免疫原或表位遞送是疫苗成功的主要問題。盡管僅幾種佐劑得到許可(http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/SafetyAvailability/VaccineSafety/ucm187810.htm,Vaccines,Blood&Biologics,2011)，但是目前揭示了針對疫苗多肽的大批基于化學(xué)的新佐劑或免疫刺激劑(Ribeiro,CM,Schijns VE,2010,Methods Mol Biol 626:1-14)。然而，已產(chǎn)生了一些關(guān)于與疫苗聯(lián)合使用的化合物的安全性問題(Bagnoli F et al.,2011,OMICS 15:545-566；Tomljenovic L,2011,J Alzheimers Dis 23:567-598；Francois G et al.,2005,Pediatr Infect Dis J 24:953-961；Piyasirisilp S,Hemachudha T,2002,Curr Opin Neurol 15:333-338；Miller E et al.,2013,BMJ 346:f794)。因此，需要開發(fā)另外的遞送策略。其中出現(xiàn)了使用減毒的(Lacerda CM et al.,2011,Mycopathologia 171:395-401)或滅活的(Stubbs AC et al.,2001,Nat Med 7:625-629；Roohvand F,Kossari N,2012,Expert Opin Ther Pat 22:391-415；Bian G et al.,2009,Vaccine 28:187-194)酵母?；诮湍傅囊呙缭跓o佐劑條件下能引起體液和細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(Stubbs AC et al.,2001,Nat Med 7:625-629；Roohvand F,Kossari N,2012,Expert Opin Ther Pat 22:391-415；Bian G et al.,2009,Vaccine 28:187-194)。熱滅活酵母已經(jīng)示出保護小鼠抗全身性曲霉菌病和球孢子菌病(Liu M et al.,2011,Vaccine 29:1745-1753)，或者為雞提供傳染性囊病的無菌保護作用(Arnold M et al.,2012,PLoS One 7:e42870)。重組酵母目前開發(fā)作為針對人體內(nèi)HBV和HCV(Haller AA et al.,2007,Vaccine 25:1452-1463)或白血病(Bui MR et al.,2010,Vaccine 28:6028-6035)的疫苗候選物。完整酵母形式的酵母激活樹突細胞(DC)并通過DC上的fungipods或吞噬突觸(phagocytic synapses)而被有效攝入(Neumann AK,Jacobson K,2010,PLoS Pathog 6:e1000760；Goodridge HS et al.,2011,Nature 472:471-475)。甘露糖和Dectin-1受體均介導(dǎo)人DC與最生物技術(shù)相關(guān)酵母即釀酒酵母(S.cerevisiae)和巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)之間的相互作用(Bazan SB et al.,2011,Vaccine 29:8165-8173)。DC通過Dectin-1模式識別受體可以區(qū)分直接真菌接觸(fungal contact)與可溶的真菌衍生成分(Goodridge HS et al.,2011,Nature 472:471-475)。因此，激活的DC成為在重組酵母中表達的抗原的強呈遞細胞，有效遞送抗原至MHC I類和II類途徑。因此，酵母-DC相互作用提供了對于抗原免疫原性的強佐劑效應(yīng)(Stubbs AC et al.,2001,Nat Med 7:625-629；Roohvand F,Kossari N,2012,Expert Opin Ther Pat 22:391-415；Bian G et al.,2009,Vaccine 28:187-194；Saiki M et al.,2005,J Autoimmun 24,203-208)。

單體抗原的多聚化也被大量證實通過DC攝入增加而增加其免疫原性(Arias MA et al.,2011,Vaccine 29:1258-1269；Singh M et al,2007,Expert Rev Vaccines 6:797-808；Xiang SD et al.,2006,Methods 40:1-9；Storni T et al.,2005,Adv Drug Deliv Rev 57:333-355)。通常源自病毒的一些多聚蛋白質(zhì)已經(jīng)用作遞送系統(tǒng)(Casares S et al.,2010,Vaccine 28:4880-4894；Gonzalez MC et al.,2009,Virus Res 146:107-114；Vietheer PT et al.,2007,Antivir Ther 12:477-487；Jariyapong P et al.,2013,Vaccine 31:417-424)。

麻疹病毒(MV)的核蛋白(N)包含病毒螺旋狀核殼(Griffin DE et al.,2012,FEMS Microbiol Rev 36:649-662；Griffin DE,2001,Fields Virology.Philadelphia:Lippincott Williams&Wilkins Publications.pp.1401–1441)，具有在表達該蛋白質(zhì)的細胞的細胞質(zhì)中在任何RNA分子周圍以1個N分子比6個核糖核苷酸的比率自組合的能力，所述細胞包括哺乳動物(Bourhis JM,Canard B,Longhi S,2006,Virology 344:94-110)、細菌(Warnes A et al.,1995,Gene 160:173-178)或者酵母細胞(Slibinskas R et al.,2004,J Biotechnol 107:115-124))。這樣產(chǎn)生了螺旋狀、高度穩(wěn)定和多聚的RNP，與在MV病毒顆粒中存在的RNP在形狀和直徑方面均是類似的(Jensen MR et al.,2011,Proc Natl Acad Sci U S A 108:9839-9844)。MV-N蛋白在巴斯德畢赤酵母GS115酵母株中的表達誘導(dǎo)形成在細胞質(zhì)中通過電子顯微鏡可見的大量這些RNP，而無需其它麻疹病毒蛋白的輔助(Slibinskas R et al.,2004,J Biotechnol 107:115-124)。

疫苗生產(chǎn)者大量使用酵母作為生物反應(yīng)器以生產(chǎn)大量的低成本疫苗，最佳的實例是抗乙型肝炎病毒(HBV)疫苗這種疫苗基于HBV小表面抗原(HBsAg)，在釀酒酵母中生產(chǎn)。與目前市場上的所有基于酵母的疫苗相同，HbsAg是從酵母中產(chǎn)生和純化的。驗證釀酒酵母作為抗原生物反應(yīng)器和遞送系統(tǒng)的嘗試目前處于臨床前和臨床試驗階段。一種HCV治療性疫苗(GI-5005)在IIb期測試，一種HBV治療性疫苗(GI-13000)正經(jīng)歷臨床前研究(http://www.globeimmune.com/)。這些疫苗候選物基于釀酒酵母，與大多數(shù)基于完整酵母的疫苗候選物相同(Liu M et al.,2011,Vaccine 29:1745-1753；Bui MR et al.,2010,Vaccine 28:6028-6035)。在2009年，巴斯德畢赤酵母(GS115株)的完整基因組被測序(De Schutter K et al.,2009,Nat Biotechnol 27:561-566)。這促進了巴斯德畢赤酵母在疫苗學(xué)中作為生物反應(yīng)器的開發(fā)。事實上，巴斯德畢赤酵母與釀酒酵母相比可賦予更多的優(yōu)勢，如通過強可誘導(dǎo)啟動子嚴格控制蛋白質(zhì)產(chǎn)生及降低翻譯后最終加入轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)中的寡糖鏈的長度。此外，與在釀酒酵母中產(chǎn)生的抗原的超抗原性作用相關(guān)的糖基化蛋白質(zhì)上末端α-1,3多糖鏈(Cregg JM et al.,1993,Biotechnology(N Y)11:905-910)在巴斯德畢赤酵母中不形成。因此，巴斯德畢赤酵母是在完整酵母疫苗開發(fā)中感興趣的替代方案，因為這個物種與釀酒酵母相比在異源抗原上導(dǎo)入較少的翻譯后修飾(Cregg JM et al.,1993,Biotechnology(N Y)11:905-910)。此外，與釀酒酵母不同，巴斯德畢赤酵母特別適于發(fā)酵生長并且具有在發(fā)酵期間達到極高細胞密度的能力，這可以改良整體蛋白質(zhì)產(chǎn)量(Liu R et al.,2009,Appl Biochem Biotechnol 158:432-444)。

國際專利申請WO2007/119011揭示了融合蛋白，其中感興趣的蛋白質(zhì)如來自病原性微生物如瘧原蟲的抗原融合在副黏液病毒科病毒如麻疹病毒的N蛋白的C末端。這些融合蛋白在大腸桿菌中表達，并以可溶環(huán)(soluble rings)形式純化，含有N蛋白的10個分子及細菌來源的RNA，被提議用于疫苗接種和細胞內(nèi)載體化。

多肽(特別是攜帶表位的多肽或抗原)與另一多肽(作為載體蛋白的N蛋白)的融合可影響載體蛋白的折疊和/或一般性質(zhì)。具體地，如果載體蛋白自組合成四級結(jié)構(gòu)(即MV RNP)，則這種蛋白質(zhì)與異源蛋白質(zhì)的融合可削弱其結(jié)合。在HBV VLP的情況中，證實與HBsAg蛋白在N末端融合的蛋白質(zhì)/肽(自組合成HBV VLP)的長度和氨基酸組成、三個讀框中半胱氨酸殘基和/或ATG密碼子的存在以及疏水性顯著影響VLP組合體的效力及其免疫原性(Gonzales MC et al.2009,Virus research 146:107-114；Berkower et al.2004,Virology 321:75–86；Cheong et al.2009,J.Virol.Methods 158:35–40；Mancini et al.1994,Int.Rev.Immunol.11:143–151；Michel et al.2007Vaccine 25:1901–1911)。值得注意的是，GSK的包含佐劑的抗惡性瘧原蟲疫苗基于這些VLP(高劑量)(WO93/10152；Vanloubbeeck Y et al.2013.Vaccine)。

國際專利申請WO2009/095791揭示了一種通過反向遺傳學(xué)產(chǎn)生感染性核糖核蛋白顆粒(RNP)、RNP樣麻疹病毒或者與異源序列融合的這種RNP的方法，所述方法在重組酵母中進行，例如在釀酒酵母或巴斯德畢赤酵母中進行。該專利申請揭示了MV-RNP在酵母中的生產(chǎn)與純化。

國際專利申請WO2010/033841揭示了熱滅活的完整酵母如巴斯德畢赤酵母在制備免疫治療性組合物以治療慢性丙型肝炎病毒中的用途。

專利申請US5830463、US8221763和EP0789593涉及基于酵母的遞送運載體，例如基于巴斯德畢赤酵母的遞送運載體，及其用于遞送各種化合物至不同細胞類型的用途。酵母運載體不需要與佐劑一起施用，且能保護動物免于感染，例如免于瘧原蟲感染。

疫苗學(xué)中的主要挑戰(zhàn)是開發(fā)新抗原生產(chǎn)和遞送策略及由于安全性考慮而避免使用化學(xué)佐劑。本發(fā)明解決這些問題。

為了評估基于作為多聚化多肽的表位遞送載體的重組酵母的新的疫苗平臺，本發(fā)明人使用了瘧疾動物模型。盡管已進行了大量研究，但是事實上有效的瘧疾疫苗仍未被獲得(Daily JP,2012,N Engl J Med 367:2349-2351)。因此，研究新的方法是值得的。

瘧疾是一種由雌性瘧蚊刺入皮膚之后血液中瘧原蟲增殖導(dǎo)致的危及生命的疾病。已知感染人體的瘧原蟲是間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)、卵形瘧原蟲(Plasmodium ovale)、三日瘧原蟲(Plasmodium malariae)、諾斯瘧原蟲(Plasmodium knowlesi)和惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)，后者是導(dǎo)致大多數(shù)人死亡的最主要的寄生物。該寄生物在皮膚中形成，稱作子孢子，進入血流并侵入肝細胞，在此其增殖為裂殖子。然后，在肝細胞破裂后，這些裂殖子感染紅細胞并經(jīng)歷多倍核分裂產(chǎn)生能侵入另外的紅細胞的進一步的裂殖(Miller LH et al.,2013,Nat Med 19:156-167)。

瘧原蟲子孢子由環(huán)子孢子蛋白(CS)覆蓋，這是針對瘧原蟲的前紅細胞階段的主流疫苗候選物。當(dāng)將其接種于宿主皮膚內(nèi)時，CS蛋白存在于瘧原蟲子孢子表面(10pg/子孢子；Kumar S et al.,2013,J Immunol Methods 390:99-105)(Miller LH et al.,2013,Nat Med 19:156-167；Nussenzweig V,Nussenzweig RS,1985,Cell 42:401-403；Gueirard P et al.,2010,Proc Natl Acad Sci U S A 107:18640-18645)。已知CS的抗體(Kester KE et al.,2009,J Infect Dis 200:337-346；John CC et al.,2005,Am J Trop Med Hyg 73:222-228；Schofield L et al.,1987,Nature 330:664-666)以及特異性CD8+T細胞(Schofield L et al.,1987,Nature 330:664-666；Weiss WR et al.,1988,Proc Natl Acad Sci U S A 85:573-576；Radosevic K et al.,2010,Clin Vaccine Immunol 17:1687-1694)在動物模型、主要是嚙齒動物中針對子孢子攻擊起保護作用。在人體中，最先進的瘧疾疫苗候選物(RTS,S)基于這種CS抗原(Regules JA et al.,2011,Expert Rev Vaccines 10:589-599)。在RTS,S中，CS多聚體化是通過其與乙型肝炎病毒樣顆粒結(jié)合而實現(xiàn)的。RTS,S的III期實驗的全部結(jié)果預(yù)期在2015年完成。目前根據(jù)年齡組和終點估計在三次劑量后12個月內(nèi)疫苗的效力為30-56％(Agnandji ST et al.,2012,N Engl J Med367:2284-2295)。然而，最近的IIb期分析示出RTS,S的效力與傳播強度負相關(guān)，在三年遠景下降至零(Bejon P et al.,2013,Lancet Infect Dis)。這大力支持了開發(fā)第二代瘧疾疫苗策略。

本發(fā)明人建立了一個基于麻疹病毒核蛋白(MV-N)在巴斯德畢赤酵母中的異源表達的遞送系統(tǒng)。本發(fā)明人示出這種蛋白質(zhì)在巴斯德畢赤酵母中與細胞RNA的自發(fā)自組合提供了一種用于多聚化異源多肽的方式或載體。作為概念驗證，本發(fā)明人將MV-N與伯氏瘧原蟲(Plasmodium berghei，Pb)的環(huán)子孢子蛋白(CS)融合，伯氏瘧原蟲是嚙齒動物瘧疾病原體(Scheller LF et al.,1994,Infect Immun 62:4844-4847)。

本發(fā)明因此涉及得自至少200個融合蛋白與細胞核糖核酸(RNA)的組合體的多聚核糖核蛋白(RNP)，其中所述融合蛋白包含與攜帶一或多個表位的異源多肽直接或間接融合的副粘液病毒科的非節(jié)段負鏈RNA病毒的核蛋白(N)。

在一個特定的實施方案中，本發(fā)明涉及得自至少200個融合蛋白與細胞核糖核酸(RNA)的組合體的多聚核糖核蛋白(RNP)，其中所述融合蛋白由與攜帶一或多個表位的異源多肽直接或間接融合的副粘液病毒科的非節(jié)段負鏈RNA病毒的核蛋白(N)組成。

本發(fā)明的核蛋白涵蓋來自MV病毒的天然核蛋白，特別是來自MV Schwarz或MV Moraten的N蛋白。其還涉及來自MV病毒的天然核蛋白的變體或突變形式。其也涵蓋已經(jīng)經(jīng)歷翻譯后修飾的核蛋白，例如糖基化核蛋白。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，核蛋白及任選地異源多肽是糖基化的，尤其是酵母糖基化的結(jié)果，例如通過巴斯德畢赤酵母或釀酒酵母糖基化。

在本發(fā)明中，術(shù)語“核糖核蛋白”縮寫為RNP。

如本文定義，術(shù)語“核糖核蛋白(RNP)”是指含有細胞核糖核酸(RNA)和本發(fā)明的融合蛋白的四級結(jié)構(gòu)，后者以使得其沿著RNA鏈組合的方式多聚體化以形成棒形結(jié)構(gòu)。所述細胞RNA特別是在細胞的細胞質(zhì)中的RNA，在此形成RNP。因此，這個四級結(jié)構(gòu)的構(gòu)象與副粘液病毒科的非節(jié)段負鏈RNA病毒的構(gòu)象不同，在該構(gòu)象中RNP得自作為核殼的N和P蛋白與復(fù)制MV-RNA的自組合。

本發(fā)明的RNP采用棒形結(jié)構(gòu)，如先前Spehner et al.(J.Virol.1991,65(11):6296-6300)或Bakker et al.(J.Gen.Virol.,2013,94:1734-1738)所述。優(yōu)選地，本發(fā)明的多聚RNP、特別是采用棒形結(jié)構(gòu)的那些RNP，具有人字形形狀，直徑為至少20nm，棒長度為至少100nm。一旦荷載異源多肽，本發(fā)明的RNP是穩(wěn)定的且保持其結(jié)構(gòu)，在其表面上暴露所述異源多肽。在多聚RNP中，異源多肽均是同一性質(zhì)，特別是在其氨基酸含量及序列長度方面均是相同的。在本發(fā)明的構(gòu)架內(nèi)，考慮到融合蛋白的數(shù)目和/或被包殼的RNA的長度和/或核苷酸組成，RNP在多聚體中可具有不同的組成。

