本發(fā)明是在由美國(guó)農(nóng)業(yè)部，食品和農(nóng)業(yè)國(guó)家研究所，農(nóng)業(yè)和食品研究計(jì)劃(USDA-NIFA-AFRI)頒發(fā)的批準(zhǔn)號(hào)No.2010-65116-20449和由美國(guó)國(guó)家科學(xué)基金會(huì)(NSF)頒發(fā)的批準(zhǔn)號(hào)No.DBI-0115911的政府支持下進(jìn)行的。政府對(duì)本發(fā)明具有一定的權(quán)益。

相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)要求在2013年10月21日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.61/893,741和在2014年10月3日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.62/059,842的優(yōu)先權(quán)35U.S.C.§119(e)權(quán)益，其中每一個(gè)在此通過引用而整體并入本文。

發(fā)明領(lǐng)域

在此公開的本申請(qǐng)通常涉及參與植物繁殖的基因和使用它們的方法。

背景技術(shù)：

無融合生殖是一種在開花植物中天然存在的無融合生殖方式；這一過程會(huì)導(dǎo)致沒有涉及卵細(xì)胞的減數(shù)分裂或受精的種子形成。繞開減數(shù)分裂和受精的無融合生殖過程，其直接導(dǎo)致克隆胚胎的形成。無融合生殖雜種是純種的雜種，因?yàn)闊o融合生殖植物的種子衍生子代在遺傳上是與母本相同的。換而言之，無融合生殖雜種在起源上是克隆的。

無融合生殖的特征是：1)不完全減數(shù)分裂，其指的是衍生自子房珠心細(xì)胞的未減數(shù)胚囊形成，和2)孤雌繁殖，其指的是未減數(shù)卵細(xì)胞發(fā)育成胚胎。許多類型的植物物種具有無融合生殖的特性和可以被無性繁殖。

簡(jiǎn)要概述

本發(fā)明的實(shí)施方案包括在缺乏卵細(xì)胞受精的情況下，從開花植物胚珠中的一個(gè)或多個(gè)配子體或孢子體細(xì)胞獲得繁殖的方法，該方法包括：用能夠編碼具有與SEQ ID NO：4多肽至少75％序列同一性的多肽的ASGR-BBML基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化開花植物；在缺乏卵細(xì)胞受精的情況下，從轉(zhuǎn)化植物胚珠中獲得一個(gè)或多個(gè)配子體或孢子體細(xì)胞；以及從所述一個(gè)或多個(gè)配子體或孢子體細(xì)胞中獲得子代植物，其中所述子代植物包含來自轉(zhuǎn)化植物的一個(gè)或多個(gè)染色體集合，從而在缺乏卵細(xì)胞受精的情況下實(shí)現(xiàn)開花植物的繁殖。

在一些實(shí)施方案中，ASGR-BBML基因構(gòu)建體還包括一個(gè)或多個(gè)未編碼區(qū)(UTR)。在一些實(shí)施方案中，ASGR-BBML基因構(gòu)建體還包含一個(gè)或多個(gè)非編碼區(qū)，其可以具有與SEQ ID NO：1至少70％的序列同一性或其完全互補(bǔ)鏈。在一些實(shí)施方案中，ASGR-BBML基因構(gòu)建體還包含一個(gè)啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是能夠調(diào)節(jié)具有與SEQ ID NO：4至少75％的序列同一性的多肽的表達(dá)。在一些實(shí)施例中，啟動(dòng)子包含具有與SEQ ID NO：5至少70％的序列同一性或其完全互補(bǔ)鏈的核苷酸。在一些實(shí)施方案中，ASGR-BBML基因構(gòu)建體還包含一個(gè)或多個(gè)非編碼區(qū)和啟動(dòng)子，其具有與SEQ ID NO：3至少70％的序列同一性或其完全互補(bǔ)鏈。

在一些實(shí)施方案中，胚胎可以從未減數(shù)的卵細(xì)胞形成。在一些實(shí)施方案中，胚胎可以從減數(shù)的卵細(xì)胞形成。在一些實(shí)施方案中，胚胎可以從體細(xì)胞形成。

在一些實(shí)施方案中，多倍體植物可以被轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生二倍體或雙單倍體子代植物。在一些實(shí)施方案中，二倍體植物可以被轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生單倍體子代植物。在一些實(shí)施方案中，單倍體子代植物可以被進(jìn)行處理以實(shí)現(xiàn)純合植物的染色體加倍和生產(chǎn)。在一些實(shí)施方案中，可以通過培養(yǎng)而獲得子代植物。

在一些實(shí)施方案中，開花植物可以是單子葉植物。在一些實(shí)施方案中，開花植物可以是雙子葉植物。

在一些實(shí)施方案中，開花植物可以是草本植物或豆科植物。在一些實(shí)施方案中，草本植物可以是小米，水稻，玉米，小麥，高粱，或柳枝稷的物種。

在一些實(shí)施方案中，開花植物可以是雜合的并且可以被轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生克隆的子代。在一些實(shí)施方案中，開花植物可以是雜合的并且可以被轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生單倍體子代。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以被用于繁殖開花植物的一個(gè)或多個(gè)遺傳性狀。

本發(fā)明還包括通過在缺乏卵細(xì)胞受精的情況下從開花植物胚珠中一個(gè)或多個(gè)配子體或孢子體細(xì)胞獲得繁殖的方法而生產(chǎn)的植物或植物部分，該方法包括：用能夠編碼具有與SEQ ID NO：4多肽至少75％的序列同一性的多肽的ASGR-BBML基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化開花植物；在缺乏卵細(xì)胞受精的情況下，從轉(zhuǎn)化植物胚珠中獲得一個(gè)或多個(gè)配子體或孢子體細(xì)胞；以及從所述一個(gè)或多個(gè)配子體或孢子體細(xì)胞中獲得子代植物，其中所述子代植物包含來自轉(zhuǎn)化植物的一個(gè)或多個(gè)染色體集合，從而在缺乏卵細(xì)胞受精的情況下實(shí)現(xiàn)開花植物的繁殖。

本發(fā)明還包括獲得開花植物在缺乏卵細(xì)胞受精的情況下能夠繁殖的方法，該方法包括：用能夠編碼具有與SEQ ID NO：4多肽至少85％的序列同一性的多肽的ASGR-BBML基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化開花植物，由此獲得能夠在缺乏卵細(xì)胞受精的情況下繁殖的開花植物。

本發(fā)明還包括通過獲得開花植物能夠在缺乏卵細(xì)胞受精的情況下繁殖的方法而生產(chǎn)的植物或植物部分，該方法包括：用能夠編碼具有與SEQ ID NO：4多肽至少85％的序列同一性的多肽的ASGR-BBML基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化開花植物，由此獲得能夠在缺乏卵細(xì)胞受精的情況下繁殖的開花植物。

本發(fā)明還包括在缺乏卵細(xì)胞受精的情況下產(chǎn)生開花植物種子的方法，該方法包括：用ASGR-BBML基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化開花植物；在缺乏卵細(xì)胞受精的情況下，從轉(zhuǎn)化植物中獲得一個(gè)或多個(gè)胚胎；和產(chǎn)生來自一個(gè)或多個(gè)胚胎的種子，所述胚胎含有一個(gè)或多個(gè)僅衍生自轉(zhuǎn)化母株的染色體集合，從而在缺乏卵細(xì)胞受精的情況下從開花植物獲得種子的繁殖。

本發(fā)明還包括通過在缺乏卵細(xì)胞受精的情況下產(chǎn)生開花植物種子的方法而生產(chǎn)的種子，該方法包括：用ASGR-BBML基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化開花植物；在缺乏卵細(xì)胞受精的情況下，從轉(zhuǎn)化植物胚珠中獲得一個(gè)或多個(gè)配子體或孢子體細(xì)胞；和從所述一個(gè)或多個(gè)配子體或孢子體細(xì)胞中獲得種子，其中所述種子包含來自轉(zhuǎn)化植物的一個(gè)或多個(gè)染色體集合，從而在缺乏卵細(xì)胞受精的情況下產(chǎn)生開花植物的種子。

本發(fā)明還包括能夠編碼具有與SEQ ID NO：4多肽至少75％的序列同一性的多肽的ASGR-BBML基因構(gòu)建體，其中多肽是由ASGR-BBML基因構(gòu)建體編碼的，當(dāng)在開花植物胚珠的一種或多種配子體或孢子體細(xì)胞中被表達(dá)時(shí)，其可以在缺乏卵細(xì)胞受精的情況下實(shí)現(xiàn)繁殖。在一些實(shí)施方案中，ASGR-BBML基因構(gòu)建體還可以包括一個(gè)或多個(gè)非編碼區(qū)和啟動(dòng)子，其中所述ASGR-BBML基因構(gòu)建體具有與SEQ ID NO：3至少70％的序列同一性或其完全互補(bǔ)鏈。

附圖的簡(jiǎn)要說明

本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解如下所述的附圖是僅用于說明的目的。附圖并不是意欲以任何方式限制本發(fā)明教導(dǎo)的范圍。

圖1描述了用標(biāo)記結(jié)構(gòu)域的嬰兒潮(BBM)，嬰兒潮樣(BBM-樣)和無孢子生殖特異性基因組區(qū)域(ASGR)-BBM樣蛋白質(zhì)的一個(gè)子集的T-Coffee比對(duì)。

圖2描述了26個(gè)BBM樣蛋白質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)育樹。使用鄰近法推測(cè)該進(jìn)化史(N.Saitou,M.Nei,Molecular Biology and Evolution 4:406-425(1987))。使用JTT matrix-based法計(jì)算進(jìn)化距離(D.T.Jones,W.R.Taylor,J.M.Thornton,Computer Applications in the Biosciences 8:275-282(1992))。顯示的公共樹步長(zhǎng)是從1000次重復(fù)而推測(cè)的(J.Felsenstein,Evolution 39:783-791(1985))。對(duì)應(yīng)于在低于50％>步長(zhǎng)重復(fù)中所產(chǎn)生的分類的分枝倒塌。在步長(zhǎng)測(cè)試中與相關(guān)類群聚集在一起的復(fù)制樹的百分比顯示在分枝附近。從每個(gè)序列對(duì)中去除所有的模糊位點(diǎn)。在最后的數(shù)據(jù)集中有總共1067個(gè)位點(diǎn)。進(jìn)化分析是在MEGA6中進(jìn)行的(K.Tamura et al.,Molecular Biology and Evolution 30:2725-2729(2013))。

圖3描述了在擬南芥中ASGR-BBML過表達(dá)的結(jié)果，包括如在圖3A中描述的表皮毛突起的形成，如在圖3B中描述的異位芽，和如在圖3C中描述的鮮花。

圖4描述了在沒有授粉的情況下BCs的胚胎發(fā)育。

圖5描述了使用設(shè)計(jì)為靶向ASGR-BBML的鎖定核酸寡核苷酸探針，如在圖5A中描述的在球形胚胎的原位雜交結(jié)果，和如在圖5B和5C中描述的后期階段的胚胎。圖5A，5B和5C描述了使用反義探針的結(jié)果；圖5D描述了使用對(duì)照探針的結(jié)果。

圖6描述了ASGR-BBML表達(dá)研究的結(jié)果。如圖6A所示，在RNAi事件中ASGR-BBML表達(dá)的差異(S7>S4>S2>S5)是與具有多細(xì)胞胚胎的胚珠頻率相關(guān)的，但是如圖6B所示與每個(gè)胚珠的無孢子生殖胚囊數(shù)量是不相關(guān)的。

圖7描述了衍生自與葡萄糖苷酸酶(GUS)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因珍珠小米雜交的BC₈的無融合生殖植物的清潔的胚珠。表達(dá)可見于卵細(xì)胞和幼胚中。圖7A描述了具有兩個(gè)單細(xì)胞胚胎的無孢子生殖胚囊。圖7B描述了兩個(gè)無孢子生殖胚囊，左邊的是多細(xì)胞胚胎，右邊的是在單細(xì)胞或雙細(xì)胞階段。

圖8描述了在性胚囊中PsASGR-BBML的表達(dá)。顯示了衍生自PsASGR-BBMLpromoter-GUS品系的三個(gè)有性子代的子房(圖8A-D)。圖8A和圖8B是聚焦于同一子房的不同平面，以顯示完整助細(xì)胞(S)和極核(PN)。在開花當(dāng)體的未受精性胚囊的卵細(xì)胞(E)中檢測(cè)GUS的表達(dá)。有時(shí)可以檢測(cè)到助細(xì)胞中較弱的GUS信號(hào)(圖8C)。在成熟性胚囊的極核(PN)或反足細(xì)胞(AN)中沒有檢測(cè)到GUS信號(hào)。在受精三天后，在發(fā)育胚胎(EM)的細(xì)胞中檢測(cè)到GUS染色，但是在發(fā)育胚乳(EN)的細(xì)胞中沒有檢測(cè)到(圖8D)。在子房組織中沒有其他的染色被識(shí)別。

圖9描述了cDNA對(duì)染色體組DNA的比對(duì)。比對(duì)序列顯示在ATG起始。上行部分包含染色體組DNA序列，以及下行部分包含cDNA序列。

圖10描述了在具有極核的胚囊中胚胎形成的實(shí)例。圖10A，10B，和10C描述了性發(fā)育的典型的胚囊結(jié)構(gòu)，即，所有均具有反足細(xì)胞，所述反足細(xì)胞是在狼尾草(Pennisetum)中發(fā)育的無孢子生殖胚囊缺失。每個(gè)胚囊含有發(fā)育中的胚胎和未受精的中央細(xì)胞，如由持久極核所示。圖10A，10B，和1OC描述了全胚囊結(jié)構(gòu)。圖10D，10E和10F描述了胚囊的胚胎(珠孔)末端的放大倍率。

圖11描述了在包含gPsASGR-BBML轉(zhuǎn)基因性四倍體珍珠小米的子房中孤雌繁殖的胚胎發(fā)育。圖像是來自開花后2天收集和固定的子房，用水楊酸甲酯清潔并且在20X光學(xué)對(duì)比下可視化。圖11描述了一個(gè)衍生自非轉(zhuǎn)化組織培養(yǎng)源的未受精的結(jié)構(gòu)化成熟胚囊的對(duì)照子房。沒有觀察到胚胎發(fā)育?；谠谂吣铱锥说呐咛咏Y(jié)構(gòu)(EM)外觀，在性轉(zhuǎn)基因品系g11a(圖11B)和g3f(圖11C)中可以清楚看到未受精子房中的胚胎發(fā)育；極核(PN)和反足細(xì)胞(A)。圖11D顯示了當(dāng)授粉被許可時(shí)，在開花后2天可以很容易的檢測(cè)到胚乳形成(EN)。

