本發(fā)明涉及能將果糖轉(zhuǎn)變?yōu)镈-阿洛酮糖的新的阿洛酮糖差向異構(gòu)酶，由重組菌株生產(chǎn)阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的方法，用它從果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖的方法等。

背景技術(shù)：

D-阿洛酮糖是果糖碳-3位置的差向異構(gòu)體，與食糖相比具有70％的甜度(Oshima2006)，但它是功能性單糖，可用作減肥食品中的低卡路里甜味劑，其能量只有0.3％(Matsuo et al.2002)。而且，D-阿洛酮糖可以通過(guò)抑制葡萄糖的吸收來(lái)抑制葡萄糖，可用于糖尿病患者的食物、援助食物(receiving food)等，并可用于抑制與肝臟中脂類合成有關(guān)的酶活性，以抑制腹部脂肪的積聚，可用在各種功能性食品例如保健食品中(Matsuo et al.2001；Iida et al.2008；Hayashi et al.2010；Hossain et al.2011)。

由于具有上述特點(diǎn)，阿洛酮糖是一種能夠替代食糖的良好來(lái)源，但是阿洛酮糖屬于稀少糖，它是在自然界中很少存在的單糖，因此，需要能有效生產(chǎn)阿洛酮糖的方法，以應(yīng)用于食品工業(yè)。作為現(xiàn)有的生產(chǎn)阿洛酮糖的方法，阿洛酮糖主要是通過(guò)化學(xué)工藝生產(chǎn)的。Bilik等提出使用鉬酸鹽離子的催化作用使果糖轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒙逋堑姆椒ācDonald通過(guò)3-步驟的化學(xué)處理工藝從1,2:4,5-二-δ-異亞丙基-β-D-吡喃果糖生產(chǎn)阿洛酮糖。進(jìn)一步，Doner將果糖與乙醇和三甲胺一起加熱來(lái)生產(chǎn)阿洛酮糖。但是，其缺點(diǎn)是在化學(xué)生產(chǎn)方法中成本消耗很大，而其效率相對(duì)低，并且產(chǎn)生許多副產(chǎn)品。

作為阿洛酮糖的生物學(xué)生產(chǎn)方法，通過(guò)微生物的細(xì)胞反應(yīng)從半乳糖醇、D-塔格糖、D-塔羅糖醇等生產(chǎn)阿洛酮糖的方法已被提出(Ken Izumori)。但是該方法難以應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，因?yàn)榈孜锸窍∩偬?。工業(yè)化的最有效方法是在D-酮糖3-差向異構(gòu)酶群組中尋找用于將果糖轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒙逋堑拿?。根?jù)現(xiàn)有報(bào)道的內(nèi)容，通過(guò)使用在大腸桿菌中表達(dá)的D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶從果糖生產(chǎn)阿洛酮糖，所述大腸桿菌通過(guò)將來(lái)自Clostridium celluloticum H(10)(Mu et al.2011)、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)(Kim et al.2006)、菊苣假單胞菌(Pseudomonas cichorii)(Itoh et al.1994)、球形根瘤菌(Rhizobium spheroides)(Zhang et al.2009)的D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶插入并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中而被轉(zhuǎn)化。關(guān)于使用酶從果糖生產(chǎn)阿洛酮糖的技術(shù)，在韓國(guó)專利登記號(hào)10-0744479中，公開(kāi)了利用來(lái)自根癌農(nóng)桿菌的阿洛酮糖差向異構(gòu)酶生產(chǎn)阿洛酮糖的方法，在韓國(guó)專利登記號(hào)10-0832339中，公開(kāi)了中華根瘤菌(Sinorhizobium)YB-58KCTC10983BP和利用它將果糖轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒙逋堑姆椒ǎ鲋腥A根瘤菌YB-58KCTC10983BP具有將果糖轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒙逋堑幕钚?，在韓國(guó)專利登記號(hào)10-1106253中，公開(kāi)了包含編碼根癌農(nóng)桿菌C58的阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的多核苷酸的大腸桿菌，和使用它從果糖生產(chǎn)阿洛酮糖的方法，所述阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶具有催化果糖轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒙逋堑幕钚?，在韓國(guó)專利登記號(hào)10-1339443(韓國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)10-2008-0071176)中，公開(kāi)了來(lái)自根瘤菌屬(Rhizobium)微生物的酮糖3-差向異構(gòu)酶和使用它將果糖轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒙逋堑姆椒?，在韓國(guó)專利登記號(hào)10-1318422中，公開(kāi)了來(lái)自Clostridiuim scindens的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶和使用它從果糖生產(chǎn)阿洛酮糖的方法。

但是，根據(jù)現(xiàn)有的其功能已知的酶催化方法，生產(chǎn)阿洛酮糖的方法在中溫和堿性條件pH值下是最佳的。在堿性條件下，反應(yīng)引起非特異性反應(yīng)和糖的褐變，因此不適于工業(yè)化。而且，存在的問(wèn)題是，現(xiàn)有的酶由于穩(wěn)定性差或者在高溫下反應(yīng)速率慢，因此具有一些在阿洛酮糖的工業(yè)化生產(chǎn)中增加生產(chǎn)成本的因素。因此，需要開(kāi)發(fā)新的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶，其中產(chǎn)品產(chǎn)率、溫度、pH和阿洛酮糖的反應(yīng)速率適合于工業(yè)化。關(guān)于此，在韓國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)10-2014-0021974中，公開(kāi)了來(lái)自Treponema primitia ZAS-1的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶，通過(guò)在基因水平上誘導(dǎo)突變，它具有快速的阿洛酮糖轉(zhuǎn)化速率，并且在高溫下具有穩(wěn)定性，在韓國(guó)專利登記號(hào)10-1203856中，公開(kāi)了阿洛酮糖差向異構(gòu)酶變體，它是由來(lái)自根癌農(nóng)桿菌的野生型阿洛酮糖差向異構(gòu)酶突變獲得的，具有提高的熱穩(wěn)定性。