令人驚奇地，在本發(fā)明中，首次證實MV病毒的N蛋白形成的RNP能遞送其表面上的異源多肽。

已經(jīng)揭示了甚至在不存在病毒RNA的條件下，MV N蛋白通過與其在之中表達的各種細胞中存在的細胞RNA相互作用可以自組合成RNP(Spehner D et al.1991J.Virol 65(11),6296-6300；Bourhis JM,Canard B,Longhi S,2006,Virology 344:94-110；Warnes A et al.,1995,Gene 160:173-178；Slibinskas R et al.,2004,J Biotechnol 107:115-124)。一個N分子包裹精確6個RNA核苷酸或者與精確6個RNA核苷酸相互作用，其已經(jīng)被建議解釋所謂的“六位原則(rule of six)”，已知六位原則是允許保持MV有效復(fù)制必需的。N蛋白與RNA分子的核苷酸之間的相互作用涉及所述蛋白質(zhì)的核心部分，所述核心部分由該蛋白質(zhì)的N末端400個氨基酸殘基組成(總共525個氨基酸殘基中的400個)。在麻疹病毒中，需要調(diào)節(jié)機制以阻止在不存在進行中的病毒基因組RNA合成的條件下N蛋白的非法自組合。這個作用是由病毒磷蛋白(P)實現(xiàn)的，其與N蛋白的結(jié)合阻止后者的非法自組合，且還保持細胞質(zhì)中N蛋白的可溶形式。因此，在不存在病毒磷蛋白表達的條件下，即在本發(fā)明的表達系統(tǒng)的情況中，N蛋白與不同長度的細胞RNA分子隨意結(jié)合。

因此，倘若多聚RNP具有如本文揭示的是全部或基本上全部由N蛋白與如本文定義的異源蛋白形成的融合蛋白，則多聚RNP在其融合蛋白的數(shù)目及RNA分子的大小和/或成分方面可彼此不同。

如本文定義，術(shù)語“融合蛋白”是指如本文定義的核蛋白(N)、特別是副粘病毒科的非節(jié)段負鏈RNA病毒、優(yōu)選麻疹病毒的核蛋白與如本文定義的異源多肽的融合。這種融合蛋白不削弱本發(fā)明多聚RNP的穩(wěn)定性。本發(fā)明的融合蛋白是通過重組多核苷酸在宿主細胞、特別是在酵母中表達而獲得的，所述重組多核苷酸編碼所述N蛋白和異源多肽，當(dāng)翻譯時這些編碼序列任選在多核苷酸內(nèi)融合依靠第三個序列作為在N蛋白與異源序列之間的接頭。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“融合蛋白”因此涵蓋了通過表達其的酵母進行的糖基化獲得的糖基化蛋白質(zhì)。

如本文定義，術(shù)語“細胞核糖核酸”是指在酵母細胞中存在的RNA，特別是在細胞的細胞質(zhì)中存在的酵母。具體地，這種RNA從細胞的基因組中轉(zhuǎn)錄，即是細胞RNA。在特定的實施方案中，RNA可以是編碼融合蛋白及任選包含如后文定義的前導(dǎo)序列和/尾隨(trailer)序列的特定RNA。

如本文定義，術(shù)語“異源多肽”是指該多肽不是由副粘病毒科病毒天然表達的蛋白質(zhì)或抗原，而是具有另一病原性生物如寄生物或另一病毒的特征。這種多肽攜帶表位B和/或T表位，當(dāng)在本發(fā)明的RNP上表達時誘導(dǎo)在宿主、特別是在人體中免疫應(yīng)答，且能針對所述病原體感染、特別是針對所述寄生物或病毒感染起保護作用。攜帶表位的多肽可特別是抗原，即由宿主免疫系統(tǒng)識別的多肽。

如本文定義，術(shù)語“副粘病毒科”涵蓋副粘病毒亞科，特別是麻疹病毒屬。

根據(jù)本發(fā)明的制備本發(fā)明RNP的一個特定實施方案，副粘病毒科的非節(jié)段負鏈RNA病毒選自：麻疹病毒，牛瘟病毒(RPV)，小反芻獸疫病毒(PPRV)，犬瘟熱病毒(CDV)，海豚麻疹病毒(DMV)和貓麻疹病毒。優(yōu)選地，副粘病毒科的非節(jié)段負鏈RNA病毒是麻疹病毒。更優(yōu)選地，所述麻疹病毒來自減毒活麻疹病毒毒株。優(yōu)選的減毒活麻疹病毒毒株是Schwarz、Moraten、Rubeovax、AIK-C、Zagreb和Edmonston毒株。最優(yōu)選的減毒活麻疹病毒毒株是Schwarz毒株和Moraten毒株。

在本發(fā)明中，術(shù)語“麻疹病毒”縮寫為“MV”。

如本文定義，短語“來自減毒活麻疹病毒毒株的麻疹病毒”是指源自在同一宿主、特別是人中與確定的親代毒株相比無毒性或低毒性毒株的麻疹病毒，同時在宿主、特別是在人體內(nèi)施用時保持感染性質(zhì)和免疫原性及可能的輔助作用。

適于制備本發(fā)明的融合蛋白和RNP的特定核蛋白是麻疹病毒核蛋白。例如，所述核蛋白可以是Schwarz/Moraten MV的核蛋白或其變體，特別是具有如在不同MV毒株中發(fā)現(xiàn)的那些氨基酸取代，如在Parks et al.(Journal of Virology,2001,75(2),910-920)中描述。

編碼Schwarz/Moraten MV的核蛋白的多核苷酸的天然及優(yōu)化的核苷酸序列以及本發(fā)明的Schwarz/Moraten MV的核蛋白的氨基酸序列是分別如SEQ ID No:1、SEQ ID No:2和SEQ ID No:3所示那些序列。

編碼Rubeovax MV的核蛋白的多核苷酸的天然和優(yōu)化的核苷酸序列以及本發(fā)明的Rubeovax MV的核蛋白的氨基酸序列是分別如SEQ ID No:4、SEQ ID No:5和SEQ ID No:6所示那些序列。

編碼AIK-C MV的核蛋白的多核苷酸的天然和優(yōu)化的核苷酸序列以及本發(fā)明的AIK-C MV的核蛋白的氨基酸序列是分別如SEQ ID No:7、SEQ ID No:8和SEQ ID No:9所示那些序列。

編碼Zagreb MV的核蛋白的多核苷酸的天然和優(yōu)化的核苷酸序列以及本發(fā)明的Zagreb MV的核蛋白的氨基酸序列是分別如SEQ ID No:10、SEQ ID No:11和SEQ ID No:12所示那些序列。

編碼Edmonston MV的核蛋白的多核苷酸的天然和優(yōu)化的核苷酸序列以及本發(fā)明的Edmonston MV的核蛋白的氨基酸序列是分別如SEQ ID No:13、SEQ ID No:11和SEQ ID No:12所示那些序列。

本發(fā)明的天然蛋白質(zhì)的突變體形式是具有點突變的蛋白質(zhì)，特別是具有1-10％氨基酸殘基取代或者具有如本文例證及在各種MV毒株中發(fā)現(xiàn)的在MV的核蛋白之間發(fā)生的突變或者通過氨基酸殘基缺失所致突變。突變形式還包括缺失多肽片段如在MV的核蛋白的C末端部分中1-125個氨基酸殘基的片段，即這個核蛋白的后125個氨基酸殘基鏈片段(氨基酸401-525)。畢竟真正觀測到MV的天然核蛋白與RNA分子之間的相互作用涉及該天然蛋白質(zhì)的N末端400氨基酸殘基。

根據(jù)本發(fā)明的一個特定實施方案，異源多肽來自寄生物，優(yōu)選來自瘧原蟲屬的原生動物寄生物，更優(yōu)選來自伯氏瘧原蟲或者惡性瘧原蟲，或者來自病毒，優(yōu)選來自小RNA病毒科，更優(yōu)選來自腸道病毒屬，例如腸道病毒71(EV71)。

短語“瘧原蟲屬原生動物寄生物”是指與哺乳動物尤其是人宿主的生命周期的各個階段相關(guān)的每一及全部形式的寄生物，包括子孢子，特別是在接種后機體內(nèi)存在的子孢子，或者在肝細胞中發(fā)育的子孢子，裂殖子，尤其包括在肝細胞中產(chǎn)生的裂殖子(紅細胞前階段形式，及包括生命周期的紅細胞階段形式，如在生命周期的紅細胞中包含的裂殖子)。這些形式的寄生物特征在于本領(lǐng)域熟知且鑒別的各種特異性抗原，及可以參考感染的階段命名。

在本發(fā)明的一個特定實施方案中，異源多肽是CS(環(huán)子孢子)多肽，特別是伯氏瘧原蟲或惡性瘧原蟲的CS多肽。

編碼伯氏瘧原蟲的CS多肽的多核苷酸的天然及優(yōu)化的核苷酸序列以及本發(fā)明的伯氏瘧原蟲的CS多肽的氨基酸序列是分別如SEQ ID No:14、SEQ ID No:15和SEQ ID No:1所示的序列。

根據(jù)本發(fā)明的一個特定實施方案，編碼惡性瘧原蟲的CS多肽的多核苷酸的天然及優(yōu)化的核苷酸序列以及本發(fā)明的惡性瘧原蟲的CS多肽的氨基酸序列是分別如SEQ ID No:17、SEQ ID No:18和SEQ ID No:19所示的序列。

腸道病毒是副粘病毒科腸道病毒屬的小正義單鏈RNA病毒，其導(dǎo)致廣泛的感染。具體地，腸道病毒71(EV71)在1969年首次分離，其導(dǎo)致手足口病(HFMD)，主要是在幼兒發(fā)病，且可以與神經(jīng)學(xué)并發(fā)癥相關(guān)。亞洲國家已經(jīng)見到疾病的大爆發(fā)，尤其是在2013年夏季。

在本發(fā)明的一個特定實施方案中，異源多肽來自腸道病毒屬，優(yōu)選來自腸道病毒71(EV71)。

在一個特定的實施方案中，來自腸道病毒的異源多肽是腸道病毒71的VP1(病毒衣殼蛋白1)。

編碼腸道病毒71的VP1蛋白質(zhì)的多核苷酸的天然及優(yōu)化的核苷酸序列以及本發(fā)明的腸道病毒71的VP1蛋白質(zhì)的氨基酸序列是分別如SEQ ID No:20、SEQ ID No:21和SEQ ID No:22所示的序列。

抗生物素蛋白，一種高度糖基化的卵清蛋白，已知其具有生物素高親和性，使得可以形成穩(wěn)定的抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其廣泛用于蛋白質(zhì)和核酸檢測以及純化方法中。

根據(jù)本發(fā)明的一個特定實施方案，異源多肽是抗生物素蛋白或者包含抗生物素蛋白。

編碼抗生物素蛋白的多核苷酸的天然及優(yōu)化的核苷酸序列以及本發(fā)明的抗生物素蛋白的氨基酸序列是分別如SEQ ID No:23、SEQ ID No:24和SEQ ID No:25所示的序列。

根據(jù)本發(fā)明的一個特定實施方案，異源多肽與如本文定義的核蛋白(N)(包括其變體)的C末端融合，特別是通過肽接頭與如本文定義的核蛋白(N)(包括其變體)的C末端融合，接頭序列大小在5-10個氨基酸殘基之間。接頭被認為是既不屬于天然核蛋白也不屬于異源多肽的序列。本發(fā)明的優(yōu)選的肽接頭由6或7個氨基酸殘基組成。優(yōu)選地，肽接頭是小肽接頭，其由具有小的及無電荷側(cè)鏈的氨基酸殘基如丙氨酸和甘氨酸組成。

根據(jù)本發(fā)明的另一特定的實施方案，本發(fā)明的融合蛋白不包含肽接頭。

根據(jù)本發(fā)明的一個特定實施方案，編碼肽接頭的核苷酸序列及本發(fā)明的肽接頭的氨基酸序列是分別如SEQ ID No:26和SEQ ID No:27所示序列。其特別用于設(shè)計制備RNP的N-PbCS、N-VP1和N-抗生物素蛋白融合蛋白中。

根據(jù)本發(fā)明的另一個特定的實施方案，編碼肽接頭的核苷酸序列及本發(fā)明的肽接頭的氨基酸序列是分別如SEQ ID No:28和SEQ ID No:29所示的序列。其特別用于設(shè)計制備RNP的N-PfCS融合蛋白中。

根據(jù)本發(fā)明的一個特定實施方案，編碼N-PbCS融合蛋白的多核苷酸的天然及優(yōu)化的核苷酸序列以及本發(fā)明的N-PbCS融合蛋白的氨基酸序列是分別如SEQ ID No:30、SEQ ID No:31和SEQ ID No:32所示序列，其中核蛋白N得自Schwarz毒株，所述融合蛋白包含如SEQ ID No:26或SEQ ID No:27所示序列的肽接頭。

根據(jù)本發(fā)明的一個特定實施方案，編碼N-PfCS融合蛋白的多核苷酸的天然及優(yōu)化的核苷酸序列以及本發(fā)明的N-PfCS融合蛋白的氨基酸序列是分別如SEQ ID No:33、SEQ ID No:34和SEQ ID No:35所示序列，其中核蛋白N得自Schwarz毒株，所述融合蛋白包含如SEQ ID No:28或SEQ ID No:29所示序列的肽接頭。

根據(jù)本發(fā)明的一個特定的實施方案，編碼N-VP1融合蛋白的多核苷酸的天然及優(yōu)化的核苷酸序列以及本發(fā)明的N-VP1融合蛋白的氨基酸序列是分別如SEQ ID No:36、SEQ ID No:37和SEQ ID No:38所示序列，其中核蛋白N得自Schwarz毒株，所述融合蛋白包含如SEQ ID No:26或SEQ ID No:27所示序列的肽接頭。

根據(jù)本發(fā)明的一個特定的實施方案，編碼N-抗生物素蛋白融合蛋白的多核苷酸的天然及優(yōu)化的核苷酸序列以及本發(fā)明的N-抗生物素蛋白融合蛋白的氨基酸序列是分別如SEQ ID No:39、SEQ ID No:40和SEQ ID No:41所示序列，其中核蛋白N得自Schwarz毒株，所述融合蛋白包含如SEQ ID No:26或SEQ ID No:27所示序列的肽接頭。

本發(fā)明的多聚RNP是高分子量RNP，由核蛋白(N)與異源多肽獲得的200-1000個融合蛋白組合而成，優(yōu)選由300-700個所述融合蛋白、特別優(yōu)選由500-700個所述融合蛋白組合而成。這些RNP的分子量在10,000-100,000kDa之間。在這個結(jié)構(gòu)中，N蛋白與異源多肽融合，且也與其在之中表達的細胞的RNA分子相互作用，以此方式所述異源多肽激發(fā)被施用該多肽的宿主的免疫系統(tǒng)。

本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明融合蛋白的多核苷酸，特別是包含如下序列的多核苷酸：(i)編碼選自SEQ ID No:2、SEQ ID No:5、SEQ ID No:8和SEQ ID No:11的核蛋白(N)的核苷酸序列，任選與(ii)編碼選自SEQ ID No:26和SEQ ID No:28的肽接頭的核苷酸序列融合，以及(iii)編碼與(i)的核苷酸序列或者如果有的話與(ii)的核苷酸序列融合的編碼異源多肽的核苷酸序列。

本說明書中使用的術(shù)語“編碼”定義為當(dāng)將核酸分子置于表達控制序列包括轉(zhuǎn)錄啟動子之下時該分子被轉(zhuǎn)錄的能力及在適當(dāng)情況下在選擇的細胞或細胞系中適當(dāng)翻譯以進行產(chǎn)物表達的能力。

根據(jù)本發(fā)明，編碼N蛋白的多核苷酸及編碼異源多肽的多核苷酸有利地優(yōu)化以在酵母中表達，及N蛋白的起始ATG密碼子置于修飾的Kozak共有序列中以在酵母中正確翻譯起始多基因(aaaaaaATGGCC)(Kozak M1987,NAR 15:8125-8148；Kozak M 1990,PNAS 87:8301-8305，其揭示了aAaAaAATGca)。

在本發(fā)明的一個特定實施方案中，包含編碼核蛋白(N)核苷酸序列的多核苷酸具有優(yōu)化的序列以在酵母中表達。這個多核苷酸的特定的實施方案是在SEQ ID No:2、SEQ ID No:5、SEQ ID No:8和SEQ ID No:11中選擇的。