圖12描述了在子房中g(shù)PsASGR-BBML表達(dá)的非定量RT-PCR分析。從開花當(dāng)天的性(性別)和無融合生殖(apo-1，apo-2)BC8子房中和從開花后2天的品系g3f和g52子房中分離總RNA。3微克的總RNA被進(jìn)行DNA酶處理，反轉(zhuǎn)錄并且用PsASGR-BBML特異性引物p779/80(Y.Akiyama et al,BMC Evolutionary Biology,11:289(2011))和ADF3引物pi 127/28擴(kuò)增部分第一鏈cDNA。從一個(gè)無融合生殖的BCs植物中分離染色體組DNA樣品。梯形圖是HI-LO DNA標(biāo)記(Minnesota Molecular,Minneapolis,MN)。標(biāo)記和DNA通路源自于用于兩個(gè)引物的相同凝膠，并且用RT-PCR通路合并以去除不必要的通路。

圖13描述了流式細(xì)胞儀分析以確定T₀植物和子代的基因組大小。使用T₀植物和g3f子代(Ti)的BD-Accuri流式細(xì)胞儀分析基因組大小的實(shí)例。圖13A描述了高粱和T₀品系g11a葉組織的峰分析。圖13B描述了高粱和g3f子代108的峰分析。圖13C描述了高粱和g3f子代101的峰分析。圖13D描述了g3f子代105和107的峰分析。S2和S4分別表示高粱的2X/2C和2X/4C峰。H2和H4分別表示具有2C和4C峰的Ti二倍體/雙單倍體子代(圖13C，13D)。T2和T4分別表示具有2C和4C峰的四倍體T₀珍珠小米(圖13A)或四倍體Ti子代(圖13B，13D)。

圖14描述了種子的流式細(xì)胞儀，顯示出減數(shù)子代的產(chǎn)生。圖14A顯示了基于與用作標(biāo)準(zhǔn)的高粱葉染色體組峰S^a(2n/2c)和S^b(2n/4c)相比較，來自具有染色體組峰M^a(4n/2c)和M^b(4n/4c)的未轉(zhuǎn)化四倍體IA4X植物的5個(gè)種子。圖14B顯示了來自g3f-子代104的5個(gè)種子，其遺傳了PsASGR-BBM轉(zhuǎn)基因但是維持是四倍體植物?；谂c用作標(biāo)準(zhǔn)的高粱葉染色體組峰S^a(2n/2c)和S^b(2n/4c)相比較，種子顯示出來自受精胚胎的小米染色體組峰M^a(4n/2c)和M^b(4n/4c)伴隨著來自未受精的減數(shù)胚胎的小米染色體組峰M^C(2n/2c)和M^d(2n/4c)。圖14C顯示了來自g3f-子代105的種子，其遺傳了PsASGR-BBM轉(zhuǎn)基因和顯示出二倍體/雙單倍體的染色體組大小減少?；谂c用作標(biāo)準(zhǔn)的高粱葉染色體組峰S^a(2n/2c)和S^b(2n/4c)相比較，種子顯示出來自未減少胚胎的小米基因組峰M^c(2n/2c)和M^d(2n/4c)伴隨著來自減少胚胎的小米基因組峰M^e(1n/1c)和M^f(1n/2c)。

圖15描述了遺傳gPsASGR-BBML轉(zhuǎn)基因的珍珠小米性子代T₀品系g52和g3f在子房中的孤雌繁殖的胚胎發(fā)育。在開花后2天收集和固定子房的實(shí)例，用水楊酸甲酯清潔并且在20X光學(xué)對(duì)比下可視化。圖15A描述了一個(gè)衍生自非轉(zhuǎn)化組織培養(yǎng)源的未受精的結(jié)構(gòu)化成熟胚囊的對(duì)照子房。沒有觀察到胚胎發(fā)育?；谠谂吣铱锥说呐咛咏Y(jié)構(gòu)(EM)外觀，在轉(zhuǎn)基因品系g52的性子代306(圖15B)和轉(zhuǎn)基因品系g3f的子代105(圖15C)中可以清楚看到未受精子房中的胚胎發(fā)育；極核(PN)和反足細(xì)胞(AN)。

圖16描述了在g3f子代子房中g(shù)PsASGR-BBML表達(dá)的非定量RT-PCR分析結(jié)果。在開花當(dāng)天，從g3f和g3f子代的子房中分離總RNA。3微克的總RNA被進(jìn)行DNA酶處理，反轉(zhuǎn)錄并且用PsASGR-BBML特異性引物p779/80(Y.Akiyama et al,BMC Evolutionary Biology,11:289(2011))擴(kuò)增部分第一鏈cDNA。從一個(gè)無融合生殖的BCs植物中分離染色體組DNA樣品。梯形圖是HI-LO DNA標(biāo)記(Minnesota Molecular)。

圖17描述了在無融合生殖RNAi F1品系中PsASGR-BBML表達(dá)減數(shù)的半定量RT-PCR分析結(jié)果。來自開花當(dāng)天的RNAi F1品系未授粉子房組織的RT-PCR產(chǎn)物雜交后產(chǎn)生的信號(hào)圖像用于定量。平均3份PCR反應(yīng)的信號(hào)以確定相比于對(duì)照植物(ASGR+/RNAi-)，在ASGR+/RNAi+品系上PsASGR-BBML的最終減少量。ADF3信號(hào)被用于標(biāo)準(zhǔn)化每個(gè)樣品的起始RNA量。使用下列公式計(jì)算減少量：(1-(ASGR-BBML RNAi品系的平均信號(hào)/ADF3的平均信號(hào))/(ASGR-BBML對(duì)照品系的平均信號(hào)/ADF3的平均信號(hào)))×100(表7)。

圖18描述了用于確定在對(duì)照和PsASGR-BBML的RNAi品系中胚胎細(xì)胞數(shù)的組織學(xué)觀察值的一個(gè)實(shí)例。圖18A描述了對(duì)照植物S7-6T10的部分和胚胎細(xì)胞計(jì)數(shù)。胚胎發(fā)育是用框架標(biāo)記的。這個(gè)胚胎含有超過16個(gè)細(xì)胞。圖18B描述了RNAi品系S5-5T-28的部分。在這個(gè)含有由星形表示的2個(gè)無孢子生殖胚囊的子房(卵細(xì)胞用箭頭標(biāo)記)中沒有識(shí)別到胚胎發(fā)育。

圖19描述了解剖胚胎的流式細(xì)胞儀，顯示出在攜帶PsASGR-BBM轉(zhuǎn)基因的水稻轉(zhuǎn)基因植物中單倍體子代的生產(chǎn)。圖19A顯示了未轉(zhuǎn)化的水稻葉染色體組峰R^a(2n/2c)和R^b(2n/4c)和未轉(zhuǎn)化的高粱葉染色體組峰S^a(2n/2c)和S^b(2n/4c)。由于相同的染色體組大小，水稻峰R^b和高粱峰S^a重疊。圖19B顯示了包含轉(zhuǎn)錄活性PsASGR-BBM轉(zhuǎn)基因的水稻T₀品系26的5個(gè)解剖胚胎?；谂c高粱葉染色體組峰S^a(2n/2c)和S^b(2n/4c)相比較，水稻品系26胚胎顯示出來自受精胚胎的水稻染色體組峰R^a(2n/2c)伴隨著來自未受精的減數(shù)胚胎的水稻峰R^c(1n/1c)。圖19C顯示出包含轉(zhuǎn)錄活性PsASGR-BBM轉(zhuǎn)基因的水稻T₀品系34的5個(gè)解剖胚胎?；谂c高粱葉染色體組峰S^a(2n/2c)和S^b(2n/4c)相比較，水稻品系34胚胎顯示出來自受精胚胎的水稻染色體組峰R^a(2n/2c)伴隨著來自未受精的減少胚胎的水稻峰R^c(1n/1c)。

發(fā)明詳述

除非另有說明，術(shù)語(yǔ)將由相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)應(yīng)用而理解。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“植物”和“植物部分”可以包括(含)，如上下文中所示，植物細(xì)胞，植物原生質(zhì)體，植物可以再生的植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物，植物愈傷組織，植物團(tuán)塊和在植物或植物部分中保持完整的植物細(xì)胞如胚胎，花粉，胚珠，種子，花，果仁，穗，穗軸，外殼，莖，根，根尖，花藥等。

術(shù)語(yǔ)多核苷酸可以包括術(shù)語(yǔ)“核酸”，“核酸序列”和“寡核苷酸”，如這些術(shù)語(yǔ)在本領(lǐng)域中的常規(guī)理解。在一個(gè)特定實(shí)例中所包括的內(nèi)容將由本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)上下文所示而理解，但是在沒有特別的上下文限制其范圍，然后該術(shù)語(yǔ)將被理解為具有廣泛的包容性。因此，術(shù)語(yǔ)多核苷酸也可以包括含有一個(gè)或多個(gè)修飾堿基的DNA或RNA。因此，如該術(shù)語(yǔ)在本文中所預(yù)期的，具有為了穩(wěn)定性或?yàn)榱似渌蚨揎椀闹麈淒NA或RNA是“多核苷酸”。此外，僅舉兩個(gè)例子，包含稀有堿基或經(jīng)修飾堿基的DNA或RNA，是如該術(shù)語(yǔ)在本文中所使用的多核苷酸，所述稀有堿基如肌苷，所述經(jīng)修飾堿基如三苯甲基化堿基。應(yīng)當(dāng)理解的是，為了許多有益目的已經(jīng)對(duì)DNA和RNA進(jìn)行了眾多類型的修飾，是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。本文所使用的術(shù)語(yǔ)多核苷酸涵蓋了如多核苷酸的化學(xué)，酶或代謝修飾形式，以及病毒和細(xì)胞的DNA和RNA特性的化學(xué)形式，尤其包括簡(jiǎn)單和復(fù)雜細(xì)胞。

如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”描述了一種包含由人類修飾的染色體組的非天然存在的植物，其中所述植物在其染色體組中包含外源性核酸分子，所述外源性核酸分子可以來自相同或不同的物種，包括非植物物種。外源核酸分子可以是基因調(diào)控要素，如啟動(dòng)子，增強(qiáng)子或其他調(diào)控要素，或者可以包含編碼序列，其可以鏈接到天然的或異源的基因調(diào)控要素上。來自有性雜交或通過自體雜交所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物是這類植物的子代。

如本文所使用的，“多態(tài)性”意味著在一個(gè)或多個(gè)個(gè)體的群體中的一種或多種核酸序列在一個(gè)或多個(gè)基因座上變體的存在。所述變體可以包括但不限于，一個(gè)或多個(gè)堿基變化，一個(gè)或多個(gè)核苷酸的插入，或一個(gè)或多個(gè)核苷酸的刪除。多態(tài)性包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)，簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)，插入缺失(插入和缺失)，限制性片段長(zhǎng)度的多態(tài)性，單倍型和標(biāo)簽SNP。此外，多態(tài)性可以包括遺傳標(biāo)記，基因，DNA衍生序列，RNA衍生序列，啟動(dòng)子，基因的5'非編碼區(qū)，基因的3'非編碼區(qū)，微小RNA，siRNA，數(shù)量性狀基因座(QTL)，衛(wèi)星標(biāo)記，轉(zhuǎn)基因，mRNA，ds mRNA，轉(zhuǎn)錄模式或甲基化模式。多態(tài)性可以通過誘變而在核酸復(fù)制的隨機(jī)過程產(chǎn)生，作為從拷貝數(shù)變體和在減數(shù)分裂過程中染色體組要素移動(dòng)的結(jié)果，例如不等交換，染色體組復(fù)制和染色體斷裂和融合。所述變體通常在群體內(nèi)可以被發(fā)現(xiàn)，或者可以以低頻率存在，前者通常在植物育種中具有更大效用，后者可以是與罕見但是重要的表型的變體相關(guān)。

如本文所使用的，“標(biāo)記”可以指多態(tài)性核酸序列或核酸特征。在更廣泛的方面，“標(biāo)記”可以是可用于區(qū)分生物之間遺傳差異的可檢測(cè)特性。這類特性的實(shí)例可以包括遺傳標(biāo)記，蛋白質(zhì)組成，蛋白質(zhì)含量，油組成，油含量，碳水化合物組成，碳水化合物含量，脂肪酸組成，脂肪酸含量，氨基酸組成，氨基酸含量，生物聚合物，藥品，淀粉組成，淀粉含量，發(fā)酵淀粉，發(fā)酵產(chǎn)量，發(fā)酵效率，能量產(chǎn)量，次級(jí)化合物，代謝產(chǎn)物，形態(tài)特性和農(nóng)藝特性。

如本文所使用的，“基因型”可以指表型的遺傳成分，這可以通過使用標(biāo)記間接地表征或通過核酸測(cè)序而直接地表征。適宜的標(biāo)記包括表型特征，代謝分布，遺傳標(biāo)記或一些其他類型的標(biāo)記?；蛐涂梢詷?gòu)建用于至少一個(gè)遺傳標(biāo)記基因座的一個(gè)等位基因，或用于至少一個(gè)單倍型窗口的一個(gè)單倍型。在一些實(shí)施方案中，基因型可以代表單個(gè)基因座，而在其他它可以代表一個(gè)全基因組的基因座集。在一些實(shí)施方案中，基因型可以反映染色體的一部分，整個(gè)染色體，染色體組的一部分，和整個(gè)染色體組的序列。

如本文所使用的，“構(gòu)建體”或“基因構(gòu)建體”可以指多核苷酸，其編碼用于基因構(gòu)建體的特定基因。此類多核苷酸可以被可操作地連接到一個(gè)或多個(gè)非編碼區(qū)(UTR)，和/或一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)序列/啟動(dòng)子調(diào)節(jié)區(qū)，其能夠指導(dǎo)所述多核苷酸在預(yù)期的宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄，例如轉(zhuǎn)化植物的組織，從而調(diào)節(jié)給定基因的表達(dá)。給定基因的表達(dá)可以由所表達(dá)的基因產(chǎn)物或蛋白質(zhì)的數(shù)量而決定，并且多種方法可以被用于檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平，包括，例如，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)，Western印跡法，免疫沉淀法，和免疫熒光法等。