技術(shù)問(wèn)題

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供新的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶，它具有將果糖轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒙逋堑幕钚?，在相?duì)高的溫度或小于或等于中性的pH下具有最大活性，并且具有極好的熱穩(wěn)定性。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供生產(chǎn)新的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的方法或生產(chǎn)新的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶所需的各種要素。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供從果糖生產(chǎn)阿洛酮糖的方法或從果糖生產(chǎn)阿洛酮糖所需的各種要素。

技術(shù)方案

本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)來(lái)自Flavonifractor plautii的酶具有將果糖轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒙逋堑母呋钚?、極好的熱穩(wěn)定性、以及在高溫范圍內(nèi)和相應(yīng)于中性或弱酸性的pH值范圍內(nèi)的最佳活性，由此完成了本發(fā)明。

為了實(shí)現(xiàn)第一個(gè)目的，本發(fā)明的一個(gè)方面提供阿洛酮糖差向異構(gòu)酶(psicose epimerase)，它由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成。

為了實(shí)現(xiàn)第二個(gè)目的，本發(fā)明的另一個(gè)方面提供編碼阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的多核苷酸，所述阿洛酮糖差向異構(gòu)酶由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成。本發(fā)明還提供引物對(duì)，所述引物對(duì)用于合成編碼阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的多核苷酸，所述阿洛酮糖差向異構(gòu)酶由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成。本發(fā)明還提供重組載體，所述重組載體包含編碼阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的多核苷酸，所述阿洛酮糖差向異構(gòu)酶由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成。本發(fā)明還提供重組菌株，所述重組菌株用編碼阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的多核苷酸轉(zhuǎn)化，所述阿洛酮糖差向異構(gòu)酶由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成，或者用重組載體轉(zhuǎn)化，所述重組載體包含編碼阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的多核苷酸，所述阿洛酮糖差向異構(gòu)酶由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成。本發(fā)明還提供生產(chǎn)阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的方法，其中所述方法包括下述步驟：通過(guò)培養(yǎng)重組菌株表達(dá)阿洛酮糖差向異構(gòu)酶，所述重組菌株用編碼阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的多核苷酸轉(zhuǎn)化，所述阿洛酮糖差向異構(gòu)酶由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成，或者用重組載體轉(zhuǎn)化，所述重組載體包含編碼阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的多核苷酸，所述阿洛酮糖差向異構(gòu)酶由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成；以及從具有表達(dá)的阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的重組菌株的裂解物分離阿洛酮糖差向異構(gòu)酶。

為了實(shí)現(xiàn)第三個(gè)目的，本發(fā)明的另一個(gè)方面提供用于生產(chǎn)阿洛酮糖的組合物，其包含阿洛酮糖差向異構(gòu)酶，所述阿洛酮糖差向異構(gòu)酶由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成。本發(fā)明還提供用于生產(chǎn)阿洛酮糖的組合物，其包含重組菌株、重組菌株的培養(yǎng)物或重組菌株的裂解物，所述重組菌株用編碼阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的多核苷酸轉(zhuǎn)化，所述阿洛酮糖差向異構(gòu)酶由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成，或者用重組載體轉(zhuǎn)化，所述重組載體包含編碼阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的多核苷酸，所述阿洛酮糖差向異構(gòu)酶由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成。本發(fā)明還提供生產(chǎn)阿洛酮糖的方法，其中所述方法包括使果糖與阿洛酮糖差向異構(gòu)酶或包含阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的組合物反應(yīng)，所述阿洛酮糖差向異構(gòu)酶由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成。本發(fā)明還提供生產(chǎn)阿洛酮糖的方法，其中所述方法包括使果糖與重組菌株、重組菌株的培養(yǎng)物、重組菌株的裂解物或包含它們的一種或多種的組合物反應(yīng)，所述重組菌株用編碼阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的多核苷酸轉(zhuǎn)化，所述阿洛酮糖差向異構(gòu)酶由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成，或者用重組載體轉(zhuǎn)化，所述重組載體包含編碼阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的多核苷酸，所述阿洛酮糖差向異構(gòu)酶由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成。

有益效果

根據(jù)本發(fā)明，新的阿洛酮糖差向異構(gòu)酶具有使果糖的碳-3位置差向異構(gòu)化以產(chǎn)生阿洛酮糖的活性，并且在相對(duì)高的溫度和小于或等于中性的pH值條件下具有將果糖轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒙逋堑淖畲蠡钚?，具有極好的熱穩(wěn)定性，并且能夠在短時(shí)間內(nèi)以高產(chǎn)率從果糖大量生產(chǎn)阿洛酮糖。因此，根據(jù)本發(fā)明的阿洛酮糖差向異構(gòu)酶在阿洛酮糖的工業(yè)生產(chǎn)中是有益的，由此生產(chǎn)的阿洛酮糖可用于功能糖工業(yè)中并用作使用阿洛酮糖的保健食品、藥物、化妝品等的材料。

