本發(fā)明涉及新的抗微生物化合物、包含該化合物的新反應(yīng)培養(yǎng)基、以及他們的用途。具體而言，根據(jù)本發(fā)明的新化合物證明對(duì)于那些對(duì)抗微生物劑具有多抗藥性的微生物是有效的，尤其是對(duì)于那些對(duì)常規(guī)抗菌藥具有多抗藥性的細(xì)菌是有效的。

背景技術(shù)：

對(duì)典型抗微生物劑(例如抗菌藥)呈現(xiàn)出多抗藥性的微生物的增加通常需要研制具有新的作用模式的新的抗微生物劑。特別是對(duì)于治療多抗藥性的革蘭氏陰性菌，例如那些產(chǎn)生碳青霉烯酶(carbapenemase)的革蘭氏陰性菌，新的抗微生物劑的缺乏是令人擔(dān)憂的，并且證實(shí)是特別令人關(guān)注的。另外，如果在對(duì)于其它微生物而言是特異性的反應(yīng)培養(yǎng)基中存在所述多抗藥性的微生物，則這些多抗藥性的微生物能夠產(chǎn)生錯(cuò)誤性的診斷，給出假陽性結(jié)果，并由此誘發(fā)檢測特異性方面的重大問題。

微生物學(xué)診斷技術(shù)仍主要基于培養(yǎng)步驟，以分離目標(biāo)微生物。如果這些技術(shù)用于尋找潛在性地存在于大量共生微生物菌叢中的小量病原體，則必須使用選擇培養(yǎng)基。這些培養(yǎng)基主要基于特異性抑制劑的使用，這些抑制劑作用于主要共生菌種，但不抑制所要尋找的病原體的生長。

在20世紀(jì)70年代后期，“模擬肽”的研制是由于其抗菌性質(zhì)。這些模擬肽通常由共價(jià)連接于一個(gè)或多個(gè)氨基酸上的“活性”抗菌部分組成，所述氨基酸用于促進(jìn)這些“模擬肽”通過微生物肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的吸收。然后，細(xì)胞內(nèi)水解斷裂(由于氨肽酶活性)在目標(biāo)細(xì)菌內(nèi)釋放出所述活性抗菌部分，用于與其目標(biāo)相互作用。對(duì)于“模擬肽”，可以提到的有阿拉磷(L-丙氨酰-L-1-氨基乙基膦酸；CAS編號(hào)：60668-24-8)，其是由Roche在20世紀(jì)70年代研發(fā)的。據(jù)該文獻(xiàn)的描述，阿拉磷的細(xì)菌吸收是通過LL-二肽透酶進(jìn)行的。一旦在目標(biāo)細(xì)菌內(nèi)部，則活性抗菌部分—此時(shí)為fosfalin(L-1-氨基乙基膦酸)，被水解(更準(zhǔn)確地說是通過水解將其與丙氨酸殘基結(jié)合在一起的肽鍵而由丙氨酸殘基中被“釋放”)，然后與丙氨酸消旋酶結(jié)合，由此阻止D-丙氨酸的合成，而D-丙氨酸對(duì)于生物合成肽多糖是必需的成分[1]。阿拉磷已被描述為具有廣譜抗菌活性[2]，無論是在活體外還是在活體內(nèi)，都可以抵抗某些需氧革蘭氏陽性微生物(金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，糞腸球菌(Enterococcus faecalis)，但不包括A組鏈球菌(Group A streptococci)以及B組鏈球菌(Group B streptococci)，如無乳鏈球菌(S.agalactiae)，也不包括肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae))、厭氧菌(擬桿菌屬(Bacteroides sp.)以及產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)，但不包括艱難梭菌(Clostridium difficile))以及許多革蘭氏陰性菌種，但不包括假單胞菌屬(Pseudomonas)或不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)。

在專利申請(qǐng)WO 02/22785以及專利EP-B-1325024中也描述了阿拉磷的應(yīng)用，其是作為用于研發(fā)選擇培養(yǎng)基的選擇劑，所述選擇培養(yǎng)基能夠分離屬于沙門氏菌屬(Salmonella spp)家族的微生物。

然而，Gibson等人[3]在1984年披露了以下事實(shí)：由于許多抗藥細(xì)菌菌株的高發(fā)生頻率，證明阿拉磷對(duì)于這些菌株是無活性的。

在20世紀(jì)80年代研制的其他合成抗菌藥使用了類似的給藥方法和/或作用模式。例如，Cheung等人[4]研究了數(shù)種通過水解釋放的鹵代二肽的抗菌活性，包括L-β-氯丙氨酰-L-β-氯丙氨酸。該通過水解釋放的β-氯丙氨酸似乎與某些酶系統(tǒng)(包括丙氨酸消旋酶)相互作用，而且還似乎表現(xiàn)出寬的抗菌活性譜[5]。在試圖優(yōu)化Cheung等人[4]的底物的工作框架中，β-Cl-L-丙氨酸(β-Cl-L-Ala)殘基被結(jié)合入各種二肽和三肽中[5]。然而，不僅如此得到的肽中沒有一個(gè)能夠顯著提高化合物L(fēng)-β-氯丙氨酰-L-β-氯丙氨酸的抗菌活性，而且該文獻(xiàn)的作者得出以下結(jié)論：包含L-丙氨酰殘基的二肽和三肽尤其是對(duì)于革蘭氏陰性微生物不具有抗菌活性。該文獻(xiàn)的作者由此推斷，由包含L-丙氨酰殘基的二肽和三肽殘基觀察到的抗菌活性的缺失有可能與L-丙氨酸為革蘭氏陰性菌中的丙氨酸消旋酶提供針對(duì)β-Cl-L-Ala殘基的保護(hù)的性質(zhì)有關(guān)。換言之，相對(duì)于丙氨酸消旋酶，在β-Cl-L-Ala殘基和L-丙氨酰殘基之間似乎發(fā)生競爭。

也是出于優(yōu)化的角度，Atherton等人[6]試圖在相同的分子中一方面結(jié)合阿拉磷，并且另一方面結(jié)合β-氯-L-丙氨酸(β-Cl-L-ala)。然而，該企圖以失敗告終，因?yàn)樵撾s化分子沒有表現(xiàn)出任何的抗菌活性，雖然已知β-氯丙氨酸具有抗菌性質(zhì)[7]。Atherton等人得出以下結(jié)論：該結(jié)果是由于L,L二肽透酶不能有效地在細(xì)菌內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)所述化合物。

對(duì)于典型/常規(guī)抗微生物劑的抗藥性越來越多，因此一個(gè)目的是研發(fā)涉及人或者動(dòng)物治療的新的抗微生物化合物，而且還涉及使用這些新的抗微生物劑作為選擇劑的活體外診斷。如前所述(參考文獻(xiàn)[5]和[6])，現(xiàn)存抗微生物化合物的改進(jìn)以及其它組合都有可能導(dǎo)致其抗微生物活性的降低或者甚至完全丟失，因此該任務(wù)變得更為困難。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

申請(qǐng)人已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)上述目的能夠用具有以下通式(I)的化合物及其鹽、衍生物和類似物，優(yōu)選其鹽來實(shí)現(xiàn)：

其中R₁代表：

-由1-5個(gè)氨基酸殘基的線性序列組成的肽部分P1；所述肽部分P1包含至少一個(gè)β-氯

丙氨酸殘基，優(yōu)選β-氯-L-丙氨酸；或者

-肽部分P2，所述肽部分P2由以下通式(II)代表：

其中：

X代表氫或氯原子，以及

Y代表氫原子或1-4個(gè)氨基酸殘基的線性序列，有利地包括至少一個(gè)β-氯丙氨酸殘基，優(yōu)選β-氯-L-丙氨酸，和/或至少一個(gè)正纈氨酸殘基，優(yōu)選L-正纈氨酸，和/或至少一個(gè)甲硫氨酸殘基，優(yōu)選L-甲硫氨酸；

以及其中如果X代表氫原子，則Y如前所定義，但不包括氫原子或丙氨酸殘基，無論該丙氨酸殘基是在N-端位置(“在鏈端”)或其通過肽鍵(在所述丙氨酸殘基的α氨基官能團(tuán)與另一個(gè)氨基酸殘基的α羧酸官能團(tuán)之間)而結(jié)合至該另一個(gè)氨基酸殘基上。

當(dāng)然，所用的術(shù)語表示，尤其是術(shù)語“肽部分”，由多個(gè)氨基酸殘基組成的線性序列意味著這些多個(gè)氨基酸殘基是通過肽鍵結(jié)合在一起的。如生物化學(xué)領(lǐng)域眾所周知的，肽鍵是在氨基酸的α碳所攜帶的羧基官能團(tuán)(“α羧基官能團(tuán)”)與該肽鏈中下一個(gè)氨基酸的α碳所攜帶的氨基官能團(tuán)(“α氨基官能團(tuán)”)之間所形成的共價(jià)鍵。該肽鍵相應(yīng)于酰胺官能團(tuán)。

優(yōu)選的是，R₁由通式(III)代表：

其中R₂是氫原子或者1-4個(gè)氨基酸殘基的線性序列，有利地包含至少一個(gè)β-氯丙氨酸殘基，優(yōu)選β-氯-L-丙氨酸，和/或至少一個(gè)正纈氨酸殘基，優(yōu)選L-正纈氨酸，和/或至少一個(gè)甲硫氨酸殘基，優(yōu)選L-甲硫氨酸。

如所定義的，如果R₂是氫原子，則R₁是包含單個(gè)氨基酸殘基的肽部分，如β-氯丙氨酸殘基，優(yōu)選β-氯-L-丙氨酸。

如前所述，并根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，如果R₂是1-4個(gè)氨基酸殘基的線性序列，則其包含至少一個(gè)β-氯丙氨酸殘基(優(yōu)選β-氯-L-丙氨酸)，和/或至少一個(gè)正纈氨酸殘基(優(yōu)選L-正纈氨酸)，和/或至少一個(gè)甲硫氨酸殘基(優(yōu)選L-甲硫氨酸)。有利地，上述β-氯丙氨酸殘基(優(yōu)選β-氯-L-丙氨酸)、正纈氨酸殘基(優(yōu)選L-正纈氨酸)或甲硫氨酸殘基(優(yōu)選L-甲硫氨酸)通過肽鍵直接結(jié)合至通式(III)所代表的β-氯-L-丙氨酸殘基(所述肽鍵是在所述β-氯丙氨酸、正纈氨酸或甲硫氨酸殘基的α羧酸官能團(tuán)與通式(III)中所表示的氨基官能團(tuán)之間形成的)。

根據(jù)一個(gè)具體的實(shí)施方案，R₂由正纈氨酸殘基，優(yōu)選L-正纈氨酸或甲硫氨酸殘基，優(yōu)選L-甲硫氨酸組成。

根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，R₁由通式(IV)代表：

其中R₃是氫原子或1-3個(gè)氨基酸殘基的線性序列，后者有利地包含至少一個(gè)β-氯丙氨酸殘基，優(yōu)選β-氯-L-丙氨酸。

根據(jù)化學(xué)領(lǐng)域中的標(biāo)記規(guī)則(特別是對(duì)于拓?fù)涫?，上述式(II)、(III)和(IV)中表示的所謂的“波浪線”或者“鋸齒線”符號(hào)是用于表示在R₁基團(tuán)與通式(I)化合物的其余部分之間的鍵(通過肽鍵的形成)。

如所定義的，如果R₃是氫原子，則R₁是僅包含兩個(gè)相同氨基酸殘基的肽部分，例如兩個(gè)β-氯丙氨酸殘基，優(yōu)選β-氯-L-丙氨酸，他們通過肽鍵相互結(jié)合在一起。以此方式形成的單元稱為“β-氯丙氨酰-β-氯丙氨酸”。

根據(jù)一個(gè)具體的實(shí)施方案，R₃包括正纈氨酸殘基，優(yōu)選L-正纈氨酸，或者甲硫氨酸殘基，優(yōu)選L-甲硫氨酸。有利地，所述正纈氨酸殘基(優(yōu)選L-正纈氨酸)或甲硫氨酸殘基(優(yōu)選L-甲硫氨酸)通過肽鍵(在所述正纈氨酸或甲硫氨酸殘基的α羧酸官能團(tuán)與通式(IV)所表示的β-氯丙氨酰-β-氯丙氨酸殘基的氨基官能團(tuán)NH-R₃之間)直接結(jié)合至通式(IV)所代表的β-氯丙氨酰-β-氯丙氨酸殘基(優(yōu)選結(jié)合至β-氯-L-丙氨酰-β-氯-L-丙氨酸殘基)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，該肽鍵的形成是通過β-氯丙氨酰-β-氯丙氨酸單元(優(yōu)選β-氯-L-丙氨酰-β-氯-L-丙氨酸)的伯氨基官能團(tuán)與正纈氨酸(優(yōu)選L-正纈氨酸)或甲硫氨酸(優(yōu)選L-甲硫氨酸)的羧酸官能團(tuán)之間的縮合反應(yīng)而得到的，由此在所述β-氯丙氨酰-β-氯丙氨酸單元與所述正纈氨酸(優(yōu)選L-正纈氨酸)或甲硫氨酸(優(yōu)選L-甲硫氨酸)之間形成肽鍵。根據(jù)一個(gè)具體的實(shí)施方案，R₃由正纈氨酸殘基，優(yōu)選L-正纈氨酸，或甲硫氨酸殘基，優(yōu)選L-甲硫氨酸組成。

優(yōu)選的是，通式(I)化合物的肽部分R₁由2-3個(gè)、優(yōu)選2個(gè)氨基酸殘基組成；如上所解釋的，這些氨基酸殘基通過肽鍵結(jié)合在一起。

通常而言，所述氨基酸殘基選自甘氨酸、肌氨酸，以及L和D形式、優(yōu)選L形式的β-氯丙氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、γ-谷氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、正纈氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、焦谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸的殘基。有利地，所述氨基酸殘基選自L和D形式、優(yōu)選L形式的β-氯丙氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、正纈氨酸和纈氨酸的殘基。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明的抗微生物化合物由上述通式(I)限定，其中R₁代表所述肽部分P2，并且其中X代表氫原子。有利地，在該另一個(gè)實(shí)施方案中，Y是選自以下的氨基酸殘基：甘氨酸、肌氨酸，L和D形式、優(yōu)選L形式的β-氯丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、γ-谷氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、正纈氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、焦谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸的殘基；有利地，Y是選自以下的氨基酸殘基：L和D形式、優(yōu)選L形式的甲硫氨酸和正纈氨酸的殘基。

根據(jù)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明的抗微生物化合物包括：

‐β-氯-L-丙氨酰-D/L-1-氨基乙基膦酸，優(yōu)選β-氯-L-丙氨酰-L-1-氨基乙基膦酸,和/或

‐β-氯-L-丙氨酰-β-氯-L-丙氨酰-D/L-1-氨基乙基膦酸,優(yōu)選β-氯-L-丙氨酰-β-氯-L-丙氨酰-L-1-氨基乙基膦酸,和/或

‐L-正纈氨酰-β-氯-L-丙氨酰-D/L-1-氨基乙基膦酸，優(yōu)選L-正纈氨酰-β-氯-L-丙氨酰-L-1-氨基乙基膦酸,和/或

‐L-甲硫氨酰-β-氯-L-丙氨酰-D/L-1-氨基乙基膦酸，優(yōu)選L-甲硫氨酰-β-氯-L-丙氨酰-L-1-氨基乙基膦酸,和/或

‐L-正纈氨酰-L-丙氨酰-D/L-1-氨基乙基膦酸，優(yōu)選L-正纈氨酰-L-丙氨酰-L-1-氨基乙基膦酸,和/或

‐L-甲硫氨酰-L-丙氨酰-D/L-1-氨基乙基膦酸,優(yōu)選L-甲硫氨酰-L-丙氨酰-L-1-氨基乙基膦酸；

有利地，所述抗微生物化合物包括β-氯-L-丙氨酰-D/L-1-氨基乙基膦酸，優(yōu)選β-氯-L-丙氨酰-L-1-氨基乙基膦酸,和/或

β-氯-L-丙氨酰-β-氯-L-丙氨酰-D/L-1-氨基乙基膦酸，優(yōu)選β-氯-L-丙氨酰-β-氯-L-丙氨酰-L-1-氨基乙基膦酸。

有利地，根據(jù)本發(fā)明的抗微生物化合物包括β-氯-L-丙氨酰-D/L-1-氨基乙基膦酸，優(yōu)選β-氯-L-丙氨酰-L-1-氨基乙基膦酸，和/或β-氯-L-丙氨酰-β-氯-L-丙氨酰-D/L-1-氨基乙基膦酸，優(yōu)選β-氯-L-丙氨酰-β-氯-L-丙氨酰-L-1-氨基乙基膦酸，或這兩者的混合物。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明的抗微生物化合物的N-端氨基官能團(tuán)用保護(hù)基進(jìn)行保護(hù)，所述保護(hù)基例如是叔丁氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基或芐基氧基羰基。

本發(fā)明還涉及包含至少一種如上所定義的抗微生物化合物的反應(yīng)培養(yǎng)基，所述化合物的最終存在濃度為0.002至1024.0mg/L，優(yōu)選0.003至32.0mg/L，有利地為0.2至8.0mg/L，優(yōu)選為0.2至2.0mg/L。

根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，所述反應(yīng)培養(yǎng)基是一種能夠檢測和/或鑒定和/或計(jì)數(shù)樣品中至少一種靶微生物、優(yōu)選至少一種靶細(xì)菌的培養(yǎng)基，所述樣品能夠包含所述靶微生物，例如是工業(yè)來源或者臨床來源的樣品，其中所述至少一種化合物是至少一種能夠抑制非靶微生物的存活和/或生長以有利于所述至少一種靶微生物的存活和/或生長的選擇劑。

有利地，所述反應(yīng)培養(yǎng)基是包含至少一種營養(yǎng)劑的培養(yǎng)基，所述營養(yǎng)劑能夠使至少一種靶微生物生長，其中所述至少一種選擇劑能夠抑制非靶微生物的生長，由此有利于所述至少一種靶微生物的生長。

優(yōu)選的是，所述反應(yīng)培養(yǎng)基還包含對(duì)所述至少一種靶微生物的酶活性具有特異性的酶底物。

優(yōu)選的是，所述反應(yīng)培養(yǎng)基包含至少一種選自以下的選擇劑：

‐β-氯-L-丙氨酰-L-1-氨基乙基膦酸，優(yōu)選其最終濃度為0.002至1024.0mg/L，優(yōu)選0.003至32.0mg/L，有利地為0.2至8.0mg/L，優(yōu)選0.2至2.0mg/L,或