在本發(fā)明的一個特定實施方案中，密碼子優(yōu)化是對編碼核蛋白(N)的多核苷酸及對編碼融合蛋白的異源多肽的多核苷酸進行的。

在特定的實施方案中，進行密碼子優(yōu)化以缺失可用于選擇用于表達本發(fā)明核糖核蛋白的酵母的蛋白酶的裂解位點。結(jié)果，融合蛋白及含有其的RNP從密碼子優(yōu)化的序列中的表達可以使得全長融合蛋白在所述選擇的酵母中較高量表達，及因此可以有利地影響因此獲得的RNP的免疫原性性質(zhì)。在確定的編碼融合蛋白的多核苷酸中酵母蛋白酶的特異性位點可以通過評定從酵母細胞中表達的融合蛋白的消化模式而實驗性確定。對表達本發(fā)明的融合蛋白的多核苷酸中裂解位點作圖的實驗方案在實施例4中特別揭示。

在本發(fā)明的一個特定實施方案中，編碼核蛋白(N)的多核苷酸及編碼異源多肽的多核苷酸被插入在來自副粘病毒科非節(jié)段負鏈RNA病毒的前導(dǎo)序列和/或尾隨序列之間。這些病毒序列含有衣殼化信號，使得RNA與核蛋白(N)組合(Longhi S.Current topics in microbiology and immunology 2009；329:103-28)?？寺〉脑诰幋a核蛋白(N)和異源多肽的多核苷酸的上游和下游的前導(dǎo)序列和尾隨序列可以使得這些RNA分子衣殼化在RNP中。副粘液病毒科的非節(jié)段負鏈RNA病毒的前導(dǎo)序列和尾隨序列已經(jīng)在國際專利申請WO2009/095791中描述。前導(dǎo)序列可包含副粘液病毒科非節(jié)段負鏈RNA病毒的一個病毒啟動子，尾隨序列可包含轉(zhuǎn)錄終止子序列。例如，克隆在核蛋白編碼序列上游的MV Schwarz前導(dǎo)序列(包含N起始密碼子)及克隆在異源多肽編碼序列下游的MV Schwarz尾隨序列分別如SEQ ID No:42和SEQ ID No:43所示。

在本發(fā)明的一個特定實施方案中，編碼本發(fā)明的融合蛋白的多核苷酸進一步包含前導(dǎo)序列和/或尾隨序列，例如克隆在核蛋白(N)的編碼序列上游的前導(dǎo)序列，序列如SEQ ID No:42所示，和/或克隆在異源多肽編碼序列的下游的尾隨序列，序列如SEQ ID No:43所示。

在本發(fā)明的一個方面，多核苷酸具有這樣的核酸序列，其由編碼MV病毒、特別是Schwarz/Moraten毒株N蛋白的核苷酸序列在其相應(yīng)于N蛋白C末端或如本文定義的變體的C末端的末端與編碼肽接頭的序列融合而成。

在本發(fā)明的一個特定實施方案中，包含編碼異源多肽的核苷酸序列的多核苷酸被優(yōu)化以在酵母中表達。這個多核苷酸的一個特定實施方案選自SEQ ID No:15、SEQ ID No:18、SEQ ID No:21和SEQ ID No:24。

在本發(fā)明的一個特定實施方案中，包含編碼融合蛋白的核苷酸序列的多核苷酸被優(yōu)化以在酵母中表達。這個多核苷酸的一個特定實施方案選自SEQ ID No:31、SEQ ID No:34和SEQ ID No:37。

本發(fā)明還涉及分離的或純化的如本文定義的編碼融合蛋白的多核苷酸。具體地，本發(fā)明涉及分離的或純化的編碼如本文定義的融合蛋白及包含選自SEQ ID No:31、SEQ ID No:34和SEQ ID No:37的核苷酸序列的多核苷酸。

本發(fā)明還涉及分離的或純化的由本文揭示的多核苷酸編碼的融合蛋白。具體地，本發(fā)明涉及分離的或純化的由本文揭示的多核苷酸編碼的及包含選自SEQ ID No:32、SEQ ID No:35和SEQ ID No:38的氨基酸序列的融合蛋白。

根據(jù)本發(fā)明的一個特定的實施方案，編碼RNP的融合蛋白的多核苷酸，特別是具有本文例證的序列之一的多核苷酸，是在適于酵母表達的可誘導(dǎo)啟動子控制下。甲醇誘導(dǎo)的AOX1啟動子是這種控制序列的一個實例。

本發(fā)明還涉及一種表達載體，特別是攜帶本發(fā)明多核苷酸的質(zhì)粒，其在實施例中例證。

本發(fā)明還涉及重組酵母，其與本發(fā)明的多核苷酸在使得本發(fā)明的多聚RNP組成型或瞬時或可誘導(dǎo)表達的條件下重組。本發(fā)明還涉及重組酵母，其用本發(fā)明的多核苷酸重組，特別是通過用包含所述多核苷酸的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染而重組。所述轉(zhuǎn)染是有利地穩(wěn)定的。

本發(fā)明還涉及重組酵母，其表達本發(fā)明的多聚RNP。

本發(fā)明還涉及重組酵母，其是重組的，尤其是用本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)染的，并且表達本發(fā)明的多聚RNP。

所述重組酵母的細胞適合以活細胞或者以滅活形式、特別是熱滅活的酵母細胞任一形式用于本發(fā)明的實施方案中。在這種情況中，酵母細胞可以設(shè)計為是完整重組酵母。

根據(jù)本發(fā)明的一個特定的實施方案，本發(fā)明的重組酵母是從巴斯德畢赤酵母或釀酒酵母株中制備的。具體地，巴斯德畢赤酵母株是SMD1168酵母株或GS115酵母株或者KM71酵母株，或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它酵母株(Lin-Cereghino J.et al.,Methods Mol.Biol.,2007,389,11-25)。巴斯德畢赤酵母株是可商購的(Invitrogen,GeneScriptTM)。

本發(fā)明還涉及一種滅活的重組酵母，其得自對如本文定義的重組酵母進行在58-60℃熱滅活45-60分鐘、優(yōu)選在60℃熱滅活45分鐘。

本發(fā)明還涉及酵母裂解物，其是本發(fā)明的重組酵母的裂解物。

如本文定義，術(shù)語“酵母裂解物”涵蓋了全部或部分酵母裂解物，如將經(jīng)機械破壞的酵母細胞進行輕度離心以消除細胞核及大多數(shù)細胞膜。

本發(fā)明還涉及免疫原性組合物，其包含本發(fā)明的多聚RNP或者重組酵母或酵母裂解物。

在特定的實施方案中，所述免疫原性組合物不包含輔助佐劑。

如本文定義，術(shù)語“輔助佐劑”涵蓋了增強疫苗的免疫應(yīng)答的任何分子，如油、鋁鹽和病毒顆粒。輔助佐劑的實例為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。

本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多聚RNP或者重組酵母或酵母裂解物的亞單位疫苗平臺。在本發(fā)明中，組合兩種遞送系統(tǒng)(酵母和MV RNP)。

本發(fā)明還涉及含本發(fā)明的重組酵母的混合物或者酵母裂解物的混合物的多價疫苗，其中在混合物中存在至少兩個克隆的重組酵母或酵母裂解物，一個克隆表達與另一克隆表達的異源多肽不同的如本文定義的異源多肽。

本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的重組酵母的混合物或者酵母裂解物的混合物的多價免疫原性組合物，其中在混合物中存在至少兩個克隆的重組酵母或酵母裂解物，一個克隆表達與另一克隆表達的異源多肽不同的如本文定義的異源多肽。具體地，所述混合物包含表達不同RNP的酵母，即通過其RNP表達的異源多肽區(qū)分酵母彼此，或者這種酵母的裂解物。在這種情況中，將各自表達感興趣的多肽的不同的重組酵母或酵母裂解物混合在一個疫苗中。

本發(fā)明還涉及一種制備本發(fā)明的多聚RNP的方法，特征在于其包括如下步驟：

(i)獲得本發(fā)明的重組酵母或酵母裂解物，及

(ii)從所述酵母或酵母裂解物中回收所述多聚RNP。

本發(fā)明還涉及一種制備本發(fā)明的重組酵母或酵母裂解物的方法，包括：

(i)將酵母用本發(fā)明的多核苷酸重組，

(ii)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述酵母，

(iii)在所述酵母中表達融合蛋白，特別是在誘導(dǎo)控制所述多核苷酸表達的啟動子，例如通過甲醇誘導(dǎo)時，

(iv)任選地，將所述酵母在58-60℃熱滅活45-60分鐘、優(yōu)選在60℃熱滅活45分鐘，及

(v)任選地，制備酵母裂解物。

本發(fā)明還涉及本發(fā)明的重組酵母或酵母裂解物在體外生產(chǎn)疫苗的用途。

本發(fā)明還涉及本發(fā)明的重組酵母或酵母裂解物在體外生產(chǎn)免疫原性組合物的用途。

本發(fā)明還涉及本發(fā)明的重組酵母或酵母裂解物用于表達及將載體系統(tǒng)遞送至宿主的用途。

本發(fā)明還涉及本發(fā)明的多聚RNP作為活性成分以在體外生產(chǎn)疫苗的用途。

本發(fā)明還涉及本發(fā)明的多聚RNP作為活性成分在體外生產(chǎn)免疫原性組合物的用途。

本發(fā)明還涉及本發(fā)明的多聚RNP或者重組酵母或酵母裂解物用于在需要其的宿主體內(nèi)引起針對異源多肽的保護性預(yù)防或治療性免疫應(yīng)答。具體地，所述免疫應(yīng)答根據(jù)在RNP上表達的異源多肽而用以對抗瘧疾起保護作用或者用以對抗腸道病毒感染起保護作用。

根據(jù)另一個特定的實施方案，包含本發(fā)明的重組酵母或酵母裂解物的疫苗誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生，尤其是針對RNP的異源多肽的抗體。

根據(jù)另一個特定的實施方案，包含本發(fā)明的重組酵母或酵母裂解物的疫苗誘導(dǎo)Th1和Th2免疫應(yīng)答。

在本發(fā)明的一個特定實施方案中，重組酵母、重組酵母裂解物或多聚RNP的施用以初免-加強(prime-boost)方案實施。

據(jù)認為本發(fā)明的組合物(特別是如本文定義的RNP、重組酵母或酵母裂解物)當(dāng)免疫的宿主在用其它感染因素的寄生物免疫攻擊后具有保護作用，其使得通常在感染所述寄生物或感染因素之后引起的癥狀延遲發(fā)生和/或減弱，這種保護作用是通過施用本發(fā)明的組合物所尋求的作用，或者特別是寄生物血癥被延遲時。

本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢通過下文實施將顯而易見，且也在附圖中例證。

附圖簡述

圖1：來自4個獨立實驗的首次接受試驗的小鼠在攻擊5天后的寄生物血癥。血液寄生物血癥以感染的紅細胞(iRBC)占總紅細胞RBC的百分比的log₁₀標(biāo)度表示。通過Mann-Whitney非參數(shù)檢驗(p>0.05)確定，寄生物血癥的中位值在所有組小鼠中均是相當(dāng)?shù)摹Ｋ膫€獨立實驗在x軸上標(biāo)為1、2、3和4。

圖2：免疫方案的示意圖。免疫和攻擊時間表以天數(shù)(d)給出，出血時間點以周數(shù)給出。

圖3：用30YU N-PbCS無佐劑的酵母裂解物免疫后在小鼠體內(nèi)引起的體液應(yīng)答。(A)抗-PbCS IgG應(yīng)答的動力學(xué)。(B)抗-N IgG應(yīng)答的動力學(xué)。OD_450nm以log₁₀標(biāo)度表示。黑色箭頭表示免疫時間表。小鼠血清以稀釋度10³使用。

圖4：免疫接種和攻擊后寄生物血癥延遲及體液應(yīng)答。(A)在用野生型酵母或表達N或N-PbCS的酵母免疫后第42天收集的小鼠血清中的抗N IgG效價。效價在算術(shù)標(biāo)度中以0-10¹表示，對數(shù)標(biāo)度(log₁₀)中以10²-10⁵表示。對于N-PbCS小鼠的特定符號表示在A、B和F圖中相同的動物。中位數(shù)值通過Wicoxon雙樣本檢驗(p＝0.4558)對比。(B)在用N-PbCS酵母免疫的小鼠中抗-PbCS IgG應(yīng)答的動力學(xué)。OD_450nm以log₁₀標(biāo)度表示。黑色箭頭表示免疫時間表。井號(#)表示在10A組中抗-N抗體陰性小鼠。(C)用N-PbCS、N或野生型酵母免疫的小鼠和未接受處理(未免疫的)小鼠在用6,000GFP⁺Pb子孢子感染后的寄生物血癥的平均和標(biāo)準(zhǔn)偏差log₁₀值。血液寄生物血癥以追蹤前7天的感染的紅細胞(iRBC)與總RBC的百分比的log₁₀標(biāo)度表示。星號(*)表示Mann-Whitney非參數(shù)檢驗的顯著性水平：一個星相應(yīng)于p<0.05，兩個星相應(yīng)于p<0.005。(D)死亡時間(天數(shù)，x軸)與iRBC/總RBC(y軸；算術(shù)標(biāo)度)/小鼠之間的逆相關(guān)性。死亡原因在該表的上部示出。(E)在用6,000GFP⁺Pb子孢子攻擊后免疫的小鼠的存活曲線。(F)用N-PbCS免疫的小鼠在第42天體液IgG應(yīng)答分型。桿(bar)相應(yīng)于每組的中位數(shù)值以log₁₀標(biāo)度表示。星號(*)表示顯著中位數(shù)差異(p<0.05；Mann-Whitney非參數(shù)檢驗)。井號(#)表示在10A組中抗-N抗體陰性小鼠。

圖5：在免疫的小鼠中第42天的體液IgG應(yīng)答分型(Isotyping)。用30YU N-PbCS酵母裂解物免疫的小鼠用(○)表示，用30YU N-PbCS熱滅活的完整酵母免疫的小鼠用(●)表示，或者用酵母裂解物免疫的小鼠用(▲)表示。桿相應(yīng)于每組的中間數(shù)值。星號(*)表示顯著中位數(shù)差異(一個星號表示p<0.05，兩個星號表示p<0.005，三個星號表示p<0.0005，Mann-Whitney非參數(shù)檢驗)。

圖6：免疫的小鼠的實驗攻擊。(A)用N-PbCS、PbCS、N或野生型無佐劑的酵母裂解物免疫接種的小鼠中及在未免疫的小鼠中在用8,000GFP⁺伯氏瘧原蟲子孢子感染之后的寄生物血癥的平均和標(biāo)準(zhǔn)偏差log₁₀值(實驗2)。星號(*)表示顯著中位數(shù)差異(兩個星號表示p<0.005，三個星號表示p<0.0005；Mann-Whitney非參數(shù)檢驗)。(B)在攻擊后第5天的寄生物血癥。桿相應(yīng)于中位數(shù)。星號表示顯著中位數(shù)差異(p<0.005，Mann-Whitney非參數(shù)檢驗)。與未接受處理組相比在N-PbCS免疫接種的小鼠組中寄生物血癥降低以倍數(shù)表示。

圖7：30YU、150YU和300YU的N-PbCS在酵母裂解物中免疫原性。在第42天對體液IgG應(yīng)答分型(Isotyping)：(A)IgG、(B)IgG1、(C)IgG2a和(D)IgG2b。桿相應(yīng)于每組中位數(shù)值。無寄生物感染的小鼠的抗體效價以環(huán)形表示。(E)用N-PbCS在不同劑量和方案免疫的小鼠中及在未免疫的小鼠中用10,000GFP⁺伯氏瘧原蟲子孢子感染后的寄生物血癥的平均和標(biāo)準(zhǔn)偏差log₁₀值(實驗3)。(F)在攻擊后第5天的寄生物血癥。桿相應(yīng)于中位數(shù)。與未接受處理組相比免疫組中寄生物血癥降低以倍數(shù)表示。

圖8：在攻擊后第5天的寄生物血癥。小鼠組用如下配方免疫及來自同一實驗的未免疫的小鼠。

(A)-30YU N-PbCS、N或者野生型酵母裂解物，每兩周一次共三次

(B)-30YU N-PbCS、N或者野生型酵母裂解物，每周一次共五次

(C)-150YU N-PbCS、N或者野生型酵母裂解物，每周一次共五次

(D)-300YU N-PbCS、N或者野生型酵母裂解物，每周一次共五次

桿相應(yīng)于中位數(shù)。星號(*)表示顯著中位數(shù)差異(一個星號表示p<0.05，兩個星號表示p<0.005；Mann-Whitney非參數(shù)檢驗)。

圖9：在用30YU N-PbCS酵母免疫接種后第42天小鼠的體液IgG應(yīng)答分型。L，無佐劑的裂解物配方，每周施用一次共五次；AL，鋁佐劑的裂解物配方，每兩周施用一次共三次。桿相應(yīng)于每組的中位數(shù)值。