根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)所公開的，可以與本發(fā)明一起使用的這類基因構(gòu)建體的構(gòu)建是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。參見，例如，Sambrook et al；Molecular Cloning；A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)；Gelvin et al；Plant Molecular Biology Manual(1990)；Plant Biotechnology:Commercial Prospects and Problems,eds.Prakash et al；Oxford&IBH Publishing Co.；New Delhi,India；(1993)；and Heslot et al；Molecular Biology and Genetic Engineering of Yeasts；CRC Press,Inc.,USA；(1992)。例如，植物表達(dá)載體可以包括(1)在5'和3'調(diào)節(jié)序列的轉(zhuǎn)錄控制下克隆的植物基因和(2)顯性選擇標(biāo)記。這類的植物基因構(gòu)建體還可能包括，如果需要的話，啟動(dòng)子調(diào)節(jié)區(qū)域(例如，賦予誘導(dǎo)型，組成型，環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)的，或細(xì)胞或組織特異性/選擇性表達(dá))，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，RNA加工信號(hào)，轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)，和/或聚腺苷酸化信號(hào)。可以使用組成型的，組織優(yōu)選的或者可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。例如，某些啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的能夠在某些組織優(yōu)先起始轉(zhuǎn)錄的，所述組合物如葉，根，果實(shí)，種子，或花。

如本文所使用的，“載體”可以指任何能夠進(jìn)入植物細(xì)胞的核酸構(gòu)建體，其包括圓形或線性核酸，和/或細(xì)菌，病毒，真菌，植物和合成的核酸，以及同源或異源核酸構(gòu)建體。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”，“轉(zhuǎn)化的”和“轉(zhuǎn)化”可以是指將外源基因引入到植物中。用于將外源基因引入植物的許多方法是已知的，并且可以用于將核酸序列插入植物宿主中，所述轉(zhuǎn)化包括生物的和物理的植物轉(zhuǎn)化方案。參見，例如，Miki et al.(1993)“Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants,”in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,ed.Glick and Thompson(CRC Press,Inc.,Boca Raton),pages 67-88。所選擇的方法可以隨宿主植物而變化，并且許多這樣的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的；這些方法包括化學(xué)轉(zhuǎn)染法，例如磷酸鈣，微生物介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法，如農(nóng)桿菌(Agrobacterium)(Horsch et al.(1985)Science227:1229-1231)，電穿孔法，顯微注射法，和基因槍轟擊法。表達(dá)試劑盒和載體以及用于植物細(xì)胞或組織轉(zhuǎn)化和植物再生的體外培養(yǎng)方法是已知的和可應(yīng)用的。參見，例如，Gruber et al.(1993)“Vectors for Plant Transformation,”in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,ed.Glick and Thompson(CRC Press,Inc.,Boca Raton),pages 89-119。

一旦已經(jīng)獲得單個(gè)轉(zhuǎn)化的植物，例如，用所需基因轉(zhuǎn)化的植物，常規(guī)植物育種方法可以通過雜交和回交而被用于轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)化基因和相關(guān)的調(diào)節(jié)序列。通常的，這類植物育種技術(shù)被用于將所期望的基因轉(zhuǎn)移到一個(gè)特定的植物中，例如作物植物或用于商業(yè)目的的另一種類型的植物。因此，所要求保護(hù)的本發(fā)明的方法可以用于，例如，植物育種，植物改良，不穩(wěn)定和/或隱性基因型的繁殖，種子生產(chǎn)，和性狀繁殖，以及涉及植物再生的其它目的。

如本文所使用的，在兩個(gè)核酸或多肽序列的上下文中，術(shù)語(yǔ)“序列同一性”或“同一性”包括當(dāng)在特定的比對(duì)窗口中對(duì)最大一致性比對(duì)時(shí)，兩個(gè)序列中涉及的殘基是相同的。當(dāng)序列同一性的百分比被用于蛋白質(zhì)時(shí)，人們認(rèn)識(shí)到不相同的殘基位置經(jīng)常因保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸殘基被用于取代具有相似化學(xué)性質(zhì)(例如，電荷或疏水性)的其它氨基酸殘基，并且因此不改變?cè)摲肿拥墓δ芴匦?。?dāng)序列在保守取代不同時(shí)，序列同一性百分比可能被向上調(diào)整以校正取代的保守性質(zhì)。經(jīng)常的，經(jīng)由這種保守取代而不同的序列具有“序列相似性”或“相似性”。用于進(jìn)行這種調(diào)節(jié)的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的。通常，這涉及保守取代的得分作為部分而不是完全錯(cuò)配，從而增加了序列同一性百分比。因此，例如，相同的氨基酸被給予1分和非保守取代的氨基酸被給予0分，保守取代的氨基酸被給予0至1之間的分?jǐn)?shù)。計(jì)算保守取代的分?jǐn)?shù)，例如，在PC/GENE程序(Intelligenetics,Mountain View,Calif.)中實(shí)施。

本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，通過在比較窗口中比較兩個(gè)最佳比對(duì)序列而確定數(shù)值，其中在所述比較窗口中的多核苷酸序列部分可以包含添加或缺失(即缺口)作為相比于參考序列(其不包含添加或缺失)而用于兩個(gè)序列的最佳比對(duì)。計(jì)算百分比，通過確定位置的數(shù)目，所述位置數(shù)目是在相同核酸堿基或氨基酸殘基出現(xiàn)在兩個(gè)序列中以產(chǎn)生匹配位置的數(shù)目，用在比較窗口中總位置數(shù)目除以匹配位置的數(shù)目，并且結(jié)果乘以100以產(chǎn)生序列同一性的百分比。

序列同一性/相似性的百分比是選自由50至99組成的群組中的整數(shù)。示例性的序列同一性/相似性數(shù)值包括55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％和95％?？梢允褂美鏕AP，CLUSTALW或BLAST算法確定序列同一性，優(yōu)選的是BLAST。用于這些目的的核苷酸或氨基酸序列的基本同一性通常意味著至少60％>，70％>，80％>，90％>，和95％或更高的序列同一性。

此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，通過考慮到密碼子簡(jiǎn)并，氨基酸相似性，閱讀框定位等，序列同一性數(shù)值可以適當(dāng)?shù)卣{(diào)整以確定經(jīng)由兩個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的相關(guān)同一性。“基本上類似的”多肽是共享除了殘基位置之外的如上所述的序列，所述殘基位置是不相同，所述多肽可以通過保守氨基酸改變而不同。核苷酸序列基本相同的另一個(gè)指示是，如果兩個(gè)分子在嚴(yán)格條件下彼此雜交。通常的，嚴(yán)格條件是選擇為在限定的離子強(qiáng)度和pH下，比用于特定序列的比熱熔點(diǎn)(Tm)低約5℃至約20℃溫度。Tm是(在限定的離子強(qiáng)度和pH下)50％的靶序列雜交到完全匹配的探針的溫度。通常的，嚴(yán)格洗滌條件是其中鹽濃度是在pH 7時(shí)大約0.02摩爾并且溫度是至少約50，55，或60℃。然而，在嚴(yán)格條件下不相互雜交的核酸仍然是基本相同的，如果它們編碼的多肽是基本相同的。這是可能會(huì)發(fā)生的，例如，當(dāng)核酸的拷貝是使用由遺傳密碼允許的最大密碼子簡(jiǎn)并性而產(chǎn)生時(shí)。兩個(gè)核酸序列基本相同的一個(gè)指示是，由第一核酸編碼的多肽是與由第二核酸編碼的多肽免疫交叉反應(yīng)的。

對(duì)于各個(gè)庫(kù)，載體，核酸等的說明，參見，例如，Stratagene Cloning Systems,Catalogs 1999(La Jolla,Calif)；和Amersham Life Sciences,Inc,Catalog'99(Arlington Heights,111.)。

本說明書和權(quán)利要求書使用單數(shù)形式“一”，“一個(gè)”，和“該”。這些術(shù)語(yǔ)是旨在不排除復(fù)數(shù)的解釋，并且可以優(yōu)選地包括復(fù)數(shù)的解釋，這取決于上下文。因此，例如，提及“一個(gè)化合物”可以包括多個(gè)這類的化合物，或幾個(gè)這些相同的化合物，除非解釋是有悖于使用它的上下文。

無融合生殖是天然存在的無性生殖的發(fā)育過程，其中所產(chǎn)生的子代是遺傳上與母株相同的，由此導(dǎo)致通過種子的母體植物的克隆繁殖。自然界中存在著多種形式的無融合生殖。例如，配子體無融合生殖的特征在于不完全減數(shù)分裂，其是衍生自子房的珠心細(xì)胞的非減數(shù)胚囊的形成，和是經(jīng)由孤雌繁殖的，所述孤雌繁殖是未減數(shù)的卵細(xì)胞進(jìn)入到胚胎發(fā)育。通過基因工程或基因滲入實(shí)現(xiàn)無融合生殖的能力可以對(duì)農(nóng)作物具有重大經(jīng)濟(jì)影響，因?yàn)橛N計(jì)劃將有能力通過父本配子而傳播無融合生殖，隨后通過母體種子的克隆繁殖固定雜合基因型/活力。

無孢子生殖是無融合生殖的一種形式，其在禾本科中是普遍的。無融合生殖的這個(gè)配子體形式的特征在于減數(shù)分裂的失敗(不完全減數(shù)分裂)或由減數(shù)分裂產(chǎn)物的變性和來自染色體未減數(shù)的珠心細(xì)胞的胚囊發(fā)育。在這些胚囊中，未減數(shù)的卵細(xì)胞孤雌繁殖發(fā)育。因此，不完全減數(shù)分裂和孤雌繁殖是無融合生殖的兩個(gè)基本的組成部分。本文所述的結(jié)果證明了在植物物種中無融合生殖的分子基礎(chǔ)，其中所述生殖過程已經(jīng)自然演變。這一發(fā)現(xiàn)可以被用于促進(jìn)在作物植物中優(yōu)良基因組合的繁殖。誘導(dǎo)無融合生殖性狀的基因已經(jīng)備受追捧了幾十年。這種基因可以在植物育種中具有巨大的價(jià)值。

目前的工作描述了在狼尾草(Pennisetum)屬和蒺藜草(Cenchrus)屬中無融合生殖品種；這兩個(gè)屬是禾本科，禾本科是栽培植物中唯一最重要的家族。其中這個(gè)家族的一個(gè)成員是珍珠小米(狼尾草藜syn(Pennisetum glaucum syn).美洲蒺藜草(Cenchrus americanus))，其是一種在半干旱熱帶地區(qū)具有顯著產(chǎn)量的性二倍體糧食。狼尾草屬也有許多無融合生殖的物種，其中大部分已經(jīng)與珍珠小米雜交以嘗試引入無融合生殖的基因；然而，迄今為止，在回交期間，雄性不育已經(jīng)限制它們對(duì)無融合生殖性狀傳統(tǒng)轉(zhuǎn)移的應(yīng)用(Dujardin M.,Hanna W.,J.Hered.74:277-279(1983a)；Dujardin M.,Hanna W.,Crop Sci.23:156-160(1983b)；Dujardin M.,Hanna W.,Theor.Appl.Genet.69:97-100(1984)；Dujardin M.,Hanna W.,Crop Sci.25:59-62(1985))。通過使用無融合生殖P.squamulatum(2n＝8x-56),應(yīng)用傳統(tǒng)轉(zhuǎn)移已經(jīng)獲得了一些進(jìn)展(Akiyama Y.et al,J.Hered.97:521-524(2006))，如在人工誘導(dǎo)四倍體珍珠小米雜交的父本(Dujardin M.,Hanna W.,J.Genet.Breed.43:145-151(1989))。

無孢子生殖是狼尾草/蒺藜草無融合生殖的一種類型(Ozias-Akins P.et al,Funct.Integr.Genomics 3:94-104(2003))，即，一個(gè)或多個(gè)體細(xì)胞的珠心開始放大，并且每個(gè)無孢子生殖的初始核經(jīng)歷兩次連續(xù)有絲分裂，以產(chǎn)生一個(gè)四核胚囊。該四個(gè)核包括卵細(xì)胞，兩個(gè)助細(xì)胞，以及一個(gè)極核，或，可選地，卵細(xì)胞，一個(gè)助細(xì)胞和兩個(gè)極核。為了胚乳的發(fā)育，單向的或雙向的核中央細(xì)胞必須是在具假配子的物種中受精(Kojima A.,Nagato Y.,Sex.Plant Reprod.5:79-85(1992)；Naumova T.et al.,Acta Botanica Neerlandica 42:299-312(1993)；Nogler G.,Gametophytic apomixis,in:B.M.Johri(Ed.),Embryology of Angisoperms,Springer,Berlin,pp.475-518.(1984))。因此，即使雌性減數(shù)分裂可以是不規(guī)則的，存在對(duì)產(chǎn)生可行授粉的正常孢子的選擇壓力。或在無融合生殖水牛草(Cenchrus ciliaris)中央細(xì)胞單獨(dú)受精略微之前或不久之后，未減數(shù)的卵細(xì)胞開始孤雌繁殖發(fā)育(Vielle J.et al.,Link.Plant J.8:309-316(1995))。

在一個(gè)屬中的物種和雜種的繁殖表型通常就可以被明確地確定，根據(jù)相對(duì)少量的清潔雌蕊(通過化學(xué)處理，其已經(jīng)變成光學(xué)透明的)的篩選。狼尾草屬表型也可以通過一個(gè)顯著的紅色的標(biāo)記基因建立(Hanna W.,Burton G.,J.Heredity 83:386-388(1992))，即當(dāng)存在于雜交測(cè)試的花粉父本中，將允許作為經(jīng)由有性繁殖產(chǎn)生的紅色子代的分類。

無融合生殖的非洲狼尾草(Pennisetum squamulatum)原點(diǎn)在先前已經(jīng)被描述(美國(guó)專利No.5,811,636)。另外，核酸標(biāo)志物已經(jīng)被用于識(shí)別含有目的基因的克隆(美國(guó)專利No.6,028,185)，和一些無孢子生殖基因在先前已經(jīng)被描述(Huo H.“Genetic analysis of the apospory-specific genomic region(ASGR)in Pennisetum squamulatum:from mapping to candidate gene”(Doctoral dissertation)(2008).Retrieved from http://dbs.galib.uga.edu/cgi-bin/getd.cgi？userid＝galileo&serverno＝9&instcode＝ugal；Zeng Y.“Identification and characterization of apospory candidate genes in Pennisetum and Cenchrus”(Doctoral dissertation)(2008).Retrieved from http://dbs.galib.uga.edu/cgi-bin/getd.cgi？userid＝galileo&serverno＝9&instcode＝ugal))。無融合生殖是由P.squamulatum中一個(gè)物理尺寸較大的，非重組染色體區(qū)域所傳送的；這個(gè)區(qū)域被稱為特異性的無孢子生殖-染色體組區(qū)域(ASGR)(P.Ozias-Akins,D.Roche,W.W.Hanna,Proc Natl Acad Sci USA 95:5127-5132(1998))，和PsASGR-嬰兒潮樣(PsASGR-BBML)基因位于此區(qū)域(G.Gualtieri et al.,Plant Physiology 140:963-971(2006))。