‐β-氯-L-丙氨酰-β-氯-L-丙氨酰-L-1-氨基乙基膦酸，優(yōu)選其最終濃度為0.002至1024.0mg/L，優(yōu)選0.003至32.0mg/L，有利地為0.2至8.0mg/L，優(yōu)選0.2至2.0mg/L，或者

‐這兩者的混合物。

根據(jù)有利的實(shí)施方案，所述反應(yīng)培養(yǎng)基能夠檢測和/或鑒定和/或計(jì)數(shù)至少一種靶微生物(目標(biāo)微生物，microorganism of interest)，所述至少一種靶微生物是：

‐至少一種革蘭氏陰性靶微生物，其屬于沙門氏菌屬，例如腸沙門氏菌(Salmonella enterica)；屬于鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhimurium)血清型或腸沙門氏菌(Salmonella Enteridis)血清型；屬于不動(dòng)桿菌屬，例如鮑氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)；屬于伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)，洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderia cepacia)；屬于假單胞菌屬，例如銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；有利地，所述至少一種革蘭氏陰性微生物屬于沙門氏菌屬；或者

‐至少一種革蘭氏陽性靶微生物，其屬于利斯特氏菌屬(Listeria)，例如屬于單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)，或?qū)儆阪溓蚓鷮?Streptococcus)，例如無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)和/或肺炎鏈球菌和/或釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)；有利地，所述至少一種革蘭氏陽性靶微生物屬于利斯特氏菌屬。

根據(jù)有利的實(shí)施方案，所述反應(yīng)培養(yǎng)基能夠檢測和/或鑒定和/或計(jì)數(shù)至少一種屬于沙門氏菌屬的靶微生物。

根據(jù)特別有利的實(shí)施方案，所述反應(yīng)培養(yǎng)基能夠檢測和/或鑒定和/或計(jì)數(shù)至少一種屬于沙門氏菌屬的靶微生物，所述培養(yǎng)基包含：

‐至少一種營養(yǎng)劑，例如蛋白胨，如豬或牛來源的，其濃度為0.2至30.0g/L，

‐任選存在的緩沖劑，

‐至少一種顯色標(biāo)記物，例如酯酶酶底物和/或α-半乳糖苷酶酶底物，其濃度為0.05至15.0g/L，

‐瓊脂，其濃度為9.0至28.0g/L，以及

‐至少一種如權(quán)利要求12-16之一所限定的選擇劑，優(yōu)選其濃度為0.002至1024.0mg/L，優(yōu)選0.003至32.0mg/L，有利地為0.2至8.0mg/L，優(yōu)選為0.2至2.0mg/L。

有利地，所述反應(yīng)培養(yǎng)基包含至少一種酯酶酶底物和/或至少一種α-半乳糖苷酶酶底物的混合物。其還可包含葡糖苷酶酶底物(有利地為β-葡糖苷酶)和/或半乳糖苷酶酶底物。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，所述反應(yīng)培養(yǎng)基包含至少一種酯酶酶底物或至少一種α-半乳糖苷酶酶底物以及至少一種β-葡糖苷酶酶底物。根據(jù)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，所述反應(yīng)培養(yǎng)基包含至少一種酯酶酶底物以及一種β-葡糖苷酶酶底物。

該類型的反應(yīng)培養(yǎng)基的例子示于下表2中(參見以下實(shí)施例3.1)。

優(yōu)選的是，所述一種或多種非靶微生物是在以下組內(nèi)：

-腸桿菌科(Enterobacteriaceae)家系中的屬，例如腸桿菌屬(Enterobacter)(例如陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae))和/或埃希氏菌屬(Escherichia)(例如大腸埃希氏菌(Escherichia Coli))和/或克雷伯氏菌屬(Klebsiella)(例如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae))和/或沙雷氏菌屬(Serratia)(例如粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens))和/或耶爾森氏菌屬(Yersinia)(例如小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica))，和/或

-腸球菌屬(Enterococcus)(例如糞腸球菌和/或屎腸球菌(Enterococcusfaecium))，和/或

-葡萄球菌屬(例如表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和/或金黃色葡萄球菌)

優(yōu)選所述一種或多種非靶微生物對(duì)至少一種常規(guī)抗菌藥是具有抗藥性的。

腸桿菌科家系中的細(xì)菌(腸細(xì)菌)，例如大腸埃希氏菌(E.coli)，是生物樣品中經(jīng)常遇到的革蘭氏陰性菌，所述樣品包含與革蘭氏陰性靶細(xì)菌，例如沙門氏菌屬的細(xì)菌的混合物。這些腸細(xì)菌容易在培養(yǎng)基上生長，并由此遮蓋所述革蘭氏陰性靶細(xì)菌(也稱為目標(biāo)革蘭氏陰性菌)。因?yàn)楦鶕?jù)本發(fā)明的抗微生物化合物相對(duì)于革蘭氏陰性靶細(xì)菌(例如沙門氏菌屬的細(xì)菌)選擇性地并且在低濃度下抑制某些腸細(xì)菌，根據(jù)本發(fā)明的所述抗微生物劑特別適合于制備用于檢測和/或鑒定和/或計(jì)數(shù)革蘭氏陰性靶細(xì)菌(例如沙門氏菌屬的細(xì)菌)的反應(yīng)培養(yǎng)基。由以上可以得到以下結(jié)果：根據(jù)本發(fā)明的抗微生物化合物特別推薦用于制備針對(duì)檢測和/或鑒定和/或計(jì)數(shù)沙門氏菌屬的細(xì)菌的反應(yīng)培養(yǎng)基。

另外，腸道球菌以及特別是那些屬于糞腸球菌種的腸道球菌是生物樣品中經(jīng)常遇到的革蘭氏陽性細(xì)菌，所述樣品包含與其他革蘭氏陽性細(xì)菌的混合物。這些腸道球菌容易在培養(yǎng)基上/中生長，并由此有可能遮蓋革蘭氏陽性靶細(xì)菌(目標(biāo)革蘭氏陽性細(xì)菌)，例如利斯特氏菌屬的細(xì)菌(例如屬于單核細(xì)胞增生利斯特氏菌種)、金黃色葡萄球菌種的細(xì)菌、鏈球菌屬的細(xì)菌(包括無乳鏈球菌、肺炎鏈球菌或釀膿鏈球菌)。因?yàn)楦鶕?jù)本發(fā)明的抗微生物化合物相對(duì)于革蘭氏陽性靶細(xì)菌(例如利斯特氏菌屬的細(xì)菌)選擇性地并且在低濃度下抑制上述腸道球菌，根據(jù)本發(fā)明的所述抗微生物化合物特別適合于制備用于檢測和/或鑒定和/或計(jì)數(shù)革蘭氏陽性靶細(xì)菌(例如如上所述的那些)的反應(yīng)培養(yǎng)基。

本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及反應(yīng)培養(yǎng)基在檢測和/或鑒定和/或計(jì)數(shù)樣品中的至少一種靶微生物、優(yōu)選至少一種靶細(xì)菌的活體外應(yīng)用，所述樣品能夠包含所述靶微生物，例如是工業(yè)來源或者臨床來源的樣品。

本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及檢測和/或鑒定和/或計(jì)數(shù)樣品中的至少一種靶微生物、優(yōu)選至少一種靶細(xì)菌的方法，所述樣品能夠包含所述靶微生物，例如是工業(yè)來源或者臨床來源的樣品，所述方法包括以下步驟：

a)用所述樣品接種如上定義的反應(yīng)培養(yǎng)基，

b)如果需要，溫育該組件足夠長的時(shí)間，以便能夠檢測和/或鑒定和/或計(jì)數(shù)至少一

種靶微生物，

c)鑒定由所述至少一種靶微生物形成的菌落。

本發(fā)明還涉及如上所定義的抗微生物化合物，其用作人或獸用藥物。

本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及如上定義的化合物作為治療微生物感染、優(yōu)選細(xì)菌感染的人用或獸用藥物的應(yīng)用。

根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，在濃度為0.002至1024.0mg/L、優(yōu)選0.003至32.0mg/L、優(yōu)選0.2至8.0mg/L、有利地為0.2至2.0mg/L時(shí)，式(I)化合物及其鹽、衍生物和類似物(特別是其鹽)對(duì)于對(duì)常規(guī)抗生素(特別是經(jīng)典抗生素)具有多重抗藥性(也稱為多抗藥性)的細(xì)菌是特別有效的。

因此，本發(fā)明涉及新的抗微生物化合物，優(yōu)選抗菌化合物(例如殺菌抗生素或抑菌抗生素)，使得能夠治療難以用常規(guī)抗菌劑(例如經(jīng)典抗生素，即、那些通常用于治療微生物感染的抗菌劑)治療的微生物感染，優(yōu)選細(xì)菌感染。

在本發(fā)明中，“氨基酸殘基”應(yīng)理解為目標(biāo)氨基酸在其與至少一個(gè)其它氨基酸建立至少一個(gè)肽鍵后的剩余部分。例如，如果檢查上述通式(IV)，則明顯的是：通式(III)所代表的分子結(jié)合至β-氯丙氨酸殘基，其本身則結(jié)合至取代基R₃；所述β-氯丙氨酸殘基本身因此具有以下式：

‐i)如果R₃是氫原子，或

‐ii)如果R₃是1-3個(gè)氨基酸殘基的線性序列(鏈)；在此情況

下，由于在β-氯丙氨酸殘基的α氨基官能團(tuán)與另一個(gè)氨基酸殘基的α羧酸官能

團(tuán)之間形成肽鍵，所述β-氯丙氨酸殘基結(jié)合至所述另一個(gè)氨基酸殘基。

當(dāng)然，相同的原理也類似地適用于丙氨酸殘基之外的氨基酸殘基。

“抗微生物化合物”應(yīng)理解為對(duì)微生物有活性的化合物，即、用于對(duì)抗后者。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，該抗微生物化合物是抗菌化合物，即、對(duì)細(xì)菌具有活性(并且用于對(duì)抗后者)。對(duì)于本發(fā)明，所述抗菌化合物可以是殺菌抗生素，即、其破壞細(xì)菌，或者是抑菌抗生素，即、其抑制細(xì)菌生長；換言之，其阻止細(xì)菌增殖但不必殺死它們。應(yīng)注意的是，抗生素在低劑量時(shí)可以是抑菌的，而在高劑量時(shí)為殺菌的。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，“抗微生物化合物”可包括“抗真菌”化合物?！翱拐婢衔铩睉?yīng)理解為任何能夠阻止或者減慢酵母或者霉菌生長的化合物。例如，可以特別提及的有兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑和放線菌酮。優(yōu)選的是，如果使用至少一種抗真菌劑，則其使用濃度是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知能夠得到上述效果的濃度。

“反應(yīng)培養(yǎng)基”應(yīng)理解為包含對(duì)于表達(dá)微生物的代謝和/或存活和/或生長而言所必需的所有成分的培養(yǎng)基。該反應(yīng)培養(yǎng)基既可以僅作為警戒培養(yǎng)基(a revealingmedium)，或者也可以作為培養(yǎng)及警戒培養(yǎng)基(a culture and revealing medium)。在第一種情況下，微生物可在接種之前培養(yǎng)，而在第二種情況下，該反應(yīng)培養(yǎng)基也可構(gòu)成所述培養(yǎng)用培養(yǎng)基。該反應(yīng)培養(yǎng)基可以是固體、半固體或液體的?！鞍牍腆w培養(yǎng)基”應(yīng)理解為例如凝膠化培養(yǎng)基。瓊脂是微生物學(xué)中培養(yǎng)微生物所用的常規(guī)膠凝劑，但是也可以使用其他的膠凝劑，例如脫乙酰吉蘭糖膠、明膠、瓊脂糖，以及其他的天然或人工膠凝劑。許多制劑是可以市售得到的，例如Columbia瓊脂、Trypcase-soy瓊脂、MacConkey瓊脂、Mueller Hinton瓊脂，或者那些在微生物學(xué)培養(yǎng)基手冊(cè)(Handbook ofMicrobiological Media(CRC Press))中描述的更為常規(guī)的。根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)培養(yǎng)基還可包含可能的添加劑，例如氨基酸、蛋白胨(本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適濃度，避免消除作為本發(fā)明目的之抗微生物化合物的抑制作用)、一種或更多種生長因子、糖、氨基酸、核苷酸、礦物質(zhì)、維生素、一種或更多種選擇劑、緩沖劑、一種或更多種膠凝劑等。所述反應(yīng)培養(yǎng)基還可包含染料。作為指示，可能的染料可以是Evans藍(lán)、中性紅、綿羊血、馬血、例如二氧化鈦的遮光劑、硝基苯胺、孔雀綠、亮綠、一種或更多種代謝指示劑、一種或更多種代謝調(diào)節(jié)劑等。該反應(yīng)培養(yǎng)基可例如為液體形式，即、隨時(shí)可用的凝膠，如用于接種在試管中、燒瓶中或者在Petri皿上。

本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以使用雙平板，這使得可以容易地比較兩個(gè)包含不同底物或者不同的選擇性混合物的培養(yǎng)基，在該雙平板上已沉積相同的生物樣品。該反應(yīng)培養(yǎng)基可包含一種或更多種選擇劑。

“選擇劑”應(yīng)理解為能夠阻止或者減緩所謂“非靶”微生物(即、靶微生物之外者)之生長的任何化合物。沒有任何限制，對(duì)于本發(fā)明而言特別合適的是，其濃度為0.002至1024.0mg/L，優(yōu)選0.003至32.0mg/L，有利地為0.2至8.0mg/L，優(yōu)選0.2至2.0mg/L。通常而言，我們推薦選擇劑的濃度為0.01mg/l至5.0g/l。

“檢測”應(yīng)理解為用裸眼或者使用光學(xué)儀器檢測是否存在靶微生物(優(yōu)選靶細(xì)菌)的生長。如果希望由其檢測靶微生物的反應(yīng)培養(yǎng)基包含顯色或者熒光底物，則該檢測對(duì)于熒光底物而言可以使用光學(xué)儀器，而對(duì)于顯色底物而言可以用裸眼或者使用光學(xué)儀器來進(jìn)行。

“計(jì)數(shù)至少一種靶微生物”應(yīng)理解為記錄/定量靶微生物的數(shù)量，例如為細(xì)菌菌落的數(shù)量，如果靶微生物是細(xì)菌。

“樣品”應(yīng)理解為用于分析的小份或者分離的少量實(shí)體。該樣品可以是工業(yè)來源的，或者根據(jù)非窮盡的名單，還可包括空氣樣品、水樣品、取自表面、部件或制成品、或食品的樣品。在食物來源的樣品中，可以非窮盡地提及以下食品的樣品：奶制品(酸奶、奶酪…)、肉、魚、蛋、水果、蔬菜、水、飲料(牛奶、果汁、蘇打水等)。這些食物樣品也可來自調(diào)味汁或準(zhǔn)備好的餐食。最后，食物樣品可來自于動(dòng)物飼料，例如動(dòng)物或植物餐。該樣品可以是生物來源的，動(dòng)物、植物或人來源的。在此情況下，其相應(yīng)于生物流體(全血、血清、血漿、尿、腦脊液、器官分泌物、糞便…)的樣品、外部樣品(皮膚、鼻子、喉嚨、會(huì)陰、直腸、陰道…)或組織樣品或分離的細(xì)胞。該樣品可原樣使用，或者在分析之前根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，通過富集、提取、濃縮或純化進(jìn)行制備。

微生物學(xué)對(duì)照相應(yīng)于分析其目的是檢測和/或計(jì)數(shù)懷疑/能夠存在于樣品中的微生物的樣品。

作為能夠使至少一種靶微生物在根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)培養(yǎng)基上或在該反應(yīng)培養(yǎng)基內(nèi)生長的營養(yǎng)劑，可以特別提及的有氨基酸、蛋白胨(本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適濃度，避免消除作為本發(fā)明目的之抗微生物化合物的抑制作用)、糖、核苷酸、礦物質(zhì)和維生素。

如果根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)培養(yǎng)基還包含對(duì)所述至少一種靶微生物的酶活性具有特異性的酶底物，則優(yōu)選使用顯色和/或熒光底物。

“顯色和/或熒光底物”應(yīng)理解為能夠通過直接或間接可檢測的信號(hào)來檢測靶/搜尋微生物之酶或代謝活性的底物。對(duì)于直接檢測，該底物可結(jié)合至起熒光或著色標(biāo)記物作用的部件上[8]。對(duì)于間接檢測，根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)培養(yǎng)基也可包括pH指示劑，其對(duì)由底物消耗所誘發(fā)的pH變化敏感并展現(xiàn)靶微生物的代謝。所述pH指示劑可以是發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)。發(fā)色團(tuán)的例子可以是溴甲酚紫、溴麝香草酚藍(lán)、中性紅、苯胺藍(lán)和溴甲酚藍(lán)。

可在本發(fā)明中使用的顯色酶底物可以是不同性質(zhì)的。

首先應(yīng)該提及的是基于吲哚酚及其衍生物的底物，其在水解之后且有氧存在時(shí)產(chǎn)生由藍(lán)至粉紅變化的沉淀物。在本發(fā)明中，這些基于吲哚酚及其衍生物的底物是特別優(yōu)選的，這是因?yàn)樗鼈兿鄬?duì)容易使用并且在檢測和/或計(jì)數(shù)細(xì)菌的工作框架內(nèi)具有良好的敏感性。它們的應(yīng)用基本上涉及osidase型、酯酶型、脂酶型和磷酸酶型酶活性(磷酸酶是磷酸的酯酶活性)。由于非常適合用于固體或半固體載體(過濾器、瓊脂、電泳凝膠等)上，因此他們很少用于液體培養(yǎng)基(形成沉淀物)。

某些型吲哚酚衍生物代表本發(fā)明感興趣的酶底物，因?yàn)橹恋砦锏某霈F(xiàn)不需要任何添加(氧、金屬鹽等)。因此，此等酶底物的使用已證明在傾注接種細(xì)菌的工作框架內(nèi)是特別有利的。這些型吲哚酚衍生物是具體的吲哚酚衍生物(1H-吲哚-3-基)，即、連接在環(huán)狀胺上的基于吲哚酚的底物(N-芳基化)，如PCT申請(qǐng)公布WO 2010/128120(申請(qǐng)人為AG[CH])中所公開的。這些酶底物可得自于AG，尤其是可通過AG網(wǎng)站http://www.biosynth.com進(jìn)行訂購。

其次可以提及的是基于羥基喹啉、二羥基蒽醌、兒茶酚、二羥基黃酮或七葉亭及其衍生物的酶底物，其在有鐵鹽存在時(shí)產(chǎn)生著色沉淀物。它們的應(yīng)用也涉及osidase型、酯酶型和磷酸酶型的酶活性。