圖10：N-PbCS的有佐劑的和無佐劑的酵母裂解物的免疫原性。在第42天體液IgG應(yīng)答的分型(Isotyping)：(A)IgG，(B)IgG1，(C)IgG2a及(D)IgG2b。桿相應(yīng)于每個組的中位數(shù)值。無寄生物感染的小鼠的抗體效價以環(huán)形表示。星號(*)表示顯著中位數(shù)差異(一個星號表示p<0.05，兩個星號表示p<0.005；Mann-Whitney非參數(shù)檢驗)。

圖11：在攻擊后第5天寄生物血癥對比。L，無佐劑的酵母裂解物(實驗3)；AL，鋁佐劑的酵母裂解物(實驗4)。Alum，僅用鋁免疫的小鼠組。桿相應(yīng)于組中寄生物感染的小鼠的平均數(shù)。桿相應(yīng)于中位數(shù)。星號(*)表示顯著中位數(shù)差(p<0.05，Mann-Whitney非參數(shù)檢驗)。無寄生物感染的小鼠從計算中排除。與同一實驗中的代表性未接受處理組相比在免疫組中寄生物血癥降低以倍數(shù)表示。

圖12：在PbCS的C末端(A)或N末端(B)截短的N-PbCS蛋白的示意圖。MV-N，深灰色；PbCS，淺灰色。氨基酸編號根據(jù)來自MV Schwarz疫苗株的N蛋白和來自Pb ANKA株的PbCS蛋白給出。

圖13：N-VP1融合蛋白(A)和NQD-VP1融合蛋白(B)的示意圖。NQD突變體在Karlin et al,Virology 302,420-432(2002)中描述。給出了突變及其氨基酸位置。

圖14：表達N-VP1的巴斯德畢赤酵母GS115的鑒定。在表達N-VP1(A)或NQD-VP1(B)的GS115裂解物的超離心級分和沉淀物中N和VP1蛋白的ELISA定量(標(biāo)準(zhǔn)化平均值來自一式兩份的超離心管)?；疑珟П硎具M行電子顯微鏡分析的集合的混合樣品(每個離心管的級分18-26)。數(shù)值相應(yīng)于在OD_450nm/620nm的光密度。SB：懸浮緩沖液。表達N(C)或N-VP1(D)的GS115的酵母的裂解物的電子顯微鏡分析。N-VP1樣品相應(yīng)于來自A圖的集合的混合物(S1和S2一式兩份)。箭頭指向RNP棒狀結(jié)構(gòu)。

圖15：巴斯德畢赤酵母GS115N-VP1酵母裂解物混合(MIX)樣品的鑒定。(A)：在GS115N-VP1酵母裂解物超離心之后獲得的集合的混合樣品的Western印跡分析(S1和S2表示來自兩個獨立超離心管的級分18-26)。N，純化的重組N蛋白。SNAP-VP1，純化的重組SNAP-標(biāo)簽的P1蛋白。(B)：N-VP1條帶(MixS1和MixS2)的平均強度的數(shù)字示意圖(上圖)，通過A圖的抗-N抗體檢測。柱狀圖示出相對于代表整體條帶強度的總面積圖(百分比)的每個峰的面積。

圖16：免疫方案示意圖。免疫時間表以天數(shù)(d)給出，放血時間點用周數(shù)給出。免疫方案A相應(yīng)于每周一次免疫接種(d0、d7、d14、d21和d28)，而方案B是兩周一次免疫接種(d0、d14和d28)。加強劑量在d58施用。

圖17：在C57Bl/6小鼠中抗-VP1抗體應(yīng)答的ELISA分析。將小鼠在皮下免疫接種30YU的表達N-VP1的巴斯德畢赤酵母及隨后實施方案B。S5、S6、S7和S8是單獨的小鼠。數(shù)據(jù)相應(yīng)于1/100稀釋的小鼠血清，在(A)圖中給出。(B)圖詳述了跟蹤前80天的在(A)圖中給出的數(shù)據(jù)。OD：在450nm的光密度(參考波長：600nm)。

圖18：在C57Bl/6小鼠中抗-N抗體應(yīng)答的ELISA分析。將小鼠在皮下免疫接種30YU的表達N-VP1的巴斯德畢赤酵母及隨后實施方案B。S5、S6、S7和S8是單獨的小鼠。數(shù)據(jù)相應(yīng)于1/100稀釋的小鼠血清，在(A)圖中給出。(B)圖詳述了跟蹤前80天的在(A)圖中給出的數(shù)據(jù)。OD：在450nm的光密度(參考波長：600nm)。

圖19：N蛋白在GS115、KM71和SMD1168巴斯德畢赤酵母株中的表達。圖中標(biāo)示出在選擇平板中針對特定克隆的Geneticin濃度以及克隆編號。酵母裂解物在western印跡加樣之前以1/600稀釋。

圖20：N-PbCS在巴斯德畢赤酵母中的表達。(A)N-PbCS融合蛋白示意圖。MV-N(灰色)由在N末端的核心結(jié)構(gòu)域和在C末端的非結(jié)構(gòu)化尾部結(jié)構(gòu)域組成(Longhi S,2012,Adv Exp Med Biol 725:126-141)。GAAGAGA接頭以黑色表示。PbCS(白色)相應(yīng)于中心重復(fù)區(qū)，兩側(cè)是蛋白質(zhì)的N末端和C末端結(jié)構(gòu)域的主要部分(Plassmeyer ML et al.,2009,J Biol Chem 284:26951-26963)。氨基酸編號根據(jù)來自MV Schwarz疫苗株的N蛋白及來自Pb ANKA株的PbCS蛋白給定(序列詳細內(nèi)容在圖21示出)。(B)表達N-PbCS或者(C)N的SMD1168的定量western印跡分析。在(B)和(C)中，將酵母裂解物如所標(biāo)示地稀釋，增加濃度的MV-N蛋白用作標(biāo)準(zhǔn)，western印跡用抗-N抗體探查。

圖21：在GS115、KM71和SMD1168巴斯德畢赤酵母株中表達的N(SEQ ID No:2)(A)和PbCS(SEQ ID No:15)(B)蛋白的優(yōu)化的核苷酸序列。N與PbCS之間的接頭的核苷酸序列(SEQ ID No:26)在方框中以粗體表示(B)；(C)N-PbCS的Kyte-Doolitle親水性分布圖(DNA Strider1.4f18)：負值相應(yīng)于親水性氨基酸基序。

圖22：表達單獨N(871ng/YU(A))或者表達N-PbCS(12ng/YU(B))的SMD1168裂解物的超離心級分(U)和沉淀物中N或PbCS蛋白質(zhì)的ELISA定量分析。酵母培養(yǎng)物、裂解物和超離心均一式兩份進行(3U和4U表達N的酵母，及5U和6U表達N-PbCS的酵母)。數(shù)值相應(yīng)于在OD_450nm(在OD_620nm數(shù)值作為參考)的光密度乘以樣品稀釋度。SB：懸浮緩沖液。

圖23：一式兩份的來自超離心樣品(U)的級分(Fr)和沉淀物中總RNA(A、B和C)和總可溶蛋白質(zhì)(TSP；D、E和F)。(A和D)用無插入體的pPIC3.5K轉(zhuǎn)化的SMD1168巴斯德畢赤酵母；(B和E)表達N的SMD1168巴斯德畢赤酵母；(C和F)表達N-PbCS的SMD1168巴斯德畢赤酵母。SB：懸浮緩沖液。靶向基因插入的PCR分析證實通過NanoDrop^TM對總RNA含量分析在樣品中不存在(源于細胞核的)基因組DNA。

圖24：來自表達N(A)或N-PbCS(B)的SMD1168巴斯德畢赤酵母的酵母裂解物的電子顯微鏡分析。標(biāo)示出比例尺。黑色箭頭指示RNP棒及環(huán)形結(jié)構(gòu)。

圖25：在酵母中N或N-PbCS表達的免疫熒光分析(N染色，第三個柱；PbCS染色，第四個柱；及核，第二個柱)。每個圖像均是間隔0.5μm的三個連續(xù)聚焦平面的最大強度投影。

圖26：巴斯德畢赤酵母在YPD平板上在熱滅活后的繁殖活性檢測。每個斑點相應(yīng)于250YU樣品中的1YU(5×10⁷個細胞)，加樣于YPD/瓊脂平板上并在30℃培養(yǎng)7天。GS115加熱處理的樣品在水平線上從1至8編號，KM71處理組編號為9-16，SMD1168處理組編號為17-24。(A)GS115、(B)KM71和(C)SMD1168樣品不進行加熱處理，而所有其它斑點在58℃加熱45分鐘(1、2、9、10、17、18)或者60分鐘(3、4、11、12、19、20)，及在60℃加熱45分鐘(5、6、13、14、21、22)或60分鐘(7、8、15、16、23、24)。未處理組樣品生長活躍(A、B和C)，而所有加熱處理的樣品(1-24)其繁殖活性均完整被阻滯(可見斑點相應(yīng)于在平板上加樣的1YU)。

圖27：在免疫的小鼠中抗-巴斯德畢赤酵母IgG應(yīng)答。將熱滅活的野生型巴斯德畢赤酵母(25YU)直接包被(黑色柱)或者在連接后包被(白色柱)。結(jié)果(OD_450nm)來自WT、N、PbCS和N-PbCS免疫的小鼠組的1/1,000稀釋度的血清樣品。天然組未示出識別巴斯德畢赤酵母的交叉反應(yīng)抗體(數(shù)據(jù)未示出)。井號(#)表示示出陰性抗-N應(yīng)答的免疫的小鼠(圖4A)。

實施例

實施例1：重組酵母產(chǎn)生和鑒定

合成并根據(jù)在巴斯德畢赤酵母(GeneScript^TM)中表達而優(yōu)化N、PbCS及PbCS核苷酸序列，在EcoRI和NotI限制位點內(nèi)克隆進pPIC3.5K質(zhì)粒(Invitrogen)中以用于在甲醇誘導(dǎo)的AOX1啟動子控制下進行酵母表達。在N-PbCS融合蛋白中，將具有7個氨基酸(GAAGAGA)的接頭插入在N與PbCS基因之間。GS115、KM71和SMD1168酵母株通過電穿孔轉(zhuǎn)化并鋪板于RDB平板(組氨酸缺陷的培養(yǎng)基)以進行第一輪克隆選擇(HIS+8克隆)。在YPD-Geneticin平板上進行具有多個插入序列的克隆的篩選，抗生素終濃度為0.25-4.0mg/ml(G8168-100，Sigma-Aldrich)。關(guān)于酵母培養(yǎng)基和平板的詳細描述見針對巴斯德畢赤酵母的Invitrogen用戶手冊所述。

基于甲醇誘導(dǎo)監(jiān)測N、PbCS和N-PbCS蛋白質(zhì)表達的動力學(xué)和水平。將酵母克隆在BMG培養(yǎng)基中培養(yǎng)過周末，然后轉(zhuǎn)移至BMM培養(yǎng)基中，通過每24小時在培養(yǎng)物中加入0.5％甲醇誘導(dǎo)并維持蛋白質(zhì)產(chǎn)生。在裂解之前，通過分光光度法在OD_600nm分析以確定酵母細胞的數(shù)量。收集的培養(yǎng)樣品每24小時使用酸洗滌的玻璃珠(425-600μm；G8772Sigma-Aldrich)和裂解緩沖液(Breaking Buffer)(Invitrogen)進行裂解。在機械裂解之后，酵母提取物在134g離心10分鐘，然后通過在371g離心15分鐘澄清上清。在變性條件下在具有XT MOPS緩沖液(Criterion 345-0123，Bio-Rad)的4-12％Bis-Tris聚丙烯酰胺凝膠上進行Western印跡(WB)，使用Color PlusTM Prestained Protein Ladder(7-200kDa；P7711BioLabs)、硝化纖維膜(HybondTM-C Extra RPN303E；Amersham Biosciences)及作為一級抗體的抗-N克隆25或120(Buckland R et al.,1989,J Gen Virol 70(Pt 2):435-441)或者抗-PbCS抗體，抗-PbCS抗體由作為BEI Resources Repository,NIAID,NIH的一部分的Malaria Research and Reference Reagent Resource Center(MR4)獲得：小家鼠(B細胞)；小家鼠(骨髓瘤)3D11，MRA-100，由V Nussenzweig保藏。一級抗體以1/1,000稀釋度在4℃過夜，二級HRP-綴合的綿羊抗小鼠IgG抗體(GE Healthcare UK Limited,NA931V)以1/5,000稀釋度在室溫1小時30分鐘。在定量WB中，將選擇的克隆在BMM中誘導(dǎo)，在54小時時終止培養(yǎng)。通過分光光度法分析(OD_600nm)量化酵母(酵母單位，YU)并裂解。裂解的樣品如所示稀釋，并以預(yù)定數(shù)量(10-20ng)與N標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(GenScript)平行加樣于凝膠上?？?N克隆25用作一級抗體。N和N-PbCS條帶強度通過發(fā)光圖像分析儀(Luminescent Image Analyzer)LAS-1000plus(FUJIFILM)量化，并報道在N標(biāo)準(zhǔn)曲線上。裂解物中總可溶蛋白質(zhì)(TSP)通過Bio-Rad Bradford測定測量。

在巴斯德畢赤酵母中表達的MV RNP的大小

在甲醇誘導(dǎo)54小時后，在冰上終止酵母培養(yǎng)，并將樣品(4,325YU)裂解及重懸浮于2ml懸浮緩沖液(SB：TrisHCl 25mM pH 7.5，NaCl 50mM，EDTA 2mM于UltraPure^TM無DNase/RNase蒸餾水中)，其中補加了抗蛋白酶混合物(Roche)及rRNasin RNase抑制劑(Promega)。將2ml樣品加樣于9ml在SB中的20％蔗糖墊中，在SW41Ti轉(zhuǎn)子中以36,000rpm在4℃離心1小時。使用連身泵取樣機(Cole-Parmer)收集1ml級分。將沉淀物重懸浮于1ml SB中。通過Bio-Rad Bradford測定、NanoDropTM1000分光光度計和抗-N或抗-PbCS夾心ELISA，分析包含沉淀物的每個等份的總可溶蛋白質(zhì)(TSP)、總RNA及N或N-PbCS蛋白濃度。對在134g離心之前和之后的裂解的酵母培養(yǎng)物及對澄清的裂解物進行的PCR分析是通過傳統(tǒng)方案進行，使用得自Invitrogen的Taq DNA聚合酶，5’AOX1(Invitrogen)和3’NOPT-INTER(5’-TTGTTCAGTCTGACCAGTCTC)引物在重組酵母基因組上產(chǎn)生一個437個核苷酸條帶?？?N和抗-PbCS夾心ELISA是在碳酸鈉緩沖液(pH 9.6)中包被0.5μg/ml小鼠抗-N(MAB8906Millipore)或者1/2,000稀釋度的MR4-100抗-PbCS單克隆抗體，并且使用在1×PBS中的稀釋度1/10,000的抗-N兔多克隆IgG抗體(ABIN346975Antibodies-Online GMBH)作為一級抗體，在1×PBS中的稀釋度1/7,000的抗-兔IgG-HRP(NA934V Amersham Biosciences)作為二級抗體。抗-N ELISA陽性對照是表達N蛋白的SMD1168，裂解并在1×PBS中以1/200、1/400和1/800稀釋。加樣于超離心管之前，抗-PbCS ELISA陽性對照是N-PbCS SMD1168裂解物(1/200)。ELISA平板使用EnSpire 2300Multilabel分析儀(Perkin Elmer)在OD_450nm讀取，使用OD_620nm作為參考波長。從無酵母(僅在20％蔗糖上加樣SB)的超離心管中收集的級分和沉淀物在所有進行的檢測(ELISA、NanoDrop^TM和Bradford)中均示出反應(yīng)物陰性背景。

根據(jù)傳統(tǒng)Svedberg方程的沉降計算程序已經(jīng)用于預(yù)測感興趣的蛋白質(zhì)從超離心管中的溶液上表面移動的距離(cm)。這個計算程序考慮到：(i)蛋白質(zhì)質(zhì)量和結(jié)構(gòu)以估計vbar和Sw20沉降參數(shù)；(ii)重組離心管特性和轉(zhuǎn)子直徑；(iii)每個溶液相的蔗糖百分比和體積；(iv)超離心時間；及(vi)旋轉(zhuǎn)速度(rpm)。

電子顯微鏡檢查

將表達N或N-PbCS的SMD1168酵母如上述裂解和澄清。對N澄清的裂解物直接進行EM，而N-PbCS澄清的裂解物通過超離心濃縮，通過在20-60％蔗糖梯度在32,000rpm(SW32Ti)離心1.5小時。收集中間相的級分，在30％蔗糖墊上在32,000rpm(SW32Ti)進一步超離心4小時以收集沉淀物。將樣品點印在輝光放電碳包被的網(wǎng)格上(EMS，美國)，并用NanoW^TM(Nanoprobes,USA)負染色(Desfosses A et al.,2011,J Virol 85:1391-1395)。然后用Philips/FEI CM 12透射電子顯微鏡在120kV觀測樣品。使用KeenViewTM相機(OSIS，德國)和ITEM軟件(OSIS，德國)記錄圖像。RNP長度和直徑以手工計數(shù)的50個顆粒的平均測量值估算。測量標(biāo)準(zhǔn)偏差為5％。