經(jīng)由在回交群體中進(jìn)行RAPD，RFLP，AFLP和SCAR標(biāo)記和經(jīng)由P.squamulatum(作為父本)與性珍珠小米之間的偽測(cè)交，狼尾草的無融合生殖已經(jīng)被分子化測(cè)繪圖像(Dujardin M.,Hanna W.,J.Genet.Breed.43:145-151(1989)；Goel S.et al,Genetics 163:1069-1082(2003)；Ozias-Akins P.et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:5127-5132(1998)；Ozias-Akins P.et al.,.Theor.Appl.Genet.85:632-638(1993))。經(jīng)測(cè)定，來自所述無融合生殖父本的單個(gè)連接基團(tuán)是必需的和足以用于無融合生殖的傳送，和一個(gè)單個(gè)的完整的染色體已經(jīng)被傳送到BC₈子代中，其中其已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)駐留在四倍體珍珠小米背景中(Singh et al,Crop Sci.50:892-902(2011))。在第二個(gè)物種的圖像中，即C.ciliaris，已經(jīng)產(chǎn)生了相似的結(jié)果(Jessup R.et al,Crop Sci.42:1688-1694(2002)；Roche D.et al,Plant J.19:203-208(1999))。在這兩個(gè)物種中，高分辨率圖像被一個(gè)非重組染色體塊所阻止，雖然通過重組到～1/4染色體或～50Mb，ASGR的尺寸已經(jīng)被減少。纖毛狼尾草的重組最近已經(jīng)恢復(fù)，其演示不完全減數(shù)分裂和孤雌繁殖的分離(Conner et al,Planta 238:51-63(2013))。該重組保留了無孢子生殖胚囊形成所需的ASGR部分；然而，孤雌繁殖所必需的ASGR部分被丟失。纖毛狼尾草和P.squamulatum之間ASGR比較顯示出在宏觀共線性和微觀共線性級(jí)別上的保護(hù)(Goel S.et al,Genetics 173:389-400(2006)；Gualtieri G.et al,Plant Physiol 140 963-971(2006))。

映射到ASGR的細(xì)菌人工染色體克隆的DNA序列分析(Roche D.et al,Theor.Appl.Genet.104:804-812(2002))已經(jīng)進(jìn)行以搜索水稻和正在研究的兩個(gè)無融合生殖物種之間的同線性。微觀共線性的小區(qū)域被確定，而沒有建立宏觀共線性，25個(gè)C.ciliaris和23個(gè)P.squamulatum ASGR基因被識(shí)別(Conner J.et al,Plant Physiol.147:1396-141 1(2008))，定序數(shù)據(jù)顯示整體ASGR是基因貧乏的和轉(zhuǎn)座子豐富的地區(qū)。在ASGR測(cè)序數(shù)據(jù)中的高豐度長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)序列的識(shí)別已經(jīng)允許序列特異性擴(kuò)增多態(tài)性(SSAP)的發(fā)育標(biāo)記物，其已經(jīng)被用于有效地靶向ASGR(Huo H.et al.,Theor.Appl.Genet.119:199-212(2009))。

如本文所述，在非洲狼尾草(L.)R.Br.中，無融合生殖已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)分離為單個(gè)顯性基因座，即ASGR，其中包含PsASGR-BBML基因的多個(gè)拷貝。本研究調(diào)查在性四倍體珍珠小米和無融合生殖Fi植物中PsASGR-BBML的功能。PsASGRBBML被發(fā)現(xiàn)在受精之前在卵子細(xì)胞中被表達(dá)，并且在性珍珠小米中PsASGR-BBML的表達(dá)被發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)孤雌繁殖和生產(chǎn)單倍體子代。遺傳了PsASGR-BBML沉默結(jié)構(gòu)的無融合生殖Fi轉(zhuǎn)基因植物中，減數(shù)的PsASGR-BBML表達(dá)被發(fā)現(xiàn)與更少的孤雌繁殖胚胎和孤雌繁殖胚胎中細(xì)胞數(shù)量相對(duì)應(yīng)。這些數(shù)據(jù)證明了在無融合生殖途徑中PsASGR-BBML基因在孤雌繁殖中的關(guān)鍵作用。

本文中所述的結(jié)果描述了在兩個(gè)無融合生殖物種中緊密聯(lián)系的ASGR細(xì)菌人工染色體(BAC)載體中發(fā)現(xiàn)的基因，但在缺乏孤雌繁殖的重組C.ciliaris植物中丟失；這種基因具有與Brassica napus的嬰兒潮(BBM)基因相似的高蛋白質(zhì)。BBM最初被創(chuàng)造作為用于cDNA轉(zhuǎn)錄物的基因命名，其經(jīng)由體細(xì)胞胚胎發(fā)生而在Brassica napus(BnBBM)的小孢子培養(yǎng)物中被誘導(dǎo)(Boutilier K.et al.,Plant Cell 14:1737-1749(2002))。BnBBMl和BnBBM2預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)是98％的彼此相似，并且85％的類似于它們的擬南芥同源物。

這三種蛋白質(zhì)具有AP2結(jié)構(gòu)域區(qū)域的重要特征。AP2結(jié)構(gòu)域，被命名為擬南芥的APETALA2基因中識(shí)別的氨基酸重復(fù)(Jofuku K.et al,Plant Cell 6:121 1-1225(1994))，一個(gè)花發(fā)育基因，其也被顯示參與調(diào)節(jié)其他花卉同源異型基因，是60-70個(gè)氨基酸的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Pfam-PF00847)。這些AP2結(jié)構(gòu)域具有轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)大家族的特性，由于在這個(gè)保守區(qū)域中它們的相似性，其不但在BBM中而且在這個(gè)類的其他相關(guān)發(fā)育基因中是高度保守的。

該APETALA 2/乙烯反應(yīng)因子(AP2/ERF)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域家族已經(jīng)在植物的廣泛群組中被識(shí)別，如苔蘚，藻類，裸子植物和被子植物。AP2的基因家族分為兩個(gè)分組，即ERF樣組(乙烯反應(yīng)要素結(jié)合因子)和AP2樣組(Weigel D.Plant Cell 7:388-389(1995)；Ohme-Takagi M.and Shinshi H.Plant Cell 7:173-182(1995)；Okamuro J.et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences 94:7076-7081(1997))。ERF樣組的特征是僅具有單個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域；在該組中，功能往往與應(yīng)激反應(yīng)(生物和非生物)相關(guān)(Riechmann J.and Meyerowitz E.,Biol.Chem.379:633-646(1998))。AP2樣組含有兩個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域(repeat 1和2)，其具有彼此相似性和一個(gè)短的域間連接體區(qū)域；這個(gè)組可以進(jìn)一步被分為兩組，即eu-AP2(其包括APETELA2)和ANT(用于AINTEGUMENTA)譜系。ANT譜系本身可以被劃分為basalANT和euANT譜系，其中包含特異性基序euANTl thur4(S.Kim,P.S.Soltis,K.Wall,D.E.Soltis,Mol.Biol.Evol.23:107-120(2006))，其中包含PLETHORA樣，AINTEGUMENTA樣，AINTEGUMENTA-樣1，AINTEGUMENTA-樣5和BBM樣的亞組。這些亞組中的蛋白質(zhì)具有在分生組織維護(hù)，細(xì)胞增殖，器官的萌發(fā)和生長(zhǎng)，胚胎發(fā)生，和根形成的關(guān)鍵作用(A.Horstman,V.Willemsen,K Boutilier,R.Heidstra,Trends in Plant Science 19:146-157(2014))。除了根部之外，所述ANT譜系是珠被啟動(dòng)和雌性配子體發(fā)育以及其他原基早期生長(zhǎng)所需的(Elliott R.et al,Plant Cell 8:155-168(1996)；Klucher K.et al,The Plant Cell 8:137-153(1996))。ANT,AtBBM,and BnBBM基因落入到ANT進(jìn)化枝范圍內(nèi)(Kim S.et al.,Mol.Biol.Evol.23:107-120(2006))。

來自玉米的被稱為ODP2的一個(gè)BBM樣基因在先前已經(jīng)被描述(國(guó)際專利NO.WO2005075655；美國(guó)專利No.8,420,893)。但是，無融合生殖特異性BBM與來自玉米AP2結(jié)構(gòu)域之外的BBM基因顯著不同。BBM，BBM樣，和ASGR-BBM樣蛋白質(zhì)共享保守的BBM-1結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域沒有在euANT譜系的其他成員中被識(shí)別。BBM-1結(jié)構(gòu)域的缺失已經(jīng)消除了轉(zhuǎn)基因植物誘導(dǎo)子葉體細(xì)胞胚胎發(fā)生的能力(S.El Ouakfaoui et al,Plant Mol Biol 74:313-326(2010))。公開的BBM樣蛋白質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)育研究(S.El Ouakfaoui et al,Plant Mol Biol 74:313-326(2010))被擴(kuò)展到包括新測(cè)序的單子葉植物BBM樣蛋白質(zhì)。來自O(shè)ryza sativa的不同進(jìn)化枝中的蛋白質(zhì)，包括ASGRBBMs，BBM1(Os1lgl9060)以及來自Setaria italica和Panicum virgatum的蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)在構(gòu)建的成熟系統(tǒng)發(fā)育樹中形成(圖2)。在此進(jìn)化枝中，相比于PsASGR-BBML，除了PsASGR-BBML之外，在這個(gè)進(jìn)化枝中沒有關(guān)于這些基因的功能研究已經(jīng)被報(bào)道，雖然在NCBI的UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unigene)和水稻寡核苷酸陣列數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ricearray.org/expression/expression.php)中包含BBM1的有限表達(dá)數(shù)據(jù)。

雖然BBM基因在受精之前已經(jīng)在性物種的胚珠中被表達(dá)，沒有觀測(cè)到胚胎發(fā)育，也沒有觀測(cè)到無融合生殖的表型。在誘導(dǎo)后3-4天，已經(jīng)在小孢子中觀察到BnBBM的表達(dá)(在它們注定要成為胚胎發(fā)生的時(shí)間)，并且在整個(gè)測(cè)試時(shí)間段內(nèi)持續(xù)(誘導(dǎo)后28天)(Boutilier K.et al,Plant Cell 14:1737-1749(2002)；Malik M.et al,Plant Physiology 144:134-154(2007))。BnBBM表達(dá)，通過RT-PCR檢測(cè)，也已經(jīng)在3日齡種子/球形胚中被觀察到，并且表達(dá)被發(fā)現(xiàn)持續(xù)在整個(gè)胚胎發(fā)育中(Malik M.et al,Plant Physiology 144:134-154(2007))。BnBBM和BnLECl(LEAFY COTYLEDON 1)，所述表達(dá)主要發(fā)生在小孢子和合子胚胎發(fā)育過程中，被認(rèn)為是對(duì)胚胎發(fā)育的標(biāo)記。BBM也被發(fā)現(xiàn)在擬南芥胚珠的游離核胚乳中是可以被檢測(cè)的，通過原位雜交而確立(Boutilier K.et al,Plant Cell 14:1737-1749(2002))。雖然發(fā)現(xiàn)一旦細(xì)胞化起始，在胚乳中的表達(dá)下降，迄今為止還沒有在胚珠內(nèi)卵細(xì)胞或受精卵細(xì)胞中BBM表達(dá)的公開證據(jù)。BnBBM最初被認(rèn)為是提供在種子中不定胚生殖誘導(dǎo)的路徑，因此母系衍生的胚胎為無融合生殖的一種形式(美國(guó)專利No.7,151,170)。在不定胚生殖中，在胚囊中的發(fā)育沒有發(fā)生改變；相反，胚珠體細(xì)胞，通常是珠心，直接分裂以形成胚胎。因此不定胚生殖是孢子體無融合生殖。

雖然AP2區(qū)域的ASGR-BBML和BnBBM之間的氨基酸相似性是高的(96％)，這個(gè)區(qū)域外的相似性顯著降低(上游35％的相似性和下游27％的相似性)。迄今為止，PsASGR-BBML的三種高度保守的染色體組重復(fù)已經(jīng)從ASGR鏈接的BACs p203，p207(J.A.Conner et al,Plant Physiol 147:1396-411(2008))，和p208被識(shí)別。p208PsASGR-BBML序列是與p207PsASGR-BBML2序列同一的(EU559277.1)，具有內(nèi)含子1中發(fā)現(xiàn)的AT重復(fù)數(shù)目的表達(dá)(11vs.17)?；蛐蛄械谋Ｊ匦砸馕吨€不清楚PsASGR-BBML染色體組區(qū)域的轉(zhuǎn)錄。所述PsASGR-BBML轉(zhuǎn)錄物編碼了衍生自8個(gè)外顯子拼接的545個(gè)氨基酸蛋白質(zhì)，一個(gè)73bp的5'非編碼區(qū)以及多個(gè)3'非編碼區(qū)，具有從30到258堿基對(duì)范圍的長(zhǎng)度。所述PsASGR-BBML基因含有兩個(gè)AP2的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，因此被預(yù)測(cè)為具有轉(zhuǎn)錄因子的功能(圖1)。ASGR-BBML的兩個(gè)ASGR鏈接副本也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在于無融合生殖水牛草中(J.A.Conner et al,Plant Physiol 147:1396-411(2008))，這兩者是被轉(zhuǎn)錄的。CcASGR-BBM-樣l包含了幾乎與PsASGR-BBML相同的一個(gè)完整的開放閱讀框，而CcASGR-BBM樣2包含了兩個(gè)無義突變，其中第一個(gè)定位于第一個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域內(nèi)。兩個(gè)相關(guān)的但是ASGR-未鏈接的BBML(non-ASGR-BBML)基因也已經(jīng)被從C.ciliaris中分離，和直系同源已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)存在于P.squamulatum中。關(guān)于水稻的先前的比較研究表明，ASGR-BBML是與水稻基因Os11gl9060最密切相關(guān)的一個(gè)BBM基因(Conner J.et ah,Plant Physiol.147:1396-1411(2008))，迄今為止沒有功能已經(jīng)被識(shí)別；表達(dá)已經(jīng)在種子中被證明(授粉后5天)和在胚胎中被證明(授粉后25天)，但沒有在雌蕊中被證明(參見http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/ORFinfopage.cgi？orf＝LOC_Osllgl9060)。此外，ASGR-BBML在8個(gè)無融合生殖中是保守的，但是在測(cè)試的7個(gè)性狼尾草物種中不存在(Akiyama Y.et al,BMC Evol.Biol.11:289(2011))。

由于ASGR-BBM-樣(ASGR-BBML)基因與BBM的蛋白相似性，它被評(píng)價(jià)為其用作一個(gè)“無融合生殖的”基因。如本文所述，ASGR-BBML基因被識(shí)別，并且其在孤雌繁殖中的作用被表征。ASGR-BBML被發(fā)現(xiàn)在無融合生殖途徑中作為孤雌繁殖誘導(dǎo)的關(guān)鍵基因中具有重要作用。