附圖說(shuō)明

圖1是重組表達(dá)載體pET-FDPE的切割圖譜。

圖2是對(duì)本發(fā)明實(shí)施例2中通過(guò)His標(biāo)簽親和色譜純化的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶進(jìn)行SDS-PAGE的結(jié)果。

圖3是說(shuō)明本發(fā)明的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的活性與加入的金屬離子種類的關(guān)系的圖。在圖3中，每種金屬離子處理情況下的酶活性以相對(duì)值表示，將對(duì)照組的酶活性設(shè)定為100。

圖4是說(shuō)明對(duì)于每一種加入的金屬離子和每一個(gè)處理濃度，本發(fā)明的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的活性的圖。

圖5是說(shuō)明對(duì)于每一個(gè)反應(yīng)pH，本發(fā)明的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的活性的圖。在圖5中，酶活性以相對(duì)值表示，將最大活性設(shè)定為100。

圖6是說(shuō)明對(duì)于每一個(gè)反應(yīng)溫度，本發(fā)明的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的活性的圖。在圖6中，酶活性以相對(duì)值表示，將最大活性設(shè)定為100。

圖7是說(shuō)明對(duì)于每一種底物，本發(fā)明的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的活性的圖。在圖7中，酶活性以相對(duì)值表示，將使用阿洛酮糖作為底物的反應(yīng)的酶活性設(shè)定為100。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。

本發(fā)明涉及新的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶(下文中稱為阿洛酮糖差向異構(gòu)酶)，它能夠?qū)⒐寝D(zhuǎn)變?yōu)榘⒙逋恰Ｔ摪⒙逋遣钕虍悩?gòu)酶來(lái)自于Flavonifractor plautii，在相對(duì)高的溫度和小于或等于中性的pH條件下具有將果糖轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒙逋堑淖畲蠡钚裕哂袠O好的熱穩(wěn)定性，并能夠在短時(shí)間內(nèi)以高產(chǎn)率從果糖大量生產(chǎn)阿洛酮糖。該阿洛酮糖差向異構(gòu)酶可以通過(guò)這樣的方法獲得：通過(guò)聚合酶反應(yīng)擴(kuò)增Flavonifractor plautii基因組DNA中存在的多種DNA中的特定DNA，將擴(kuò)增的特定DNA插入到表達(dá)載體中制備重組表達(dá)載體，用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌株產(chǎn)生重組菌株，然后培養(yǎng)和表達(dá)重組菌株。根據(jù)本發(fā)明的阿洛酮糖差向異構(gòu)酶優(yōu)選具有30-34kDa的分子量，最佳活性溫度在55-67℃范圍內(nèi)，最佳活性pH值在6.5-8范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的阿洛酮糖差向異構(gòu)酶由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成，但是根據(jù)本發(fā)明的阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的等同范圍不限于此。例如，在根據(jù)本發(fā)明的阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的等同范圍內(nèi)，只要保持將果糖轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒙逋堑幕钚裕琒EQ ID NO:1的一些氨基酸可以被替換、插入、和/或刪除。優(yōu)選地，可以通過(guò)保守氨基酸替換進(jìn)行氨基酸的替換，其中蛋白質(zhì)的特性不改變。進(jìn)一步，可以通過(guò)糖基化、乙?；?、磷酸化等進(jìn)行氨基酸的修飾。進(jìn)一步，根據(jù)本發(fā)明的阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的等同范圍可以包括通過(guò)氨基酸序列的突變或修飾而具有增加的對(duì)熱、pH值等的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)，或者具有將果糖轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒙逋堑脑黾拥幕钚缘牡鞍踪|(zhì)。而且，根據(jù)本發(fā)明的阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的等同范圍可以包括與SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多、或99％或更多的同源性的氨基酸序列。下述表1列舉了可以通過(guò)保守氨基酸替換方式替換蛋白質(zhì)中的氨基酸的氨基酸。

表1

本發(fā)明的另一個(gè)示例性的實(shí)施方案涉及生產(chǎn)新的阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的方法或者生產(chǎn)新的阿洛酮糖差向異構(gòu)酶所需的各種要素。生產(chǎn)新的阿洛酮糖差向異構(gòu)酶所需的各種要素包括多核苷酸、引物對(duì)、重組載體、重組菌株等。

所述多核苷酸是編碼差向異構(gòu)酶的多核苷酸，所述差向異構(gòu)酶由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成，所述多核苷酸優(yōu)選由SEQ ID NO:2的堿基序列組成。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”指所有未修飾的或修飾的多聚核糖核苷酸(RNA)或多聚脫氧核糖核苷酸(DNA)。多核苷酸包括單鏈或雙鏈DNA、單鏈和雙鏈區(qū)域混合的DNA、單鏈和雙鏈RNA、單鏈和雙鏈區(qū)域混合的RNA、或它們的雜交分子，但不限于此。進(jìn)一步，編碼差向異構(gòu)酶的多核苷酸的等同范圍包括與SEQ ID NO:2的堿基序列基本上相同的序列?；旧舷嗤侵溉魏纹渌蛄幸宰畲蟪潭鹊叵鄳?yīng)于SEQ ID NO:2的堿基序列的方式排列，并且通過(guò)分析其序列，所述任何其它序列與SEQ ID NO:2的堿基序列具有70％或更多、90％或更多、或98％或更多的序列同源性。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，通過(guò)本領(lǐng)域已知的基因重組技術(shù)，可以替換、添加、或刪除多核苷酸的堿基序列的一個(gè)或多個(gè)堿基，以產(chǎn)生編碼具有相同活性的酶的多核苷酸，所述具有相同活性的酶具有基本上相同的同源性。可以使用市售的計(jì)算機(jī)程序計(jì)算兩個(gè)或更多個(gè)序列之間的同源性百分比(％)，來(lái)進(jìn)行同源性的比較。