免疫熒光分析

在誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達之后，將50YU/樣品用3.7％甲醛固定。細胞壁用溶細胞酶(Sigma-Aldrich:L2524-50KU)消化，并將細胞通過甲醇/丙酮再次固定，并附著于顯微鏡載玻片上，如Keeling et al.(Keeling JW,Miller RK,2011,Methods Mol Biol 782:231-244)所述。將細胞用兔多克隆抗-MV-N(Covalab pab0035；1/500稀釋度)或者MRA-100小鼠抗-PbCS單克隆抗體(1/1,000稀釋度)標(biāo)記，然后Alexa 488山羊抗-兔IgG(H+L)(Invitrogen A-11008；1/500稀釋度)或CY3-AffinityPure F(ab’)2Frag山羊抗-小鼠IgG(Jackson ImmunoReasearch 115-166-072；1/1,000稀釋度)作為二級抗體。在機動的(motorized)倒置寬場熒光顯微鏡上獲得明視野和熒光圖像。該系統(tǒng)由AxioVision軟件(Release 4.8.2.0,Zeiss)控制，由機動的倒置顯微鏡(AxioObserver Z.1,Zeiss)組成，裝備了鹵素照明器(HAL100,Zeiss)、金屬鹵化物照明器(HXP120,Zeiss)及CCD相機(AxioCam MR,Zeiss)。DAPI、Alexa Fluor和Cy3使用特定濾器檢測。間隔0.5μm的6個焦平面堆疊使用100×油鏡(EC Plan-Neofluar 100x/1,30Oil Iris,Zeiss)獲得。然后將圖像用ImageJ軟件(Schneider CA et al.,2012,Nat Methods 9:671-675)處理。

巴斯德畢赤酵母的熱滅活

將GS115、KM71或SMD1168酵母株在YPD培養(yǎng)基中在30℃培養(yǎng)，將250YU在134g離心沉淀10分鐘，小心除去培養(yǎng)基，將酵母沉淀物在指定溫度和時間點在水浴中處理。熱滅活通過將樣品轉(zhuǎn)移至冰上而終止。然后將每個樣品的1YU鋪板于YPD/瓊脂上，在30℃培養(yǎng)7天。通過將20μl亞甲藍溶液(Sigma-Aldrich；0.05mmol-1 3于PBS pH 7.2中)加入同體積酵母細胞懸浮液中進行存活性檢測，死亡細胞計數(shù)在光學(xué)顯微鏡下進行。對于免疫，將完整的SMD1168野生型酵母或者表達N、PbCS或N-PbCS的酵母(54修飾培養(yǎng)物)在60℃熱滅活45分鐘，以30YU/50μl重懸浮于1×PBS中。

小鼠免疫、流式細胞計量術(shù)、存活率和ELISA分析

6周齡的C56Bl/6雌性小鼠根據(jù)European Directive 2010/63/EU要求圈養(yǎng)及列入在實驗方案組中。將實驗方案遞交Ethic Comity Ile-de-France-Paris1(advise n^er2012-0009)并由其許可。從到來至死亡(研究終點)每天監(jiān)測小鼠。在對應(yīng)的腹股溝淋巴結(jié)為小鼠進行皮下注射(50μl)，在第一次免疫接種之前3天(天數(shù)減3)或者在下一次免疫接種之前6小時進行放血(100μl)。在最后一次放血后(d42)，將小鼠在d43用6,000個子孢子/小鼠攻擊(1μl，在后足墊進行皮內(nèi)注射)。子孢子是從用在hsp70啟動子控制下表達GFP(GFP⁺)的Pb ANKA株感染的斯氏按蚊(Anopheles stephensi)的唾液腺解剖中新鮮收集的[63]。在攻擊后(c+)，從c⁺3至c⁺7每天從尾部收集血樣(2μl)，在600μl1×PBS中稀釋并在平板中通過熒光激活的細胞淘選法(FACS；Miltenyi Biotec)分析。紅細胞(RBC)的雙聯(lián)(Doublets)和集簇從計數(shù)中除去。估算總RBC中單一GFP⁺RBC(感染的RBC，iRBC)，數(shù)據(jù)通過MACSQuantify^TM軟件分析。每天登記攻擊后的死亡數(shù)直至全部小鼠死亡(c⁺29)。在研究終點之前不有意處死小鼠，因為死亡評分是確定接種對于最終增強的腦型瘧抗性及延長的存活時間的效力所必需的。在這個臨床前研究中沒有評估疫苗效力可接受的減輕處理。對于血液中IgG定量，通過T-MG毛細管血液收集系統(tǒng)(Terumo Medical Corporation)從血樣中分離放血血清并在-20℃貯存直至進行ELISA測定?？?N IgG ELISA通過在孔中包被50μg的>70％純的重組N蛋白(Genscript)進行及使用在1×PBS、Tween 0.05％和BSA 0.5％中1/5,000和1/20,000稀釋度的單克隆小鼠抗-N一級抗體(MAB8906,Millipore)作為陽性對照?？?PbCS IgG ELISA通過在孔中包被50μg重組PbCS蛋白而進行，所述蛋白質(zhì)是在巴斯德研究院(Institut Pasteur)的重組蛋白質(zhì)和抗體生產(chǎn)核心實驗室產(chǎn)生的，使用BioPod F800微型發(fā)酵罐電池(Fogale Nanotech)(Frachon E et al.,2006,Appl Environ Microbiol 72:5225-5231)。來自MR4-100反應(yīng)物的抗-PbCS單克隆抗體以1/4,000和1/10,000稀釋度用于陽性對照。通過在碳酸鈉緩沖液(pH 9.6)中包被25YU的完整或裂解的野生型巴斯德畢赤酵母/孔進行抗-巴斯德畢赤酵母IgG ELISA。酵母如所述預(yù)先培養(yǎng)、滅活及裂解。完整的或裂解的酵母的孔中飽和度通過ELISA定義，使用1/200稀釋度的抗巴斯德畢赤酵母兔多克隆抗體(BP2240，Acris Antibodies)及1/10,000稀釋度的抗-兔IgG-HRP(NA934V Amersham Biosciences)。在對所有血清樣品進行的ELISA中，使用系列稀釋液(對于抗-N和抗-PbCS ELISA使用1/100、1/1,000、1/10,000和1/100,000稀釋度；對于抗-巴斯德畢赤酵母ELISA使用1/300和1/1,000)、在1×PBS中1/5,000稀釋的HRP-綴合的綿羊抗-小鼠IgG二級抗體(NA931V，GE Healthcare UK Limited)及3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺底物(TMB；Sigma-Aldrich)。在5分鐘后用2N H₂SO₄終止ELISA進展，并在OD_450nm讀取平板，使用OD_620nm作為參考波長。在IgG同種型的ELISA確定中，來自Southern Biotech的多克隆山羊抗-小鼠ads-HRP IgG(1030-05:稀釋度1/8,000)、IgG1(1070-05；稀釋度1/4,000)、IgG2a(1080-05；稀釋度1/4,000)和IgG2b(1090-05；稀釋度1/4,000)用作二級抗體。將血清經(jīng)兩倍稀釋從1/50稀釋至最大1/614,400。效價以O(shè)D_450nm信號高于截止值(平均光密度加上研究小鼠預(yù)先免疫的對照血清的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差)的最高樣品稀釋度的倒數(shù)確定。進行Mann-Whitney非參數(shù)檢驗和Spearman檢驗，使用美國加州圣地亞哥GraphPad軟件的針對Mac OS X的GraphPad Prism version 5.0b(www.graphpad.com)進行。

實施例2：RNP-酵母疫苗平臺的固有性質(zhì)

重組RNP酵母；裂解物與完整的熱滅活酵母配制物的對比

在完整的熱滅活酵母內(nèi)的抗原遞送已經(jīng)證實高度有效。酵母細胞壁成分代表PAMP(病原體相關(guān)的分子模式)，這被免疫系統(tǒng)、尤其是樹突細胞認為是危險信號，使得酵母是一種有效的遞送載體(Neumann A.K.et al.,2010,PLoS Pathog 6,e1000760；Stubbs,A.C.et al.,2001,Nat.Med.7,625-629)。為了研究由酵母內(nèi)部成分提供的佐劑作用，本發(fā)明人評估了在酵母裂解物內(nèi)的N-PbCS RNP遞送，并將其與完整酵母疫苗配制物進行對比。產(chǎn)生酵母裂解物(通過用玻璃珠的傳統(tǒng)機械裂解獲得并部分除去細胞膜和細胞核級分)，重組蛋白質(zhì)含量通過定量western印跡測量。確立的酵母裂解物生產(chǎn)的實驗條件提供了高度可再現(xiàn)性。

為了能對比不同攻擊實驗中的保護性效力，本發(fā)明人評估了在未接受實驗的小鼠中攻擊的可再現(xiàn)性，在不同時間點進行的四個實驗中使用單獨批次的伯氏瘧原蟲子孢子。在所有四組中在攻擊后第5天的寄生物血癥根據(jù)Mann-Whitney非參數(shù)檢驗是統(tǒng)計學(xué)相當(dāng)?shù)?圖1)。因此，子孢子批次的感染性是可再生的，使得本發(fā)明人可以對比在單獨的攻擊實驗中獲得的結(jié)果。

使用與針對完整重組酵母相同的免疫時間表和小鼠組檢測在無佐劑的酵母裂解物內(nèi)N-PbCS RNP遞送(圖2)。在1-2次免疫接種后出現(xiàn)抗-PbCS抗體應(yīng)答(圖3A)，而使用完整的熱滅活酵母在第2-4次接種后出現(xiàn)(圖4B)。使用30YU的N-PbCS酵母裂解物進行5次免疫接種誘導(dǎo)與如在攻擊前時間點確定的在完整的熱滅活酵母(3×10⁴)內(nèi)N-PbCS免疫接種(圖5)相比更同質(zhì)的抗-PbCS抗體效價及更高的效價水平(10⁵)。此外，在這兩個配制物之間不同的抗體同種型模式(尤其是IgG2a)表示由裂解的或完整酵母配制物提供的佐劑對于抗PbCS免疫應(yīng)答的Th1和Th2極化具有不同的作用。在N-PbCS裂解物免疫組中檢測到的抗-N應(yīng)答在1-2次免疫接種后出現(xiàn)，在第3次免疫后達到高臺水平，在隨后的免疫中保持這個水平直至攻擊前時間點，而在用完整的熱滅活的N-PbCS酵母免疫的小鼠中，抗-N抗體在2-4次免疫接種后出現(xiàn)，在一些小鼠中持續(xù)增長直至攻擊前時間點(數(shù)據(jù)未示出)。

令人驚奇地，抗-PbCS應(yīng)答甚至在用具有非多聚的PbCS的酵母裂解物免疫接種的小鼠中存在(這不是等同于完整的熱滅活配制物的情況)，然而比在裂解物中具有多聚PbCS的水平低2-log(圖5)及比在完整酵母配制物中具有多聚PbCS的水平低1-log。

然而，當(dāng)攻擊免疫的小鼠時，無多聚的PbCS的小鼠示出寄生物血癥無延遲，表明引起的抗-PbCS體液應(yīng)答對于對抗鼠伯氏瘧原蟲感染無保護作用，并且對于完整酵母配制物，需要在酵母裂解物中PbCS的多聚化遞送以誘導(dǎo)抗原特異性保護性免疫應(yīng)答(圖6A)。事實上，在用8,000個伯氏瘧原蟲子孢子攻擊時，用N-PbCS酵母裂解物免疫組與未接受處理組相比寄生物血癥明顯延遲(3.3-倍)(圖6B)。相當(dāng)?shù)募纳镅Y延遲是通過熱滅活的完整酵母遞送N-PbCS而獲得(4-倍)。

這些結(jié)果表明失去酵母細胞壁的酵母裂解物提供佐劑，但是因為其僅呈現(xiàn)完整酵母遞送胚胎的一部分，似乎其以不同方式刺激免疫系統(tǒng)。然而，盡管事實是N-PbCS酵母裂解物在誘導(dǎo)抗-PbCS體液應(yīng)答中比完整的熱滅活的N-PbCS酵母更有效，但是這兩個配制物之間抗-PbCS抗體效價和IgG同種型模式的不同未能預(yù)測接種對于寄生物血癥的不同影響，這兩個配制物獲得對抗伯氏瘧原蟲攻擊的相同益處。

PbCS抗原劑量遞增

N-PbCS RNP在完整酵母細胞中的遞送受限于酵母的量(30YU)，其不能安全地施用小鼠而不導(dǎo)致在注射部位的嚴重局部炎癥(數(shù)據(jù)未示出)。由本發(fā)明人進行的初步研究表明每兩周施用一次共三次(three bi-weekly)30YU的完整的熱滅活酵母證實不足以誘導(dǎo)強力抗-PbCS抗體，且對于攻擊無有益作用，而每周一次共五次施用相同劑量則顯著降低寄生物血癥和臨床結(jié)果，如上文所述。由于酵母裂解物可以濃縮，因此在酵母裂解物內(nèi)RNP的遞送允許增加N-PbCS RNP的劑量及可以評估更高劑量的N-PbCS對于寄生物血癥的效力。

每周一次共施用五次劑量的30YU、150YU和300YU的N-PbCS酵母裂解物之間的對比未證實在N-PbCS體液應(yīng)答IgG效價中劑量依賴性作用是相當(dāng)?shù)那疫_到3×10⁵，這似乎是高臺值(圖7A、B、C、D)。此外，對比使用相同抗原/裂解物劑量在每兩周一次共三次(30YU×3)與每周一次共五次(30YU×5)的免疫方案，示出每周一次注射是觸發(fā)較早的(從第7天開始)抗-N和抗N-PbCS抗體應(yīng)答所必需的，這與使用完整酵母配制物的情況一樣(數(shù)據(jù)未示出)。事實上，在攻擊前時間點(第43天)，在每周一次共五次的免疫方案中抗-PbCS效價與在每兩周施用一次共三次的免疫方案相比增加1-log(中位數(shù)分別為2×10⁵和1.9×10⁴)(圖7A)。

寄生物血癥延遲是劑量依賴性的，使用三次免疫接種30YU N-PbCS酵母裂解物與未接受處理組小鼠相比對于寄生物血癥無影響，五次免疫接種30YU、150YU和300YU在第5天導(dǎo)致寄生物血癥分別降低2.3-倍、4.2-倍和8.4-倍(無寄生物感染的小鼠從計算中排除)(圖7E、F)。此外，在300YU組中的一只小鼠在整個跟蹤的研究期間(攻擊后30天)保持陰性寄生物血癥，并發(fā)展為無瘧疾臨床跡象，表明對抗伯氏瘧原蟲感染的無菌性保護作用。注意接受三次或五次免疫接種30YU的N-PbCS酵母裂解物的小鼠與接受150YU和300YU的小鼠相比呈現(xiàn)出較少的腦型瘧(數(shù)據(jù)未示出)。然而，每組小鼠的數(shù)目不足以確定這種作用是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。

較高劑量的酵母裂解物(150YU和300YU)通過集合一些酵母裂解物而制備，純RNP濃度在技術(shù)上是不可能的。結(jié)果，“酵母背景”在這些配制物中成比例地增加。然而，用可比較劑量的N和野生型酵母免疫的小鼠對照組在整個研究中始終存在，檢測到N和野生型酵母無顯著影響(圖8)。

這個數(shù)據(jù)表明在基于N的RNP上遞送較高劑量的PbCS增強疫苗候選物對抗伯氏瘧原蟲感染的保護性效力。

解釋參與的免疫機制的初步嘗試

如上文所述，在酵母裂解物中獲得的增加劑量的N-PbCS提供了對抗攻擊的更好的保護作用。平行地，使用鋁(氫氧化鋁)佐劑的30YU N-PbCS裂解物免疫的三只小鼠的初步實驗示出總的抗-PbCS IgG應(yīng)答與通過等價物佐劑的裂解物配制物誘導(dǎo)的那些應(yīng)答相當(dāng)(圖9)。然而，通過兩個對比的配制物誘導(dǎo)的IgG模式不同(圖9)。較高效價的IgG1及較低效價的IgG2a和IgG2b表明鋁對Th2應(yīng)答的增強作用，根據(jù)其固有的抗體刺激性質(zhì)實現(xiàn)(Gupta,R.K.et al.,2000,Vaccine Adjuvants)。在本發(fā)明的模型中，未能提供涉及抗-PbCS T細胞應(yīng)答的直接證據(jù)，因為在C57Bl/6小鼠中未鑒別出來自PbCS的T細胞表位，因此T細胞應(yīng)答的參與通過抗-PbCS IgG分型間接評估。