這些結(jié)果表明ASGR-BBML可以被用于在植物中實(shí)現(xiàn)孤雌繁殖，其通常不顯示這個(gè)表型。該種子組的轉(zhuǎn)化品系是低的，而且植物子代可以篩選倍性水平。孤雌轉(zhuǎn)基因品系可以由此產(chǎn)生子代，其被減少到二倍體水平(或在細(xì)胞周期范圍內(nèi)的單倍體)。因?yàn)閱伪扼w誘導(dǎo)隨后染色體加倍是隨后在許多谷類作物中的育種實(shí)踐以便于更迅速地獲得純合系，通過在卵細(xì)胞中依賴于染色體非減數(shù)分裂的無融合生殖途徑，這些發(fā)現(xiàn)可以用于在有性植物或克隆繁殖的單倍體誘導(dǎo)。

已經(jīng)詳細(xì)地描述了本發(fā)明，顯而易見的是，不脫離在所附的權(quán)利要求限定的本發(fā)明的范圍的修改，變體和等價(jià)實(shí)施方案是可能的。此外，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，在本發(fā)明所公開的所有實(shí)施例是作為非限制性實(shí)例提供的。

實(shí)施例

提供下述非限制性實(shí)施例以進(jìn)一步說明本文所公開的本發(fā)明的實(shí)施方案。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)預(yù)期的是，在以下實(shí)施例中公開的技術(shù)方案已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的實(shí)施中起到很好的作用，并且因此可以被認(rèn)為構(gòu)成用于其實(shí)施的實(shí)例模式。然而，根據(jù)本發(fā)明的公開內(nèi)容，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，許多變化可以在具體實(shí)施方案中進(jìn)行，其被公開并且仍然獲得相同或類似的結(jié)果而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。

實(shí)施例1

材料和方法

DNA提取

使用溴化十六烷基三甲銨(CTAB)方案完成DNA提取(J.Conner,G.Gunawan,P.Ozias-Akins,Planta 238:51-63(2013))。

PCR擴(kuò)增

基于引物重組和擴(kuò)增長(zhǎng)度需要不同的PCR條件。所有未公開擴(kuò)增子的引物和PCR信息出現(xiàn)在表1中。根據(jù)制造商的說明實(shí)施PCR反應(yīng)，除非另有說明。反應(yīng)在GeneAmp 9700熱循環(huán)儀中實(shí)施(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)。

ASGR-BBML組織表達(dá)的非定量RT-PCR

使用從各種組織分離的RNA，經(jīng)由RT-PCR證實(shí)ASGR-BBML的表達(dá)，包括以下：開花前1天，通過種子發(fā)育，和最多開花后5天而分離的子房；在開花前第1天的花藥；從溫室種植的盆栽植物所收集的根尖；新生的葉組織；和衍生自無融合生殖狼尾草BCg品系的胚性愈傷組織(M.Singh et al,Crop Science 50:892-902(2010))?？俁NA經(jīng)由RNeasy植物小型試劑盒(QIAGEN,Valencia,CA,USA)從各種組織中提取總RNA，并且進(jìn)行DNA酶處理(Invitrogen，Carlsbad，USA)。通過寡聚-dT和SuperScriptlll(Invitrogen)，3至5微克的總RNA被用于第一鏈cDNA的合成。2μL的第一鏈cDNA合成反應(yīng)物被用于使用ASGR-BBML特異性引物p779/80的PCR擴(kuò)增(Y.Akiyama et al,BMC Evolutionary Biology,11:289(2011))，或被用作對(duì)照的肌動(dòng)蛋白解聚因子3(ADF3)的引物pi 127/1128的PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物在1.25％的瓊脂糖凝膠上運(yùn)行，用溴化乙錠染色，并且用分子成像儀Gel DocXR系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories,Hercules，CA，USA)成像。

PsASGR-BBML的cDNA末端(RACE)快速擴(kuò)增

經(jīng)由GeneRacer RLM-RACE試劑盒(Invitrogen)，生成PsASGR-BBML的5'和3'非編碼區(qū)的RACE產(chǎn)物，并且從無融合生殖BC7品系58的小穗組織中提取總RNA(M.Singh et al,Crop Science 50:892-902(2010))。所使用的PCR引物列在表1中。用QIAquick凝膠純化試劑盒(QIAGEN)凝膠純化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，并且克隆到PCR4-TOPO(Invitrogen)載體或pGEM-T easy(Promega，Madison，WI，USA)載體中。使用CEQ 8000遺傳分析系統(tǒng)(Beckman Coulter，F(xiàn)ullerton，CA，USA)進(jìn)行核苷酸測(cè)序，并且用載體NTI(Invitrogen)處理序列。

PsASGR-BBML轉(zhuǎn)基因的序列分析

在開花當(dāng)天，為了g3f子代從子房中提取總RNA，即105，123，144和159。3微克RNA進(jìn)行DNA酶處理(Invitrogen)和使用寡-dT和SuperScriptlll(Invitrogen)用于第一鏈cDNA合成中。經(jīng)由轉(zhuǎn)基因特異性引物pl792/pl801和p2347/p423，2μL的第一鏈cDNA合成反應(yīng)物被用于PCR擴(kuò)增。用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN)凝膠純化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，并且克隆到PCR4-TOPO(Invitrogen)中。在實(shí)驗(yàn)室中為了基因組學(xué)與生物信息學(xué)而實(shí)施核苷酸測(cè)序(University of Georgia，Athens，GA)。去除載體和質(zhì)量差的序列，然后使用Geneious Pro5.6.6(Biomatters Limited，Auckland，New Zealand)組裝修剪的序列。

轉(zhuǎn)化構(gòu)建體

構(gòu)建PsASGR-BBMpromoter-GUS。用BamHI/NcoI消化pCambia3301以除去CaMV 35S啟動(dòng)子，其被一個(gè)2,074bp的PCR產(chǎn)生的BamHI/NcoI位PsASGR-BBML啟動(dòng)子片段所替代，所述PsASGR-BBML啟動(dòng)子是使用引物p690和p692而從BAC p208擴(kuò)增的(D.Roche et al.Theor Appl Genet.,104:804-812(2002))。該BamRl位點(diǎn)是內(nèi)源性的啟動(dòng)子，并且正好定位于p690的下游。一個(gè)Ncol位點(diǎn)被摻入到p692中。通過用BamHI/BseYl的消化作用去除，鈍化pCambia3301的PsASGR-BBMLpromoter-GUS-NospolyA基因盒，然后被放入到pACH20的一個(gè)鈍化的和去磷酸化HindIII位點(diǎn)中(A.H.Christensen,P.H.Quail,Transgenic Research,5:213-218(1996))以創(chuàng)建質(zhì)粒2BE。

構(gòu)建gPsASGR-BBML。該pBluescript載體被裝配為2,074bp的PsASGRBBML啟動(dòng)子，3540bp的8個(gè)外顯子，來自BAC p208的PsASGR-BBML編碼區(qū)的7個(gè)內(nèi)顯子(D.Roche et al.Theor Appl Genet,104:804-812(2002))和609bp的3'終止密碼子，包括預(yù)測(cè)的多聚(A)信號(hào)。

構(gòu)建RNAi-BBM-3p。二元表達(dá)載體pMCG161(http://www.chromdb.org)用于RNAi載體構(gòu)建。經(jīng)由引物p966和p967，生成一個(gè)425bp的擴(kuò)增子，所述擴(kuò)增子覆蓋52％的PsASGRBBML的最后外顯子和摻入用于克隆到pMCG161的限制酶，并且被插入pMCG161中，根據(jù)下面的可用說明http://www.chromdb.org。

構(gòu)建Ubi-Hygro。用HindllVBamRl消化pCB13(H.Yang et al,Plant Cell Reports,17:693-699(1998))以除去CaMV 35S啟動(dòng)子和用來自pAHC20的HindIII/BamHI玉米泛素(Ubi-1)啟動(dòng)子片段替換(A.H.Christensen,P.H.Quail,Transgenic Research,5:213-218(1996))。

植物轉(zhuǎn)化

按照先前的方案，由四倍體性IA4X植物的7-10日齡幼胚產(chǎn)生的胚性愈傷組織被轟擊，選擇(25毫克/升潮霉素B或15毫克/升草丁膦)和再生(J.J.Goldman,W.W.Hanna,G.Fleming,P.Ozias-Akins,Plant Cell Rep.,21:999-1009(2003))。用質(zhì)粒2BE和p524EGFP.1的混合物轟擊PsASGR-BBMpromoter-GUS品系(G.H.Fleming,O.Olivares-Fuster,S.Del-Bosco,J.W.Grosser,In Vitro Cell Dev Biol Plant 36:450-455(2000))，用質(zhì)粒gPsASGR-BBML，p524EGFP.1和Ubi-Hygro的混合物轟擊gPsASGR-BBML品系，和用質(zhì)粒RNAi-BBM-3p轟擊RNAi品系。

胚挽救

用于胚挽救的培養(yǎng)基是基于在5DAP用于狼毒草合子胚的先前工作(C.Nitsch et al.,“Production of haploid plants of Zea mays and Pennisetum through androgenesis.”Variability in plants regenerated from tissue culture.Praeger,New York(1982):69-91)和使用IX NITSCH&NITSCH基礎(chǔ)培養(yǎng)基重量/維生素(PhytoTechnology Laboratories,Shawnee Mission,KS)，1％蔗糖，赤霉酸(1毫克/升)，吲哚乙酸(0.03毫克/升)，0.75％瓊脂，pH 5.8的0.2％>植物防腐劑混合物(PPM)(Plant Cell Technology,Inc.,Washington,DC)。根據(jù)先前的方案，發(fā)育(授粉后10-15天)和成熟的種子進(jìn)行滅菌(J.J.Goldman,W.W.Hanna,G.Fleming,P.Ozias-Akins,Plant Cell Rep.,21:999-1009(2003))。手術(shù)切除胚胎，盾片側(cè)朝上放置在培養(yǎng)基上，并且監(jiān)測(cè)根和枝條的伸長(zhǎng)。胚胎被放置在GA/IAA培養(yǎng)基上最多10天，然后棄去如果沒有根/枝條生長(zhǎng)發(fā)生。根和枝條生長(zhǎng)的子代被轉(zhuǎn)移到一個(gè)IXMurashige&Skoog(MS)培養(yǎng)基中重量/維生素(PhytoTechnology Laboratories)，所述培養(yǎng)基補(bǔ)充有3％蔗糖，0.75％瓊脂，pH5.8的PPM直到生長(zhǎng)允許硬化和移動(dòng)到溫室中。

用于PsASGR BBMpromoter-GUS品系X-Gluc染色的β葡萄糖醛酸酶活性

基于使用轉(zhuǎn)基因特異性引物，即p2354/p2355；p2349/p2350；和p2885/p2886而過量的PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生含有全長(zhǎng)轉(zhuǎn)基因的8個(gè)獨(dú)立的PsASGR BBMpromoter-GUS品系(表1)。所述PsASGR BBMpromoter-GUS的To品系是或允許自花授粉或呈現(xiàn)與無融合生殖BCg-品系63花粉的交叉授粉。5個(gè)品系的種子發(fā)芽，然后如果是雜交的話則進(jìn)行ASGR遺傳的基因分型和PsASGR BBMpromoter-GUS轉(zhuǎn)基因。最初，從開花前一天解剖的子房或在柱頭外露之前在開花當(dāng)天從包裹的頭部，檢查PsASGR BBMpromoter-GUS基因的表達(dá)模式；在開花之前，機(jī)械方式移除柱頭。

新的PsASGR BBMpromoter-GUS植物發(fā)芽和被分離到單個(gè)溫室中以便于進(jìn)一步控制意外授粉。在花粉散落之前持續(xù)削減所有的頭部以便于保持溫室中小米花粉的游離。在開花前一天收集小花，用手工除去花藥。刪割的小花然后被置于IX MS培養(yǎng)基上，0.75％瓊脂，pH 5.8的含有0.2％>PPM以及在27℃下在長(zhǎng)日照光條件的生長(zhǎng)室中孵育24小時(shí)。解剖子房并且在X-Gluc反應(yīng)溶液(100mM磷酸鈉/pH 7.0，10mMEDTA，0.5mM亞鐵氰化鉀，0.5mM鐵氰化鉀，0.1％的Triton X-100和1mM 5-溴-4-氯-3-P-D-葡糖苷酸)中在37℃下孵育48小時(shí)。X-Gluc-染色子房在室溫下分別在15，30和50％>乙醇中脫水1小時(shí)，然后固定在FAA(50％乙醇，3.7％甲醛，和5％乙酸)上過夜。FAA-固定的子房在室溫下分別在70，85，90，100，和100％的乙醇中進(jìn)一步脫水1小時(shí)，然后通過一系列乙醇：水楊酸甲酯溶液(3：1，1：1和1：3，每個(gè)1小時(shí))清潔脫水的子房。清潔的子房?jī)?chǔ)存在100％的水楊酸甲酯中1小時(shí)。使用Axioskop 2plus顯微鏡，AxioCam照相機(jī)和AxioVision軟件4.8(Zeiss，Thornwood，NY)獲得的子房相襯圖像。

gPsASGR BBML/Ubi Hvgo轉(zhuǎn)基因品系的基因分型

基于分別使用pl800/01和p297/298的PCR擴(kuò)增結(jié)果，恢復(fù)含有g(shù)PsASGR_BBML和Ubi_Hygo構(gòu)建體的9個(gè)獨(dú)立株。

流式細(xì)胞儀

在BD Accuri C6流式細(xì)胞儀(BD Biosciences，Sun Jose，CA USA)或Partec倍性分析儀(Partec，Munster，Germany)上運(yùn)行以處理樣品。該過程涉及切碎的高粱(對(duì)照)和樣品(未知)的幼葉組織與1000μL的Tris-氯化鎂的核提取緩沖液(0.2M的Tris-HCl，pH7.5，4mM氯化鎂x6H₂0，0.5％的Triton X-100)混合，并且該混合物通過一個(gè)30μm的CellTrics一次性過濾器(Partec)。500μL的RNA酶/碘化丙啶溶液(BD Biosciences)加入到過濾的樣品中，然后在冰上孵育15分鐘。對(duì)于BD Accuri C6流式細(xì)胞儀分析，通過對(duì)象的選擇而設(shè)置選通，其表現(xiàn)出使用每分鐘14μL樣品流速在FL2和FL3信號(hào)之間有很強(qiáng)的相關(guān)性。在選通區(qū)域內(nèi)收集每個(gè)樣品至少3000個(gè)事件。在Partec倍性分析儀上運(yùn)行樣品直到可以明確的看到峰?；贕1和G2樣品峰相對(duì)于高粱對(duì)照G1和G2峰，確定倍性水平。