進(jìn)一步，引物對(duì)是為了合成編碼阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的多核苷酸，所述阿洛酮糖差向異構(gòu)酶由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成，并且所述引物對(duì)優(yōu)選由具有SEQ ID NO:3的堿基序列的正向引物和具有SEQ ID NO:4的堿基序列的反向引物組成。

進(jìn)一步，重組載體包含編碼阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的多核苷酸，所述阿洛酮糖差向異構(gòu)酶由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成。重組載體可以以如下方式提供：將編碼阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的多核苷酸通過(guò)已知的標(biāo)準(zhǔn)方法插入到克隆載體或表達(dá)載體中。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“克隆載體”被定義為可以將DNA片段輸送到宿主細(xì)胞中并復(fù)制所述DNA片段的材料。在本發(fā)明中，克隆載體可以進(jìn)一步包含多腺苷酸化信號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止序列和多克隆位點(diǎn)。在這種情況下，多克隆位點(diǎn)包括至少一個(gè)核酸內(nèi)切酶限制性酶切位點(diǎn)。進(jìn)一步，克隆載體可以進(jìn)一步包含啟動(dòng)子。作為一個(gè)實(shí)例，在本發(fā)明中，編碼阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的多核苷酸可以位于多腺苷酸化信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止序列的上游，并且至少一個(gè)核酸內(nèi)切酶限制性酶切位點(diǎn)可以位于多腺苷酸化信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止序列的上游。進(jìn)一步，在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”被定義為將克隆的DNA在合適的宿主中轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的DNA序列。進(jìn)一步，在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”指包含必需的調(diào)節(jié)元件的基因構(gòu)建體，所述調(diào)節(jié)元件與插入序列可操作地連接，以在目的細(xì)胞中表達(dá)所述插入序列。表達(dá)載體可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生和純化。表達(dá)載體的種類沒(méi)有特別限制，只要表達(dá)載體能在不同的宿主細(xì)胞，例如原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中表達(dá)所期望的基因，并實(shí)現(xiàn)產(chǎn)生所希望的蛋白的功能，但優(yōu)選是這樣的載體：它能夠大量生產(chǎn)類似于自然狀態(tài)形式的外來(lái)蛋白，同時(shí)具有表現(xiàn)出強(qiáng)活性和強(qiáng)表達(dá)能力的啟動(dòng)子。表達(dá)載體優(yōu)選包含至少啟動(dòng)子、起始密碼子、編碼所期望蛋白的基因和終止密碼子。此外，表達(dá)載體可以適當(dāng)?shù)匕幋a信號(hào)肽、其它表達(dá)調(diào)節(jié)序列、所期望基因的5'端和3'端的非翻譯區(qū)、選擇性標(biāo)記區(qū)域、復(fù)制單元等的DNA?！皢?dòng)子”指足以啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的最小序列。而且，可以包括足以表達(dá)依賴于調(diào)節(jié)性啟動(dòng)子的基因的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)(promoter configuration)，該結(jié)構(gòu)(configuration)可以位于基因的5'或3'，該基因被細(xì)胞類型特異性信號(hào)或外部信號(hào)誘導(dǎo)。保守啟動(dòng)子和誘導(dǎo)啟動(dòng)子二者都包括在內(nèi)。啟動(dòng)子序列可以來(lái)自于原核生物、真核生物或病毒。術(shù)語(yǔ)“可操作連接”指通過(guò)在一條多核苷酸上與多核苷酸序列相連，使得一個(gè)功能由另一個(gè)對(duì)象調(diào)節(jié)。例如，在啟動(dòng)子可以控制編碼序列的表達(dá)的情況下(即，編碼序列在啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下)，如果啟動(dòng)子與編碼序列連接以操作，或者存在核糖體結(jié)合位點(diǎn)以促進(jìn)翻譯，則核糖體結(jié)合位點(diǎn)與編碼序列連接并操作。編碼序列可以以有義方向或反義方向與調(diào)節(jié)序列連接并操作。在根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體中，重組載體優(yōu)選是表達(dá)載體，表達(dá)載體優(yōu)選具有圖1的切割圖譜。

進(jìn)一步，重組菌株用編碼阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的多核苷酸轉(zhuǎn)化，所述阿洛酮糖差向異構(gòu)酶由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成，或者用重組載體轉(zhuǎn)化，所述重組載體包含編碼阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的多核苷酸，所述阿洛酮糖差向異構(gòu)酶由SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“重組菌株”指將編碼一種或多種靶蛋白的多核苷酸或者具有該多核苷酸的表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞而轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。將表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體的方法包括：化學(xué)處理方法，包括瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、DEAE右旋糖酐介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、聚凝胺介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、電注射、PEG等；使用基因槍等的方法，諸如此類，但不限于此。在本發(fā)明中，只要能夠被表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域已知的，例如原核細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞等，其種類基本沒(méi)有限制。優(yōu)選地，通常使用具有高DNA引入效率和對(duì)引入的DNA具有高表達(dá)效率的宿主。例如，宿主細(xì)胞可以是大腸桿菌。大腸桿菌包括BL21、JM109、K-12、LE392、RR1、DH5α或W3110等，但不限于此。此外，宿主細(xì)胞可以是選自由芽孢桿菌(Bacillus)菌株如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)，棒桿菌(Coryne)菌株如谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)，沙門氏菌(Salmonella)菌株如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)，其它粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)，和腸桿菌(Enterobacteriaceae)菌株如各種假單胞菌(Pseudomonas species)組成的組的菌株。