第三可以提及的有基于硝基酚和硝基苯胺及其衍生物的酶底物，其導(dǎo)致黃色化合物的形成。對(duì)于基于硝基酚的底物，它們可以檢測osidase、酯酶和磷酸酶活性，而對(duì)于基于硝基苯胺的底物，它們可以檢測肽酶活性。然而，在檢測肽酶活性時(shí)，所釋放的硝基苯胺對(duì)于期望鑒定或表征的細(xì)菌是毒性的，這證明對(duì)于正在進(jìn)行或者隨后進(jìn)行的分析是有害的。另一方面，它們不太適合用在固體載體上，而更適合用于液體培養(yǎng)基中。另外，顏色(黃色)在生物培養(yǎng)基中具有低對(duì)比度(這影響相應(yīng)微生物學(xué)測試的靈敏度)。

第四可以提及的是基于萘酚和萘胺及其衍生物的酶底物。在此情況下，酶-底物反應(yīng)按照兩個(gè)步驟進(jìn)行，由酶活性釋放的萘酚或萘胺在有重氮鹽存在時(shí)經(jīng)歷“偶氮偶聯(lián)”，該重氮鹽是在顯色時(shí)添加的，導(dǎo)致不溶性有色化合物的形成。它們使得能夠通過萘酚檢測osidase和酯酶活性，并通過萘胺檢測肽酶活性?！芭嫉悸?lián)”反應(yīng)是在對(duì)于細(xì)菌而言通常為化學(xué)侵略性、毒性的介質(zhì)中，并且該樣品不適合其他分析，另外萘胺化合物是致癌的。

在適合于本發(fā)明使用的熒光酶底物中，可以特別提及的是香豆素、熒光素、若丹寧、吩噁嗪和羥基黃酮的衍生物，或者是酶底物97或其衍生物。

根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，如果根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)培養(yǎng)基于其中使用根據(jù)本發(fā)明的抗微生物化合物作為選擇劑以特異性地靶向革蘭氏陰性(Gram-)菌，例如屬于沙門氏菌屬的細(xì)菌，則所述反應(yīng)培養(yǎng)基還可包含至少一種抗革蘭氏陽性(anti-Gram+)選擇系統(tǒng)和/或抗真菌選擇系統(tǒng)。該抗革蘭氏陽性和/或抗真菌選擇系統(tǒng)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。例如可以提及表面活性劑、糖肽、兩性霉素、azoles、結(jié)晶紫(非窮盡列表)，其濃度為得到所預(yù)期效果而對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，即、消除革蘭氏陽性細(xì)菌。類似地，如果根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)培養(yǎng)基使用至少一種新的抗微生物化合物作為至少一種革蘭氏陽性(Gram+)細(xì)菌(例如金黃色葡萄球菌種的細(xì)菌)的選擇劑，則可以使用至少一種對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的抗革蘭氏陰性和/或抗真菌選擇系統(tǒng)。例如，可以提及的是氨曲南、polymixins、萘啶酸。

如果需要溫育以使靶/搜尋微生物生長，則溫育接種有待測試的生物樣品的根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)培養(yǎng)基。“溫育”應(yīng)理解為升高并保持適當(dāng)?shù)臏囟裙?至48小時(shí)、優(yōu)選4至24小時(shí)、更優(yōu)選16至24小時(shí)，該溫度通常為20℃至50℃、優(yōu)選30至45℃。

“至少一種靶微生物”在本發(fā)明中應(yīng)理解為至少一種期待檢測和/或鑒定和/或計(jì)數(shù)的微生物。

相反地，“非靶微生物”應(yīng)理解為不期望檢測和/或鑒定和/或計(jì)數(shù)的微生物，而且因?yàn)椴黄谕麢z測和/或鑒定和/或計(jì)數(shù)它們，對(duì)這些非靶微生物不具有任何興趣。避免該一種或多種非靶微生物是關(guān)鍵的，因?yàn)樗鼈兡軌蛘T導(dǎo)假陽性結(jié)果，并因此影響檢測和/或鑒定和/或計(jì)數(shù)所述至少一種靶微生物的特異性。

附圖說明

圖1表示6個(gè)抗微生物化合物A-F的結(jié)構(gòu)，其抑制主要細(xì)菌組的抑制能力在以下實(shí)施例2中進(jìn)行評(píng)估(這些根據(jù)本發(fā)明的新的抗微生物化合物如結(jié)構(gòu)C和E所示，結(jié)構(gòu)A、B、D和F涉及現(xiàn)有技術(shù)的化合物)。

圖2顯示的是根據(jù)本發(fā)明的4種其他抗微生物化合物(即化合物G-J)的結(jié)構(gòu)。

圖3顯示的是用于制備β-氯-L-丙氨酰-L-1-氨基乙基膦酸18(圖1中結(jié)構(gòu)C所代表的)和β-氯-L-丙氨酰-β-氯-L-丙氨酰-L-1-氨基乙基膦酸24(圖1中結(jié)構(gòu)E所代表的結(jié)構(gòu))的合成方法的各個(gè)步驟。

圖4示意性地表示根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)抗微生物化合物的合成方法，即、化合物L(fēng)-正纈氨酰-L-β-氯丙氨酰-D/L-fosfalin 37(圖2中的化合物G)。

圖5顯示的是能夠得到化合物L(fēng)-正纈氨酰-L-β-氯丙氨酰-D/L-fosfalin 37的反應(yīng)中間體，即β-氯-L-丙氨酸O-芐基酯32(由tBoc-L-絲氨酸 41起始)的各個(gè)合成步驟。

圖6代表能夠得到化合物L(fēng)-正纈氨酰-L-β-氯丙氨酰-D/L-fosfalin 37的另一個(gè)反應(yīng)中間體，即D/L-fosfalin二乙基酯35的各個(gè)合成步驟。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例能夠使本發(fā)明更容易理解。然而，這些實(shí)施例僅用于說明，絕非是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。

實(shí)施例1：根據(jù)本發(fā)明的抗微生物化合物C和E的合成方法(圖1)

1.1總體方案

合成圖1中式A、B、D和F所代表的現(xiàn)有技術(shù)中的化合物的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。根據(jù)本發(fā)明的新的抗微生物化合物的合成方法如以下所示，其是用于圖1中式C和E所代表的化合物。該合成方法另外概括在圖3中。該合成方法框架中所用的試劑和條件如下：

i)芐基溴,DBU,苯；ii)Cl₃CCN,PPh₃,DCM,N₂,t.a.；iii)H₂,10％Pd/C,MeOH；iv)PFP,DCC,EtOAc；v)DCC,DCM,DMF；vi)HBr,AcOH,然后氧化丙烯

NMR光譜是在Bruker Ultrashield 300光譜儀(對(duì)于¹H光譜是在300MHz，而對(duì)于¹³C光譜是在75MHz)上得到的?；瘜W(xué)位移是由四甲基硅烷低磁場的ppm表示的，其中使用殘留氯仿(¹H NMR)或CDCl₃碳三重峰的中間峰¹³C NMR)作為內(nèi)標(biāo)。熔點(diǎn)是通過Reichart-Kofler加熱板顯微鏡得到的，但未進(jìn)行校正。紅外光譜是用PerkinElmer Spectrum BX FT-IR儀器記錄的。低分辨率質(zhì)譜是在使用正離子模式電蒸發(fā)源(positive ion mode electrovaporisation source)的Bruker Esquire 3000plus分析儀上記錄的。高分辨率質(zhì)譜是在納米霧化電離模式(nanospray ionisation mode)的LTQ Orbitrap XL設(shè)備上得到的。元素分析是是用Exeter Analytical CE-440元素分析儀進(jìn)行的。所有市售可得的試劑和溶劑都得自于Sigma-Aldrich、Alfa-Aesar、Fisher Scientific和Fluka，而且在使用時(shí)沒有任何附加的純化。薄層色譜是在Merck硅膠板(60F-254)上進(jìn)行的。

1.2制備^tBoc-L-絲氨酸芐基酯12

將^tBoc-絲氨酸11(16.60g,81.0mmol)溶解在苯(250mL)中，然后添加DBU(18.90g,21.6mL,124.0mmol)。接著將芐基溴(21.25g,15mL,124.0mmol)滴加至經(jīng)攪拌的反應(yīng)混合物中。在室溫下攪拌過夜后，該反應(yīng)用1M HCl溶液(150mL)進(jìn)行中和。在低壓下除去所述苯，而殘留物放入乙酸乙酯中處理。該溶液用鹽水洗滌，有機(jī)層在Na₂SO₄上干燥，然后真空除去溶劑，得到粗產(chǎn)物。柱色譜(50％石油醚,50％乙酸乙酯)后，得到白色固體形式的^tBoc-絲氨酸芐基酯12(16.90g,57.0mmol,71％)；熔點(diǎn)61-63℃(文獻(xiàn)中的熔點(diǎn)69-70℃[16])；[實(shí)測:C,60.63；H,7.16；N,4.64.C₁₅H₂₁NO₅需要C,61.00；H,7.17；N,4.74％]；ν_max/cm^-1 3417,3356(NH和OH),1756(C＝O,酯),1667(C＝O,氨基甲酸),1523(酰胺II)；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ_H1.44(9H,s,C(CH₃)₃),2.24(1H,br,OH),3.91(1H,br d,J＝11.1Hz,CH_a-3),3.98(1H,br d,J＝11.1Hz,CH_b-3),4.41(1H,br,CH-2),5.19(1H,d,J＝12.3Hz,COOCH_a),5.24(1H,d,J＝12.3Hz,COOCH_b),5.44(1H,br,NH),7.35-7.37(5H,m,5x CH_Ar)；¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ_C27.9(CH₃,C(CH₃)₃),55.6(CH,C-2),63.3(CH₂),67.1(CH₂),80.1(quat.,C(CH₃)₃),127.8(2x CH_Ar),128.1(CH_Ar),128.3(2x CH_Ar),134.9(quat.,C_Ar),153.0(quat.,C＝O),170.3(quat.,C＝O)；MS(ESI)m/z 318.3(MNa⁺)。

1.3制備^tBoc-β-氯-L-丙氨酸芐基酯13

在氮?dú)庀聦⑷纫译?15.16g,10.5mL,105.0mmol)添加至^tBoc-絲氨酸芐基酯12(15.58g,52.8mmol)在二氯甲烷(200mL)中的溶液，然后在室溫下攪拌10分鐘。在氮?dú)夥障聦⑷交?27.54g,105.0mmol)溶解在二氯甲烷(150mL)中，然后將該溶液滴加至經(jīng)攪拌的反應(yīng)混合物中。在室溫下攪拌過夜后，反應(yīng)物用鹽水(250mL)中和；分離后，有機(jī)層用鹽水萃取(3x 100mL)。有機(jī)層在無水硫酸鈉上干燥，然后在低壓下除去溶劑，得到粗產(chǎn)物。通過柱色譜進(jìn)行純制(70％石油醚,30％乙酸乙酯)，形成白色固體形式的產(chǎn)物13(14.94g,47.6mmol,90％)；熔點(diǎn)54-57℃；[實(shí)測:C,57.53；H,6.49；N,4.38.C₁₅H₂₀ClNO₄需要C,57.42；H,6.42；N,4.46％]；ν_max/cm^-1 3364(NH),1725(C＝O,酯),1680(C＝O,氨基甲酸),1518(酰胺II)；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ_H 1.45(9H,s,C(CH₃)₃),3.84(1H,dd,J＝3.3和11.4Hz,CH_a-3),4.00(1H,dd,J＝3.3和11.4Hz,CH_b-3),4.74(1H,m,CH-2),5.22(1H,d,J＝12.3Hz,COOCH_a),5.27(1H,d,J＝12.3Hz,COOCH_b),5.43(1H,d,J＝7.2Hz,NH),7.36(5H,m,5x CH_Ar)；¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ_C 28.3(CH₃,C(CH₃)₃),45.5(CH₂,C-3),54.6(CH,C-2),67.8(COOCH₂),80.5(quat.,C(CH₃)₃),128.3(CH),128.6(2x CH),128.6(2x CH),134.9(quat.,C_Ar),155.0(quat.,C＝O),169.0(quat.,C＝O)；HRMS(納米噴霧電離)計(jì)算(C₁₅H₂₁NO₄Cl)⁺314.1154,實(shí)測314.1159。

1.4制備β-氯-L-丙氨酸HBr芐基酯14

將^tBoc-β-氯-L-丙氨酸芐基酯13(1.40g,4.46mmol)溶解在最小量的乙酸(5mL)中，然后添加在AcOH中的HBr(33％m/m)(5.53mL,30.7mmol的HBr)，然后在室溫下攪拌反應(yīng)混合物10分鐘。該反應(yīng)物用二乙基醚(200mL)中和，然后該溶液在冷凍機(jī)中保持過夜。在靜置時(shí)，沉淀出白色固體，過濾收集，然后用冷二乙基醚洗滌，得到產(chǎn)物14(1.10g,3.6mmol,81％)；熔點(diǎn)131-134℃；[實(shí)測:C,40.56；H,4.51；N,4.68.C₁₀H₁₃BrClNO₂需要C,40.77；H,4.45；N,4.75％]；ν_max/cm^-1 2950,2875,2846(br NH₃⁺),1750(C＝O,酯),1489,1228,1208(C-O)；¹H NMR(300MHz,D₂O)δ_H 4.17(1H,dd,J＝3.3和12.6Hz,CH_a-3),4.31(1H,dd,J＝3.3和12.6Hz,CH_b-3),4.81(1H,m,CH-2),5.31(1H,d,J＝12.3Hz,COOCH_a),5.39(1H,d,J＝12.3Hz,COOCH_b),7.55(5H,m,5x CH_Ar)；¹³C NMR(75MHz,D₂O)δ_C 41.8(CH₂,C-3),53.9(CH,C-2),69.2(COOCH₂),128.7(2x CH),128.9(2x CH),129.1(CH),134.5(quat.,C_Ar),167.0(quat.,C＝O)；HRMS(納米噴霧電離)計(jì)算(C₁₀H₁₃³⁵ClNO₂)⁺214.0629,實(shí)測214.0630。

1.5制備化合物^tBoc-β-氯-L-丙氨酸15

將^tBoc-β-氯-L-丙氨酸芐基酯13(1.57g,5.0mmol)溶解在甲醇(50mL)中，然后添加在乙酸乙酯(20mL)中的10％鈀炭(0.16g)。反應(yīng)物在1.5bar H₂壓力下攪拌過夜。用Celite塞通過過濾除去催化劑，然后用甲醇(200mL)洗滌。低壓除去甲醇后，粗產(chǎn)物通過柱色譜進(jìn)行純制(95％二氯甲烷,5％甲醇)，得到白色固體形式的產(chǎn)物15(0.99g,4.4mmol,88％)；熔點(diǎn)119-123℃(文獻(xiàn)中的熔點(diǎn)123-125℃(13))；ν_max/cm^-1 3434(NH),2975(OH),1752(C＝O),1734(C＝O),1677,1521(酰胺II),1370,1212；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ_H1.47(9H,s,C(CH₃)₃),3.90(1H,dd,J＝2.7和11.1Hz,CH_a-3),4.05(1H,d,J＝11.1Hz,CH_b-3),4.78(1H,m,CH-2),5.47(1H,d,J＝6.3Hz,NH)；¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ_C 28.3(CH₃,C(CH₃)₃),45.2(CH₂,C-3),54.3(CH,C-2),80.9(quat.,C(CH₃)₃),155.3(quat.,C＝O,C-4),173.2(quat.,C＝O,C-1)；HRMS(納米噴霧電離)計(jì)算(C₈H₁₃NO₄³⁵Cl)^-222.0539,實(shí)測222.0541。

1.6制備^tBoc-β-氯-L-丙氨酸五氟苯酚酯16

將^tBoc-β-氯-L-丙氨酸15(1.16g,5.2mmol)和五氟苯酚(0.95g,5.7mmol)溶解在乙酸乙酯(25mL)中，然后在冰浴中冷卻。添加二環(huán)己基碳二亞胺(1.05g,5.7mmol)，然后該溶液攪拌3小時(shí)。沉淀出的副產(chǎn)物脲通過過濾除去。殘留物在低壓下濃縮，然后通過過濾除去任何額外的沉淀物。剩余的乙酸乙酯通過蒸發(fā)被除去。如此得到的油用石油醚研磨，通過過濾收集得到產(chǎn)物16白色固體形式的(3.35g,8.6mmol,69％)；熔點(diǎn)128-131℃；[實(shí)測:C,43.53；H.3.49；N,3.63.C₁₄H₁₃³⁵ClF₅NO₄需要C,43.15；H,3.36；N,3.59％]；ν_max/cm^-1 3367(NH),1780(C＝O),1681(C＝O),1518(酰胺II)；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ_H 1.48(9H,s,C(CH₃)₃),3.94(1H,dd,J＝3.6和11.4Hz,CH_a-3),3.96(1H,dd,J＝3.6和11.4Hz,CH_b-3),5.10(1H,br t,J＝3.6Hz,CH-2),5.46(1H,d,J＝7.5Hz,NH)；¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ_C 28.25(CH₃,C(CH₃)₃),44.78(CH₂,C-3),54.55(CH,C-2),81.26(quat.,C(CH₃)₃),118.94(m,C-F_Ar),154.74(quat.,C-1’),154.79(quat.,C＝O,C-4),166.77(quat.,C＝O,C-1)；¹⁹F NMR(282MHz,CDCl₃)δ_F-161.67(2F,t,J＝19.8Hz,CF-3’和5’),-156.73(1F,t,J＝23.1Hz,CF-4’),-151.63(2F,d,J＝18.9Hz,CF-2’和6’)；MS(ESI)m/z388.8(M-H)^-。

1.7制備^tBoc-β-氯-L-丙氨酰-L-fosfalin二乙基酯17

將L-fosfalin二乙基酯(1.10g,6.1mmol)溶解在無水DCM(50mL)中，然后在冰浴中冷卻。分批添加^tBoc-β-氯-丙氨酰五氟苯酚酯16(2.37g,6.1mmol)，然后反應(yīng)混合物在室溫下攪拌直至反應(yīng)完全。該反應(yīng)物用水中和(150mL)，然后用二氯甲烷(3x100mL)進(jìn)行萃取。有機(jī)層在無水MgSO₄上干燥，然后真空除去溶劑。殘留物通過柱色譜進(jìn)行純制(50％石油醚,50％乙酸乙酯直至90％乙酸乙酯,10％甲醇)，得到白色固體形式的產(chǎn)物17(1.45g,3.8mmol,62％)；熔點(diǎn)80-83℃；[實(shí)測:C,43.46；H,7.27；N,7.21.C₁₄H₂₈ClN₂O₆P需要C,43.47；H,7.30；N,7.24％]；ν_max/cm^-1 3303,3215,3065,2978(NH),1716(C＝O),1667(C＝O),1555,1518(酰胺II)；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ_H 1.25-1.42(9H,m,3x CH₃),1.46(9H,s,C(CH₃)₃),3.73(1H,dd,J＝4.2和11.1Hz,CH_a-3),4.00(1H,dd,J＝4.2和11.1Hz,CH_b-3),4.07-4.18(4H,m,2x OCH₂),4.39-4.54(2H,m,CH-2和2’),5.35(1H,d,J＝8.4Hz,NH),6.77(1H,d,J＝8.7Hz,NH)；¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ_C15.8(CH₃,C-3’),16.3-16.5(2x CH₃,m,CH₃CH₂O),28.2(3x CH₃,C(CH₃)₃),40.3(CH),42.4(CH),44.9(CH₂,C-3),62.6(CH₂,d,J＝6.75Hz,OCH₂CH₃),62.9(CH₂,d,J＝6.6Hz,OCH₂CH₃),80.8(quat.,C(CH₃)₃),155.0(quat.,C＝O),168.3(quat.,C＝O)；³¹P NMR(121.5MHz,CDCl₃)δ_P 24.6(m)；MS(ESI)m/z 387.3(MH⁺),409.3(MNa⁺),385,1(M^-)。