根尖染色體計(jì)數(shù)

如果可用，從g3f子代收獲6個(gè)健康的根尖，清除土壤，放置在含有300μL dH2O的Eppendorf管中，用一氧化二氮在150磅下處理2個(gè)半小時(shí)，最后固定在新鮮的乙醇：乙酸(3：1)中至少2天。根的分生組織區(qū)域在含有0.3％纖維素RS(Karlan Research，Torrance，CA)，0.3％>果膠酶Y23(Karlan Research)和0.3％>N,N-二丁基苯胺(Sigma-Aldrich,St.Louis)的pH 4.5的30mM檸檬酸鹽緩沖液中，在37℃下孵育60-90分鐘。酶消化之后，來自每個(gè)植株的至少3個(gè)根尖分別在載玻片上擴(kuò)散。定位染色體擴(kuò)散，數(shù)字化拍照，然后使用Adobe Photoshop CS6計(jì)數(shù)染色體數(shù)目。使用源自至少2個(gè)載玻片的最少4個(gè)擴(kuò)散測(cè)定每個(gè)植物的倍性水平。

RNAi篩選

基于分別使用以下引物：p992/p993，pl222/pl223和pl224/p1125的BAR基因和RNAi正義和反義插入的PCR擴(kuò)增，含有RNAi_BBM_3p構(gòu)建體的16個(gè)獨(dú)立的性四倍體IA4X品系被恢復(fù)。8個(gè)品系與P.squamulatum花粉進(jìn)行雜交，因此產(chǎn)生Fi子代。用P.squamulatum特定引物pl032/1035，RNAi_BBM_3p引物p992/p993，pl222/pl223和pl224/p1125以及ASGR特異性引物Ugtl97篩選來自每個(gè)品系的Fi子代植物(P.Ozias-Akins,D.Roche,W.W.Hanna,Proc Natl Acad Sci USA 95:5127-5132(1998))。使用來自葉組織和衍生自轉(zhuǎn)基因的章魚堿合酶終止子區(qū)域的引物pl226/pl227的總RNA的RT-PCR分析，ASGR+/RNAi+和ASGR-/RNAi+植物隨后測(cè)試RNAi轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。來自5個(gè)品系的25個(gè)植物被選擇用于進(jìn)一步分析；這些包括14個(gè)ASGR+/RNAi+，5個(gè)ASGR+/RNAi-和6個(gè)ASGR-/RNAi+植物。

PsASGR-BBML表達(dá)的半定量分析

PsASGR-BBML的半定量RT-PCR定量是基于一個(gè)先前的方案(E.Albertini et al,Plant Molecular Biology 56:879-894(2004))。ADF3引物pi 127/1128被用作內(nèi)部對(duì)照，伴隨著PsASGR-BBML特異性引物，即p779/p780(Y.Akiyama et al,BMC Evolutionary Biology,11:289(2011))。經(jīng)由RNeasy植物小試劑盒(QIAGEN)，每個(gè)試驗(yàn)中使用3.3微克在開花當(dāng)天從子房中提取的總RNA，和使用DNA酶(Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)處理樣品而用于使用寡脫氧胸苷和SuperScriptlll(Invitrogen)的第一鏈cDNA合成。在所有的PCR反應(yīng)中使用2μL的cDNA合成反應(yīng)物；所有的反應(yīng)一式三份運(yùn)行。憑經(jīng)驗(yàn)確定ADF3和PsASGR-BBML的PCR循環(huán)數(shù)被發(fā)現(xiàn)分別是26和40個(gè)循環(huán)。用Storm phosphorimager(Amersham Biosciences,Pittsburgh,PA,USA)進(jìn)行雜交成像，并且按照制造商的說明使用ImageQuant 5.0版(AmershamBiosciences)定量條帶。

在RNAi品系中胚胎發(fā)育的組織學(xué)分析

在柱頭外露之前包裹頭部，在開花之前除去柱頭以防止授粉。開花后2天從頭部收集小穗，固定在FAA上，然后在室溫下固定24小時(shí)之前，在15毫米汞柱下真空處理30分鐘。起初用TBA1(40％乙醇，10％叔丁醇(TBA)，50％蒸餾水)脫水2小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到TBA2(50％乙醇，20％的TBA，30％蒸餾水)中8小時(shí)，TBA3(50％乙醇，35％的TBA，15％蒸餾水)1小時(shí)，TBA4(45％乙醇，55％的TBA)1小時(shí)，TBA5(25％乙醇，75％的TBA)1小時(shí)，和TBA6(100％的TBA)1小時(shí)。然后子房被轉(zhuǎn)移至新鮮100％的TBA中8小時(shí)，轉(zhuǎn)移到TBA：石蠟油(Fisher,Pittsburgh,PA,USA)中在58℃下(1：1)過夜。在嵌入之前，子房通過純Paraplast X-tra的三個(gè)轉(zhuǎn)變(Fisher,Pittsburgh,PA)，每個(gè)48小時(shí)。然后所有樣品以9μm進(jìn)行切片。使用修改的先前描述方案(Jensen 1962)，用番紅O/快綠進(jìn)行樣品染色，其中嵌入并切片的樣品在乙醇中脫蠟，再在醚-醇(50％乙醚，50％乙醇)中用0.05％>硝化纖維素(用火棉膠稀釋，F(xiàn)isher,Pittsburgh,PA)包裹30秒。通過70％>乙醇，30％>乙醇和蒸餾水轉(zhuǎn)移而完成樣品的再水化，每次轉(zhuǎn)移5分鐘。首先用番紅O溶液(4g番紅O，100ml蒸餾水，100ml95％的乙醇，4g醋酸鈉)染色5分鐘。然后在以下系列溶液對(duì)樣品進(jìn)行脫水，每次5分鐘：蒸餾水更換兩次，50％>乙醇，95％乙醇，100％乙醇。隨后樣品被快綠溶液(1g快綠，100ml 100％的乙醇，100ml溶纖劑和100ml丁香油)染色4秒鐘，然后立即放入純丁香油10秒，迅速被轉(zhuǎn)移到清潔混合物(50％>丁香油，25％乙醇，25％脫蠟劑)中。切片最終在脫蠟劑中被清潔5分鐘，然后嵌入裝配。

Phylo遺傳分析

從NCBI下載在BBM狀進(jìn)化枝中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)(S.El Ouakfaoui et al.,Plant Mol Biol 74:313-326(2010))。然后使用BLASTP和PsASGR-BBML完整蛋白在Phytozome草分枝的每個(gè)成員中搜索。下載與延伸超越AP2結(jié)構(gòu)域的PsASGR-BBML相似的所有蛋白質(zhì)，而截短蛋白和那些沒有BBM-1結(jié)構(gòu)域(S.El Ouakfaoui et al.,Plant Mol Biol 74:313-326(2010))被除去。使用的phytozome目標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)是高粱1.4蛋白質(zhì)組，玉米蛋白質(zhì)組，小米蛋白質(zhì)組，柳枝稷vO.O蛋白質(zhì)組，水稻蛋白質(zhì)組和二穗短柄草蛋白質(zhì)組。被發(fā)現(xiàn)與BBM樣進(jìn)化枝(S.El Ouakfaoui et al,Plant Mol Biol 74:313-326(2010))之間相同的蛋白質(zhì)和Phytozome被除去。使用網(wǎng)絡(luò)基于比對(duì)程序比對(duì)26個(gè)氨基酸序列；結(jié)果是，T-Coffee(http://tcoffee.erg.cat/apps/tcoffee/do.regular)和Mafft(http://mafft.cbrc.jp/alignment/server)比對(duì)確定BBM狀分枝中最保守的結(jié)構(gòu)域，特別是在未編輯的蛋白質(zhì)的C末端。T-Coffee比對(duì)產(chǎn)生了對(duì)所有蛋白的一個(gè)具有283個(gè)保守位點(diǎn)的1,067個(gè)氨基酸共有序列長(zhǎng)度(圖1)。使用E-INS-I命令，Mafft比對(duì)產(chǎn)生了對(duì)所有蛋白的一個(gè)具有264個(gè)保守位點(diǎn)的1,040個(gè)氨基酸共有長(zhǎng)度。經(jīng)由MEGA6軟件((K.Tamura et al,Molecular Biology and Evolution 30:2725-2729(2013)))，T-Coffee比對(duì)被用于創(chuàng)建系統(tǒng)發(fā)育樹(P.Di Tommaso et al,Nucl.Acids Res.39(suppl 2):W13-W17(2011))(圖2)。

表1.引物和PCR條件

iProof(Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室)

JumpStart Taq DNA聚合酶(Sigma)

Takara ExTaq Hot Start，Primestar GXL，PrimeSTAR HS DNA聚合酶(Clonetch Laboratories，Inc，Mountain View，CA)

實(shí)施例2

在擬南芥中ASGR-BBML的過度表達(dá)

通過5'和3'RACE識(shí)別來自P.squamulatum的全長(zhǎng)ASGR-BBML cDNA。該cDNA被發(fā)現(xiàn)使用CaMV35S啟動(dòng)子在擬南芥中被過表達(dá)，過表達(dá)的多效性作用如異位枝條，帶毛狀突起，和不完整的花的形成(圖3A-C)。在這些品系中發(fā)現(xiàn)繁殖力受損，并且觀察到轉(zhuǎn)基因的偏態(tài)分離。當(dāng)過表達(dá)是在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下時(shí)，ASGR-BBML過表達(dá)的表型是更容易被理解的。

實(shí)施例3

在P.SQUAMULATUM，C.CILIARIS和無融合生殖回交中ASGR-BBML的表達(dá)

用ASGR-BBML基因構(gòu)建體的染色體組拷貝轉(zhuǎn)化性四倍體珍珠小米，發(fā)現(xiàn)在沒有相應(yīng)胚乳受精時(shí)誘導(dǎo)胚胎在減數(shù)分裂衍生胚囊中形成，所述染色體組拷貝包括一個(gè)啟動(dòng)子和3'非編碼區(qū)。通過之前的在柱頭外露之前通過包裹頭部以及隨后在再次外露之前除去柱頭/花柱而預(yù)防受精，具有作為胚珠缺乏受精的證據(jù)，所述胚珠是在中央細(xì)胞的二極核中持續(xù)和缺少胚乳形成。在開花前1天起始和持續(xù)到早期種子發(fā)育的子房中，以及在開花前1天的花藥和根部中，通過RT-PCR在兩種無融合生殖物種(P.squamulatum和C.ciliaris)和在無融合生殖狼尾草回交7個(gè)和8個(gè)品系內(nèi)事先觀察到ASGR-BBML的表達(dá)(M.Singh et al,Crop Science 50:892-902(2010))。

PsASGR-BBML被發(fā)現(xiàn)在衍生自無融合生殖狼尾草BC₈品系的胚性愈傷組織中被表達(dá)。在無融合生殖的物種和無融合生殖回交中，在花粉脫落之前，在無孢子生殖胚囊中胚胎發(fā)育可以起始，在花粉脫落后持續(xù)數(shù)天，當(dāng)授粉被預(yù)防和無胚乳形成時(shí)(圖4)。雖然球狀和后期胚胎表現(xiàn)出良好的信號(hào)，在生殖組織中ASGR-BBML基因表達(dá)的低水平導(dǎo)致對(duì)胚胎發(fā)育早期階段的原位雜交實(shí)驗(yàn)無效RNA(圖5A-D)。因此，使用RT-PCR檢測(cè)表達(dá)。

在花粉脫落當(dāng)天和最多花粉脫落后兩天之前，為了ASGR-BBML轉(zhuǎn)錄和胚胎發(fā)育而檢測(cè)未授粉雌蕊；授粉是通過除去柱頭而防止的。證實(shí)了ASGR-BBML基因的表達(dá)與無融合生殖P.squamulatum和C.ciliaris中未減數(shù)的卵細(xì)胞的孤雌繁殖發(fā)育相關(guān)聯(lián)；即，在花藥開裂和花粉脫落之前，通過去除柱頭確保缺乏授粉的情況下檢測(cè)所述表達(dá)(圖6中的DAP0)。來自P.squamulatum和C.ciliaris的花藥，花粉，根顯示出ASGR-BBML表達(dá)，但是柱頭和葉組織沒有；然而，在葉中的表達(dá)被證明是無融合生殖狼尾草BC₇和BC_S品系。第二胚胎表達(dá)基因表達(dá)的時(shí)間模式(通過半定量RT-PCR)，即LEC，并且在C.ciliaris中識(shí)別的非-ASGR-BBML基因相比于ASGR-BBML有輕微的延遲。AtBBM已經(jīng)顯示出上調(diào)其自身的表達(dá)，但不能直接調(diào)節(jié)LEC的表達(dá)(Passarinho P.et al,Plant Mol.Biol.68:225-237(2008))。因此，非-ASGR-BBML基因可以是ASGR-BBML的靶點(diǎn)。

實(shí)施例4

敲減ASGR-BBML的表達(dá)

通過基因槍法，用一個(gè)反向重復(fù)(IR)構(gòu)建體中ASGR-BBML編碼區(qū)的一部分轉(zhuǎn)化四倍體珍珠小米，并且用草丁膦篩選。IR的轉(zhuǎn)錄通過CaMV 35S啟動(dòng)子進(jìn)行。同源-依賴性基因沉默取決于發(fā)夾RNA的形成和RNA干擾的觸發(fā)，其中內(nèi)源基因正義轉(zhuǎn)錄是靶向降解的(Ossowski S.et al.,Plant Journal 53:674-690(2008)；Eamens A.et al.,Plant Physiology 147:456-468(2008))。根據(jù)Southern印跡雜交，ASGR-BBMLIR沒有表現(xiàn)出與珍珠小米顯著的同源性。

通過四倍體IA4X轉(zhuǎn)化產(chǎn)生RNAi品系，但是沒有預(yù)期RNAi的表型直到IR通過雜交與ASGR組合。IA4X RNAi品系與P.squamulatum的雜交產(chǎn)生了具有兩者組合基因的子代，和然后篩選轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄，ASGR-BBML轉(zhuǎn)錄的變化，和在生殖發(fā)育的變化。通過半定量RT-PCR測(cè)定ASGR-BBML轉(zhuǎn)錄在幾個(gè)子代事件中的變化，如下：ASGR-BBML信號(hào)的減少(圖6A)與減少的早熟胚的發(fā)育(圖6B)相關(guān)聯(lián)以及事件S7>S4>S2>S5。分析含有該基因不同部分的基因敲減少品系作為在水稻肌動(dòng)蛋白1啟動(dòng)子控制下的反向重復(fù)表達(dá)時(shí)，進(jìn)行類似的觀察。