進(jìn)一步，生產(chǎn)阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的方法包括以下步驟：通過(guò)培養(yǎng)重組菌株表達(dá)阿洛酮糖差向異構(gòu)酶，所述重組菌株用編碼阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的多核苷酸轉(zhuǎn)化，所述阿洛酮糖差向異構(gòu)酶由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成，或者用重組載體轉(zhuǎn)化，所述重組載體包含編碼阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的多核苷酸，所述阿洛酮糖差向異構(gòu)酶由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成；以及從表達(dá)阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的重組菌株的裂解物分離阿洛酮糖差向異構(gòu)酶?？梢允褂卯惐?1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)作為誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)宿主細(xì)胞表達(dá)蛋白，可以調(diào)整誘導(dǎo)時(shí)間以使得蛋白的量達(dá)到最大。在本發(fā)明中，可以從重組菌株的裂解物收集阿洛酮糖差向異構(gòu)酶。蛋白表達(dá)中使用的細(xì)胞可以通過(guò)各種物理或化學(xué)方法裂解，例如重復(fù)凍融、超聲處理、機(jī)械破碎或細(xì)胞裂解劑，并且可以通過(guò)通常的生物化學(xué)分離技術(shù)分離或純化(Sambrook et al.,Molecular Cloning:A laborarory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989；Deuscher,M.,Guide to Protein Purification Methods Enzymology,Vol.182.Academic Press.Inc.,San Diego,CA,1990)。例如，分離或純化由宿主細(xì)胞表達(dá)的蛋白的方法包括電泳、離心、凝膠過(guò)濾、沉淀、透析、色譜(離子交換色譜、親和色譜、免疫吸附親和色譜、反相HPLC和凝膠滲透HPLC)、等點(diǎn)聚焦和它們的各種改良方法或復(fù)合方法，但不限于此。同時(shí)，在本發(fā)明中，從重組菌株的裂解物中分離阿洛酮糖差向異構(gòu)酶優(yōu)選可以通過(guò)使用肽標(biāo)簽的親和色譜來(lái)進(jìn)行。對(duì)于肽標(biāo)簽，可以使用各種已知的標(biāo)簽，例如HA標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽、His標(biāo)簽、生物素羧基載體蛋白(BCCP)、c-myc標(biāo)簽、V5標(biāo)簽、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)或麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)，其中優(yōu)選使用His標(biāo)簽。帶有His標(biāo)簽的蛋白在鎳-次氮基三乙酸(Ni-NTA)樹(shù)脂的柱上被特異地捕獲，并可以通過(guò)EDTA或咪唑釋放。

本發(fā)明的另一個(gè)示例性的實(shí)施方案涉及從果糖生產(chǎn)阿洛酮糖的方法或者從果糖生產(chǎn)阿洛酮糖所需的各種要素。作為從果糖生產(chǎn)阿洛酮糖所需的各種要素，涉及用于生產(chǎn)阿洛酮糖的組合物。

用于生產(chǎn)阿洛酮糖的組合物的一個(gè)實(shí)例包括阿洛酮糖差向異構(gòu)酶，所述阿洛酮糖差向異構(gòu)酶由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成。進(jìn)一步，用于生產(chǎn)阿洛酮糖的組合物的另一個(gè)實(shí)例包括重組菌株、重組菌株的培養(yǎng)物或重組菌株的裂解物，所述重組菌株用編碼阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的多核苷酸轉(zhuǎn)化，所述阿洛酮糖差向異構(gòu)酶由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成，或者用重組載體轉(zhuǎn)化，所述重組載體包含編碼阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的多核苷酸，所述阿洛酮糖差向異構(gòu)酶由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成。在這種情況下，優(yōu)選地，用于生產(chǎn)阿洛酮糖的組合物可以進(jìn)一步包括一種或多種選自由錳離子、鎳離子和鈷離子組成的組的物質(zhì)，并且更優(yōu)選地，可以進(jìn)一步包括鎳離子或鈷離子。根據(jù)本發(fā)明的新的阿洛酮糖差向異構(gòu)酶具有金屬酶特性，其中由金屬離子調(diào)節(jié)其活化，并且在存在特定金屬離子，例如鎳離子或鈷離子的條件下進(jìn)行酶反應(yīng)，以提高阿洛酮糖的生產(chǎn)產(chǎn)量。