1.8得到化合物β-氯-L-丙氨酰-L-fosfalin 18(圖1中的化合物)

在33％m/m HBr/乙酸(17mL)中攪拌tBoc-β-氯-L-丙氨酰-L-fosfalin二乙基酯17(1.33g,3.4mmol)共24h。將反應(yīng)混合物傾倒在二乙基醚(200mL)中，然后放置在冷凍機(jī)(-15℃)中過夜。潷析掉二乙基醚，而將殘留的沉淀物放入最小量的甲醇(約10mL)中。大大過量地添加氧化丙烯(約250mL)。過濾吸水性的沉淀物，然后由水和丙酮中重結(jié)晶，得到白色固體形式的產(chǎn)物18(0.99g,3.2mmol,93％)；熔點(diǎn)210-212℃；[實(shí)測:C,25.80；H,5.21；N,12.04.C₅H₁₂ClN₂O₄P需要C,26.04；H,5.25；N,12.15％]ν_max/cm^-13258(br NH),3100,2930(br)(OH),1654(C＝O),1565,1514(酰胺II),1038；¹H NMR(300MHz,D₂O)δ_H 1.30(3H,dd,J＝7.2和15Hz,CH₃-3’),3.97-4.11(3H,m,CH₂-3和CH-2’),4.39(1H,m,CH-2)；¹³C NMR(75MHz,D₂O)δ_C 15.2(CH₃,C-3’),42.6(CH₂,C-3),44.2(CH,d,J＝147.9Hz,C-2’),54.2(CH,C-2),165.6(quat.,C＝O,C-1)；³¹P NMR(121.5MHz,CDCl₃)δ_P 18.6(m)；HRMS(納米噴霧電離)計(jì)算(C₅H₁₁N₂O₄P³⁵Cl)^-229.0150,實(shí)測229.0154。

1.9制備^tBoc-β-氯-L-丙氨酰-β-氯-L-丙氨酸芐基酯19

將β-氯-L-丙氨酸芐基酯氫溴酸鹽14(1.13g,3.9mmol)溶解在DMF(30mL)，然后在0℃下添加至^tBoc-β-氯-L-丙氨酸五氟苯酚酯16(1.50g,3.9mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液內(nèi)。在該溶液內(nèi)滴加二異丙基乙基胺(0.50g,0.66mL,3.9mmol)。如此得到的混合物在室溫下攪拌2小時(shí)，然后加熱至35℃，反應(yīng)的進(jìn)展通過TLC(80％石油醚,20％乙酸乙酯)進(jìn)行監(jiān)測。一旦反應(yīng)完全，用1M HCl溶液(50mL)進(jìn)行中和，并用水(100mL)和鹽水(100mL)洗滌有機(jī)層。有機(jī)層在無水硫酸鈉上干燥，然后真空蒸發(fā)溶劑。粗產(chǎn)物通過梯度柱色譜進(jìn)行純制(由80％石油醚,20％乙酸乙酯；至50％石油醚,50％乙酸乙酯)，得到白色固體形式的產(chǎn)物19(1.16g,2.8mmol,70％)；熔點(diǎn)89-91℃；[實(shí)測:C,51.83；H,5.78；N,6.78.C₁₈H₂₄³⁵Cl₂N₂O₅需要C,51.56；H,5.77；N,6.68％]；ν_max/cm^-1 3336(NH),3321(NH),1739(C＝O),1655(m,C＝O),1508(酰胺II)；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ_H 1.48(9H,s,C(CH₃)₃),3.73(1H,dd,J＝4.8和11.1Hz,CH),3.89-4.06(3H,m,3x CH),4.55(1H,br,CH),4.98(1H,m,CH),5.24(2H,m,COOCH₂),5.35(1H,br,NH),7.25(1H,br,NH),7.37(5H,br s,5x CH_Ar)；¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ_C 28.24(CH₃,C(CH₃)₃),33.90(CH₂Ph),44.5(CH),44.60(CH₂),53.61(CH),68.13(CH₂),81.37(quat.,C(CH₃)₃),128.22(CH_Ar),128.41(CH_Ar),128.69(CH_Ar),134.71(quat.),168.19(2x quat.,C＝O),168.90(quat.,C＝O)；HRMS(納米噴霧電離)計(jì)算(C₁₈H₂₅N₂O₅³⁵Cl)⁺419.1135,實(shí)測419.1139。

1.10制備化合物^tBoc-β-氯-L-丙氨酰-β-氯-L-丙氨酸20

將^tBoc-β-氯-L-丙氨酸-β-氯-L-丙氨酸芐基酯19(1.00g,2.4mmol)溶解在甲醇(50mL)中，然后添加在乙酸乙酯(20mL)中的10％鈀炭(0.10g)。反應(yīng)混合物在H₂氣氛(1.8bar)中攪拌24h，然后通過Celite塞進(jìn)行過濾，并用甲醇(200mL)洗滌。真空除去溶劑，并在通過柱色譜進(jìn)行純制(95％DCM,5％甲醇)后，用石油醚研磨，得到白色固體形式的產(chǎn)物20(0.52g,1.6mmol,66％)；熔點(diǎn)72-74℃；ν_max/cm^-1 3320(NH),2978(NH),1724(C＝O),1665(C＝O),1530(酰胺II)；¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ_H 1.39(9H,s,C(CH₃)₃),3.67(1H,dd,J＝8.4和11.1Hz,CH),3.79-3.95(3H,m,CH_2和CH),4.36(1H,br,CH),4.61-4.67(1H,m,CH),7.16(1H,d,J＝8.1Hz,NH),8.38(1H,d,J＝7.5Hz,NH)；HRMS(納米噴霧電離)計(jì)算(C₁₁H₁₇³⁵Cl₂N₂O₅)^-327.0520,實(shí)測327.0517。

1.11制備^tBoc-β-氯-L-丙氨酰--氯-L-丙氨酸五氟苯酚酯22

將^tBoc-β-氯-L-丙氨酰-β-氯-L-丙氨酸20(0.48g,1.46mmol)溶解在乙酸乙酯(50mL)，并在冰浴中冷卻，然后添加五氟苯酚(0.29g,1.56mmol)和二環(huán)己基碳二亞胺(0.33g,1.61mmol)。該溶液在0℃下攪拌2小時(shí)，然后過濾除去沉淀出的脲。殘留物在真空下濃縮，并通過過濾除去任何新的沉淀物。真空除去乙酸乙酯，如此得到的油用石油醚研磨，得到白色固體形式的產(chǎn)物22(0.65g,1.3mmol,89％)，其通過過濾進(jìn)行收集，并在未純制的情況下用于下一步；ν_max/cm^-1 3334(NH),3006,2970,2939(NH),1787(C＝O),1688(C＝O),1664(C＝O),1514(酰胺II)；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ_H 1.46(9H,s,C(CH₃)₃),3.76(1H,dd,J＝4.7和11.3Hz,CH_a),3.98(1H,dd,J＝3.5和11.7Hz,CH_c),4.06(1H,dd,J＝4.4和11.3Hz,CH_b),4.16(1H,dd,J＝3.2和11.7Hz,CH_d),4.53(1H,br,CH),5.32-5.37(2H,m,CH和NH),7.31(1H,d,J＝7.1Hz,NH)。

1.12制備^tBoc-β-氯-L-丙氨酰-β-氯-L-丙氨酰-L-fosfalin二乙基酯23

在0℃下將^tBoc-β-氯-L-丙氨酰-β-氯-L-丙氨酸五氟苯酚酯22(0.95g,1.9mmol)和二乙基1-氨基乙基膦酸3(0.32g,1.9mmol)溶解在二氯甲烷(25mL)，然后在室溫下攪拌直至通過TLC監(jiān)測反應(yīng)完全。用水(100mL)萃取后，有機(jī)層在無水MgSO₄上干燥，然后低壓除去揮發(fā)性的成分。粗產(chǎn)物固體通過柱色譜進(jìn)行純制(97％DCM,3％MeOH)，得到白色固體形式的產(chǎn)物23(0.62g,1.3mmol,66％)；熔點(diǎn)154.6-155.9℃；ν_max/cm^-1 3291,3265,2962,2848(NH),1680(C＝O),1639(C＝O),1523(酰胺II)；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ_H 1.35-1.41(9H,m,3x CH₃),1.48(9H,s,C(CH₃)₃),3.73-3.80(2H,m,CH_a-3和CH_a-3’),4.01-4.2(6H,m,CH_b-3,CH_b-3’和2x OCH₂),4.43-4.54(2H,m,CH-2”和CH-2),4.79-4.84(1H,m,CH-2’),5.38(1H,d,J＝6.9Hz,NH),7.05(1H,d,J＝9.0Hz,NH),7.19(1H,d,J＝7.8Hz,NH)；¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ_C15.7(CH₃,C-3’),16.6(CH₃,OCH₂CH₃),16.7(CH₃,OCH₂CH₃),28.4(3x CH₃,C(CH₃)₃),40.7(CH),44.5(CH₂),44.6(CH₂),49.4(CH),54.1(CH),62.8(CH₂,d,J＝15.5Hz,OCH₂CH₃),63.1(CH₂,d,J＝15.7Hz,OCH₂CH₃),81.6(quat.,C(CH₃)₃),156.9(quat.,C＝O),168.9(quat.,C＝O),177.3(quat.,C＝O)；MS m/z 514.3,515.2,516.2(MNa⁺)；HRMS(納米噴霧電離)計(jì)算(C₁₇H₃₃N₂O₇P³⁵Cl₂)⁺492.1428,實(shí)測492.1422。

1.13得到β-氯-L-丙氨酰-β-氯-L-丙氨酰-L-fosfalin 24(圖1中的化合物E)

將^tBoc-β-氯-L-丙氨酰-β-氯-L-丙氨酰-L-fosfalin二乙基酯23(0.36g,0.7mmol)溶解在乙酸(5mL)中，然后添加HBr/AcOH(33％m/m(4mL)。該溶液在室溫下攪拌過夜，然后該反應(yīng)物用二乙基醚(200mL)中和。在冷凍機(jī)(-15℃)中放置4h后，潷析掉二乙基醚，由此分離如此得到的棕色油。粗產(chǎn)物用冷二乙基醚(5x 50mL)洗滌。殘留物放入甲醇(3mL)中，添加氧化丙烯(150mL)，形成白色沉淀。隨后潷析掉液體，而殘留物用冷二乙基醚(5x 30mL)研磨，得到白色固體形式的產(chǎn)物24(0.18g,0.4mmol,59％)；熔點(diǎn)157-159℃；ν_max/cm^-1 3285,3258(br NH),1646(br)(C＝O),1539(large酰胺II),1152,1044；¹H NMR(300MHz,D₂O)δ_H 1.37(3H,dd,J＝7.2和15.3Hz,CH₃-3”),3.98-4.2(5H,m,CH₂-3和CH₂-3’和CH),4.62(1H,t,J＝4.8Hz,CH),4.87-4.90(1H,m,CH)；¹³C NMR(75MHz,D₂O)δ_C 15.4(CH₃,C-3”),42.4(CH₂),43.4(CH₂),45.1(CH,C-2”),53.8(CH),55.1(CH),166.8(quat.,C＝O),168.9(quat.,C＝O)；HRMS(納米噴霧電離)計(jì)算(C₈H₁₅N₃O₅P³⁵Cl₂)^-336.0102,實(shí)測336.0096。

實(shí)施例2:評(píng)估根據(jù)實(shí)施例1合成的抗微生物化合物C和E的抗菌活性

2.1介紹

該實(shí)施例2顯示了以下研究的結(jié)果：

-評(píng)估在實(shí)施例1中合成的根據(jù)本發(fā)明的化合物，即圖1中表示的化合物C和E的抗菌活性，以及

-對(duì)比該抗菌活性和用現(xiàn)有技術(shù)的三種模擬肽(圖1中的化合物A、B和D)以及磷霉素(化合物F)得到的抗菌活性。

5個(gè)化合物A-E的抗菌活性是用大規(guī)模采集297種細(xì)菌進(jìn)行評(píng)估的，這些細(xì)菌包括主要的多抗藥性菌株，其包括產(chǎn)碳青霉烯酶的腸細(xì)菌(n＝128)、抗甲氧西林的金黃色葡萄球菌(n＝37)、以及抗糖肽的腸道球菌(n＝43)。為進(jìn)行比較還包括磷霉素(F)，其是一種天然存在的也包含膦酸基的抗生素。

作為提醒，化合物A-F如下：

A:L-丙氨酰-L-1-氨基乙基膦酸(阿拉磷)；

B:L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-1-氨基乙基膦酸(二-丙氨酰fosfalin)；

C:β-氯-L-丙氨酰-L-1-氨基乙基膦酸(β-Cl-阿拉磷)；

D:β-氯-L-丙氨酰-β-氯-L-丙氨酸(β-Cl-Ala-β-Cl-Ala)；

E:β-氯-L-丙氨酰-β-氯-L-丙氨酰-L-1-氨基乙基膦酸(β-Cl-Ala-β-Cl-阿拉磷)；

F:[(2R,3S)-3-甲基環(huán)氧乙烷-2-基]膦酸二鈉(磷霉素)。

2.2材料和方法

抗菌劑和培養(yǎng)基：磷霉素、阿拉磷、葡萄糖-6-磷酸以及無拮抗劑的瓊脂培養(yǎng)基的所有成分都購自Sigma Chemical Company,Poole,United Kingdom。瓊脂培養(yǎng)基IsoSensitest購自O(shè)xoid,Basingstoke,United Kingdom。

細(xì)菌分離菌：由各種國際來源得到腸細(xì)菌(n＝197)，并且所有都具有β-內(nèi)酰胺酶，這些酶是由著名實(shí)驗(yàn)室和/或本領(lǐng)域著名專家在分子水平上定義的。這些包括弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)(n＝5)、其它種的檸檬酸桿菌(Citrobacter)(n＝4)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)(n＝1)、陰溝腸桿菌(n＝27)、大腸埃希氏菌(n＝53)、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)(n＝5)、肺炎克雷伯氏菌(n＝87)、克呂沃爾氏菌屬(Kluyvera spp)(n＝1)、奇異變形菌(Proteus mirabilis)(n＝8)、雷氏普羅威登斯菌(Providencia rettgeri)(n＝2)、沙門氏菌屬(n＝3)、以及粘質(zhì)沙雷氏菌(n＝1)。在這些197種分離菌中，有128(65％)種是產(chǎn)碳青霉烯酶的細(xì)菌，包括87種具有NDM-1，9種具有IMP，11種具有KPC，14種具有OXA-48，以及7種具有VIM。絕大部分的產(chǎn)碳青霉烯酶的細(xì)菌聯(lián)合產(chǎn)生廣譜β-內(nèi)酰胺酶(BSBL)或頭孢菌素酶(AmpCβ-內(nèi)酰胺酶)，但后者由于清楚的原因未被記錄。在其余的分離菌中，47種具有BSBL(20種具有CTX-M，19種具有SHV型，以及8種具有TEM型)，以及22種具有AmpC(3種具有ACC-1，6種具有CMY型，6種具有DHA-1，3種具有FOX型，以及4種具有LAT型)。

采集的50株金黃色葡萄球菌分離菌包括在歐洲經(jīng)常遇見的36株抗甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)，包括在比利時(shí)、芬蘭、法國、德國以及英國分離的菌株。另一個(gè)菌株MRSA,NCTC 11939是作為對(duì)照包括在內(nèi)的，還包括甲氧西林敏感對(duì)照(NCTC 6571)。還包括最近由血液培養(yǎng)基中采集的12種其他的甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)的分離菌。最后，50種腸道球菌的分離菌包括2種對(duì)照菌株(糞腸球菌NCTC 755和屎腸球菌NCTC 7171)和48種得自于至少3所不同醫(yī)院的臨床樣品的分離菌。這些臨床分離菌包括糞腸球菌(E.faecalis)(n＝10)、屎腸球菌(E.faecium)(n＝33)、鉛黃腸球菌(Enterococcus casseliflavus)(n＝3)、鶉雞腸球菌(Enterococcus gallinarum)(n＝2)。在這50種分離菌中，如MIC值以及由PCR證實(shí)的抗性基因所表明的，43種是抗萬古霉素的。

測定最小抑制濃度(MIC)：所有的MIC都是用瓊脂稀釋法[16]測定的。這需要使用如前所述制備的沒有明確拮抗劑的培養(yǎng)基，其包含2％用皂苷溶解的馬血、25.0μg/mL的NAD和25.0μg/m的氯高鐵血紅素[17]。所測試的氯高鐵血紅素合物溶解在無菌去離子水中，然后以0.0031至8.0μg/mL(對(duì)于革蘭氏陽性菌為0.016至32μg/mL)的濃度加入瓊脂培養(yǎng)基中。所有的分離菌以相當(dāng)于無菌去離子水中0.5McFarland單位的密度進(jìn)行制備，其中使用密度計(jì)進(jìn)行測量(約1.5x 10⁸CFU/mL)，然后按1:15稀釋。接著用多點(diǎn)接種器將1份1μL每種經(jīng)稀釋的懸浮液放置在板上，達(dá)到最終推薦的接種10 000CFU/點(diǎn)[16]。磷霉素的MIC是用相同的方法測定的，但使用IsoSensitest培養(yǎng)基(Oxoid,Basingstoke,United Kingdom)，再加上25.0μg/mL的葡萄糖-6-磷酸(Sigma,Poole,United Kingdom)以及寬范圍濃度的磷霉素。所有的盤(包括無抗微生物的對(duì)照組)在37℃下培養(yǎng)22小時(shí)。所有這些測試都至少獨(dú)立充分2次，以檢查可重復(fù)性。

2.3結(jié)果

計(jì)算5個(gè)化合物A-E的最小抑制濃度(MIC)50和90，并示于下表1中。這些值分別相應(yīng)于足以在活體外抑制50％和90％細(xì)菌菌株生長的最小抗生素濃度，分別為MIC₅₀和MIC₉₀。