由于從這些實(shí)驗(yàn)中沒有實(shí)現(xiàn)完全的敲減，這些數(shù)據(jù)沒有使ASGR-BBML表達(dá)與胚胎發(fā)育的程度與因果關(guān)系(ASGR-BBML表達(dá)負(fù)責(zé)胚胎誘導(dǎo))相關(guān)聯(lián)；因此，進(jìn)行另外的實(shí)驗(yàn)以測(cè)試ASGR-BBML在孤雌繁殖中的作用。這些由以下步驟組成：1)用β-葡萄糖苷酸酶(GUS)作為報(bào)告基因轉(zhuǎn)化性珍珠小米，在天然BBM啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，和2)在天然啟動(dòng)子的控制下，用ASGR-BBML或作為cDNA或作為染色體DNA轉(zhuǎn)化珍珠小米。

雖然ASGR-BBML的器官特異性表達(dá)模式通過RT-PCR已經(jīng)在兩種無融合生殖物種(P.squamulatum和C.ciliaris)和無融合生殖狼尾草回交中被充分的表征，這不會(huì)使表達(dá)的細(xì)胞定位被確定。在授粉前最多2天，觀察到雌蕊(雌蕊)中無融合生殖的表達(dá)；在授粉后也觀察到表達(dá)，因?yàn)榕咛ラ_始發(fā)育并且持續(xù)生長(zhǎng)。用RT-PCR進(jìn)行這些分析，因?yàn)樵陂_花雌蕊中ASGR-BBML轉(zhuǎn)錄是低豐度的；因此，通過原位雜交未檢測(cè)出轉(zhuǎn)錄。

在授粉之前，經(jīng)由PsASGR-BBML-啟動(dòng)子-GUS構(gòu)建體，在細(xì)胞水平研究子房?jī)?nèi)PsASGR-BBML表達(dá)模式。從轉(zhuǎn)基因珍珠小米雜交回收無融合生殖系，在無孢子生殖胚囊中識(shí)別表達(dá)GUS的分裂的未減數(shù)的卵細(xì)胞(圖7)。在開花當(dāng)天未授粉的胚囊中，在卵細(xì)胞內(nèi)觀察到GUS信號(hào)；有時(shí)候在助細(xì)胞中有較弱的GUS信號(hào)(圖8A-C)。助細(xì)胞信號(hào)可以歸因于來自卵細(xì)胞的PsASGR-BBML的較低表達(dá)或GUS信號(hào)泄漏。胚囊內(nèi)完好助細(xì)胞和極核的存在表明，在授粉前發(fā)生PsASGR-BBML表達(dá)。在有性胚囊的中央細(xì)胞或反足細(xì)胞或在周圍的子房組織中沒有GUS染色被可視化(圖8A-C)。最多授粉后3天，GUS活性也在發(fā)育胚胎特征中被識(shí)別(圖8D)；GUS活性沒有在發(fā)育胚乳中被識(shí)別。

這種表達(dá)模式表示在發(fā)育時(shí)間框架中，BBM是細(xì)胞自主的和表達(dá)的，其在孤雌繁殖角色中是穩(wěn)定的角色。為了得到更確切的證據(jù)，在其天然啟動(dòng)子的控制下，用ASGR-BBML轉(zhuǎn)化有性珍珠小米或作為cDNA或染色體DNA。根據(jù)下表2中提供的序列，下面描述該構(gòu)建體的兩個(gè)版本，下表提供了ASGR-BBML的cDNA，染色體DNA，氨基酸序列，和啟動(dòng)子序列。染色體構(gòu)建體：2074bp的ASGR-BBM啟動(dòng)子(p208)(含有6個(gè)殘基的GGATCC BamHI限制位點(diǎn)序列)，3,540bp的編碼區(qū)(外顯子：內(nèi)含子)的上游和3'非編碼的610bp。cDNA構(gòu)建體：2074bp的ASGR-BBM啟動(dòng)子(含有6個(gè)殘基的GGATCC BamHI限制位點(diǎn)序列)融合至1638bp cDNA編碼區(qū)和3'非編碼區(qū)的610bp。在圖9中描繪了cDNA對(duì)染色體DNA的比對(duì)。

表2.ASGR-BBML的cDNA，染色體DNA，氨基酸序列和啟動(dòng)子序列；起始密碼子是由單下劃線表示的，并且終止密碼子是通過雙下劃線表示的。

SEQ ID NO：1.ASGR-BBM cDNA序列與非編碼區(qū)

