圖14)。

解剖拍攝完胃部的微計算機斷層掃描技術(shù)的小鼠并采集分布在整個身體的脂肪組織來觀察了脂肪組織的量。結(jié)果，與攝取一般食物的對照組相比，可確認在攝取高脂肪飲食的對照組的小鼠中的脂肪的量多，在于高脂肪飲食一同處理肽復合體的組中，可確認脂肪的量急劇下降(圖15)。

分離脂肪并通過蘇木精-伊紅染色(H&E)染色觀察脂肪的大小，結(jié)果，可確認與攝取高脂肪飲食的對照組相比，在與高脂肪飲食一同攝取肽復合體的處理組中，脂肪的大小變小(圖16a)。通過程序分析脂肪大小，結(jié)果，當將一般食物的對照組的脂肪大小計算成100％時，攝取高脂肪飲食的對照組的脂肪大小為127％，確認了脂肪的大小變大，且與高脂肪飲食一同攝取肽復合體的組中，脂肪的大小為減少至97％(圖16b)。

分離脂肪并確認作為在脂肪組織內(nèi)表達的脂肪分解因子的磷酸激素敏感性脂肪酶的表達量的結(jié)果，確認了與高脂肪飲食一同攝取肽復合體的處理組中，磷酸激素敏感性脂肪酶的表達增加(圖17)。

完成實驗之后，確認小鼠血液內(nèi)的膽固醇量，結(jié)果，攝取一般食物的小鼠的膽固醇量為2.52μg/ml，攝取高脂肪飲食的對照組的膽固醇量為3.5μg/ml，與高脂肪飲食一同攝取肽復合體的組中，膽固醇量為2.86μg/ml。在肽復合體處理組中，可確認了當肥胖時降低上升的膽固醇的數(shù)值(圖18)。

確認完成實驗的小鼠血液內(nèi)的血糖數(shù)值，結(jié)果，攝取一般食物的對照組的小鼠的血糖為174mg/dL，攝取高脂肪飲食的對照組的血糖為235mg/dL，由此可確認血糖數(shù)值的上升，在與高脂肪飲食一同攝取肽復合體的組中，血糖數(shù)值為183mg/dL，由此確認了減少了與攝取一般食物的對照組類似的血糖數(shù)值。

實施例4：血糖調(diào)整

血糖調(diào)整效果

在本動物實驗中使用了C57BL/6(正常小鼠)((株)Samtako)和雄性C57BLKS/JLepr(糖尿模型小鼠，db/db小鼠)((株)從中央實驗動物購買)，作為抗糖尿病和/或抗肥胖功效物質(zhì)，使用了復合劑，作為陽性對照組藥物，使用了西他列汀(sitagliptin)。在本實施例中，對于正常小鼠模型和可具有遺傳性糖尿病的模型的極性糖尿病功效(單次給藥)，通過作為代表性糖尿病診斷檢查方法的葡萄糖耐量試驗(GTT，Glucose Tolerance Test)方法對抗糖尿病和/或抗肥胖功效復合劑進行了評價。小鼠的飼養(yǎng)環(huán)境條件設(shè)定為22～24℃，相對濕度為50～30％，并在每個飼養(yǎng)箱飼養(yǎng)四只小鼠。從上午8點至下午8點給予150-300勒克斯(Lux)的照明，且每天開燈12小時并關(guān)燈12小時。飼料使用了一般飲食(18％蛋白質(zhì)，2018，Harlan Laboratories Inc，USA制作)并使小鼠自由攝取，并在進行ITT實驗前，使小鼠絕食4小時以上，且在進行葡萄糖耐量試驗之前12小時開始使小鼠絕食。在執(zhí)行葡萄糖耐量試驗之前1小時，把復合劑分別利用口服給藥用一次性注射器來進行強制口服給藥，為了進行葡萄糖耐量試驗，在進行實驗0時間時，使小鼠攝取40分鐘的高脂肪飲食。在自由攝取高脂肪飲食40分鐘之后，為了分別檢查血液內(nèi)的血糖，以0分鐘、30分鐘、60分鐘、90分鐘、120分鐘及180分鐘的間隔從尾部靜脈采血并利用羅氏活力型血糖儀測定了血糖水平。另一方面，作為陽性對照組藥物，選擇了目前用為糖尿治療劑的西他列汀，并以100mg/kg的給藥量進行給藥。作為抗糖尿病和/或抗肥胖功效后部物質(zhì)選擇的復合劑按100mg/kg的給藥量劃分實驗組，且每個實驗組使用4只公小鼠。

實驗結(jié)果，借助高脂肪飲食增加的血糖數(shù)值因肽復合體處理而呈現(xiàn)出血糖減少效果。在糖尿病引發(fā)小鼠模型中，確認了糖尿病的高血糖減少(圖20a、圖20b)。并且，與攝取高脂肪飲食的對照組相比，在與高脂肪飲食一同攝取肽復合體的處理組中確認膽固醇量的降低(參照圖21)。

并且，使誘導DB/DB糖尿病的小鼠維持16小時空腹之后，使小鼠攝取30分鐘飲食后，并使小鼠攝取肽，且按時間測定了血糖數(shù)值。

實驗結(jié)果，觀察在處理序列表的序列1、序列3及序列5的肽的組中，高血糖的數(shù)值以依賴時間的方式降低(圖22a～圖22c)。

實施例5：胰島素和胰島素類似成長因子的表達促進

胰島素和胰島素類似成長因子的表達促進

按3×10⁵細胞/孔的細胞密度，在6孔板種植了3T3-L1(前脂肪細胞)。在培養(yǎng)24小時之后，按濃度(10ng～1μg/ml)對肽進行處理，并在37℃培養(yǎng)基中培養(yǎng)了14天。對細胞溶解緩沖液進行處理來確保溶解物之后，對蛋白質(zhì)進行定量，利用作為脂肪分解因子的抗胰島素樣生長因子1(IGF-1)、胰島素抗體(Santa Cruz Biotechnology，USA)來實施蛋白印跡分析并進行了觀察。

實驗結(jié)果，觀察了借助序列表的序列7的肽，類胰島素一號增長因子和胰島素的表達以依賴濃度的方式增加(圖23)。

實施例6：通過臨床實驗的血糖減少效果觀察

基于復合劑服用的血糖減少

以空腹血糖為170mg/dL以上，且45～65歲為對象，簡單臨床實驗進行空腹血糖基準，在飯后30分鐘攝取復合制劑并以30、60、90、120、150、180分鐘的間隔取血，且利用羅氏活力型血糖儀測定了血糖水平。

實驗結(jié)果，均在每位實驗對象中觀察到基于復合制劑的血糖減少(圖25a～圖25d)。

以上，詳細記述了本發(fā)明的特定的部分，對于該領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，明確的是，這種詳細記述僅為優(yōu)選實施例，本發(fā)明的范圍并不受其限制。因此，本發(fā)明的實質(zhì)范圍由所附的發(fā)明要求保護范圍和與其等同的技術(shù)方案定義。