更具體而言，下表1示出了6種抗微生物劑對(duì)所測試的主要細(xì)菌組的MIC。阿拉磷對(duì)大多數(shù)的腸細(xì)菌分離菌具有良好的活性，雖然不同的種類表現(xiàn)出不同程度敏感性。對(duì)53種大腸埃希氏菌分離菌觀察到高活性，其中35種分離菌(66％)是產(chǎn)碳青霉烯酶的細(xì)菌。對(duì)大腸埃希氏菌的MIC₉₀為0.25μg/mL，而且在2μg/mL時(shí)抑制了所有分離菌的生長。發(fā)現(xiàn)阿拉磷的活性約為磷霉素活性的4倍。

雖然阿拉磷對(duì)大腸埃希氏菌的抗菌活性是令人滿意的，但是如前所述，已證明β-Cl-阿拉磷對(duì)大腸埃希氏菌的活性至少是阿拉磷活性的2倍，并且至少是磷霉素活性的8倍。MIC₉₀是0.125μg/mL，而且在0.5μg/mL時(shí)看見所有分離菌的生長都被抑制。

與大腸埃希氏菌相比，肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)于所有測試的化合物都更為不敏感，但多種分離菌表現(xiàn)出較低的MIC。例如，87％的肺炎克雷伯氏菌分離菌被8μg/mL阿拉磷抑制，而93％被8μg/mLβ-Cl-阿拉磷抑制。

陰溝腸桿菌(E.cloacae)(n＝27)被4μg/mL阿拉磷抑制，其對(duì)該菌種的活性通常為磷霉素的32倍。如前所述，已證實(shí)β-Cl-阿拉磷是活性最高的化合物，其中在1μg/mL時(shí)抑制所有的分離菌。其它種的腸細(xì)菌不在表1中，這是因?yàn)橹挥械陀?0種測試的分離菌。

對(duì)于分類群檸檬酸桿菌(n＝9)、產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)(n＝1)、克呂沃爾氏菌屬(n＝1)和粘質(zhì)沙雷氏菌(S.marcescens)(n＝1)，所有分離菌對(duì)于≤4μg/mL阿拉磷和≤2μg/mLβ-Cl-阿拉磷都是敏感的。5種產(chǎn)酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)分離菌中的一種需要MIC>8μg/mL阿拉磷，但是所有都被≤2μg/mLβ-Cl-阿拉磷抑制，再一次表明后者具有高度令人滿意的抗菌活性。

8種奇異變形菌(P.mirabilis)和2種雷氏普羅威登斯菌(P.rettgeri)分離菌對(duì)于所有的測試藥劑(包括磷霉素)都需要MIC≥8μg/mL。

3種沙門氏菌屬分離菌對(duì)于阿拉磷表現(xiàn)出MIC≥8.0μg/mL，但是對(duì)于β-Cl-阿拉磷僅為2.0-4.0μg/mL。

β-Cl-阿拉磷和β-Cl-Ala-β-Cl-Ala對(duì)金黃色葡萄球菌具有最高的活性，但是在5種肽抗微生物劑之間則具有略微總的差異。90％的源自各種地理源的MRSA分離菌被8.0μg/mL阿拉磷抑制，而所有的分離菌被2.0μg/mLβ-Cl-阿拉磷抑制，再一次表明其具有比阿拉磷更高的抗菌活性。

對(duì)于腸球菌，最顯著的觀察結(jié)果是二丙氨酰fosfalin的高活性，對(duì)此MIC(平均)比阿拉磷的活性低16倍，而且在某些情況下，低256倍。在34種屎腸球菌分離菌(包括31種抗萬古霉素分離菌)中，所有都被32μg/mL阿拉磷或4μg/mL二-丙氨酰fosfalin抑制。在任何情況下，在腸球菌中，β-Cl-Ala-β-Cl-阿拉磷(根據(jù)本發(fā)明的化合物)的抗菌活性證實(shí)比阿拉磷的活性高。

2.4結(jié)論

如我們?cè)诖搜芯恐兴@示的，根據(jù)本發(fā)明的抗微生物化合物，特別是β-Cl-阿拉磷，對(duì)于絕大多數(shù)的細(xì)菌、特別是絕大多數(shù)的多抗藥性細(xì)菌都有活體外抗菌活性(非常常見地高于阿拉磷的活性)。因此，例如，阿拉磷對(duì)于CPE的MIC₅₀和MIC₉₀分別是1μg/mL和4μg/mL，但是根據(jù)本發(fā)明的磷酸肽，β-Cl-阿拉磷，呈現(xiàn)0.5μg/mL和2μg/mL兩個(gè)值之一。阿拉磷對(duì)MRSA僅具有中等活性，其MIC₉₀為8μg/mL，而β-Cl-阿拉磷則活性更高，其MIC₉₀為2μg/mL。

與阿拉磷相比，β-Cl-Ala-β-Cl-阿拉磷針對(duì)某些菌種能夠獲得抑制作用。這對(duì)于抑制一個(gè)菌種但不改變微生物菌群之余者是有用的，例如抑制大腸埃希氏菌但不抑制其它腸細(xì)菌，或抑制糞腸球菌但不抑制屎腸球菌。這對(duì)于通過抑制其它細(xì)菌而特異性地分離一個(gè)菌種是特別有利的，例如尋找金黃色葡萄球菌。

表1:各種抗微生物劑對(duì)多種細(xì)菌的最小抑制濃度，包括具有明確抗藥機(jī)理的分離菌

縮寫:CPE:產(chǎn)碳青霉烯酶的腸桿菌科；BSBL:具有廣譜β-內(nèi)酰胺酶的腸桿菌科；MRSA:抗甲氧西林的金黃色葡萄球菌；MSSA:甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌；GRE:抗糖肽的腸球菌。

實(shí)施例3:用于檢測沙門氏菌屬細(xì)菌的根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)培養(yǎng)基

3.1培養(yǎng)基的組成

本實(shí)施例3的目的在于對(duì)比根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)培養(yǎng)基的檢測特異性，意欲檢測沙門氏菌屬的細(xì)菌，即、“改良chromID Salmonella”培養(yǎng)基對(duì)用于相同細(xì)菌的參比檢測培養(yǎng)基，即、“chromID Salmonella”培養(yǎng)基。

根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)培養(yǎng)基和參比反應(yīng)培養(yǎng)基的相應(yīng)組成示于下表2中。

表2:根據(jù)本發(fā)明反應(yīng)培養(yǎng)基和參比培養(yǎng)基的組成

3.2結(jié)果

所得結(jié)果示于以下表3中。

表3：結(jié)果

3.3結(jié)論

在chromID Salmonella培養(yǎng)基中添加β-Cl-阿拉磷使得能夠選擇性地抑制大腸埃希氏菌菌株的osidase活性。因?yàn)榕c在藍(lán)色菌落的培養(yǎng)基中相比，在無色菌落培養(yǎng)基中更容易檢測一個(gè)或多個(gè)淡紫色菌落。如果沙門氏菌株以低濃度存在于與一個(gè)或多個(gè)大腸埃希氏菌菌株的混合物中，則能夠明顯更容易地在本發(fā)明的反應(yīng)培養(yǎng)基中檢測到前者。

實(shí)施例4:根據(jù)本發(fā)明的抗微生物化合物G的合成方法(圖2):L-正纈氨酰-β–氯-L-丙氨酰-D/L-fosfalin

L-正纈氨酰-β–氯-L-丙氨酰-D/L-fosfalin(L-Nva-β-Cl-L-Ala-D/L-fosfalin)由下式代表：

抗微生物化合物的合成詳細(xì)說明如下。該相應(yīng)的合成方法另外也示于圖4中。

如圖4中所示，根據(jù)本發(fā)明的上述化合物是由^tBoc-L-正纈氨酸(市售可得的)、β-氯-L-丙氨酸O-芐基酯(其合成示于圖5中)和D/L-fosfalin二乙基酯(其合成示于圖6中)合成的。

4.1由化合物^tBoc-L-絲氨酸41(如圖5所示)合成反應(yīng)中間體β-氯-L-丙氨酸O-芐基酯32

4.1.1合成(S)-芐基2-((tert-丁氧基羰基)氨基)-3-羥基丙酸酯(^tBoc-L-絲氨酸O-芐基酯)43[9]

將^tBoc-L-絲氨酸(市售可得的)41(30mmol,6.16g)溶解在無水苯(100mL)中，然后向其中添加1,8-二氮雜二環(huán)[5,4,0]十一烷-7-烯(DBU)(36mmol,5.5mL)和芐基溴42(36mmol,4.4mL)。該溶液在室溫和氮?dú)庀聰嚢柽^夜，然后在低壓下除去溶劑，得到米色液體殘留物。添加乙酸乙酯(200mL)，燒瓶中的內(nèi)容物進(jìn)行超聲處理，然后用1M HCl溶液(2x 50mL)、10％w/v K₂CO₃水溶液(2x 50mL)和鹽水(2x 50mL)洗滌。有機(jī)層在MgSO₄上干燥，過濾，真空濃縮并通過柱色譜純制[石油溶劑油/乙酸乙酯(1:1)]，得到白色固體形式的產(chǎn)物43(8.05g,27.3mmol,91％)；m.p.61–66℃(lit.m.p.[10]59–60℃)；[α]²¹_D-18.5°(c 1.0,CH₃OH)；ν_max/cm^-1 3419(NH),3361(OH),2978(CH),1758(C＝O),1668(C＝O),1524(NH bend),1155(C-O),1068(C-O)；¹H NMR(300MHz,DMSO)δ_H 1.38(9H,s,C(CH₃)₃),3.68(2H,t,J＝6.0Hz,CH₂OH),4.10-4.16(1H,m,CH-2),4.91(1H,t,J＝6.0Hz,OH),5.10(1H,d,J＝12.0Hz,OCH_2aAr),5.17(1H,d,J＝12.0Hz,OCH_2bAr),6.97(1H,d,J＝9.0Hz,NH),7.32-7.38(5H,m,5x CH_Ar)；¹³C NMR(75MHz,DMSO)δ_C 28.6(C(CH₃)₃),57.0(CH-2),61.8(CH₂-3),66.2(OCH₂Ar),78.8(C(CH₃)₃),128.0(CH_Ar),128.4(CH_Ar),128.8(CH_Ar),136.5(CH_Ar quat),155.8(C-4,quat),171.4(C-1,quat)。

4.1.2合成(R)-芐基2-((tert-丁氧基羰基)氨基)-3-氯丙酸酯(^tBoc-β-氯-L-丙氨酸O-芐基酯)44[11]

將上述步驟4.1.1中得到的((S)-芐基2-(((tert-丁氧基羰基)氨基)-3-羥基丙酸酯43(25mmol,7.39g)溶解在無水DCM(100mL)中，然后添加三氯-乙腈(50mmol,5.0mL)。該溶液在室溫下攪拌2小時(shí)。向該溶液丈夫緩慢添加在無水DCM(50mL)中的三苯基膦(50mmol,13.15g)。如此得到的溶液在室溫和氮?dú)庀聰嚢柽^夜。添加鹽水(100mL)，以使反應(yīng)停止。分離后，有機(jī)層用鹽水(3x 60mL)洗滌，在MgSO₄上干燥，過濾并真空濃縮，得到橙色液體殘留物。殘留物通過柱色譜進(jìn)行純制[石油溶劑油/乙酸乙酯(7:3)]，得到米色固體形式的產(chǎn)物44(7.41g,23.6mmol,95％)；m.p.53–58℃；[α]²²_D-23.0°(c 1.0,CH₃OH)；ν_max/cm^-1 3365(NH),2917(CH),1727(C＝O),1679(C＝O),1522(NH bend),1181(C-O),1158(C-O)；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ_H 1.45(9H,s,C(CH₃)₃),3.85(1H,dd,J＝12.0Hz,3.0Hz,CH_2a-3),3.99(1H,dd,J＝12.0Hz,3.0Hz,CH_2b-3),4.74(1H,m,CH-2),5.20(1H,d,J＝12.0Hz,OCH_2aAr),5.25(1H,d,J＝12.0Hz,OCH_2bAr),5.44(1H,d,J＝6.0Hz,NH),7.33-7.38(5H,m,5x CH_Ar)；¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ_C 27.3(C(CH₃)₃),44.5(CH₂-3),53.5(CH-2),66.8(OCH₂Ar),79.5(C(CH₃)₃),127.3(CH_Ar),127.6(CH_Ar),127.6(CH_Ar),133.9(CH_Ar quat),154.0(C-4,quat),168.0(C-1,quat)；CHN[實(shí)測:C,57.71；H,6.46；N,4.18.C₁₅H₂₀ClNO₄需要C,57.42；H,6.42；N,4.46％].

4.1.3合成(R)-1-(芐基氧基)-3-氯-1氧代丙烷-2-氯化銨(β-氯-L-丙氨酸鹽酸鹽)32

將在上述步驟4.1.2.中得到的化合物44(10mmol,3.14g)溶解在2M HCl之乙醚溶液(200mL)中。該溶液在室溫下攪拌過夜。由此得到的固體過濾并用二乙基醚洗滌，得到白色固體形式的產(chǎn)物32(2.36g,9.5mmol,95％)；m.p.145℃(secondary)；ν_max/cm^-12848(CH),1749(C＝O),1593(Ar C-C),1490(Ar C-C),1231(C-O)；¹H NMR(300MHz,DMSO)δ_H 4.16(1H,dd,J＝12.0Hz,3.0Hz,CH_2a-3),4.22(1H,dd,J＝12.0Hz,3.0Hz,CH_2b-3),4.77(1H,t,J＝3.0Hz,CH-2),5.26(1H,d,J＝12.0Hz,OCH_2aAr),5.31(1H,d,J＝15.0Hz,OCH_2bAr),7.33-7.46(5H,m,5x CH_Ar),9.09(3H,br,NH₃⁺)；¹³C NMR(75MHz,DMSO)δ_C 43.3(CH₂-3),53.5(CH-2),68.0(OCH₂Ar),128.6(CH_Ar),128.8(CH_Ar),128.9(CH_Ar),135.4(CH_Ar quat),167.0(C-1,quat)；CHN[實(shí)測:C,47.16；H,5.43；N,5.43.C₁₀H₁₃Cl₂NO₂·0,2H₂O需要C,47.34；H,5.32；N,5.52％].

4.2合成(R)-芐基2-((S)-2-((tert-丁氧基羰基)氨基)戊酰胺基)-3-氯丙酸酯(^tBoc-L-正纈氨酰-β-氯-L-丙氨酸O-芐基酯)33

將^tBoc-L-正纈氨酸(市售可得的)31(6.0mmol,1.31g)溶解在無水THF(50mL)中，然后添加N-甲基嗎啉(6.0mmol,0.66mL)。該溶液接著冷卻至0℃，然后滴加氯甲酸異丁基酯(6.0mmol,0.78mL)?；旌衔镌?℃和氮?dú)庀聰嚢?小時(shí)。于0℃下向該攪拌的溶液中添加在上述步驟4.1.3中得到的一些(R)-1-(芐基氧基)-3-氯-1-氧代丙烷-2-氯化銨(β-Cl-L-丙氨酸芐基酯的鹽酸鹽)32(5.4mmol,1.36g)，其事先在無水DCM(30mL)中用N-甲基嗎啉(5.4mmol,0.59mL)中和。該如此得到溶液在室溫和氮?dú)庀聰嚢柽^夜。該溶液過濾并真空濃縮。殘留物溶解在DCM(60mL)中并用10％w/v檸檬酸溶液(2x 25mL)、接著用水(25mL)洗滌。有機(jī)層在MgSO₄上干燥，過濾并真空濃縮，得到一黃色液體，其通過柱色譜進(jìn)行純制[石油溶劑油/乙酸乙酯(7:3)]，得到白色固體形式的產(chǎn)物33(1.74g,4.2mmol,78％)；m.p.95–98℃；[α]²⁵_D-25.0°(c 1.0,CH₃OH)；ν_max/cm^-1 3327(NH),2960(CH),1738(C＝O),1668(C＝O),1518(NH bend),1169(C-O)；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ_H 0.92(3H,t,J＝9.0Hz,CH₃-8),1.35-1.45(11H,[m,CH₂-7],[s,C(CH₃)₃]),1.52-1.65(1H,m,CH_2a-6),1.75-1.82(1H,m,CH_2b-6),3.89(1H,dd,J＝12.0Hz,3.0Hz,CH_2a-3),3.99(1H,dd,J＝12.0Hz,3.0Hz,CH_2b-3),4.11-4.15(1H,m,CH-5),4.96-5.00(2H,[m,CH-2],[m,HNCO₂]),5.20(1H,d,J＝12.0Hz,OCH_2a Ar),5.25(1H,d,J＝12.0Hz,OCH_2a-Ar),6.97(1H,d,J＝6.0Hz,HNCO),7.33-7.37(5H,m,5x CH_Ar)；¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ_C 12.7(CH₃-8),17.8(CH₂-7),27.3(C(CH₃)₃),33.4(CH₂-6),43.8(CH₂-3),52.2(CH-2),53.4(CH-5),67.0(OCH₂Ar),79.3(C(CH₃)₃),127.4(CH_Ar),127.6(CH_Ar),127.7(CH_Ar),133.8(CH_Ar quat),154.5(C-9,quat),167.5(C-1,quat),171.2(C-4,quat)；CHN[實(shí)測:C,58.49；H,7.22；N,6.81.C₂₀H₂₉ClN₂O₅需要C,58.18；H,7.08；N,6.78％]；HRMS(納米噴霧電離)計(jì)算(C₂₀H₃₀ClN₂O₅)⁺413.1838,實(shí)測MH⁺413.1837.

4.3合成(R)-2-((S)-2-((tert-丁氧基羰基)氨基)戊酰胺基)-3-氯丙酸(^tBoc-L-正纈氨酰-β-氯-L-丙氨酸)34

將在上述步驟4.2中得到的產(chǎn)物33(1.8mmol,0.75g)溶解在甲醇(60mL)中，然后添加至不銹鋼壓力容器中。添加10％鈀炭(0.0941g)，如此得到的溶液在3.5bar H₂壓和室溫下攪拌72小時(shí)。在Celite上過濾除去催化劑，用甲醇洗滌并真空濃縮，得到亮黃色固體形式的產(chǎn)物34(0.573g,1.78mmol,99％)；m.p.59-63℃；[α]²⁵_D-12.0°(c 1.0,CH₃OH)；ν_max/cm^-13313(NH),2964(CH),1655(C＝O),1509(NH bend),1161(C-O)；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ_H0.87(3H,t,J＝4.2Hz,CH₃-8),1.38(11H,[m,CH₂-7],[s,C(CH₃)₃]),1.51-1.62(1H,m,CH_2a-6),1.67-1.79(1H,m,CH_2b-6),3.91(2H,m,CH₂-3),4.19(1H,m,CH-5),4.85(1H,m,CH-2),5.20(1H,m,NH氨基甲酸),6.45(1H,br,OH),7.25(1H,m,NH酰胺)；¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ_C12.7(CH₃-8),17.9(CH₃-7),27.3(C(CH₃)₃),33.6(CH₂-6),43.4(CH-3),52.4(CH-2),53.2(CH-5),79.7(C(CH₃)₃),155.1(C-9,quat),170.7(C-1/4,quat),172.0(C-1/4,quat)；CHN[實(shí)測:C,48.77；H,7.61；N,8.22.C₁₃H₂₃ClN₂O₅需要C,48.37；H,7.18；N,8.68％].