為了評估是否可以發(fā)現(xiàn)這樣的實驗條件以誘導(dǎo)通過用N-PbCS RNP免疫提供的無菌性保護作用，將高劑量(50YU、100YU和150YU)的N-PbCS酵母裂解物(分別為215ng、430ng和645ng的PbCS)通過每兩周一次共三次注射方案在存在50μg/劑鋁佐劑條件下施用小鼠。選擇每兩周施用一次的方案，因為我們的初步結(jié)果表明小鼠不良好耐受用具有鋁佐劑的每周一次共五次的免疫方案，導(dǎo)致對攻擊的易感性增加(數(shù)據(jù)未示出)。用鋁-佐劑的N-PbCS酵母裂解物進行免疫接種與用150YU和300YU N-PbCS在不存在鋁佐劑的條件下獲得的最高應(yīng)答相比引起抗-PbCS抗體效價增加1-log(圖10)。顯然，由所有含鋁配制的劑量(50YU、100YU和150YU)誘導(dǎo)的抗-PbCS抗體應(yīng)答在第42天均達到相同的中位數(shù)效價(106)，這似乎是抗-PbCS抗體應(yīng)答的高臺值。在這些組的每一組中，六只小鼠中的兩只小鼠對于10,000個伯氏瘧原蟲子孢子攻擊是被無菌性保護的，而其它四只小鼠表明寄生物血癥顯著降低(在用50YU、100YU和150YU免疫組中在攻擊后第5天分別是9.7-倍、8.7-倍和6.7-倍，無寄生物感染的小鼠從計算中除去)(圖11)。在三個檢測的劑量中，鋁佐劑的最小劑量(50YU)的N-PbCS酵母裂解物足以誘導(dǎo)PbCS介導(dǎo)的保護作用。顯然，先前用表達N蛋白的完整重組酵母觀測的對于寄生物血癥的非特異性益處對照在用鋁佐劑的N裂解物免疫組中未鑒別。

如先前所觀測，在抗-PbCS抗體效價與無菌性保護作用之間無相關(guān)性，因為小鼠組呈現(xiàn)出在抗體效價中相對一致的結(jié)果，無菌性保護的小鼠未示出最高的抗-PbCS效價。在用佐劑和非佐劑的N-PbCS裂解物免疫的無菌保護的小鼠中觀測到寄生物血癥降低未證實一種配制物相對于另一種配制物的優(yōu)勢，假設(shè)高劑量的N-PbCS在所有疫苗候選物中對于保護性效力具有最顯著的影響。

總之，本發(fā)明人評估了遞送N-PbCS RNP疫苗的三種不同的配制物：完整的重組酵母、無鋁佐劑的酵母裂解物及有鋁佐劑的酵母裂解物。兩種裂解物配制物均允許PbCS抗原的施用量成比例增加，這可以僅在完整的重組酵母配制物中初步優(yōu)化。通過用30YU(130ng PbCS)的完整的重組酵母免疫獲得寄生物血癥顯著降低(4-倍)，使用沒有鋁佐劑的300YU(1300ng PbCS)酵母裂解物，這種降低可以達到8.4-倍。N-PbCS RNP(50-150YU，相應(yīng)于215-645ng PbCS)組合鋁佐劑在一些小鼠中產(chǎn)生無菌性保護作用(六只小鼠中的兩只)及在同一免疫組中的其它小鼠中顯著降低寄生物血癥，程度與無佐劑的300YU組相同。

增加基于RNP的疫苗候選物效力的多種方法

用在熱滅活的完整酵母內(nèi)遞送的N-PbCS RNP進行免疫提供了針對伯氏瘧原蟲攻擊的無可非議的有益作用。利用在所有進行的實驗中獲得的結(jié)果，本發(fā)明人確定在熱滅活的配制物中N-PbCS的劑量是次佳的。通過增加裂解物單價配制物中N-PbCS的劑量，增強保護性效力，但是不能繞開(bypass)一定的閾值。這個結(jié)果與多個臨床前研究和臨床研究的結(jié)果一致，表明基于CS蛋白的單價疫苗候選物不能提供針對瘧疾的完全的無菌保護作用(Schwartz et al.,2012,Malaria Journal,11,11)。因此，本發(fā)明人評估了使用重組RNP平臺在熱滅活的完整酵母中多聚其它抗原并產(chǎn)生多價疫苗配制物的可能性。

為此目的，將在感染人的瘧原蟲物種中具有功能和結(jié)構(gòu)同系物的五種伯氏瘧原蟲蛋白PbTRAP、PbSPECT、PbSPECT2、PbSUB1和PbSUB2與N蛋白融合在SMD1168巴斯德畢赤酵母中表達，使用與PbCS基因相同的實驗方案進行。雖然來自惡性瘧原蟲的的TRAP已經(jīng)在一些亞單位疫苗候選物中評估(在人體實驗中在ChAd-MVA初免-加強配制物中針對感染具有20％效力)(Ewer et al.,2013,Nat.Commun.,4,2836)，本發(fā)明人了解到其它四種蛋白質(zhì)仍未在臨床前實驗或臨床實驗中檢測其免疫原性。選擇這些伯氏瘧原蟲蛋白進行研究是基于其在瘧原蟲感染的紅細胞前和紅細胞階段的功能相關(guān)性。

在不同的誘導(dǎo)時間點，與N和N-PbCS選擇相似地進行表達最高量N-PbTRAP、N-PbSPECT、N-PbSPECT2、N-PbSUB1和N-PbSUB2融合蛋白的重組酵母克隆的選擇。這些蛋白質(zhì)的最佳誘導(dǎo)時間和最高表達水平是可變的，但是與PbCS抗原一樣，所述融合蛋白產(chǎn)量低于單獨的N蛋白及最終的單獨的抗原的表達水平(表1)。

表1：在單獨的SMD1168巴斯德畢赤酵母中或者在與MV N融合蛋白中伯氏瘧原蟲蛋白質(zhì)的表達。

五種獲得的融合蛋白的免疫原性和保護性效力首先在單價配制物中評估。檢測不同的參數(shù)以鑒別針對每個抗原的最佳免疫方案，如配制物(熱滅活的完整酵母或者鋁佐劑的酵母裂解物)、劑量(在這兩種配制物中均為3YU、30YU，及在鋁佐劑的裂解物中150YU)以及施用時間表(三次或五次免疫，每周一次或每兩周一次)(表2)。由于參數(shù)的高可變性，每組僅三只小鼠用于篩選，在三種情況中當(dāng)結(jié)果有歧義時，使用六只小鼠再次進行實驗以證實數(shù)據(jù)(3+6只小鼠，表2)。根據(jù)免疫方案，抗-TRAP和抗-SPECT2抗體可以在攻擊前時間點在不同水平檢測。通過“自制”ELISA(如Jacob et al.,2014,PLoS ONE 9,e86658所述進行，使用在大腸桿菌中重組產(chǎn)生的伯氏瘧原蟲蛋白)，在評估的免疫方案中檢測到無抗-SPECT、抗-SUB1和抗-SUB2抗體。引起的抗-N抗體的水平根據(jù)所述配制物及融合抗原是高度可變的。

獨立于體液免疫應(yīng)答和使用的免疫參數(shù)，無一抗原-配制物設(shè)置是對抗伯氏瘧原蟲攻擊具有保護性的，通過在攻擊后3-7天在免疫組中與未免疫的未接受處理的小鼠組相比不存在寄生物血癥延遲而判斷(表2)。盡管檢測的單價配制物不提供保護作用，但是仍評估表達不同N-抗原的熱滅活的酵母的兩個組合。第一個組合由15YU N-PbSPECT2、3YU N-PbSUB1和15YU N-PbSUB2的表達酵母混合物組成，第二個組合由15YU N-PbCS、15YU N-PbSPECT2和3YU N-PbSUB1表達酵母組成。這兩個組合均在完整的熱滅活的配制物中施用(33YU/免疫接種)，每周施用一次共五次。其無一對伯氏瘧原蟲攻擊具有保護性。因此評估的五種伯氏瘧原蟲蛋白質(zhì)使用不同酵母配制物(完整酵母或酵母裂解物)與N蛋白融合在單價或多價配制物中均未提供關(guān)于寄生物血癥的任何益處。具有較強抗原性性質(zhì)的瘧原蟲蛋白質(zhì)的鑒別是為基于在熱滅活的完整酵母中遞送的重組RNP產(chǎn)生多價疫苗候選物所必需的。然而，這項研究證實酵母-RNP平臺潛在地適于設(shè)計多價疫苗，通過各種抗原在酵母中與MV N融合的表達及混合這些重組酵母而實現(xiàn)。

表2：N-PbTRAP、N-PbSPECT、N-PbSPECT2、N-PbSUB1和N-PbSUB2單價配制物在小鼠中的免疫原性和保護性效力。HI，熱滅活的酵母；AL，鋁佐劑的酵母裂解物?？贵w應(yīng)答如果在所有小鼠中均檢測到用“+”表示，如果在一些小鼠中檢測到用“+/-”表示，如果在任何小鼠中均未檢測到用“-”表示。

針對熱滅活的完整酵母遞送的表達優(yōu)化：N-PbCS和N-PfCS.

用N-PbCS酵母裂解物免疫小鼠已經(jīng)明確證實N-PbCS劑量與有益結(jié)果之間的相關(guān)性。通過ELISA而不是通過western印跡篩選N-PbCS克隆嘗試相對高產(chǎn)量地選擇表達N-PbCS的巴斯德畢赤酵母SMD1168克隆。通過這種方法，檢測多達80個克隆，但是這種嘗試獲得與這項研究中使用的克隆均相似N-PbCS表達水平的克隆。這提示應(yīng)該進行較高通量的選擇或者PbCS蛋白或酵母的固有性質(zhì)與N-PbCS表達的高臺水平相關(guān)(初級氨基酸結(jié)構(gòu)或者對于酵母細胞的毒性)。為了檢測第二個假說，本發(fā)明人評估了與N融合的截短形式的PbCS的產(chǎn)生。由于蛋白質(zhì)的中心重復(fù)部分是高度免疫原性的，因此PbCS的N-或C-末端結(jié)構(gòu)域或者可以從N-PbCS融合基因中缺失(圖12)。SMD1168酵母用如先前所述與N融合的兩種截短形式的PbCS之一轉(zhuǎn)化(PbCS-ΔNterm或者PbCS-ΔCterm)。N截短的N-PbCS克隆(N-PbCS-ΔNterm)在SMD1168中不能獲得，而C截短的形式(N-PbCS-ΔCterm)最佳選擇的克隆中以237ng/YU表達，這比全長N-PbCS(12ng/YU)高20倍(表3)。這個結(jié)果表明獨特的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的氨基酸成分影響融合蛋白的表達水平。

本發(fā)明人然后評估了與N融合的PfCS在巴斯德畢赤酵母中的表達水平，PfCS是來自感染人的惡性瘧原蟲的CS抗原。N-PfCS成功在GS115和KM71中表達，表達水平為97ng/YU(表3)，這比在上述臨床前研究中使用的N-PbCS高接近1-log(Jacob et al.,2014,PLoS ONE 9,e86658)。這提示與N融合的蛋白質(zhì)在巴斯德畢赤酵母中的表達是序列和酵母株特異性的，及進一步的PbCS和PfCS序列優(yōu)化為產(chǎn)生作為瘧疾疫苗候選物在優(yōu)化完整的重組酵母評估中具有較高表達水平酵母克隆所必需。

表3：在巴斯德畢赤酵母中與MV N融合的PbCS和PfCS表達的優(yōu)化。“-”表示未嘗試在指定條件下蛋白質(zhì)表達，“N/A”表示由于快速降解不能獲得蛋白質(zhì)表達。

實施例3：針對其它感染性疾病的完整的重組酵母：腸道病毒71(EV-71)實例

由于其免疫原性和自主佐劑性質(zhì)，本發(fā)明人建議所述酵母-RNP平臺可以用于影響人體的各種病理學(xué)中。為了證實這點，本發(fā)明人研究了這種新的疫苗平臺針對腸道病毒71(EV71)感染的效力。EV71是導(dǎo)致手足口病(HFMD)的因素，這種疾病嚴重影響5歲以下的兒童，引起神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥并導(dǎo)致死亡(Solomon et al.,2010,The Lancet Infectious Diseases,100,778-790)。如先前針對PbCS所述，將EV-71病毒的主要的抗原性VP1衣殼蛋白(Chen et al.,2008,Vaccine,26,2882-2889；Wu et al.,2001,Vaccine,20,895-904)在C末端與N融合(圖13)。轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母，并且與N-PbCS相反，N-VP1在GS115株中表達，表達水平為94ng/YU，但是在SMD1168株中降解(表4)，再次提示對于每個指定抗原均需要進行實驗性評估序列特異性和最佳酵母株。EV71VP1與N融合及維持RNP形成的可能性通過電子顯微鏡分析Mix樣品中包含的級分，隨后酵母裂解和超離心而驗證(圖14A、C和D)。重組RNP上VP1的存在通過對混合(Mix)樣品進行western印跡分析證實，通過電子顯微鏡觀測(圖15)。

表4：EV-71蛋白VP1在單獨的巴斯德畢赤酵母或者在與MV N融合中的表達

中和抗-VP1抗體與免于EV-71的保護作用相關(guān)(Lee et al.,2010,Expert Rev Vaccines 9,149-156；Wu et al.,2001,Vaccine,20,895-904)。進行使用完整N-VP1RNP重組酵母的免疫方案并收集血清以評估抗-VP1體液應(yīng)答。由于EV-71感染通過口服途徑發(fā)生，因此這種病毒提供了檢測用攜帶N-VP1RNP的完整酵母口服免疫的相關(guān)性的完美模型，以在病毒感染部位直接引起粘膜免疫性。

用重組巴斯德畢赤酵母免疫以產(chǎn)生在VP1蛋白質(zhì)表面上暴露的RNP

免疫方案的示意圖在圖16中示出。概括而言，根據(jù)圖中所示方案A或B，經(jīng)皮下或口服用表達本發(fā)明的在RNP中作為融合蛋白的VP1蛋白熱滅活的巴斯德畢赤酵母免疫小鼠(C57BL/6)。根據(jù)進行的實驗，酵母的施用劑量為0、0.3、3和30YU。在根據(jù)方案A或B施用多次劑量后，在第58天施用加強劑量。

進行ELISA以確定得自各個實驗的抗-VP1效價，最佳結(jié)果在圖17中報道；在相同免疫背景下也測量抗-N抗體效價(圖18)。

當(dāng)在皮下施用時，熱滅活的酵母在30YU劑量即在最高的檢測劑量以最低注射次數(shù)提供更高的免疫作用(根據(jù)方案B)。對于N和VP1抗原獲得相同的結(jié)論。相反，口服免疫不提高針對VP1蛋白的清晰應(yīng)答(觀測到背景信號，及在第58天的加強免疫未示出明確作用)。針對N蛋白，當(dāng)以最低施用次數(shù)施用時，施用的最低劑量(0.3YU)提供最佳結(jié)果(方案B)。

實施例4：酵母中蛋白酶的裂解位點

在酵母細胞中，蛋白酶識別表達的異源蛋白質(zhì)中的特異性裂解位點。這些蛋白酶及其裂解位點仍未闡述。不同的巴斯德畢赤酵母株(即GS115vs SMD118)具有特異性蛋白酶。因此，一旦重組蛋白質(zhì)在特異性酵母株中表達，則其可經(jīng)歷巴斯德畢赤酵母株相關(guān)蛋白酶的降解。對許多N-X融合蛋白(其中X是感興趣的抗原)進行的實驗示出取決于X，N-X消化模式(在N-X誘導(dǎo)、酵母裂解及抗-N和抗-X WB之后后顯示)是X-特異性的，在相同酵母株中在相同蛋白質(zhì)誘導(dǎo)時間點高度可再生，顯示一些蛋白質(zhì)條帶。還未明確這種模式是否相應(yīng)于完整酵母細胞內(nèi)部的實際情況，因為為了分析這種模式，酵母必須被裂解。蛋白酶在裂解及裂解物處理后可起作用(即使在裂解期間使用抗-蛋白酶混合物)。但是在任何情況中，蛋白質(zhì)消化模式均相應(yīng)于在高度特異性位點蛋白酶裂解。

在完整的和裂解物酵母配制物兩種形式中，在疫苗批次中存在N-X蛋白的所有長度變體(如果證實存在)，因此一旦疫苗平臺根據(jù)用于產(chǎn)生疫苗批次的參數(shù)校準(zhǔn)，則蛋白酶活性是不相關(guān)的。

但是，時刻記住可以增加酵母內(nèi)部的N-X全長產(chǎn)生和/或疫苗免疫原性，通過改變巴斯德畢赤酵母生產(chǎn)株或者通過根據(jù)經(jīng)驗修飾相應(yīng)于蛋白酶裂解位點的蛋白質(zhì)序列以改變N-X蛋白的消化模式?？梢酝ㄟ^對N-X蛋白質(zhì)條帶進行質(zhì)譜分析和蛋白質(zhì)測序分析對裂解位點作圖。裂解位點的中和化將增加N-X全長相關(guān)的產(chǎn)品。