進(jìn)一步，從果糖生產(chǎn)阿洛酮糖的方法的一個(gè)實(shí)例包括使果糖與阿洛酮糖差向異構(gòu)酶或包含阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的組合物反應(yīng)，所述阿洛酮糖差向異構(gòu)酶由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成。進(jìn)一步，從果糖生產(chǎn)阿洛酮糖的方法的另一個(gè)實(shí)例包括使果糖與重組菌株、重組菌株的培養(yǎng)物、重組菌株的裂解物或包含它們的一種或多種的組合物反應(yīng)，所述重組菌株用編碼阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的多核苷酸轉(zhuǎn)化，所述阿洛酮糖差向異構(gòu)酶由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成，或者用重組載體轉(zhuǎn)化，所述重組載體包含編碼阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的多核苷酸，所述阿洛酮糖差向異構(gòu)酶由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成。進(jìn)一步，從果糖生產(chǎn)阿洛酮糖的方法可以另外包括加入的金屬離子，金屬離子的種類如上所述。作為一個(gè)實(shí)例，金屬離子可以被加入到底物果糖中，或者被加入到酶和果糖的混合物中。進(jìn)一步，作為另一個(gè)實(shí)例，金屬離子可以被加入到固定有酶的載體中(在加入果糖之前)，被加入到固定有酶的載體和果糖的混合物中(在加入果糖之后)，或者在加入果糖時(shí)以和果糖的混合物的形式被加入。在使用重組菌株的情況下，金屬離子可以被加入到培養(yǎng)物中，或者可以在添加有金屬離子的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。進(jìn)一步，在從果糖生產(chǎn)阿洛酮糖的方法中，阿洛酮糖差向異構(gòu)酶或重組菌株優(yōu)選被固定在載體中。載體可以建立一種環(huán)境，在其中可以長(zhǎng)時(shí)間保持固定化酶的活性，并且載體可以選自所有已知的可用于酶固定化的載體。例如，可以使用海藻酸鈉作為載體。海藻酸鈉是天然的膠質(zhì)多糖，在藻類的細(xì)胞壁中含量豐富，由β-D-甘露糖醛酸和α-L-葡糖酸組成。在其組成上，海藻酸鈉通過(guò)隨機(jī)形成β-1,4鍵而形成，菌株或酶被穩(wěn)定地固定化，因此它對(duì)于獲得優(yōu)異的阿洛酮糖產(chǎn)量來(lái)說(shuō)是有益的。作為一個(gè)實(shí)例，為了進(jìn)一步提高阿洛酮糖的產(chǎn)量，濃度為1.5-4.0％(w/v)的海藻酸鈉溶液(例如海藻酸鈉水溶液)，優(yōu)選濃度為大約2.5％(w/v)的海藻酸鈉溶液可用于固定重組菌株。進(jìn)一步，在從果糖生產(chǎn)阿洛酮糖的方法中，當(dāng)考慮酶的穩(wěn)定性時(shí)，反應(yīng)溫度在55-67℃，優(yōu)選55-65℃，更優(yōu)選55-60℃的范圍內(nèi)，并且反應(yīng)pH值在6.5-8，優(yōu)選6.5-7.5，更優(yōu)選6.5-7的范圍內(nèi)。進(jìn)一步，在從果糖生產(chǎn)阿洛酮糖的方法中，果糖的濃度沒(méi)有特別限制，但考慮到生產(chǎn)率和經(jīng)濟(jì)性，優(yōu)選是按全部反應(yīng)物計(jì)35-75％(w/w)，更優(yōu)選是40-70％(w/w)。進(jìn)一步，在從果糖生產(chǎn)阿洛酮糖的方法中，所使用的酶的量可以是按全部反應(yīng)物計(jì)0.001-0.1mg/ml，優(yōu)選0.01-0.1mg/ml，更優(yōu)選0.02-0.05mg/ml。進(jìn)一步，在使用重組菌株從果糖生產(chǎn)阿洛酮糖的情況下，重組菌株的宿主菌株優(yōu)選是細(xì)胞學(xué)安全的菌株。細(xì)胞學(xué)安全的菌株是一般認(rèn)為安全(generally accepted as safe,GRAS)的菌株，其一般被認(rèn)為是安全的，例如可以是棒桿菌菌株。棒桿菌菌株是工業(yè)微生物，它生產(chǎn)在飼料、藥物、食品等領(lǐng)域具有不同用途的化學(xué)物質(zhì)，包括L-賴氨酸、L-蘇氨酸和各種核酸。棒桿菌菌株是GRAS菌株，它具有易于基因操作和大量培養(yǎng)的菌株特性。進(jìn)一步，棒桿菌菌株是一種在各種處理?xiàng)l件下都具有高穩(wěn)定性的菌株，并且與其它細(xì)菌相比具有相對(duì)堅(jiān)實(shí)的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，因而具有這樣的生物學(xué)特性：甚至是在由高糖濃度引起的高滲透壓的情況下，該菌株也能以穩(wěn)定狀態(tài)存在。棒桿菌菌株的具體實(shí)例包括谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)等。

下面，將通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做更詳細(xì)描述。但是，下述實(shí)施例僅僅是為了清楚說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)特征，本發(fā)明的范圍不限于此。

實(shí)施例1：生產(chǎn)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的重組菌株的制備

從得自韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures)的Flavonifractor plautii KCTC 5970提取基因組DNA并用作模板，使用引物和Ex-Taq(TAKARA)聚合酶進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，克隆編碼D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的基因(SEQ ID NO:2的多核苷酸)。下述表2列出了從Flavonifractor plautii的基因組DNA克隆編碼D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的基因使用的引物。下述表2中列出的引物由Bioneer co.,KR制備。

表2

之后，使用凝膠提取試劑盒(Qiagen)從PCR產(chǎn)物中分離出唯一的所期望的靶DNA，然后連接到easy T-vector(Promega)中。委托Bioneer co.,KR對(duì)分離的靶DNA進(jìn)行堿基序列分析。結(jié)果證實(shí)通過(guò)PCR擴(kuò)增的靶DNA相應(yīng)于SEQ ID NO:2的多核苷酸。之后，使用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI，將通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增的靶DNA插入到表達(dá)載體pET15b載體(Novagen)的相同的限制性識(shí)別位點(diǎn)上，制備重組表達(dá)載體pET-FDPE。圖1是重組表達(dá)載體pET-FDPE的切割圖譜。然后，用重組表達(dá)載體pET-FDPE通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21(制造商：RBC，臺(tái)北，臺(tái)灣)大腸桿菌，制備重組菌株。