4.4合成反應(yīng)中間體D/L-fosfalin二乙基酯35

如圖6所示，D/L-fosfalin二乙基酯35是根據(jù)Kudzin和Stec法[9]由N-苯基硫脲53、三苯基亞磷酸酯52和乙醛51在酸性條件下合成的。該反應(yīng)中間體的合成詳細(xì)說明如下。

4.4.1合成(β)-(1-氨基乙基)膦酸(D/L-fosfalin)54[12]

將N-苯基硫脲53(40mmol,6.10g)溶解在冰乙酸(20mL)中。滴加乙醛51(60mmol,3.40mL)，然后添加三苯基亞磷酸酯52(40mmol,11mL)。該溶液在室溫下攪拌5分鐘，然后在85℃下加熱至回流1小時(shí)。添加冰乙酸(2mL)和鹽酸(37％,20mL)的混合物，然后將反應(yīng)物在145℃下加熱至回流過夜。該溶液在室溫下冷卻，轉(zhuǎn)移至500mL圓底燒瓶中并用乙醇洗滌。通過過濾得到少量的fosfalin鹽酸鹽，而濾液進(jìn)行真空濃縮，得到暗橙色的液體殘留物。將該殘留物溶解在最小量的乙醇(20mL)中，然后添加氧化丙烯(120mL)，產(chǎn)生白色沉淀物。該白色固體在氮?dú)庵羞^濾，并在干燥器(在五氧化磷上)中干燥3天，然后由熱水/乙醇中重結(jié)晶，得到白色固體形式的兩性離子產(chǎn)物54(4.39g,35mmol,88％)；m.p.265–268℃(s)(lit.m.p.[13]271–275℃)；ν_max/cm^-12910(br OH),1616(P-OH),1532(NH bend),1143(P＝O),1035(P-O),930(P-O)；¹H NMR(500MHz,D₂O)δ_H 1.47(3H,dd,J_P-H＝14.9Hz和J_H-H＝7.3Hz,CH₃),3.40(1H,m,CH)；¹³C NMR(125MHz,D₂O)δ_C 13.5(CH₃,d,J_P-C＝2.7Hz),44.7(CH,d,J_P-C＝144.2Hz).

4.4.2合成(1-(2,2,2-三氟-乙酰胺基)乙基)膦酸二乙基酯56[14]

將在上述步驟4.4.1中得到的1-氨基乙基膦酸44(40mmol,6.47g)添加至三氟乙酸(5mL)和三氟乙酸酐(25mL)的混合物中。該溶液攪拌并在60℃加熱至回流。1小時(shí)后，該溶液冷卻，然后緩慢地添加原甲酸三乙基酯(150mL)。該溶液在110℃加熱至回流共2小時(shí)，然后冷卻至室溫。真空除去溶劑，得到棕色固體。將該固體重新溶解在DCM中，然后通過柱色譜純制[DCM/MeOH(9:1)]，得到米色固體形式的產(chǎn)物56(11.00g,39.6mmol,99％)；m.p.98–103℃(s)(lit.m.p.³ 101–102℃)；ν_max/cm^-1 3202(NH),1715(C＝O),1565(NH bend),1210(P＝O),1011(C-F),968(P-O)；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ_H 1.23(3H,t,J＝6.0Hz,OCH₂CH₃-a),1.28(3H,t,J＝9.0Hz,OCH₂CH₃-b),1.38(3H,dd,J_P-H＝15.0Hz和J_H-H＝6.0Hz,CH₃-2),3.98-4.13(4H,m,2x OCH₂CH₃),4.32-4.47(1H,m,CH-1),8.11(1H,d,J＝9.0Hz,NH)；¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ_C 13.7(CH₃-2),15.2(OCH₂CH₃,d,J_P-C＝2.3Hz),15.3(OCH₂CH₃,d,J_P-C＝1.5Hz),40.8(CH-1,d,J_P-C＝159.0Hz),61.8(OCH₂CH₃,d,J_P-C＝6.8Hz),62.2(OCH₂CH₃,d,J_P-C＝7.5Hz),114.9(CF₃,q,J_F-C＝285.8Hz),156.0(C＝O,q,J_F-C＝6.0Hz)；³¹P-¹H_decoup NMR(121MHz,CDCl₃)δ_P 23.0；¹⁹F-¹H_decoup NMR(282MHz,CDCl₃)δ_P-75.5.

4.4.3合成(β)-二乙基(1-氨基乙基)膦酸酯(D/L-fosfalin二乙基酯)35[15]

將在上述步驟4.4.2.中得到的(1-(2,2,2-三氟-乙酰胺基)乙基)膦酸二乙基酯56(20mmol,5.55g)溶解在乙醇(200mL)中，然后緩慢添加硼氫化鈉(200mmol,7.57g)。如此得到的混合物在室溫下攪拌1小時(shí)，然后加熱至回流(90℃)3小時(shí)。該溶液冷卻至室溫，然后在低壓下除去溶劑，得到白色固體殘留物。該殘留物用NaHCO₃(96g/L)飽和溶液(150mL)處理，然后在DCM(6x 50mL)中萃取。有機(jī)層在MgSO₄上干燥并過濾。濾液進(jìn)行真空濃縮，得到淡黃色液體，然后通過柱色譜純制[DCM/MeOH(9.0:1.0)]，得到黃色液體形式的產(chǎn)物35(2.52g,13.9mmol,70％)；ν_max/cm^-1 3431(NH),2980(CH),1215(P＝O),1020(P-O),957(P-O)；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ_H 1.19-1.30(9H,[dd,J_P-H＝17.4Hz,7.2Hz,CH₃-2],[t,J＝7.2Hz,2x OCH₂CH₃),1.65(2H,br,NH₂),2.99-3.09(1H,m,CH-1),4.02-4.14(4H,m,2x OCH₂CH₃)；¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ_C 15.5(OCH₂CH₃-a),15.6(OCH₂CH₃-b),16.3(CH₃-2),43.3(CH-1,d,J_P-C＝148.5Hz),61.1(OCH₂CH₃-a,d,J_P-C＝1.5Hz),61.2(OCH₂CH₃-b,d,J_P-C＝1.5Hz)；³¹P-¹H_decoupNMR(121MHz,CDCl₃)δ_P 29.6.

4.5合成((2S-1-(((2R)-3-氯-1-((1-(二乙氧基磷?；?乙基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-1-氧代戊烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯(^tBoc-L-正纈氨酰-β-氯-L-丙氨酰-D/L-fosfalin二乙基酯)36

將在上述步驟4.3中得到的(R)-2-((S)-2-((tert-丁氧基羰基)氨基)戊酰胺基)-3-氯丙酸(^tBoc-L-正纈氨酰-β-氯-L-丙氨酸)34(1.8mmol,0.58g)溶解在無水THF(35mL)中，然后添加N-甲基嗎啉(1.9mmol,0.21mL)。該溶液冷卻至0℃，然后滴加異丁基氯甲酸酯(1.9mmol,0.25mL)?；旌衔镌?℃下攪拌1小時(shí)。將在無水THF(10mL)中的于上述步驟4.4.3.中得到的1-氨基乙基膦酸二乙基酯(D/L-fosfalin二乙基酯)35(1.8mmol,0.33g)添加至上述攪拌溶液中，如此得到的溶液在氮?dú)夂褪覝叵聰嚢柽^夜。該溶液過濾并真空濃縮。殘留物溶解在DCM(60mL)中，然后用10％w/v檸檬酸溶液(2x30mL)、10％w/v碳酸鉀(30mL)和水(30mL)洗滌。有機(jī)層在MgSO₄上干燥，過濾并真空濃縮，得到亮黃色液體殘留物。殘留物通過柱色譜進(jìn)行純制[乙酸乙酯/甲醇(96:4)]，得到粘稠白色固體形式的產(chǎn)物36(0.45g,0.93mmol,52％)；m.p.196℃(分解)；[α]²⁴_D-22.5°(c 1.0,CH₃OH)；ν_max/cm^-1 3272(NH),2977(CH),1709(C＝O),1644(C＝O),1530(NH bend),1229(C-O),1165(P-O),1019(P-O),972(P-O)；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ_H 0.86(3H,t,J＝6.0Hz,CH₃-12),1.17-1.38(20H,[m,2x OCH₂CH₃],[m,CH₃-2],[s,C(CH₃)₃],[m,CH₂-11]),1.53-1.59(1H,m,CH_2a-10),1.70-1.86(1H,m,CH_2b-10),3.69(1H,dd,J＝12.0Hz,3.0Hz,CH_2a-6),3.91(1H,dd,J＝12.0Hz,3.0Hz,CH_2a-6),3.97-4.13(5H,[m,2x OCH₂CH₃],[m,CH-9]),4.35-4.46(1H,m,CH-1),4.73-4.79(1H,m,CH-5),4.97-5.03(1H,m,NH-13),7.00-7.10(1H,2x d,J＝9.0Hz,9.0Hz,NH-7,非對(duì)映-異構(gòu)體L,L,L和L,L,D),7.23-7.34(1H,2x d,J＝9.0Hz,9.0Hz,NH-3,非對(duì)映-異構(gòu)體L,L,L和L,L,D)；¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ_C 12.7(CH₃-12),14.5(CH₃-2),15.3,15.5(2x OCH₂CH₃),17.9(CH₂-11),27.3(C(CH₃)₃),33.2(CH₂-10),40.4(d,J_P-C＝157.5Hz,CH-1),43.4(CH₂-6),52.7(CH-5),61.4,61.9(2x OCH₂CH₃),79.4(C(CH₃)₃),155.0(C-14,quat),166.8(C-4,quat),171.4(C-8,quat)；³¹P-¹H_decoup NMR(121MHz,CDCl₃)δ_P 24.8；HRMS(納米噴霧電離)計(jì)算(C₁₉H₃₈ClN₃O₇P)⁺486.2130,實(shí)測486.2124；CHN[實(shí)測:C,46.51；H,7.76；N,8.21.C₁₉H₃₇ClN₃O₇P需要C,46.96；H,7.67；N,8.65％].

4.6合成氫合(1-((R)-2-((S)-2-銨基戊酰胺基)-3-氯丙酰胺基)乙基)膦酸(L-正纈氨酰-β-氯-L-丙氨酰-D/L-fosfalin)37

將在上述步驟4.5中得到的((2S)-1-(((2R)-3-氯-1-((1-(二乙氧基磷?；?乙基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-1-氧代戊烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯(^tBoc-L-正纈氨酰-β-氯-L-丙氨酰-D/L-fosfalin二乙基酯)36(2.0mmol,0.99g)溶解在HBr和乙酸(33％)(3.0mL)中。該溶液在室溫下攪拌過夜。添加無水二乙基醚(150mL)，然后該混合物在-20℃下保存過夜。潷析掉溶劑，而油狀棕色粗產(chǎn)物用無水二乙基醚(5x 60mL)研磨。將橙色-棕色吸水性殘留物溶解在無水甲醇(5mL)中，然后添加過量的氧化丙烯。該溶液過濾并用二乙基醚洗滌，得到淡綠色固體，其隨后進(jìn)行過濾，得到淡綠色固體形式的最終產(chǎn)物37(0.64g,1.94mmol,97％)；m.p.175℃(secondary)[α]²¹_D-2.50°(c 1.0,H₂O+DIEA,9.9:0.1)；ν_max/cm-¹3294(NH⁺),2963(CH),1668(C＝O),1645(C＝O),1538(NH bend),1132(P-O),1039(P-O),998(P-O)；¹H NMR(300MHz,D₂O)δ_H 1.01(3H,t,J＝9.0Hz,CH₃-12),1.30-1.37(3H,m,CH₃-2),1.44-1.54(2H,m CH₃-11),1.90-1.98(2H,m,CH₂-10),3.91-4.15(4H,[m,CH₂-6],[m,CH-9],[m,CH-1]),4.79(1H,m,CH-5)；¹³C NMR(75MHz,D₂O)δ_C 12.9(CH₃-12),15.7(CH₃-2),17.6(CH₂-11),33.0(CH₂-10),43.3(CH₂-6),53.1(CH-1,CH-9),55.0(CH-5),170.4(C-4,C-8,quat)；³¹P-¹H_deco_up NMR(121MHz,CDCl₃)δ_P 18.5；HRMS(納米噴霧電離)計(jì)算(C₁₀H₂₀ClN₃O₅P)-328.0835,實(shí)測328.0833.

實(shí)施例5:根據(jù)本發(fā)明的抗微生物化合物H的合成方法(圖2):L-甲硫氨酰-β-氯-L-丙氨酰-D/L-fosfalin

L-甲硫氨酰-β-氯-L-丙氨酰-D/L-fosfalin(L-Met-β-Cl-L-Ala-D/L-fosfalin)由以下式表示：

以下詳細(xì)說明抗微生物化合物的合成。

5.1.合成反應(yīng)中間體((2R)-3-氯-1-((1-(二乙氧基磷?；?乙基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯(^tBoc-β-Cl-L-Ala-D/L-Fos二乙基酯)

^tBoc-β-Cl-L-Ala-D/L-Fos二乙基酯由以下式代表：

在-5℃下將N-甲基嗎啉(7.8mmol,0.90mL)添加至^tBoc-β-Cl-L-Ala-OH(7.8mmol,1.74g)在無水THF(60mL)中的懸浮液內(nèi)。緩慢添加異氯甲酸丁基酯(7.8mmol,1.00mL)，并在-5℃下攪拌所得的混合物1小時(shí)。在-5℃下向該攪拌的混合物中添加在無水THF(20mL)中的1-氨基乙基膦酸二乙基酯(8.6mmol,1.57g)。所得的混合物在氮?dú)夂?5℃下攪拌30分鐘，然后在室溫下攪拌過夜。該混合物過濾并真空除去溶劑，得到淡黃色液體，其用10％w/v檸檬酸溶液(2x 25mL)、10％w/v碳酸鉀(25mL)和水(25mL)洗滌。合并的有機(jī)層在硫酸鎂上干燥，過濾并真空濃縮，得到淡黃色液體。該液體通過柱色譜進(jìn)行純制，其中使用100％DCM，然后逐漸增加至90:10DCM/MeOH，得到黃色糖漿形式的產(chǎn)物，其由2個(gè)非對(duì)映異構(gòu)體組成，^tBoc-β-Cl-L-Ala-L-Fos二乙基酯和^tBoc-β-Cl-L-Ala-D-Fos二乙基酯(2.70g,7.0mmol,90％)；ν_max/cm^-1 3261(NH),1713(C＝O),1670(C＝O),1517(NH bend),1225(P＝O),1164(P-O),1020(P-O),970(P-O)；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ_H 1.15-1.39(18H,[s,C(CH₃)₃],[m,CH₃-2],[m,2x OCH₂CH₃]),3.64-3.71(1H,m,CH_a/b-6),3.89-3.96(1H,m,CH_a/b-6),4.01-4.12(4H,m,2x OCH₂CH₃),4.42-4.49(2H,[m,CH-1],[m,CH-5]),5.40(1H,d,J＝3.0Hz,NH-3或NH-7-A),5.43(1H,d,J＝6.0Hz,NH-3或NH-7-A),7.00(1H,d,J＝9.0Hz,NH-3或NH-7-A),7.07(1H,d,J＝9.0Hz,NH-3或NH-7-B)；¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ_C 15.6(d,J_P-C＝5.3Hz,CH₃-2),16.3(d,J_P-C＝2.3Hz,OCH₂CH₃),16.5(d,J_P-C＝2.3Hz,OCH₂CH₃),28.3(C(CH₃)₃)41.2(d,J_P-C＝157.5Hz,CH-1-A),41.3(d,J_P-C＝156.8Hz,CH-1-B),44.9(CH₂-6-A),45.0(CH₂-6-B),55.3(CH-5),62.5(d,J_P-C＝3.0Hz,OCH₂CH₃-A),62.6(d,J_P-C＝3.8Hz,OCH₂CH₃-B),62.9(d,J_P-C＝3.0Hz,OCH₂CH₃-A),63.0(d,J_P-C＝3.0Hz,OCH₂CH₃-B),80.7(C(CH₃)₃),154.9(C＝O-8),168.3(C＝O-4)；³¹P-¹H_decoup NMR(121MHz,CDCl₃)δ_P 24.8.

5.2.合成反應(yīng)中間體(2R)-3-氯-1-((1-(二乙氧基磷?；?乙基)氨基)-1-氧代丙烷-2-氯化銨(β-Cl-L-Ala-D/L-Fos二乙基酯鹽酸鹽)

β-Cl-L-Ala-D/L-Fos二乙基酯鹽酸鹽由下式代表：

在氮?dú)夂褪覝叵聰嚢?sup>tBoc-β-Cl-L-Ala-D/L-Fos二乙基酯(步驟5.1.中得到的；6.7mmol,2.59g)于2M HCl之二乙基醚溶液(100mL)中的溶液過夜。該混合物接著過濾，而米色吸水性固體用二乙基醚洗滌。該固體在包含氧化磷(V)的干燥器中干燥過夜，然后用石油溶劑油研磨，得到淡綠色固體形式的產(chǎn)物，其由2種非對(duì)映異構(gòu)體組成，β-Cl-L-Ala-L-Fos二乙基酯鹽酸鹽和β-Cl-L-Ala-D-Fos二乙基酯鹽酸鹽(1.51g,4.7mmol,70％)；m.p.127–131℃(分解)；ν_max/cm^-1 3204(NH),1687(C＝O),1562(NH bend),1204(P＝O),1010(P-O),961(P-O)；¹H NMR(300MHz,D₂O)δ_H 1.28(3H,t,J＝6.0Hz,OCH₂CH₃),1.29(3H,t,J＝6.0Hz,OCH₂CH₃),1.37(3H,dd,³J_P-H＝18.0Hz,³J_H-H＝6.0Hz,CH₃-2),3.92-4.04(2H,m,CH₂-6),4.07-4.21(4H,m,2x OCH₂CH₃),4.38-4.48(2H,[m,CH-1],[m,CH-5])；¹³C NMR(75MHz,D₂O)δ_C 13.7(CH₃-2),14.0(CH₃-2),15.7(OCH₂CH₃),15.7(OCH₂CH₃),41.7(d,J_P-C＝158.3Hz,CH-1),42.0(d,J_P-C＝157.5Hz,CH-1),42.4(CH₂-6),53.7(CH-5),53.8(CH-5),64.3(d,J_P-C＝6.8Hz,OCH₂CH₃),64.5(d,J_P-C＝6.8Hz,OCH₂CH₃-B),165.7(C＝O-4-A),165.8(C＝O-4-B)；³¹P-¹H_decoup NMR(121MHz,CDCl₃)δ_P 26.1.