結(jié)果

麻疹病毒核蛋白在巴斯德畢赤酵母中的表達

優(yōu)化編碼麻疹病毒疫苗(MV)Schwarz株(Combredet C et al.,2003,J Virol 77:11546-11554)的核蛋白(N)的核苷酸序列以在巴斯德畢赤酵母中表達，并克隆進在甲醇可誘導(dǎo)的AOX1啟動子控制下的pPIC3.5K質(zhì)粒中。將三個巴斯德畢赤酵母株(常用的GS115和KM71，以及SMD1168，后者是蛋白酶A活性缺陷的)用所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，并擴增10個陽性克隆/株。N表達的第一個動力學(xué)研究通過酵母裂解物的western印跡分析進行。發(fā)現(xiàn)N表達的最佳時間點是在甲醇誘導(dǎo)這三個巴斯德畢赤酵母株之后54小時(h)。然后通過對在誘導(dǎo)后54h收集的酵母裂解物進行western印跡分析以選擇每個酵母株的最佳N表達克隆。這些克隆示出相當(dāng)重量的全長未降解的N的最高水平表達(圖19)。N表達通過Bradford分析和定量western印跡在GS115、KM71和SMD1168最佳克隆中進一步鑒定。N蛋白在預(yù)測的表觀分子量表達，無可見降解或加工。表達的N蛋白的量為大約1μg/酵母單位(YU)。在GS115和KM71酵母株中，N產(chǎn)量占總可溶蛋白質(zhì)(TSP)的24％，而在SMD1168酵母株中僅為14％(表5)。在GS115和KM71中的表達水平與先前針對這些酵母株示出的范圍相同(Slibinskas R et al.,2004,J Biotechnol 107:115-124)。

表5：在巴斯德畢赤酵母GS115、KM71和SMD1168株中表達的N蛋白的量。1個YU相應(yīng)于10⁷個酵母細胞。

N-PbCS在SMD1168巴斯德畢赤酵母中的表達

為檢測使用基于MV N的RNP作為載體以在瘧疾疫苗原型中多聚化異源抗原的可能性，本發(fā)明人將來自Pb(ANKA株)的環(huán)子孢子(CS)抗原(Nussenzweig V,Nussenzweig RS,1985,Cell 42:401-403)通過具有7個氨基酸的接頭與MV-N的C末端融合(圖20A；圖21；Kyte J,Doolittle RF,1982,J Mol Biol 157:105-132)。選擇使用Pb使得可以使用小鼠動物模型以通過接種和寄生物攻擊評估疫苗原型的免疫原性和效力(Scheller LF et al.,1994,Infect Immun 62:4844-4847；Craig AG et al.,2012,PLoS Pathog 8:e1002401)。將GS115、KM71和SMD1168巴斯德畢赤酵母株通過AOX1甲醇可誘導(dǎo)啟動子控制下攜帶N-PbCS編碼基因的pPIC3.5K轉(zhuǎn)化。在GS115和KM71酵母株中N-PbCS的誘導(dǎo)導(dǎo)致融合蛋白快速降解(數(shù)據(jù)未示出)，而全長融合蛋白在SMD1168酵母株中正確產(chǎn)生(圖20B)。在誘導(dǎo)后54h獲得N-PbCS最大表達。在通過定性和定量western印跡選擇的最佳N-PbCS表達克隆中，在相同酵母株中融合蛋白的表達水平(12ng/YU)比單獨的N(871ng/YU)低73倍(表5；圖20C)。因此，全長N-PbCS融合蛋白可以僅在SMD1168巴斯德畢赤酵母中表達，與單獨的N蛋白的水平相比低接近2-log。為了獲得具有單體形式瘧原蟲抗原的對照酵母，如先前所述產(chǎn)生并選擇只PbCS表達的SMD1168克隆。PbCS酵母示出單獨的抗原(16ng/YU)與N-PbCS融合蛋白(12ng/YU)的相當(dāng)?shù)谋磉_水平。表達N、PbCS或N-PbCS的重組SMD1168酵母的復(fù)制動力學(xué)在所有檢測的培養(yǎng)基(YPD、BMG和BMM)中均是嚴格相當(dāng)?shù)?。在重組與野生型SMD1168酵母之間觀測到無宏觀(macroscopic)表型差異。

在巴斯德畢赤酵母中高分子量基于N的核糖核蛋白的產(chǎn)生

MV-N核蛋白具有在哺乳動物、細菌或酵母細胞的細胞質(zhì)中圍繞RNA自組合的能力(Bourhis JM et al.,2006,Virology 344:94-110；Warnes A et al.,1995,Gene 160:173-178；Slibinskas R et al.,2004,J Biotechnol 107:115-124)。為了評定在SMD1168巴斯德畢赤酵母中N和N-PbCS是否被組合為高分子量RNP，將酵母裂解物在20％蔗糖上超離心，確定級分和沉淀物中存在的N和PbCS蛋白的數(shù)量(圖22)。盡管N多聚化可以影響不同大小的RNP對于用于量化的抗-N抗體的親和性，按時仍可以在N和N-PbCS樣品中在相似水平級分中進行N數(shù)量的對比。對于這兩種重組酵母，在蔗糖上N和N-PbCS的分布模式示出在上方級分中存在單體或寡聚的N，在中間級分中存在多聚形式，在沉淀物中存在高度多聚RNP。顯然，本發(fā)明人通過計算程序估計沉淀物中存在的RNP重于36,502kDa，組合超過628個N分子。在兩種重組酵母之間讀取的2-log差異與在N和N-PbCS酵母之間N表達水平(871ng/YU vs 12ng/YU)的2-log差異相關(guān)。

顯然，在N-PbCS重組酵母中，N主要在沉淀物中發(fā)現(xiàn)。對N-PbCS沉淀物進行的定量western印跡分析表明RNP主要由N組成(70-80％)，全長N-PbCS蛋白代表全部N的10-20％。此外，重組RNP含有10％的降解的N-PbCS蛋白(數(shù)據(jù)未示出)。N-PbCS酵母的失衡情況可能是由于PbCS抗原與亞細胞元件相互作用拉下RNP所致，或者由于N-PbCS融合使RNP穩(wěn)定化產(chǎn)生高度多聚的RNP所致。與野生型酵母相比，異源抗原表達不修飾酵母RNA和TSP模式(圖23)。這些模式不依賴于加樣于蔗糖上的酵母的量而維持(數(shù)據(jù)未示出)。

為了尋找RNP的結(jié)構(gòu)，通過電子顯微鏡(EM)觀測酵母裂解物。在N重組SMD1168酵母中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)具有人字形的直徑為20-22nm及30-200nm的可變棒長度的許多RNP(圖24A)。這個發(fā)現(xiàn)與先前在重組巴斯德畢赤酵母GS115株(Slibinskas R et al.,2004,J Biotechnol 107:115-124)及在MV感染的哺乳動物細胞(Griffin DE,2001,Fields Virology.Philadelphia:Lippincott Williams&Wilkins Publications.pp.1401–1441)中的描述相似。在N-PbCS樣品中，RNP呈現(xiàn)出與長度為30-70nm的僅具有N的RNP相比具有較低剛性。大多數(shù)N-PbCS RNP在微環(huán)境中檢測到，其中可見在棒結(jié)構(gòu)旁邊的獨立的環(huán)(圖24B)。由于與N相比N-PbCS較低的表達水平，因此對N-PbCS澄清的裂解物進行兩次超離心，以濃縮N-PbCS結(jié)構(gòu)，而N樣品則否。這解釋了如先前所述在兩種樣品中觀測到的平均棒長度的差異(Slibinskas R et al.,2004,J Biotechnol 107:115-124)。此外，在第一次超離心之后，本發(fā)明人選擇含有大約333個N分子的RNP的級分，其代表與其它超離心級分或沉淀物中存在的較短或較長RNP結(jié)構(gòu)相比的主要群體?？紤]到1個N分子關(guān)聯(lián)6個RNA核糖核苷酸(Griffin DE,2001,Fields Virology.Philadelphia:Lippincott Williams&Wilkins Publications.pp.1401–1441)，及真核mRNA的平均大小為2kb(Jackson DA,Pombo A,Iborra F,2000,FASEB J 14:242-254)而產(chǎn)生這個假說。然后基于沉降計算程序進行RNP選擇(見“方法”章節(jié))。裂解物中較輕或較重N-PbCS RNP的存在以及選擇的RNP中N-PbCS融合蛋白的存在通過對取自兩次超離心的從離心管頂部至底部的所有1ml級分進行抗-PbCS/抗-N夾心ELISA證實(數(shù)據(jù)未示出)。

對N或N-PbCS重組SMD1168酵母進行免疫熒光分析示出RNP位于較大且緊密的細胞質(zhì)包涵體中，如先前在GS115巴斯德畢赤酵母中針對單獨的N所觀測結(jié)果(Slibinskas R et al.,2004,J Biotechnol 107:115-124)，并且N包涵體與PbCS共同位于N-PbCS酵母中(圖25)。

巴斯德畢赤酵母的熱滅活

巴斯德畢赤酵母替代釀酒酵母作為完整的重組酵母疫苗的開發(fā)利用，需要一套熱滅活方案以保證在其使用之前處于生長狀態(tài)的酵母細胞死亡。將先前在IIb期實驗中檢測的重組釀酒酵母在56℃熱滅活1小時(Haller AA et al.,2007,Vaccine 25:1452-1463)。由于這個方案只是部分滅活巴斯德畢赤酵母GS115，本發(fā)明人評估了一系列滅活溫度和處理時間以實現(xiàn)酵母生長的完全損害。本發(fā)明人檢測了巴斯德畢赤酵母GS115、KM71和SMD1168。在加熱處理后酵母的存活力通過將其在平板上及在液態(tài)培養(yǎng)基中在30℃培養(yǎng)7天進行分析。繁殖能力的總體損失與缺乏代謝活性相關(guān)，通過亞甲藍存活性檢測評定。在58-60℃熱滅活45-60分鐘后獲得這三種酵母株的完全生長損害(表6)。對于接下來的實驗，本發(fā)明人使用在60℃熱滅活45分鐘。

表6：巴斯德畢赤酵母GS115、KM71和SMD1168的熱滅活。連字符(-)相應(yīng)于不完全滅活，“n.v.”相應(yīng)于無存活的酵母。這些實驗結(jié)果在圖26中示出。

在伯氏瘧原蟲-C57Bl/6小鼠模型中評估完整的重組N-PbCS SMD1168酵母疫苗的免疫原性和效力

為了評估表達作為PbCS抗原的載體的基于MV-N-的RNP的完整的重組SMD1168酵母的免疫原性和效力，本發(fā)明人使用Pb感染的C56Bl/6小鼠模型，這是重度嚙齒動物瘧疾的高度嚴格動物模型(Scheller LF et al.,1994,Infect Immun 62:4844-4847)。通過五次(每周一次)皮下注射30YU熱滅活的不存在輔助佐劑條件下表達N-PbCS的SMD1168巴斯德畢赤酵母進行免疫接種(圖2)。這個劑量含有360ng的N-PbCS，相應(yīng)于大約230ng的N和130ng的PbCS抗原。第二組小鼠用30YU僅表達N的重組SMD1168相似免疫(用野生型SMD1168酵母稀釋以相對于N-PbCS組調(diào)節(jié)N與酵母材料的量)。第三組接受30YU野生型(WT)SMD1168，第四組保持不接種但是平行圈養(yǎng)(未接受處理組)。在免疫期間每周及就在攻擊之前(第42天)進行引流放血，以確定抗體應(yīng)答。所有組小鼠均在第43天用6,000個GFP⁺Pb子孢子攻擊，監(jiān)測寄生物血癥及小鼠存活率。GFP⁺Pb子孢子提供了在整個Pb生命周期與野生型寄生物相同的生長速度和感染性(Ishino T et al.,2006,59:1175-1184)，用于促進通過流式細胞計量術(shù)確定寄生物血癥。為了擴大小鼠取樣及驗證第一個實驗的結(jié)果，根據(jù)上述方案進行另外的免疫研究。在這個第二次免疫中，加入一個8只小鼠的新組：用單體形式表達瘧原蟲抗原的PbCS重組酵母免疫的PbCS組。與免疫次數(shù)無關(guān)，數(shù)據(jù)是相當(dāng)?shù)模境鲚敵龅聂敯粜?，盡管是兩個獨立的子孢子和重組酵母制備物。因此，集合這兩次的免疫組(圖4和圖27)。

抗-N IgG抗體在用N或N-PbCS酵母免疫的小鼠體內(nèi)在第三次注射后變得可檢測，并在第42天達到最高效價。在第42天的抗-應(yīng)答(圖4A)在N與N-PbCS免疫組中均是統(tǒng)計學(xué)相當(dāng)?shù)?，除去在?N體液應(yīng)答中N與PbCS之間的免疫干擾。所有免疫的小鼠均示出抗巴斯德畢赤酵母抗體應(yīng)答(圖27)，而未接受處理的小鼠未呈現(xiàn)抗-巴斯德畢赤酵母交叉反應(yīng)抗體應(yīng)答(數(shù)據(jù)未示出)。有趣的是，抗-N抗體陰性的兩只N-PbCS小鼠(圖4A)具有抗-PbCS應(yīng)答，抗體效價為4×10⁴和1.5×10⁵(圖4B和4F)。在PbCS組中，抗-PbCS抗體應(yīng)答在整個跟蹤期間均在檢測限度(數(shù)據(jù)未示出)，而在N-PbCS組中，在2-4次免疫之后檢測到且在最后一次注射之后在半數(shù)動物中仍增加(圖4B)。當(dāng)免疫完成時，中位數(shù)效價在第42天達到3×10⁴(圖4F)。PbCS與N-PbCS組之間的對比明確示出MV N RNP上瘧原蟲抗原的多聚化拯救了抗原特異性抗體應(yīng)答。

在最后一次免疫之后2周，免疫的小鼠用6,000GFP⁺Pb子孢子攻擊，在寄生物指數(shù)生長期間在較早時間點確定寄生物血癥(含有寄生物的RBS的比例)(圖4C)。從攻擊后第3天至第6天，在N、PbCS及野生型對照組中的寄生物血癥是相當(dāng)?shù)模渲衖RBC降低與未接受治療組的值無統(tǒng)計學(xué)差異，而寄生物血癥在N-PbCS組中顯著降低(顯然，在攻擊后第5天降低大約4倍；在第4天和第5天p<0.05，及在第6天p<0.005；Mann-Whitney非參數(shù)檢驗)。N-PbCS與PbCS組之間寄生物血癥對比再次示出在RNP上PbCS多聚化產(chǎn)生這種差異。本發(fā)明人觀測到早期死亡的小鼠(第7-14天)呈現(xiàn)出實驗性腦型瘧疾的臨床跡象，而在20天后小鼠由于高寄生物血癥的結(jié)果導(dǎo)致死亡(在第20天高至35-55％的iRBC/RBC，及在第25天為60-70％)。在第5天的寄生物血癥和死亡天數(shù)示出顯著的負相關(guān)性(Spearman檢驗；p<0.005)：低寄生物血癥(0-0.2％)優(yōu)先導(dǎo)致推遲死亡，而較高寄生物血癥(>0.2％)導(dǎo)致與實驗性腦型瘧疾相關(guān)的更快速死亡(圖4D)。用N-PbCS酵母免疫增加存活率，因為14只小鼠中有10只在攻擊后第22天仍存活，而PbCS、野生型和未接受處理組的大多數(shù)小鼠在第11天左右死亡(圖4E)。令人驚奇地，盡管在N與PbCS之間抗體交叉反應(yīng)完全不存在，并且N和N-PbCS免疫對寄生物血癥有不同影響，但是N組示出與N-PbCS組相當(dāng)?shù)拇婊盥省Ｔ贜-PbCS組中，具有最高抗-PbCS IgG水平的小鼠具有最延長的存活時間，盡管抗體效價不能預(yù)測或早或晚的動物死亡結(jié)果(Mann-Whitney非參數(shù)檢驗)。

由于IgG亞類根據(jù)其結(jié)構(gòu)而介導(dǎo)不同的免疫效應(yīng)功能(Nimmerjahn F,Ravetch JV,2008,Nat Rev Immunol 8:34-47)，本發(fā)明人確定了在N-PbCS免疫的小鼠中在攻擊之前應(yīng)答PbCS的IgG亞類(圖4F)。沒有體液免疫應(yīng)答的Th1和Th2極化，因為IgG1應(yīng)答與IgG2b是統(tǒng)計學(xué)相當(dāng)?shù)?，而且IgG1與IgG2a(p<0.05)之間的相關(guān)差異通過IgG2b應(yīng)答在Th2/Th1偏倚中補償(Mann-Whitney非參數(shù)檢驗)。顯然，檢測到顯著的IgG1和IgG2a/b體液應(yīng)答提示在用完整的N-PbCS重組酵母在不存在佐劑的條件下免疫接種之后引起Th1和Th2細胞因子環(huán)境。