實(shí)施例2：D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的表達(dá)和純化

將轉(zhuǎn)化的重組菌株的單克隆接種到15ml LB-氨芐青霉素培養(yǎng)基(Difco)中，然后在37℃和200rpm的條件下預(yù)培養(yǎng)大約6hrs。之后，將預(yù)培養(yǎng)的溶液接種到500ml LB-氨芐青霉素培養(yǎng)基中，在37℃和200rpm的條件下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)。之后，當(dāng)培養(yǎng)物溶液的吸收值(在600nm)為0.5時(shí)，加入IPTG至濃度為0.1mM，以誘導(dǎo)靶酶的過(guò)表達(dá)。在這種情況下，將過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)時(shí)間的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至16℃和150rpm的條件下保持大約16hrs。之后，將重組菌株的培養(yǎng)物溶液在13,000rpm離心2mins，移除上清，收集重組菌株的菌株細(xì)胞。

將收集的重組菌株的菌株細(xì)胞重懸于裂解緩沖液(50mM Tris_HCl 300mM NaCl pH8.0,10mM咪唑)中，然后通過(guò)超聲處理進(jìn)行裂解。將細(xì)胞裂解物在13,000rpm離心10mins，只收集上清，然后將其加到用裂解緩沖液預(yù)平衡的Ni-NTA柱(Bio-Rad,Profinia)上，使在50mM Tris_HCl 300mM NaCl pH 8.0中含有20mM咪唑和200mM咪唑的緩沖溶液順序流過(guò)。最后，使50mM Tris_HCl 300mM NaCl pH 8.0和200mM咪唑流過(guò)以洗脫靶蛋白。下文描述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)洗脫的蛋白是D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶。然后將洗脫的蛋白儲(chǔ)存在緩沖溶液(PIPES,pH 7.5)中，測(cè)量酶活性，以用于下一個(gè)實(shí)驗(yàn)中。進(jìn)一步，對(duì)洗脫的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，由此證實(shí)洗脫蛋白的大小是32kDa。圖2是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例2中通過(guò)His標(biāo)簽親和色譜純化的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶進(jìn)行SDS-PAGE的結(jié)果。

實(shí)施例3：D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的特性的驗(yàn)證

(1)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的金屬離子需求分析

檢查金屬離子對(duì)于實(shí)施例2中獲得的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶是否具有效果。

將ZnSO₄、CaCl₂、MnSO₄、NiSO₄、CoCl2、MgSO₄、CuSO₄、CaCO₃和FeSO₄分別加到純化酶緩沖溶液(PIPES,pH 7.5)中，至1mM，然后使金屬離子與酶結(jié)合大約1hr。之后，將結(jié)合有金屬離子的酶與100mM底物果糖水溶液按重量比1:1混合，制備獲得混合物，其中酶濃度為0.025ml/mg，果糖濃度為50mM，在60℃反應(yīng)10mins。然后向其中加入鹽酸溶液終止反應(yīng)。另外，在對(duì)照組中，使用未經(jīng)金屬離子處理的酶(無(wú))進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)。之后，測(cè)量產(chǎn)生的阿洛酮糖的量(mM)并除以酶量和反應(yīng)時(shí)間，以計(jì)算酶活性。通過(guò)HPLC分析阿洛酮糖的量。進(jìn)行HPLC分析，使用87C(BIO-RAD)柱，用100％(v/v)水作為流動(dòng)相，在80℃以0.6ml/min的流速流過(guò)，用折光率檢測(cè)器(Agilent 1260TID)檢測(cè)阿洛酮糖，以分析產(chǎn)生的阿洛酮糖的量。圖3是說(shuō)明本發(fā)明的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的活性與加入的金屬離子種類的關(guān)系的圖。在圖3中，每種金屬離子處理情況下的酶活性以相對(duì)值表示，將對(duì)照組的酶活性設(shè)定為100。如圖3所示，在實(shí)施例2中獲得的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶中，通過(guò)加入錳離子、鎳離子和鈷離子，將果糖轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒙逋堑幕钚蕴岣?，特別是，鎳離子和鈷離子的活性的提高是顯著的。

之后，在純化的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶溶液中用不同濃度的MnSO₄、NiSO₄和CoCl₂處理，然后進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)。圖4是說(shuō)明對(duì)于每一種加入的金屬離子和每一個(gè)處理濃度，本發(fā)明的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的活性的圖。如圖4所示，錳離子、鎳離子和鈷離子在不同的濃度范圍提高D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的活性。

(2)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶活性與pH值或溫度改變的關(guān)系的分析

為了檢查實(shí)施例2中獲得的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的最適pH值，使用MES緩沖液、PIPES緩沖液、EPPS緩沖液和CHES緩沖液制備不同pH值的測(cè)試溶液。具體來(lái)說(shuō)，在純化酶的緩沖溶液中用濃度為1mM的NiSO₄處理，然后與100mM果糖水溶液按重量比1:1混合，制備不同pH值的測(cè)試溶液，所述測(cè)試溶液的緩沖液濃度為50mM，酶濃度為0.025ml/mg，果糖濃度為50mM。之后，測(cè)試溶液在60℃反應(yīng)10mins，加入鹽酸溶液終止反應(yīng)。之后，用HPLC分析和測(cè)量產(chǎn)生的阿洛酮糖的量(mM)并除以酶量和反應(yīng)時(shí)間，計(jì)算酶活性。圖5是說(shuō)明對(duì)于每一個(gè)反應(yīng)pH，本發(fā)明的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的活性的圖。在圖5中，酶活性以相對(duì)值表示，將最大活性設(shè)定為100。如圖5所示，本發(fā)明的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶在pH 6.5-8，優(yōu)選在pH 6.5-7.5具有高活性，在pH 7具有最大活性。