5.3.合成反應(yīng)中間體((2S)-1-(((2R)-3-氯-1-((1-(二乙氧基磷?；?乙基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-4-(甲硫基)-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯(^tBoc-L-Met-β-Cl-L-Ala-D/L-Fos二乙基酯)

^tBoc-L-Met-β-Cl-L-Ala-D/L-Fos二乙基酯由下式代表：

將N-甲基嗎啉(3.4mmol,0.40mL)添加至tBoc-L-Met-OH(3.4mmol,0.85g)在無水THF(60mL)中的溶液內(nèi)。該溶液冷卻至-5℃，然后滴加氯甲酸異丁基酯(3.4mmol,0.45mL)。該混合物在-5℃下攪拌1小時(shí)。在-5℃下向該攪拌的混合物中滴加在步驟5.2.中得到的β-Cl-L-Ala-D/L-Fos二乙基酯鹽酸鹽(3.4mmol,1.10g)在無水DCM(20mL)中的溶液，該溶液已用N-甲基嗎啉(3.4mmol,0.40mL)中和過。所得的混合物在氮?dú)夂?5℃下攪拌30分鐘，然后在室溫下攪拌過夜。該混合物過濾并真空濃縮，然后用10％w/v檸檬酸溶液(2x 25mL)、10％w/v碳酸鉀(25mL)、水(25mL)和鹽水(30mL)洗滌。有機(jī)層在MgSO₄上干燥，過濾并真空除去溶劑，得到黃色液體，其通過柱色譜[DCM/MeOH(95:5)]進(jìn)行純制，得到無色液體。由二乙基醚/石油溶劑油中重結(jié)晶，形成白色固體形式的產(chǎn)物，其由2個(gè)非對(duì)映異構(gòu)體組成，tBoc-L-Met-β-Cl-L-Ala-L-Fos二乙基酯和tBoc-L-Met-β-Cl-L-Ala-D-Fos二乙基酯(0.88g,1.7mmol,50％)；m.p.96-99℃；ν_max/cm^-1 3278(NH),1709(C＝O),1639(C＝O),1523(NH bend),1228(P＝O),1018(P-O),970(P-O)；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ_H 1.17-1.36(9H,[m,CH₃-2],[m,2x OCH₂CH₃]),1.38(9H,s,C(CH₃)₃),1.87-2.07(5H,[s,CH₃-12],[m,CH₂-10]),2.48-2.54(2H,m,CH₂-11),3.71(1H,dd,J＝12.0Hz,6.0Hz,CH_a/b-6),3.88(1H,dd,J＝12.0Hz,6.0Hz,CH_a/b-6),3.99-4.13(4H,m,2x OCH₂CH₃),4.20(1H,m,CH-9),4.37-4.47(1H,m,CH-1),4.78-4.84(1H,m,CH-5),5.39(1H,d,J＝6.0Hz,NH-13-A),5.41(1H,d,J＝6.0Hz,NH-13-B),7.15(1H,d,J＝6.0Hz,NH-7-A),7.24(1H,d,J＝6.0Hz,NH-7-B),7.52(1H,m,NH-3)；¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ_C 14.4(CH₃-2或CH₃-12),14.5(CH₃-2或CH₃-12),15.4(OCH₂CH₃),15.5(OCH₂CH₃),27.3(C(CH₃)₃),29.2(CH₂-11-A),29.3(CH₂-11-B),30.2(CH₂-10-A),30.4(CH₂-10-B),40.3(d,J_P-C＝159.0Hz,CH-1),43.5(CH₂-6-A),43.7(CH₂-6-B),52.7(CH-5),53.1(CH-9),61.6(d,J_P-C＝6.8Hz,OCH₂CH₃-A),61.7(d,J_P-C＝6.0Hz,OCH₂CH₃-B),62.0(d,J_P-C＝6.8Hz,OCH₂CH₃-A),62.1(d,J_P-C＝7.5Hz,OCH₂CH₃-B),79.6(C(CH₃)₃),154.8(C＝O-14),166.7(C＝O-4-A),166.8(C＝O-4-B),170.7(C＝O-8-A),170.8(C＝O-8-B)；³¹P-¹H_decoup NMR(121MHz,CDCl₃)δ_P 24.8；CHN[實(shí)測:C,44.08；H,7.47；N,8.18.C₁₉H₃₇ClN₃O₇PS需要C,44.06；H,7.20；N,8.11％].

5.4.合成抗微生物化合物H(圖2)，即、化合物氫合(1-((R)-2-((S)-2-銨基-4-(甲硫基)丁酰胺基)-3-氯丙酰胺基)乙基)膦酸(L-Met-β-Cl-L-Ala-D/L-Fos)

抗微生物化合物L(fēng)-Met-β-Cl-L-Ala-D/L-Fos由下式代表：

在步驟5.3.中得到的^tBoc-L-Met-β-Cl-L-Ala-D/L-Fos二乙基酯(1.4mmol,0.71g)在溴化氫/冰乙酸(33％)(8.0mL)中的溶液在室溫下攪拌過夜。添加無水二乙基醚(70mL)，然后將該混合物放置在冷凍機(jī)中過夜。筆析掉溶劑，而粗產(chǎn)物用無水二乙基醚研磨(5x 50mL)。將該棕色-橙色粗產(chǎn)物溶解在甲醇(5mL)中，然后添加過量的氧化丙烯。該混合物過濾并用無水二乙基醚洗滌，得到綠色固體，其在包含氧化磷(V)的干燥器中干燥，然后由熱水/乙醇中重結(jié)晶，得到淡綠色固體形式的產(chǎn)物，其由2種非對(duì)映異構(gòu)體組成L-Met-β-Cl-L-Ala-L-Fos和L-Met-β-Cl-L-Ala-D-Fos(0.17g,0.48mmol,35％)；m.p.175–179℃(分解)；ν_max/cm-¹3264(NH⁺),2829(large OH),1641(C＝O),1546(NH bend),1149(P-O),1041(P-O),921(P-O)；¹H NMR(300MHz,D₂O)δ_H 1.10-1.50(3H,m,CH₃-2),2.08-2.32(5H,[m,CH₃-12],[m,CH₂-10])2.61(2H,CH₂-11),3.37-4.16(4H,[m,CH₂-6],[m,CH-1],[m,CH-9]),4.48(1H,m,CH-5)；¹³C NMR(75MHz,D₂O.)δ_C 14.0(CH₃-12),15.5(CH₃-2),28.2(CH₂-11),30.0(CH₂-10),43.3(CH₂-6),44.8(CH-1),52.3(CH-9),55.0(CH-5),169.4(C＝O-4和C＝O-8)；³¹P-¹H_deco_up NMR(121MHz,CDCl₃)δ_P 18.7.

實(shí)施例6:評(píng)估分別根據(jù)實(shí)施例4和5合成的L-正纈氨酰-β-氯-丙氨酰-D/L-fosfalin(化合物G；參考圖2)和L-甲硫氨酰-β-氯-丙氨酰-D/L-fosfalin(化合物H；參考圖2)的抗菌活性

6.1.介紹

在使用如實(shí)施例2所述的瓊脂稀釋法(特別是參考“2.2材料和方法”)溫育22小時(shí)后，測定化合物G和H對(duì)12株革蘭氏陰性菌和6株革蘭氏陽性菌的最小抑制濃度(MIC)。

6.2結(jié)果

所得結(jié)果示于下表4中。

表4:抗微生物化合物G和H對(duì)各種細(xì)菌的最小抑制濃度

根據(jù)上述表4中所示的數(shù)據(jù)，其清楚地表明，化合物G和H對(duì)某些革蘭氏陰性菌種和某些革蘭氏陽性菌種的測試菌株具有強(qiáng)烈的抑制作用，特別是對(duì)于大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、糞腸球菌，但對(duì)于其他的革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌種不太抑制，特別是對(duì)于鮑氏不動(dòng)桿菌、洋蔥伯克霍爾德氏菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌。

6.3結(jié)論

在各種細(xì)菌之間觀察到的抑制濃度具有非常顯著的差異，這使得化合物G和H特別適合作為摻入反應(yīng)培養(yǎng)基的化合物，其能夠選擇性地尋找和/或分離生物樣品中的某些細(xì)菌，特別是可以選擇性地尋找：

‐革蘭氏陰性菌(革蘭氏陰性靶細(xì)菌)，例如鮑氏不動(dòng)桿菌、洋蔥伯克霍爾德氏菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌；或

‐革蘭氏陽性菌(革蘭氏陽性靶細(xì)菌)，例如單核細(xì)胞增生利斯特氏菌。

實(shí)施例7:根據(jù)本發(fā)明的抗微生物化合物I的合成方法(圖2):L-正纈氨酰-L-丙氨酰-D/L-fosfalin

L-正纈氨酰-L-丙氨酰-D/L-fosfalin(L-Nva-L-Ala-D/L-fosfalin)由下式代表：

以下詳細(xì)描述該抗微生物化合物的合成。

7.1.合成反應(yīng)中間體(S)-芐基2-((S)-2-((tert-丁氧基羰基)氨基)戊酰胺基)丙酸酯(^tBoc-L-Nva-L-Ala-OBzl)

化合物^tBoc-L-Nva-L-Ala-OBzl由下式代表：

將N-甲基嗎啉(15.0mmol,1.65mL)添加至^tBoc-L-Nva-OH(10.0mmol,2.17g)在無水THF(60mL)中的溶液內(nèi)。該溶液冷卻至-5℃，然后滴加氯甲酸異丁基酯(15.0mmol,1.95mL)。該混合物在-5℃下攪拌1小時(shí)。向該攪拌的混合物中滴加一些在無水DCM(30mL)中的L-丙氨酸芐基酯p-甲苯磺酸鹽(10.0mmol,3.52g)，其已在-5℃下用二異丙基乙基胺(15.0mmol,2.60mL)中和。所得的溶液在氮?dú)夂?5℃下攪拌30分鐘，然后在室溫下攪拌過夜。該溶液過濾并真空濃縮，接著用10％w/v檸檬酸(2x 25mL)、10％w/v碳酸鉀(25mL)和水(25mL)洗滌。有機(jī)層在MgSO₄上干燥，過濾并真空濃縮，得到黃色吸水性液體，該液體通過柱色譜進(jìn)行純制[40-60石油溶劑油/乙酸乙酯(7:3)]，得到米色固體形式的產(chǎn)物(2.40g,6,3mmol,63％)；m.p.60-63℃；ν_max/cm^-1 3299(NH),1743(C＝O),1655(C＝O),1527(NH bend),1245(C-O),1162(C-O)；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ_H 0.83(3H,t,J＝9.0Hz,CH₃-8),1.25-1.36(14H,[d,J＝6.0Hz,CH₃-3],[m,CH₂-7],[s,C(CH₃)₃]),1.42-1.54(1H,m,CH_a/b-6),1.64-1.73(1H,m,CH_a/b-6),4.02(1H,m,CH-5),4.54(1H,pentet,J＝6.0Hz,CH-2),4.96(1H,d,J＝9.0Hz,NHCO₂),5.07(1H,d,J＝12.0Hz,OCH_a/bAr),5.12(1H,d,J＝12.0Hz,OCH_a/bAr),6.56(1H,d,J＝6.0Hz,NHCO),7.27(5H,m,5xCH_Ar)；¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ_C 12.7(CH₃-8),17.3(CH₃-3),17.8(CH₂-7),27.3(C(CH₃)₃),33.7(CH₂-6),47.1(CH-2),53.4(CH-5),66.1(OCH₂Ar),79.0(C(CH₃)₃),127.1-127.6(5xCH_Ar),134.3(CH_Ar quat.),154.6(C＝O-9),170.8(C＝O-4),171.5(C＝O-1)；CHN[實(shí)測:C,63.75；H,8.37；N,7.86.C₂₀H₃₀N₂O₅需要C,63,47；H,7.99；N,7.40％]；HRMS(納米噴霧電離)計(jì)算(C₂₀H₃₁N₂O₅)⁺379.2227,實(shí)測379.2222.

7.2.合成反應(yīng)中間體(S)-2-((S)-2-((tert-丁氧基羰基)氨基)戊酰胺基)丙酸(^tBoc-L-Nva-L-Ala-OH)

化合物^tBoc-L-Nva-L-Ala-OH由下式代表：

將在步驟7.1.中得到的^tBoc-L-Nva-L-Ala-OBzl(6.0mmol,2.27g)溶解在甲醇(60mL)中，然后在3.5bar H₂和室溫下于5％鈀炭(0.23g)存在時(shí)進(jìn)行氫化過夜。催化劑通過用Celite過濾而被除去，然后用甲醇洗滌。該溶液進(jìn)行真空濃縮，得到白色固體形式的產(chǎn)物(1.66g,5.7mmol,96.0％)；m.p.53-58℃(分解)；ν_max/cm^-1 3500-2500(br,OH),3300(NH),2961(NH),1688(C＝O),1655(C＝O),1522(NH bend),1245(C-O),1164(C-O)；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ_H 0.85(3H,t,J＝9.0Hz,CH₃-8),1.27-1.39(14H,[m,CH₃-3],[m,CH₂-7],[s,C(CH₃)₃]),1.48-1.53(1H,m,CH_a/b-6),1.67-1.71(1H,m,CH_a/b-6),4.10(1H,m,CH-5),4.50(1H,m,CH-2),5.27(1H,m,NHCO₂),6.93(1H,m,NHCO),8.87(1H,br,OH)；¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ_C 13.7(CH₃-8),18.0(CH₃-3),18.8(CH₂-7),28.3(C(CH₃)₃),34.5(CH₂-6),48.1(CH-2),54.3(CH-5),80.4(C(CH₃)₃),156.0(C＝O-9),172.5(C＝O-4),175.5(C＝O-1)；CHN[實(shí)測:C,54.18；H,8.78；N,9.62.C₁₃H₂₄N₂O₅需要C,54.15；H,8.39；N,9.72％]；HRMS(納米噴霧電離)計(jì)算(C₁₃H₂₅N₂O₅)⁺289.1758,實(shí)測289.1758.

7.3.合成反應(yīng)中間體((2S)-1-(((2S)-1-((1-(二乙氧基磷酰基)乙基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-1-氧代戊烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯(^tBoc-L-Nva-L-Ala-D/L-Fos二乙基酯)

^tBoc-L-Nva-L-Ala-D/L-Fos二乙基酯由下式代表：

在-5℃下將N-甲基嗎啉(5.3mmol,0.58mL)添加至^tBoc-L-Nva-L-Ala-OH(5.0mmol,1.45g；得自于步驟7.2.)在無水THF(50mL)中的溶液內(nèi)。緩慢添加氯甲酸異丁基酯(5.3mmol,0.70mL)，而所得的混合物在-5℃下攪拌1小時(shí)。在-5℃下向該攪拌的混合物中添加在無水THF(15mL)中的1-氨基乙基膦酸二乙基酯(4.8mmol,0.87g；其合成如實(shí)施例4.4中所述，并示于圖6中)。所得的混合物在氮?dú)夂?5℃下攪拌30分鐘，接著在室溫下攪拌過夜?；旌衔镞^濾并真空除去溶劑，得到白色固體，其重新溶解在DCM(50mL)中，并用10％w/v檸檬酸(2x 25mL)、10％w/v碳酸鉀(25mL)和水(25mL)洗滌。有機(jī)層在硫酸鎂上干燥，過濾并真空濃縮，得到白色固體，其通過柱色譜進(jìn)行純制，其中使用100％DCM，并增加至90:10DCM/甲醇，得到白色固體，其由2種非對(duì)映異構(gòu)體組成，^tBoc-L-Nva-L-Ala-L-Fos二乙基酯和^tBoc-L-Nva-L-Ala-D-Fos二乙基酯(1.70g,3.8mmol,78％)；m.p.165-168℃；ν_max/cm^-1 3267(NH),1708(C＝O),1638(C＝O),1537(NH bend),1227(P＝O),1019(P-O),966(P-O)；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ_H 0.85(3H,t,J＝9.0Hz,CH₃-12),1.18-1.34(14H,[m,2x OCH₂CH₃],[CH₃-2],[m,CH₃-6],[m,CH₂-11]),1.37(s,C(CH₃)₃),1.47-1.54(1H,m,CH_a/b-10),1.65-1.73(1H,m,CH_a/b-10),3.98-4.12(5H,[m,2x OCH₂CH₃],[m,CH₃-5或CH₃-9]),4.33-4.44(1H,m,CH-1),4.48-4.54(1H,m,CH-5或CH-9),5.18-5.23(1H,d,J＝6.0Hz,NH-7或NH-13),5.18-5.23(1H,d,J＝6.0Hz,NH-7或NH-13),6.77-6.88(1H,d,J＝6.0Hz,NH-7或NH-13),6.77-6.88(1H,d,J＝6.0Hz,NH-7或NH-13),7.13-7.24(1H,d,J＝9.0Hz,9.0Hz,NH-3),7.13-7.24(1H,d,J＝9.0Hz,9.0Hz,NH-3)；¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ_C 12.7(CH₃-12),14.5(CH₃-2,d,J_P-C＝6.0Hz),15.3(OCH₂CH₃-A),15.4(OCH₂CH₃-A),15.5(OCH₂CH₃-B),15.6(OCH₂CH₃-B),17.6(CH₃-6-A),17.7(CH₃-6-B),17.8(CH₂-11-A),17.9(CH₂-11-B),27.3(C(CH₃)₃),33.8(CH₂-10-A),33.9(CH₂-10-B),39.9(CH-1-A,d,J_P-C＝157.5Hz),40.0(CH-1-B,d,J_P-C＝156.8Hz),47.7(CH-5或CH-9-A),47.9(CH-5或CH-9-B),53.5(CH-5或CH-9-A),53.5(CH-5或CH-9-B),61.4-62.0(2x OCH₂CH₃-A和B,4x d,J＝7.5Hz,6.8Hz,7.5Hz,7.5Hz),78.9(C(CH₃)₃),154.7(C＝O-14),170.6(C＝O-4或C＝O-8-A),170.7(C＝O-4或C＝O-8-B),171.0(C＝O-4或C＝O-8-A),171.1(C＝O-4或C＝O-8-B)；³¹P-¹H_decoup NMR(121MHz,CDCl₃)δ_P 24.8；CHN[實(shí)測:C,50.74；H,8.55；N,9.51.C₁₉H₃₈N₃O₇P需要C,50.54；H,8.48；N,9.31％]；HRMS(納米噴霧電離)計(jì)算(C₁₉H₃₉N₃O₇P)⁺452.2520,實(shí)測452.2518.