在本發(fā)明中，PbCS與MV-N的融合導(dǎo)致抗原在RNP結(jié)構(gòu)中多聚化，其位于重組酵母的細胞質(zhì)中。在不存在輔助佐劑及在低抗原劑量條件下皮下注射(每次注射130ng PbCS)，在嚴厲攻擊之后N-PbCS巴斯德畢赤酵母誘導(dǎo)明顯的寄生物血癥延遲出現(xiàn)以及受體C57Bl/6小鼠的延長的存活期，所述嚴厲攻擊由皮內(nèi)注射高數(shù)目(6,000)感染性Pb子孢子組成。在N、PbCS和N-PbCS組之中進行對比表明RNP上PbCS多聚化是在小鼠中顯著降低寄生物血癥及增加存活率所必需的。但是就存活率而言，N蛋白似乎與瘧原蟲抗原多聚化一起導(dǎo)致這樣的結(jié)果?？?PbCS IgG應(yīng)答反映出Th1和Th2免疫應(yīng)答的無偏貢獻，表明在不存在輔助佐劑條件下免疫系統(tǒng)的廣泛引起。

本發(fā)明人假設(shè)來自Pb(感染小鼠)和惡性瘧原蟲(感染人)的CS蛋白共有構(gòu)象和功能性質(zhì)，盡管其存在大約60％不同的氨基酸序列(Plassmeyer ML et al.,2009,J Biol Chem 284:26951-26963)。為了確定在巴斯德畢赤酵母中CS表達是否依賴于特異性蛋白質(zhì)序列，本發(fā)明人產(chǎn)生了MV-N融合蛋白，具有來自惡性瘧原蟲(株系3D7；PfCS)和來自PbCS的等價CS結(jié)構(gòu)域。全長N-PfCS(92.73kDa)在巴斯德畢赤酵母GS115和KM71中產(chǎn)生，產(chǎn)量為97ng/YU(數(shù)據(jù)未示出)，而N-PbCS(91.32kDa)不在GS115或KM71酵母株中產(chǎn)生，只在SMD1168酵母株中以較低產(chǎn)量產(chǎn)生(12ng/YU)。這些數(shù)據(jù)表明初級氨基酸序列決定在巴斯德畢赤酵母中N-CS融合蛋白表達的效力。酵母蛋白酶在外源蛋白質(zhì)降解中是主要作用物。由于對于蛋白酶靶位的僅可獲得一般知識基本來自釀酒酵母，因此本發(fā)明的生產(chǎn)系統(tǒng)的結(jié)果從可利用的現(xiàn)有知識中不可預(yù)測。在巴斯德畢赤酵母中觀測到與PbCS相比PfCS更好的生產(chǎn)產(chǎn)量由本發(fā)明人認為是有利于這個策略開發(fā)人疫苗。對于完整的滅活的酵母，施用方案是重要問題。在這項研究中，本發(fā)明人示出以一周間隔注射三次是在大多數(shù)小鼠中引起可檢測的抗-CS抗體應(yīng)答所必需的。在初步實驗中，本發(fā)明人觀察到以兩周的間隔注射三次(d0、d14、d28)不誘導(dǎo)抗-CS抗體或寄生物血癥延遲(數(shù)據(jù)未示出)。這也許是由于N-PbCS在SMD1168株中的低表達水平(12ng/YU)或者完整的重組巴斯德畢赤酵母的固有特點所致。顯然需要通過進一步選擇表達克隆而增加抗原生產(chǎn)產(chǎn)量。然而，也許需要頻繁的加強免疫以引起強力的長期免疫應(yīng)答。檢測多劑量的完整重組酵母與肌生成抑制蛋白(Zhang T et al.,2011,Vaccine 29:8412-8416)、K-Ras腫瘤蛋白(Lu Y et al.,2004,Cancer Res 64:5084-5088)或者HCV NS3與Core(GI-5005；Haller AA et al.,2007,Vaccine 25:1452-1463)的治療性接種的免疫方案。特別是在這個最后的研究中，多至13次每周一次的劑量的完整的重組酵母示出在小鼠中無酵母中和化及在兔中無毒性，以及細胞免疫應(yīng)答隨著注射頻率而增加(Haller AA et al.,2007,Vaccine 25:1452-1463)。然而，由于物流(logistic)和經(jīng)濟原因，僅可以計劃不超過三種疫苗對生活在瘧疾流行地區(qū)的嬰兒進行預(yù)防性免疫。

總之，本發(fā)明人提供了巴斯德畢赤酵母作為疫苗生產(chǎn)和遞送系統(tǒng)的替代方案以多聚化瘧原蟲抗原。鑒于Pb子孢子感染嚴格C57Bl/6小鼠模型的可利用性，選擇PbCS，使得可以評估疫苗在體內(nèi)的效力。CS抗原通過與已知在酵母中在大型RNP中自組合的MV-N融合而多聚化。通過在巴斯德畢赤酵母SMD1168中表達，N-PbCS蛋白產(chǎn)生在表面攜帶PbCS的高度聚合的及異源的RNP。電子顯微鏡和免疫熒光分析表明這些RNP的形狀及其在周圍細胞包涵體中的位置。用熱滅活的表達N-PbCS RNP的完整的巴斯德畢赤酵母對C57Bl/6小鼠進行皮下免疫接種提供了對抗高劑量寄生物的皮內(nèi)注射攻擊的顯著保護作用。因此，在不存在輔助佐劑的條件下，在完整的未純化酵母中表達的極低量PbCS抗原顯著降低與在高度嚴厲攻擊模型中Pb感染相關(guān)的臨床損害，證實了這種疫苗策略的固有佐劑性。

完整酵母-RNP疫苗平臺的固有佐劑性和效力

本研究的關(guān)鍵步驟是檢驗N蛋白在與另一蛋白質(zhì)例如PbCS融合時是否保留其形成RNP的能力。本發(fā)明人在巴斯德畢赤酵母中表達N-PbCS融合蛋白并證實在PbCS的C末端與N蛋白N末端融合時N蛋白確實能形成RNP。重組N-PbCS RNP具有與只由N產(chǎn)生的RNP相似的“人字形”結(jié)構(gòu)，位于酵母細胞質(zhì)的緊密包涵體中。PbCS與N融合與單獨的N相比導(dǎo)致表達水平降低70倍，使得N-PbCS產(chǎn)量為12ng/YU。盡管存在這種降低，但是本發(fā)明人證實在不存在輔助佐劑的條件下，在免疫和攻擊之后表達這些RNP的完整重組酵母導(dǎo)致寄生物血癥顯著延遲及對于臨床結(jié)果的益處。

重組RNP代表設(shè)計的疫苗平臺的主要抗原性成分，可以認為是納米顆粒亞單位疫苗。根據(jù)示出多聚化抗原遞送的優(yōu)勢的其它研究(Bachmann et al.,2010,Nature,10,787-796)，證實RNP是一種強力的載體，其增加PbCS的免疫原性。非多聚化PbCS誘導(dǎo)較低的(通過酵母裂解物遞送)或無(通過熱滅活的完整酵母遞送)體液應(yīng)答，在這兩種情況中用非多聚化PbCS免疫對于伯氏瘧原蟲攻擊均無保護作用。相反，根據(jù)劑量和配制物，多聚化PbCS誘導(dǎo)強體液應(yīng)答，并提供寄生物血癥延遲或者無菌保護作用。重點提及的是在加熱處理后，酵母細胞壁變得難以通過機械裂解而降解，阻止在熱滅活的酵母中分析RNP。然而，用攜帶N-PbCS RNP而不是單體狀態(tài)PbCS的酵母免疫接種的益處提供了PbCS在酵母中確實多聚體化的證據(jù)。

表達N-PbCS RNP的完整的熱滅活的巴斯德畢赤酵母的免疫原性通過在免疫后的強抗體應(yīng)答而更顯著，并且在攻擊時感染延遲。盡管評估的配制物/免疫方案(用30YU表達N-PbCS的熱滅活的巴斯德畢赤酵母免疫，每周一次共五次)對于抗伯氏瘧原蟲感染不是無菌性保護作用，但是其顯著延遲寄生物血癥發(fā)生，證實在肝臟感染節(jié)段已經(jīng)發(fā)生PbCS-依賴性寄生物抑制作用。這種作用通過等于在30YU的N-PbCS表達酵母的少如130ng的PbCS的實現(xiàn)，這是極低劑量的抗原(例如在GSK臨床前實驗中，在小鼠中每次注射使用5μg的RTS,S與ASO1佐劑組合，其含有1μg的CS抗原)。此外，用表達N-PbCS的酵母免疫顯著降低腦型瘧疾的發(fā)病率。這種作用對于隨后開發(fā)人疫苗候選物具有重要價值，因為腦型瘧疾是在人體中造成瘧疾感染的永久后果或死亡的主要因素。對腦型瘧疾的易感性示出與在感染期間的變應(yīng)性炎癥應(yīng)答相關(guān)(Mécheri,2012,BBA,1822,49-56)。根據(jù)這種見解，需要尋求與通過接種表達N-PbCS RNP的完整的熱滅活酵母誘導(dǎo)的腦型瘧疾逃逸(escape)相關(guān)的機制。由于用表達N的酵母免疫的小鼠也示出寄生物血癥降低，盡管程度較N-PbCS免疫的小鼠低，以及同樣的腦型瘧疾逃逸，因此N自身似乎對于寄生物血癥和腦型瘧疾逃逸具有非特異性益處，這需要進行研究。

由于在完整酵母內(nèi)遞送的RNP的劑量受限于在感染部位不引起不可逆的炎癥的可以給小鼠施用的酵母的最大量(30YU)，因此利用酵母裂解物配制物進行較高劑量RNP的遞送。事實上，隨著無佐劑酵母裂解物的劑量增加(30、150和300YU)，在寄生物血癥延遲中檢測到明顯的劑量依賴性作用。在用最高劑量的300YU N-PbCS酵母裂解物免疫的組中，六只動物中的一只動物在整個跟蹤期間無寄生物感染及發(fā)展為無臨床感染跡象，表明無菌性保護作用。用3或5次注射攜帶N-PbCS的30YU酵母裂解物免疫的小鼠與用150YU和300YU免疫的小鼠相比示出對抗腦型瘧疾的更高比率的保護作用。然而，需要較大組的小鼠進行統(tǒng)計學(xué)分析。

除去酵母細胞壁及在酵母裂解物內(nèi)遞送RNP也使得本發(fā)明人去評估酵母內(nèi)部成分的潛在佐劑作用。熱滅活的酵母含有細胞壁PAMP(病原體相關(guān)的分子模式)，雖然其在熱滅活時在一定程度被修飾，但仍被免疫系統(tǒng)細胞識別為危險信號。相反，酵母裂解物基本上沒有酵母表面PAMP，而是代表酵母蛋白質(zhì)和外源性質(zhì)核酸的配制物，其可以由哺乳動物細胞識別為危險信號。將30YU的攜帶N-PbCS的酵母在完整的熱滅活的配制物和無佐劑的裂解配制物中評估。示出酵母裂解物誘導(dǎo)略高的針對N和PbCS的抗體應(yīng)答?？贵w在用免疫裂解物免疫2-3次后出現(xiàn)，而用熱滅活的酵母需要3-4次免疫才引起體液應(yīng)答。然而，N-PbCS RNP在這兩種遞送配制物中降低寄生物感染的保護性效力是相當(dāng)?shù)?，因為在攻擊后?天，用熱滅活的配制物免疫的小鼠中寄生物血癥降低4倍，用酵母裂解物免疫的小鼠中降低3.3倍。

體液應(yīng)答和細胞應(yīng)答均被認為在對抗人體中惡性瘧原蟲感染的CS介導(dǎo)保護作用中起作用(Kai et al.,2011,PLoS ONE；Kumar et al.,2006,Nature,444,937-940；Moorthy et al.,2008,Malaria Journal,8,312)。由于在C57Bl/6小鼠中未鑒別出針對PbCS的T細胞表位，這使得要進行簡便的T細胞測定，在本研究中細胞應(yīng)答的誘導(dǎo)是通過對IgG抗體應(yīng)答分型而間接探索的。已知IgG同種型模式已知與Th1和Th2細胞因子環(huán)境的建立相關(guān)(分別為IgG2b和IgG2a)(Nimmerjahn et al.,2008,Nature,8,34-47)。此外，為了評估實驗條件是否可以改良以誘導(dǎo)通過N-PbCS RNP免疫的無菌性保護作用，在酵母裂解物配制物中加入氫氧化鋁凝膠(明礬)佐劑。由于明礬具有抗體刺激性質(zhì)(Gupta et al.,2000,Vaccine Adjuvants)，因此評估在保護作用中抗-PbCS體液應(yīng)答的參與情況。

對三只小鼠的小組的初步研究示出在熱滅活的完整酵母中及在鋁佐劑的酵母裂解物中遞送的30YU的N-PbCS提供的保護作用無顯著差異(數(shù)據(jù)未示出)。由于先前示出抗-PbCS體液應(yīng)答以及寄生物血癥降低是劑量依賴性的，因此在具有鋁的配制物中評估一系列更高的劑量(50YU、100YU和150YU)。有趣的是，以每兩周施用一次共三次的所有這三個劑量產(chǎn)生相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果：與先前獲得的最大值(2×10⁵，300YU N-PbCS酵母裂解物)相比抗-PbCS抗體效價增加接近10-倍(10⁶)，在每組中六只小鼠有兩只處于無菌性保護作用。關(guān)于整體高水平的抗體效價，小鼠中抗-PbCS抗體的個體水平不預(yù)測無菌性保護作用。與其它研究結(jié)果一致，本發(fā)明人示出抗-PbCS抗體在對抗瘧原蟲感染的保護作用中起有限的作用，因為≥50YU的攜帶N-PbCS的具有鋁的酵母裂解物配制物誘導(dǎo)抗-PbCS抗體的高臺效價，這不能預(yù)測保護作用。

雖然N-PbCS在30YU熱滅活的完整酵母內(nèi)遞送，但是無佐劑的或者鋁佐劑的酵母裂解物提供了與抗-PbCS抗體效價無關(guān)的相似水平的寄生物血癥降低，本發(fā)明人認為應(yīng)優(yōu)先進一步開發(fā)熱滅活的完整酵母配制物。熱滅活的完整酵母配制物在生產(chǎn)和經(jīng)濟觀點方面是有利的，因為制備酵母裂解物可顯著增加疫苗成本及限制其在發(fā)展中國家的潛在用途。此外，熱滅活的完整酵母提供了在不存在冷鏈條件下凍干轉(zhuǎn)運以及口服途徑施用的可能性，這樣對于促進疫苗分配和施用具有重大影響。水凝膠作為佐劑刺激體液應(yīng)答的用途在這個疫苗平臺是無優(yōu)勢的，因為無佐劑配制物在刺激抗體應(yīng)答中是有效的，其與保護作用無關(guān)。隨著公眾由于對疫苗及其佐劑成分的副作用的社會不耐受性所致對接種的不接受性的增加，通常與這些副作用問題相關(guān)，完整酵母RNP配制物代表一種優(yōu)化的疫苗策略，因為其可以在不存在輔助佐劑條件下誘導(dǎo)抗原特異性免疫應(yīng)答。

這項研究提供了在熱滅活的完整酵母中產(chǎn)生的重組RNP作為預(yù)防性疫苗的有效抗原遞送平臺的證據(jù)。然而，關(guān)于瘧疾疫苗的開發(fā)，需要進一步優(yōu)化。由于N-PbCS RNP的保護性效力是劑量依賴性的，因此優(yōu)化酵母中N-PbCS表達對于更有效的完整的熱滅活的疫苗配制物是關(guān)鍵因素。其次，為了改良疫苗配制物，需要繼續(xù)研究重組RNP的完整酵母遞送的免疫原性的根本機制。在多個研究中證實，完整酵母細胞被樹突細胞有效攝取，這導(dǎo)致重組表達的抗原在MHC I類和II類分子中的有效呈遞及CD4+和CD8+T細胞的誘導(dǎo)。在瘧疾的情況中，T細胞介導(dǎo)的免疫性的誘導(dǎo)似乎在保護作用中起主要作用。由于在免疫應(yīng)答誘導(dǎo)中作為第一步，需要研究完整重組酵母與DC之間的相互作用。通過對比在存在純化的N-PbCS RNP條件下DC激活和運動性，或者在酵母-裂解物或者熱滅活的完整酵母中的遞送，可以確定抗原與全部酵母成分的最佳比率。此外，為了更直接證實細胞應(yīng)答的誘導(dǎo)作用，需要將這個平臺在具有指定T細胞表位的另一抗原背景中評估。