進(jìn)一步，在純化酶的緩沖溶液(PIPES,pH 7.5)中用濃度為1mM的NiSO₄處理，然后與100mM果糖水溶液按重量比1:1混合，制備測(cè)試溶液，所述測(cè)試溶液pH值為7.0，酶濃度為0.025ml/mg，果糖濃度為50mM。之后，測(cè)試溶液在不同溫度反應(yīng)10mins，然后加入鹽酸溶液終止反應(yīng)。之后，用HPLC分析和測(cè)量產(chǎn)生的阿洛酮糖的量(mM)并除以酶量和反應(yīng)時(shí)間，計(jì)算酶活性。圖6是說(shuō)明對(duì)于每一個(gè)反應(yīng)溫度，本發(fā)明的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的活性的圖。在圖6中，酶活性以相對(duì)值表示，將最大活性設(shè)定為100。如圖6所示，本發(fā)明的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶在55-67℃的溫度下具有高活性，在65℃具有最大活性。

(3)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的底物特異性分析

分析實(shí)施例2中獲得的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶對(duì)于不同底物例如阿洛酮糖、果糖和塔格糖的反應(yīng)活性。

在純化酶的緩沖溶液(PIPES,pH 7.5)中用濃度為1mM的NiSO₄處理，然后與100mM底物水溶液按重量比1:1混合，制備測(cè)試溶液，所述測(cè)試溶液pH值為 7.0，酶濃度為0.025ml/mg，底物濃度為50mM。之后，測(cè)試溶液在65℃反應(yīng)10mins，然后加入鹽酸溶液終止反應(yīng)。之后，用HPLC分析和測(cè)量相應(yīng)于底物的差向異構(gòu)酶的量(mM)并除以酶量和反應(yīng)時(shí)間，計(jì)算酶活性。圖7是說(shuō)明對(duì)于每一種底物，本發(fā)明的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的活性的圖。在圖7中，酶活性以相對(duì)值表示，將使用阿洛酮糖作為底物的反應(yīng)的酶活性設(shè)定為100。如圖7所示，證明本發(fā)明的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶對(duì)阿洛酮糖和果糖具有高活性，特別是，與現(xiàn)有的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶相比，本發(fā)明的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶將果糖轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒙逋堑幕钚苑浅８?。因此，使用本發(fā)明的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶可以以高產(chǎn)率從果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖。

(4)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性分析

將實(shí)施例2中獲得的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶用50mM PIPES緩沖溶液制備成0.05mg/ml濃度，然后，將得到的溶液放置并儲(chǔ)存在溫度分別設(shè)定為55℃、60℃、65℃和70℃的水浴中加熱。在每個(gè)儲(chǔ)存時(shí)間取純化酶的緩沖溶液，用濃度為1mM的NiSO₄處理，然后與100mM底物水溶液按重量比1:1混合，制備測(cè)試溶液，所述測(cè)試溶液pH值為 7.0，酶濃度為0.025ml/mg，底物濃度為50mM。之后，測(cè)試溶液在65℃反應(yīng)10mins，然后加入鹽酸溶液以終止反應(yīng)。之后，用HPLC分析和測(cè)量產(chǎn)生的阿洛酮糖的量(mM)并除以酶量和反應(yīng)時(shí)間，計(jì)算酶活性。結(jié)果，雖然純化酶的緩沖溶液在55℃加熱了250mins，酶活性仍然保持不變。進(jìn)一步，當(dāng)純化酶的緩沖溶液在60℃加熱大約200mins時(shí)，酶活性與加熱處理之前相比減少了大約80％。通常認(rèn)為大部分D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶在50℃的半衰期(酶活性為加熱處理之前的50％時(shí)的加熱處理時(shí)間)為大約一個(gè)小時(shí)，本發(fā)明的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶具有非常好的熱穩(wěn)定性。

(5)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶在高濃度果糖下的活性分析

將700μl濃度為70wt％的果糖在60℃預(yù)熱并向其加入280μl PIPES緩沖溶液，所述緩沖溶液中含有實(shí)施例2中獲得的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶，濃度為0.1mg/ml，然后得到的反應(yīng)物在60℃進(jìn)行反應(yīng)。在每個(gè)反應(yīng)時(shí)間取10μl反應(yīng)產(chǎn)物并稀釋25倍。向稀釋的產(chǎn)物加入鹽酸溶液終止反應(yīng)。之后，用HPLC分析和測(cè)量產(chǎn)生的阿洛酮糖的量(mM)并除以底物果糖的量，以計(jì)算轉(zhuǎn)化率。在每個(gè)反應(yīng)時(shí)間從果糖向阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率列在下述表3中。如表3所列出的，當(dāng)本發(fā)明的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶與高濃度的果糖反應(yīng)時(shí)，僅僅經(jīng)過(guò)約18個(gè)小時(shí)轉(zhuǎn)化率就達(dá)到超過(guò)33％的最大轉(zhuǎn)化率。

表3

如上所述，本發(fā)明通過(guò)實(shí)施例進(jìn)行描述，但并不一定限于此，在不背離本發(fā)明的范圍和精神的情況下可以形成各種修改的實(shí)施方案。因此，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的范圍包括屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的所有實(shí)施方案。