7.4.合成化合物I，即、化合物氫合(1-((S)-2-((S)-2-銨基戊酰胺基)丙酰胺基)乙基)膦酸(L-Nva-L-Ala-D/L-Fos)

如前所述，化合物L(fēng)-Nva-L-Ala-D/L-Fos由下式代表：

將在步驟7.3中得到的^tBoc-L-Nva-L-Ala-D/L-Fos二乙基酯(1.6mmol,0.72g)溶解在冰乙酸(30mL)中，然后添加溴化氫/乙酸(33％)(25mL)。該溶液在室溫下攪拌過夜。添加無水二乙基醚(150mL)，然后將該混合物放置在冷凍機(jī)中過夜。筆析出溶劑，而粗產(chǎn)物用無水二乙基醚研磨(5x 100mL)。橙黃色的粗產(chǎn)物溶解在甲醇(5mL)中，然后添加過量的氧化丙烯。該溶液過濾并用二乙基醚洗滌，得到淡綠色固體，其由熱水/丙酮中重結(jié)晶，得到淡綠色固體形式的產(chǎn)物，其由2種非對(duì)映異構(gòu)體組成，L-Nva-L-Ala-L-Fos和L-Nva-L-Ala-D-Fos(0.22g,0.75mmol,47％)；m.p.200–210℃(分解)；ν_max/cm^-1 3280(NH⁺),1643(C＝O),1552(NH bend),1149(P-O),1037(P-O),922(P-O)；¹H NMR(300MHz,D₂O)δ_H 0.96(3H,t,CH₃-12),1.29(3H,m,CH₃-6)1.42-1.40(5H,[m,CH₃-2],[m,CH₂-11]),1.88-1.86(2H,m,CH₂-10),4.02-4.00(2H,[m,CH-5],[m,CH-9]),4.34-4.39(1H,m,CH-1)；¹³C NMR(75MHz,D₂O.)δ_C13.4(CH₃-12),16.0(CH₃-2),17.1(CH₃-6),17.2(CH₃-6),18.1(CH₂-11),33.5(CH₂-10),50.7(d,J_P-C＝22.5Hz,CH-1),53.5(CH-5或CH-9),170.4(C＝O-8),174.7(C＝O-4)；HRMS(納米噴霧電離)計(jì)算(C₁₀H₂₃N₃O₅P)⁺296.1370,實(shí)測296.1373；³¹P-¹H_deco_up NMR(121MHz,CDCl₃)_P18.5；CHN[實(shí)測:C,37.61；H,7.51；N,12.91.C₁₀H₂₂N₃O₅P·1.4H₂O需要C,37.48；H,7.80；N,13.11％].

實(shí)施例8:抗微生物化合物J的合成方法(圖2):L-甲硫氨酰-L-丙氨酰-D/L fosfalin

化合物L(fēng)-甲硫氨酰-L-丙氨酰-D/L fosfalin由下式代表：

以下詳細(xì)描述該抗微生物化合物的合成。

8.1.合成反應(yīng)中間體((S)-1-(((R)-1-(二乙氧基磷?；?乙基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯(^tBoc-L-Ala-D/L-Fos二乙基酯)

^tBoc-L-Ala-D/L-Fos二乙基酯由下式代表：

在-5℃下將N-甲基嗎啉(15.0mmol,1.65mL)添加至^tBoc-L-Ala-OH(10.0mmol,1.90g)在無水THF(60mL)中的溶液內(nèi)。添加氯甲酸異丁基酯(15.0mmol,1.90mL)，所得的混合物在-5℃下攪拌1小時(shí)。在-5℃下向該攪拌的混合物中添加在無水THF(20mL)中的1-氨基乙基膦酸二乙基酯(10.0mmol,1.84g)。所得的混合物在氮?dú)夂?5℃下攪拌30分鐘，接著在室溫下攪拌過夜。該溶液過濾并真空濃縮，得到淡黃色的糖漿，將其重新溶解在DCM(60mL)中，然后用10％w/v檸檬酸(2x 25mL)、10％w/v碳酸鉀(25mL)和水(25mL)洗滌。合并的有機(jī)層在硫酸鎂上干燥，過濾并真空濃縮，得到淡綠色糖漿，其通過柱色譜進(jìn)行純制，其中初始使用100％DCM，然后增加至95:5DCM/甲醇，得到米色固體形式的產(chǎn)物，其由2種非對(duì)映異構(gòu)體組成，^tBoc-L-Ala-L-Fos二乙基酯和^tBoc-L-Ala-D-Fos二乙基酯(2.49g,7.1mmol,71％)；m.p.102-105℃；ν_max/cm^-1 3280(NH),1710(C＝O),1652(C＝O),1556(NH bend),1229(P＝O),1173(P-O),1013(P-O),973(P-O)；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ_H 1.23-1.44(21H,[s,C(CH₃)₃],[m,CH₃-2],[m,CH₃-6],[m,2x OCH₂CH₃]),4.06-4.23(5H,[m,2x OCH₂CH₃],[m,CH-5]),4.40-4.52(1H,m,CH-1),5.11-5.15(1H,2x d,J＝1.5Hz,1.5Hz,NH-7),6.70-6.78(1H,2x d,J＝2.3Hz,2.3Hz,NH-3)；¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ_C 15.6(CH₃-2),16.3(d,J＝3.0Hz,OCH₂CH₃),16.4(d,J＝2.3Hz,OCH₂CH₃),16.4(d,J＝3.8Hz,OCH₂CH₃),16.5(d,J＝1.5Hz,OCH₂CH₃),18.4(CH₃-6),28.3(C(CH₃)₃)40.8(d,J_P-C＝156.8Hz,CH-1),41.0(d,J_P-C＝156.8Hz,CH-1),50.0(CH-5),62.4-62.8(4x d,J_P-C＝6.8Hz,6.8Hz,6.8Hz,6.8Hz,2x OCH₂CH₃),80.0(C(CH₃)₃),155.2(C＝O-8),172.1(C＝O-4)；CHN[實(shí)測:C,48.22；H,8.58；N,7.87.C₁₄H₂₉N₂O₆P需要C,47.72；H,8.30；N,7.95％].

8.2.合成反應(yīng)中間體(S)-1-(((R)-1-(二乙氧基磷?；?乙基)氨基)-1-氧代丙烷-2-氯化銨(L-Ala-D/L-Fos二乙基酯鹽酸鹽)

L-Ala-D/L-Fos二乙基酯鹽酸鹽由下式代表：

在氮?dú)夂褪覝叵聰嚢?sup>tBoc-L-Ala-D/L-Fos二乙基酯(步驟8.1中得到的；6.0mmol,2.13g)在2M HCl之二乙基醚溶液(100mL)中的溶液過夜。過濾收集所得的固體，并用無水二乙基醚洗滌。米色吸水性固體在包含氧化磷(V)的干燥器中干燥過夜，然后用石油溶劑油洗滌，得到淡綠色固體形式的產(chǎn)物，其由2種非對(duì)映異構(gòu)體組成，L-Ala-L-Fos二乙基酯鹽酸鹽和L-Ala-D-Fos二乙基酯鹽酸鹽(1.46g,5.1mmol,84％)；m.p.102-105℃；ν_max/cm^-1 2986(NH⁺),1673(C＝O),1555(NH bend),1017(P-O),950(P-O)；¹H NMR(300MHz,d₄-CH₃OH)δ_H 1.29-1.44(9H,[m,2x OCH₂CH₃],[m,CH₃-2],1.51(3H,d,J＝6.0Hz,CH₃-6),3.90-3.98(1H,m,CH-5),4.08-4.22(4H,m,2x OCH₂CH₃),4.28-4.47(1H,m,CH-1)；¹³C NMR(75MHz,d₄-CH₃OH)δ_C13.7(CH₃-2-A),14.0(CH₃-2-B),15.4(2x OCH₂CH₃),16.3(CH₃-6),41.1(d,J_P-C＝158.3Hz,CH-1),41.4(d,J_P-C＝158.3Hz,CH-1),48.8(CH-5),48.9(CH-5),62.7-63.0(2x OCH₂CH₃),169.0(C＝O-4).

8.3.合成反應(yīng)中間體Tert-丁基((2S)-1-(((2S)-1-((1-(二乙氧基磷?；?乙基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基-4-(甲硫基)-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸(^tBoc-L-Met-L-Ala-D/L-Fos二乙基酯)

化合物^tBoc-L-Met-L-Ala-D/L-Fos二乙基酯由下式代表：

將N-甲基嗎啉(5.1mmol,0.60mL)添加至^tBoc-L-Met-OH(3.4mmol,0.88g)在無水THF(50mL)中的溶液內(nèi)。該溶液冷卻至-5℃，然后滴加氯甲酸異丁基酯(5.1mmol,0.70mL)。該混合物在-5℃下攪拌1小時(shí)。向該攪拌的溶液內(nèi)滴加在無水THF(15mL)中的由步驟8.2中得到的L-Ala-D/L-Fos二乙基酯鹽酸鹽(3.4mmol,0.97g)，其已在-5℃下用二異丙基乙基胺(5.1mmol,1,00mL)進(jìn)行中和。所得的溶液在氮?dú)夂?5℃下攪拌30分鐘，然后在室溫下攪拌過夜。該溶液過濾并真空濃縮，接著用10％w/v檸檬酸(2x 25mL)、10％w/v碳酸鉀(25mL)和水(25mL)洗滌。有機(jī)層在MgSO₄上干燥，過濾并真空濃縮，得到黃色固體，其通過柱色譜進(jìn)行純制[DCM/MeOH(95:5)]，得到米色固體形式的產(chǎn)物，其由2種非對(duì)映異構(gòu)體組成，^tBoc-L-Met-L-Ala-L-Fos二乙基酯和^tBoc-L-Met-L-Ala-D-Fos二乙基酯(0.53g,1.1mmol,32％)；m.p.172-176℃；ν_max/cm^-1 3272(NH),1708(C＝O),1637(C＝O),1530(NH bend),1226(P＝O),1165(P-O),1020(P-O),966(P-O)；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ_H 1.16-1.36(12H,[m,CH₃-2],[m,CH₃-6],[m,2x OCH₂CH₃]),1.36(9H,s,C(CH₃)₃),1.82-2.01(2H,m,CH₂-10),2.04(3H,s,CH₃-12),2.49(2H,t,J＝9.0Hz,CH₂-11),4.00-4.12(4H,m,2x OCH₂CH₃),4.21(1H,m,CH-9),4.33-4.43(1H,m,CH-1),4.45-4.53(1H,m,CH-5),5.40(1H,d,J＝9.0Hz,NH-13-A),5.44(1H,d,J＝6.0Hz,NH-13-B),6.85(1H,d,J＝6.0Hz,NH-7-A),6.92(1H,d,J＝6.0Hz,NH-7-B),7.07(1H,d,J＝9.0Hz,NH-3-A),7.16(1H,d,J＝9.0Hz,NH-3-B)；¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ_C 14.3(CH₃-2-A),14.3(CH₃-2-B),15.4-15.5(2x OCH₂CH₃),17.7(CH₃-6),27.3(C(CH₃)₃),29.2(CH₂-11-A),29.3(CH₂-11-B),30.8(CH₂-10-A),30.8(CH₂-10-B),39.9(d,J_P-C＝156.8Hz,CH-1-A),40.0(d,J_P-C＝156.8Hz,CH-1-B),47.9(CH-5-A),48.0(CH-5-B),52.6(CH-9),61.5(d,J_P-C＝4.5Hz,OCH₂CH₃-A),61.6(d,J_P-C＝4.5Hz,OCH₂CH₃-B),61.7(d,J_P-C＝6.8Hz,OCH₂CH₃-A),61.9(d,J_P-C＝6.8Hz,OCH₂CH₃-B),79.1(C(CH₃)₃),154.6(C＝O-14),170.3(C＝O-4或C＝O-8-A),170.4(C＝O-4或C＝O-8-B),170.5(C＝O-4或C＝O-8-A),170.6(C＝O-4或C＝O-8-B).

8.4.合成根據(jù)本發(fā)明的化合物J，即、化合物氫合(1-((S)-2-((S)-2-銨基-4-(甲硫基)丁酰胺基)丙酰胺基)乙基)膦酸(L-甲硫氨酰-L-丙氨酰-D/L fosfalin)

如前所述，化合物L(fēng)-甲硫氨酰-L-丙氨酰-D/L-fosfalin由以下結(jié)構(gòu)式代表：

在室溫下攪拌^tBoc-L-Met-L-Ala-D/L-Fos二乙基酯(步驟8.3中得到的；0.9mmol,0.43g)在溴化氫/冰乙酸(33％)(10mL)中的溶液過夜。添加無水二乙基醚(150mL)，然后該混合物放置在冷凍機(jī)中過夜。筆析出溶劑，而粗產(chǎn)物用無水二乙基醚研磨(5x100mL)。棕黃色的粗固體溶解在甲醇(5mL)中，然后添加過量的氧化丙烯。該溶液過濾并用洗滌二乙基醚，得到綠色固體，其由熱乙醇重結(jié)晶，然后在包含氧化磷(V)的干燥器中進(jìn)一步干燥，得到淡綠色固體形式的產(chǎn)物，其由2種非對(duì)映異構(gòu)體組成，L-Met-L-Ala-L-Fos和L-Met-L-Ala-D-Fos(0.13g,0.41mmol,46％)；m.p.213–217℃(分解)；ν_max/cm-¹3263(NH⁺),2834(large OH),1641(C＝O),1552(NH bend),1150(P-O),1041(P-O),919(P-O)；¹H NMR(300MHz,D₂O)δ_H1.12-1.29(3H,m,CH₃-2),1.38(3H,d,J＝6.0Hz,CH₃-6),2.11-2.34(5H,[s,CH₃-12],[m,CH₂-10]),2.62(2H,m,CH₂-11),3.95-4.11(2H,[m,CH-1],[m,CH-9]),4.32-4.46(1H,m,CH-5)；¹³C NMR(75MHz,D₂O.)δ_C14.2(CH₃-12),15.5(CH₃-2),16.6(CH₃-6),28.5(CH₂-11),29.5(CH₂-10),49.9(CH-1,CH-5和CH-9),169.4(C＝O-4和C＝O-8)；³¹P-¹H_deco_up NMR(121MHz,CDCl₃)δ_P 20.7.

實(shí)施例9:評(píng)估分別在實(shí)施例7和8中合成的L-正纈氨酰-L-丙氨酰-D/L-fosfalin(圖2中的化合物I)和L-甲硫氨酰-L-丙氨酰-D/L-fosfalin(圖2中的化合物J)的抗菌活性

9.1.介紹

如實(shí)施例6，在使用如實(shí)施例2所述的瓊脂稀釋法(特別是參考“2.2材料和方法”)溫育22小時(shí)后，測定化合物I和J對(duì)12株革蘭氏陰性細(xì)菌和6株革蘭氏陽性細(xì)菌的最小抑制濃度(MIC)。

用于本實(shí)施例測試的18株細(xì)菌與實(shí)施例6中所用的相同。

9.2結(jié)果

所得結(jié)果示于以下表5中。

表5:抗微生物化合物I和J對(duì)各種細(xì)菌的最小抑制濃度

根據(jù)上述表5中所示的數(shù)據(jù)，其清楚地表明，化合物I和J對(duì)某些革蘭氏陰性菌種和某些革蘭氏陽性菌種的測試菌株具有強(qiáng)烈的抑制作用，特別是對(duì)于大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、糞腸球菌，但對(duì)于其他的革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌種不太抑制，特別是對(duì)于鮑氏不動(dòng)桿菌、洋蔥伯克霍爾德氏菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌。

參考文獻(xiàn)

[1]Rao J，Lahiri J，Weis RM，Whitesides GM.2000.Design，synthesis，and characterization of a high-affinity trivalent system derived from vancomycin and L-Lys-D-Ala-D-Ala.J.Am.Chem.Soc.122：2698-2710.

[2]Kametani T，Suzuki Y，Kigasawa K，Hiiragi M，Wakisaka K，Sugi H，Tanigawa K，F(xiàn)ukawa K，Irino O，Saita O，Yamabe S.1982.Studies on the synthesis of chemotherapeutics.Part XIII.Synthesis and biological studies on phosphonopeptides having alkyl-，phenyl-，and heterocyclic substituents.Heterocycles 18：295-319.

[3]J.Bacteriol.1984，160(1)，122-130Gibson et al

[4]Cheung et al，Chloroalanyl and Propargylglycyl Diperptides.Suicide Substrate Containing Antibacterials.J.Med.Chem.1983，26，1733-1741

[5]Cheung KS，Boisvert W，Lerner SA，Johnston M.1986.Chloroalanyl antibiotic peptides：antagonism of their antimicrobial effects by L-alanine and L-alanyl peptides in gram-negative bacteria.J.Med.Chem.29：2060-2068.

[6]Atherton et al.，Synthesis and Structure-Activity Relationships of Antibacterial Phosphonopeptides Incorporating(l-Aminoethyl)phosphonic Acid and(Aminomethyl)phosphonic Acid，Chemistry Department，Roche Products Limited，1984

[7]Arfin et al.，Inhibition of Growth of Salmonella typhimurium and of Threonine Deaminase and Transamine B by β-Chloroalanine

[8]Orenga et al.，2009；J.Microbiol.Methods；79(2：139-55)

[9]Lavielle，S.；Ling，N.C.；Saltman，R.；Guillemn，R.C.Carbohydrate Research，1981，89(2)，229

[10]Nakata，T.；Nakatani，M.；Takahashi，M.；Okai，J.；Kawaoka，Y.；Kouge，K.；Okai，H.Bulletin of Chemical Society of Japan，1996，69(4)，1099

[11]Doctoral thesis of Varadi，L.，University of Sunderland，2012

[12]Kudzin，Z.H.；Stec，W.J.Synthesis，1978，469.

[13]Boduszek，B.；Soroka，M.Polish Journal of Chemistry，2002，76(8)，1105

[14]Kudzin，Z.H.；Luczak，J.Synthesis，1995，1995(5)，509.

[15]Yuan，C.；Xu，C.；Zhang，Y.Tetrahedron，2003，59(32)，6095

[16]Andrews JM.2001.Determination of minimum inhibitory concentrations.J.Antimicrob.Chemother.48Suppl 1：5-16.

[17]Atherton FR，Hall MJ，Hassall CH，Lambert RW，Ringrose PS.1979.Phosphonopeptides as antibacterial agents：rationale，chemistry，and structure-activity relationships.Antimicrob.Agents Chemother.15：677-683.