TCTCTCTCTCTTCTCTCTCTCCATTTCTCTTCCCTAGGATCAGTGCTAGTGCTTGCA

GCGGCCGCGTTCCGAGATGGGTTCCACCAACAACTGGCTGCGCTTCGCCTCGTTC

TCCGGCGGCGGCGGCGCCAAGGATGCCGCGGCCCTGCTCCCGCTGCCGCCCTCGC

CCCGTGGCGATGTCGACGAGGCCGGCGCAGAGCCGAAGCTCGAGGACTTCCTCG

GCCTGCAGGAGCCGAGCGCCGCCGCGGTGGGGGCTGGGCGGCCATTCGCGGTGG

GTGGCGGTGCGAGCTCCATCGGGCTGTCCATGATCAGGAACTGGCTGCGCAGCC

AGCCGGCGCCGGCCGGGCCTGCTGCGGGGGTCGATTCGATGGTGCTGGCGGCTG

CGGCGGCGTCGACGGAGGTGGCCGGCGATGGCGCGGAGGGCGGCGGCGCCGTG

GCTGACGCGGTGCAGCAGAGGAAGGCGGCGGCGGTGGACACTTTCGGGCAGCGG

ACCTCCATATACCGCGGCGTCACAAAGCATAGATGGACAGGAAGGTATGAAGCC

CATCTTTGGGACAATAGCTGCAGAAGAGAAGGTCAAACTCGGAAAGGTAGACAA

GTGTATCTTGGTGGATATGATAAAGAAGAAAAAGCAGCTAGAGCTTATGATTTA

GCTGCTCTCAAGTACCGGGGCACCACAACTACTACAAATTTTCCGATGAGCAACT

ATGAAAAGGAGTTAGAAGAGATGAAGCATATGTCACGACAAGAATATGTTGCAT

CCCTTAGAAGGAAAAGCAGTGGTTTTTCTCGTGGTGCATCAATTTACCGAGGGGT

TACCAGGCACCATCAGCATGGAAGGTGGCAAGCAAGAATAGGAAGTGTGGCAG

GAAACAAGGATCTTTATTTGGGCACATTCAGTACCCAGGAGGAAGCTGCAGAGG

CTTACGACATTGCTGCCATCAAATTCCGAGGCCTCAATGCTGTCACGAACTTTGA

CATGAGCCGGTATGACGTCAAGAGCATCATTGAGAGCAGCTCCCTGCCTGTTGGC

GGCACTCCAAAGCGTCTCAAGGAAGTGCCTGATCAATCAGATATGGGCATCAAC

ATAAACGGTGACTCTGCTGGTCATATGACTGCTATCAACCTTCTTACTGATGGCA

ATGACAGCTATGGAGCTGAGAGTTATGGTTACAGTGGTTGGTGTCCCACAGCCAT

GACGCCAATCCCCTTTCAATTCAGCAATGGCCATGACCATTCCAGGCTGTGGTGC

AAGCCAGAGCAGGACAATGCGGTTGTTGCAGCACTGCATAACCTGCATCACCTC

CAGCACTTGCCAGCCCCAGTTGGCACCCATAATTTTTTCCAGCCATCGCCTGTTCA

GGACATGACAGGTGTTGCCGATGCTTCATCGCCACCAGTAGAATCTAATTCATTC

CTGTACAATGGGGACGTTGGTTACCATGGTGCCATGGGTGGCAGCTATGCCATGC

CGGTTGCCACACTAGTTGAGGGCAACTCTGCGGGCAGTGGCTATGGAGTTGAGG

AAGGCACAGGGTCTGAAATCTTTGGTGGACGGAACTTGTATTCTCTCTCCCAAGG

TTCCTCAGGCGCCAATACTGGAAAGGCAGATGCTTATGAAAGCTGGGATCCATCT

ATGCTGGTGATATCACAGAAGTCTGCCAATGTGACTGTCTGCCATGGCGCACCTG

TATTTTCAGTTTGGAAATGATGGTTAGATGAAAATATAGTAGTGATATTAACTAG

TTCTTGGAGGGGAAGATTAAATTCTAGGTATACAAAAGTTTAATTTATTAGTGCT

TCAAGATCTCGTATGAAAAAAAGTTTTGCTGCTTAATCAGCTCCAGTGGGAGTCT

AGGAGCCATGAGAAATGTCGTTTTATTATTGACTAATGCTACAATGCTAACATGC

TGACTCTTTTGAATGGCACAAGAGCTCTGGTGTTTCAATACATCAGCCAGTTTCA

TT

SEQ ID NO:2.ASGR-BBM cDNA序列

ATGGGTTCCACCAACAACTGGCTGCGCTTCGCCTCGTTCTCCGGCGGCGGCGGCG

CCAAGGATGCCGCGGCCCTGCTCCCGCTGCCGCCCTCGCCCCGTGGCGATGTCGA

CGAGGCCGGCGCAGAGCCGAAGCTCGAGGACTTCCTCGGCCTGCAGGAGCCGAG

CGCCGCCGCGGTGGGGGCTGGGCGGCCATTCGCGGTGGGTGGCGGTGCGAGCTC

CATCGGGCTGTCCATGATCAGGAACTGGCTGCGCAGCCAGCCGGCGCCGGCCGG

GCCTGCTGCGGGGGTCGATTCGATGGTGCTGGCGGCTGCGGCGGCGTCGACGGA

GGTGGCCGGCGATGGCGCGGAGGGCGGCGGCGCCGTGGCTGACGCGGTGCAGCA

GAGGAAGGCGGCGGCGGTGGACACTTTCGGGCAGCGGACCTCCATATACCGCGG

CGTCACAAAGCATAGATGGACAGGAAGGTATGAAGCCCATCTTTGGGACAATAG

CTGCAGAAGAGAAGGTCAAACTCGGAAAGGTAGACAAGTGTATCTTGGTGGATA

TGATAAAGAAGAAAAAGCAGCTAGAGCTTATGATTTAGCTGCTCTCAAGTACCG

GGGCACCACAACTACTACAAATTTTCCGATGAGCAACTATGAAAAGGAGTTAGA

AGAGATGAAGCATATGTCACGACAAGAATATGTTGCATCCCTTAGAAGGAAAAG

CAGTGGTTTTTCTCGTGGTGCATCAATTTACCGAGGGGTTACCAGGCACCATCAG

CATGGAAGGTGGCAAGCAAGAATAGGAAGTGTGGCAGGAAACAAGGATCTTTAT

TTGGGCACATTCAGTACCCAGGAGGAAGCTGCAGAGGCTTACGACATTGCTGCC

ATCAAATTCCGAGGCCTCAATGCTGTCACGAACTTTGACATGAGCCGGTATGACG

TCAAGAGCATCATTGAGAGCAGCTCCCTGCCTGTTGGCGGCACTCCAAAGCGTCT

CAAGGAAGTGCCTGATCAATCAGATATGGGCATCAACATAAACGGTGACTCTGC

TGGTCATATGACTGCTATCAACCTTCTTACTGATGGCAATGACAGCTATGGAGCT

GAGAGTTATGGTTACAGTGGTTGGTGTCCCACAGCCATGACGCCAATCCCCTTTC

AATTCAGCAATGGCCATGACCATTCCAGGCTGTGGTGCAAGCCAGAGCAGGACA

ATGCGGTTGTTGCAGCACTGCATAACCTGCATCACCTCCAGCACTTGCCAGCCCC

AGTTGGCACCCATAATTTTTTCCAGCCATCGCCTGTTCAGGACATGACAGGTGTT

GCCGATGCTTCATCGCCACCAGTAGAATCTAATTCATTCCTGTACAATGGGGACG

TTGGTTACCATGGTGCCATGGGTGGCAGCTATGCCATGCCGGTTGCCACACTAGT

TGAGGGCAACTCTGCGGGCAGTGGCTATGGAGTTGAGGAAGGCACAGGGTCTGA

AATCTTTGGTGGACGGAACTTGTATTCTCTCTCCCAAGGTTCCTCAGGCGCCAAT

ACTGGAAAGGCAGATGCTTATGAAAGCTGGGATCCATCTATGCTGGTGATATCAC

AGAAGTCTGCCAATGTGACTGTCTGCCATGGCGCACCTGTATTTTCAGTTTGGAA

ATGA

SEQ ID NO:3.ASGR-BBM構(gòu)建體序列

GGATCCAGCCATGTCTAAACGATCAACAGATGACTGCCTAATATAAGGTTTTTGG

GTTGTTGAATAATTAGGCAATATCCATATTAGATTCCGAAAGCAGTAAAACATGA

CAATGATAGTAACTAGTATGCACGCATAAGACATACTAGACGATAGTAACAACA

TAACCATGAACTCAGTAAACATGACTAAAGATTGGATCTTAGATCCGTACCTGGC

GCTCAGAGTTGCAAGCACTGCGGAGGGCGTCGATACTTCGGGGAAGACAAGCGG

CGCAGACGAAGCGACGACGGTGTTCCGGACGGCACGTAGCAGCCGACATTGAAG

GCAATGCGCCCTCTCGTCAGGAGACTTGCTAGGAAGACGAGCCACGATGACGAC

GATTGAGCAGTCACGCGGAGCACTTCCCAAAAACCTTATTCGCCCTCTCCCGGTG

CAGGATCGCAAGGACGGACGGTTCCGGAGACCTGCTCTCCCAATCACCTGTGCA

CGCAGGTGTTCGGGATGGAGTAGATGGCGGCGGCGGCGGCGCAGCAGCGAGCG

AGAGAGGCAAAGTCCTAACTCAGATCAGATCTATTTTAGGGATACCCTTTCATGG

GGCCTTTCCGTAGATAGTCTATTGTGCATCTCTTCTGTGAGGGGGTGGTCCATTTT

TATATGGAGGGAAACCTCCAACACCCTCGTCTATTAGCAATATGAGACTAATAGA

TGGTGTACCCCCTCATCACGCTAATGGGCCTTTGAGATTTATTCAGGAATTATTG

GATTGGCTAATGGGCCAAGCCCAAAATTCCAACACAATCAAGTTTGCCTCGCATA

TCTCGATTCTCGAACCAACCTCCGAGCCATATCTGATTGTAGACAAGTAAACAAA

CTCGGAGGCGGAAGGGGGAACTGACCCGTTGAACGCCGTCACTGCCGGAACCGA

CGTCGCCGTCACTGAAGAAGAAGGAAGATGCTTCCGAACCACCCAATACAAAAC

CTCACTAATTCCTCGCTGACGCCAGAGCAGACGCCGACGAAACGGGAAAGGAGT

CAAAATACCTTATTCCATCGCCACCACATCATTTGGGCGCTGCTCGCTGATACGC

CGGCGGGAGCGGTGGCAGCCAGGTGTACGCCCCCGCGGACTGCGCGCCGGCTGG

CCGGCCGGCCACCGGGGCCGGGGCCCTTCAATCTCTTAGGGCGTCCCCAACAAG

GCTGATTCAGCTAGCTATTTGAGTGTACACATCAGCATGTATCCTACATGGAGGA

AAGAGAGTATGCATTGAACATTGAGCCGGCTATTTGCTCGTCGCCTATCTAGCAC

ATCACCCAAGGCAGCGCTGTGTCTATGGCCTGGCAGAAAATATTGTTTAAATAAC

AAGTAGCCAGCTTTAGTAGATAGTACTTTCTCTTGCTGGCTTTTTTTTTTTTTGATA

ACAGCTCTTGCTGGCTTTTAGCGTGCCGGCTCCGAGCTACTCCCTCTGTCCCAGA

ATTTGAGTCGCCGGCCAACAGTGAAATGAGAGAGGGGCACGGAGTCCCAACGAC

AGTAATATTGGGACAGGGAGTAGCAGCTATCCAGGACTGCTGTAGACGCCCTTA

GTCCTCGACTCCTCGCAGCCTTTCGCCGTTGAAAGAATCACACCGCCCCCTGCAG

TTACGTGTTAACCCAACCCGGGCCATTGGTCAGTCCCTAACCCGGGCGGTTGACC

GCTAGAAATTAGAATTAACCCTTGGTTAACACCGGTCAAAGCGCACATATGCGGT

GCAATCTAATCGAAGTGGCCGCGTCATAATTACACACGCCCGCTCCTATACGTGT

GCCCCGTTCATACGCATGCTCACCTCGCGCGTTCCCATGAGGTTTCACACCCCTTG

TGGGAATCCAAGGCGTCAGAGATTTATTGATCCCATTTCCCTAGCCTGCCTCGCC

TCTCTATCTACTTGTGTGGAGATTAGAGCACAGCAGCGAGAAAGGGCTTGCAGTC

TATAAAGGCGACAAGAGCCCACACCCTCCTCTCTCTCTCTCTTCTCTCTCTCCATT

TCTCTTCCCTAGGATCAGTGCTAGTGCTTGCAGCGGCCGCGTTCCGAGATGGGTT

CCACCAACAACTGGCTGCGCTTCGCCTCGTTCTCCGGCGGCGGCGGCGCCAAGGA

TGCCGCGGCCCTGCTCCCGCTGCCGCCCTCGCCCCGTGGCGATGTCGACGAGGCC

GGCGCAGAGCCGAAGCTCGAGGACTTCCTCGGCCTGCAGGAGCCGAGCGCCGCC

GCGGTGGGGGCTGGGCGGCCATTCGCGGTGGGTGGCGGTGCGAGCTCCATCGGG

CTGTCCATGATCAGGAACTGGCTGCGCAGCCAGCCGGCGCCGGCCGGGCCTGCT

GCGGGGGTCGATTCGATGGTGCTGGCGGCTGCGGCGGCGTCGACGGAGGTGGCC

GGCGATGGCGCGGAGGGCGGCGGCGCCGTGGCTGACGCGGTGCAGCAGAGGAA

GGCGGCGGCGGTGGACACTTTCGGGCAGCGGACCTCCATATACCGCGGCGTCAC

AAAGTAGGTTCTTGATTTTATTTTGGTTTTGGAAAAATTCTTCTTTGTTTTTTCTGT

TTTCTTCCGACTGGTATATCTTGTGTTAAGAACTTTTTCATTAGATGCATGTCATA

CTGTTGCTTTTTCTTGTTGCTTTGAACCTTTTGGCGTTTGCAGCTTCGTTTGGATAT

ACAGAACCTATATTATCCCCTTTAGTAACCAGTAGATTCTTTTTTTTTCTTTTTTTT

TTTTTGCTTTCGATGTTGTTAGTGTTCTTGCATCACGCATGTTTTTCCTCTGATATT

TTAATGGACGATATCATCTCTAGTTCAAGTTTTTGCTCTTGCTCTTGTTGTAGTGG

TGCTAAGATTTTTAAAAAAAAAAATTATGAGCAGTTCTTGTGCTGTTTGAAAATG

TAAGCATCTCACAGTTCTAAAATATATATATATATATATATATAAGTCTCTCATGT

TGATTTGTGGATGTACTGAAGCCCCGCGCGCACACATGCACACACCGCACGCTCA

CACGCCCTAAATCCCCGGTGCAACACCAGGGTTGTCCCCGATGGGGATCGAACC

CTGGCGGGTGGCCTAACCACCGTCAGCTCCCACCACCGAGCTATCAGCTCGTTTG

CCCATATTTCGTGTGGTACCTCGATATTTTTATATTTCTAGATTGCTGTATCTATCT

TCTAGACTTATATAAGTGTTGCGCCACTCATACTTTTTACCGCCTGTAATCGAGTA

GAACTGCTTCCTCTTTTGATTATATTGTATCAGTTAAATGATCTTGTTGTTGATGT

GTTTACCACTTTACCATCACCATTGCATGAAATCACTTCAAGACATGTATTCATG

ATTTGGCTGGCTAAATTTGCTAGTGGCACATACATGTGGTAAAAAAATATTTTTA

GTTTGTGCTTGCTATTCTTTTCGGTCATCCCTTCGTGCCTGTTTATCCAGAACACC

CAATCTGCTTCACATAGTTTTTGAATGCTATCATCATATTTCTTTTTTGGAGATAT

TGTTACTAAAAGTTTGGCTTTGTCCTCAATAGGCATAGATGGACAGGAAGGTATG

AAGCCCATCTTTGGGACAATAGCTGCAGAAGAGAAGGTCAAACTCGGAAAGGTA

GACAAGGTAATGATTATAATATAGATATTTAAATTTGTAATTATAAGCTGCATCA

TATTATTATTTATTAGATCGGCTTTAAAATTTCACTAGCTAATTTAGTGTTTTTCTT

TTCTTCATCGATACCTGCAATCGCTTCATTCCATTGATTCAGTGTATCTTGGTAAG

TAATACTTGTTTACAATTGCAAAATGGTATATCTCTTGTTGTTTCTCATGTCAAGT

ATATTAAATATGTGGTTGATGCATTGAAGGTGGATATGATAAAGAAGAAAAAGC

AGCTAGAGCTTATGATTTAGCTGCTCTCAAGTACCGGGGCACCACAACTACTACA

AATTTTCCGGTATTACTTATTGTTAATATGTTGGTTCTCCAGAATTGATATTTTAC

TTCTAATATATAACTGCGTATATGAATGAATGTTGTAAGATTTTGCATTTTATGTT

CAGATGAGCAACTATGAAAAGGAGTTAGAAGAGATGAAGCATATGTCACGACAA

GAATATGTTGCATCCCTTAGAAGGTACATGTGTTGTCAAAACTTTGTACCTTCAT

GGAAACTGAACTTATATATTTCACAAATGGATTGACATAGAACATATATTTGTGA

TACAGGAAAAGCAGTGGTTTTTCTCGTGGTGCATCAATTTACCGAGGGGTTACCA

GGTACAAAATATTCCTTTTCCTTATTATCTCTGGTTTTAGTTAGCAAGTGCATTGT

TTCTATGGGAATTTGTGTTGCATGTAGATGGGAATTTGTGTTGCATGTAGATCAT

AAATAGTTGCAACTATTAATCTCATCGTTCTATTGCTGAATAGTTGTGGTACTCCT

TTACCACAGTTGACTATGATATTCTATTATATTATTTTTCTTGCAAAGTTGATATT

TAATTGCTTGTCTAGCTAACTTTCAAGCAATCATGTAAAACAGGCACCATCAGCA

TGGAAGGTGGCAAGCAAGAATAGGAAGTGTGGCAGGAAACAAGGATCTTTATTT

GGGCACATTCAGTAAGTCACATTTTAATATTTTTAATGAAGCACTGATTTTTTTTT

GTCAAGCAAAATGGAAGCAAGACAGAAAAACATAAACCTACTGGAGCACCTTTT

TCATTATTTTGTCTCTTGAATATAATAGTATGTGGCTGACCTCTCCCTGTGTAGGT

ACCCAGGAGGAAGCTGCAGAGGCTTACGACATTGCTGCCATCAAATTCCGAGGC

CTCAATGCTGTCACGAACTTTGACATGAGCCGGTATGACGTCAAGAGCATCATTG

AGAGCAGCTCCCTGCCTGTTGGCGGCACTCCAAAGCGTCTCAAGGAAGTGCCTG

ATCAATCAGATATGGGCATCAACATAAACGGTGACTCTGCTGGTCATATGACTGC

TATCAACCTTCTTACTGATGGCAATGACAGCTATGGAGCTGAGAGTTATGGTTAC

AGTGGTTGGTGTCCCACAGCCATGACGCCAATCCCCTTTCAATTCAGCAATGGCC

ATGACCATTCCAGGCTGTGGTGCAAGCCAGAGCAGGACAATGCGGTTGTTGCAG

CACTGCATAACCTGCATCACCTCCAGCACTTGCCAGCCCCAGTTGGCACCCATAA

TTTTTTCCAGCCATCGCCTGTTCAGGACATGACAGGTGTTGCCGATGCTTCATCGC

CACCAGTAGAATCTAATTCATTCCTGTACAATGGGGACGTTGGTTACCATGGTGC

CATGGGTGGCAGCTATGCCATGCCGGTTGCCACACTAGTTGAGGGCAACTCTGCG

GGCAGTGGCTATGGAGTTGAGGAAGGCACAGGGTCTGAAATCTTTGGTGGACGG

AACTTGTATTCTCTCTCCCAAGGTTCCTCAGGCGCCAATACTGGAAAGGCAGATG

CTTATGAAAGCTGGGATCCATCTATGCTGGTGATATCACAGAAGTCTGCCAATGT

GACTGTCTGCCATGGCGCACCTGTATTTTCAGTTTGGAAAJGATGGTTAGATGAA

AATATAGTAGTGATATTAACTAGTTCTTGGAGGGGAAGATTAAATTCTAGGTATA

CAAAAGTTTAATTTATTAGTGCTTCAAGATCTCGTATGAAAAAAAGTTTTGCTGC

TTAATCAGCTCCAGTGGGAGTCTAGGAGCCATGAGAAATGTCGTTTTATTATTGA

CTAATGCTACAATGCTAACATGCTGACTCTTTTGAATGGCACAAGAGCTCTGGTG

TTTCAATACATCAGCCAGTTTCATTATTGTCCATTTGCTGTGCACATTTTCTGCGC

TGGCACCTATAATAATATGATTCTAAACTGTGAATTAGTTCAGATGTCAACTGTA

AGTAACTTTATTTTAGCTTTCTTATATACATCTCTTTTTCTTTTTGAGAAACGGGCT

TTGCCCCCAGCCTTCATAGGAGGCTGGTGCAGCGTACCGGGTCCGAACCTGGGCT

GGTGACGTCCTCAGCATGAGCGCCCACCACCGAGCTACACGCTCGTCTGCTCTTA

TATACATCTCTTCAGTAAGGGTAATATGGTACTTCACAGTTCACAGTCCAGTCAT

TCCAACCATGGATGAGCAAAATGTGCTTGTGCACATGGTGGGTC

SEQ ID NO:4.ASGR-BBM氨基酸序列

MGSTNNWLRFASFSGGGGAKDAAALLPLPPSPRGDVDEAGAEPKLEDFLGLQEPSA

AAVGAGRPFAVGGGASSIGLSMIRNWLRSQPAPAGPAAGVDSMVLAAAAASTEVA

GDGAEGGGAVADAVQQRKAAAVDTFGQRTSIYRGVTKHRWTGRYEAHLWDNSCR

REGQTRKGRQVYLGGYDKEEKAARAYDLAALKYRGTTTTTNFPMSNYEKELEEMK

HMSRQEYVASLRRKSSGFSRGASIYRGVTRHHQHGRWQARIGSVAGNKDLYLGTFS

TQEEAAEAYDIAAIKFRGLNAVTNFDMSRYDVKSIIESSSLPVGGTPKRLKEVPDQSD

MGININGDSAGHMTAINLLTDGNDSYGAESYGYSGWCPTAMTPIPFQFSNGHDHSRL

WCKPEQDNAVVAALHNLHHLQHLPAPVGTHNFFQPSPVQDMTGVADASSPPVESNS

FLYNGDVGYHGAMGGSYAMPVATLVEGNSAGSGYGVEEGTGSEIFGGRNLYSLSQ

GSSGANTGKADAYESWDPSMLVISQKSANVTVCHGAPVFSVWK*

SEQ ID NO:5.ASGR-BBM啟動(dòng)子序列

GGATCCAGCCATGTCTAAACGATCAACAGATGACTGCCTAATATAAGGTTTTTGG

GTTGTTGAATAATTAGGCAATATCCATATTAGATTCCGAAAGCAGTAAAACATGA

CAATGATAGTAACTAGTATGCACGCATAAGACATACTAGACGATAGTAACAACA

TAACCATGAACTCAGTAAACATGACTAAAGATTGGATCTTAGATCCGTACCTGGC

GCTCAGAGTTGCAAGCACTGCGGAGGGCGTCGATACTTCGGGGAAGACAAGCGG

CGCAGACGAAGCGACGACGGTGTTCCGGACGGCACGTAGCAGCCGACATTGAAG

GCAATGCGCCCTCTCGTCAGGAGACTTGCTAGGAAGACGAGCCACGATGACGAC

GATTGAGCAGTCACGCGGAGCACTTCCCAAAAACCTTATTCGCCCTCTCCCGGTG

CAGGATCGCAAGGACGGACGGTTCCGGAGACCTGCTCTCCCAATCACCTGTGCA

CGCAGGTGTTCGGGATGGAGTAGATGGCGGCGGCGGCGGCGCAGCAGCGAGCG

AGAGAGGCAAAGTCCTAACTCAGATCAGATCTATTTTAGGGATACCCTTTCATGG

GGCCTTTCCGTAGATAGTCTATTGTGCATCTCTTCTGTGAGGGGGTGGTCCATTTT

TATATGGAGGGAAACCTCCAACACCCTCGTCTATTAGCAATATGAGACTAATAGA

TGGTGTACCCCCTCATCACGCTAATGGGCCTTTGAGATTTATTCAGGAATTATTG

GATTGGCTAATGGGCCAAGCCCAAAATTCCAACACAATCAAGTTTGCCTCGCATA

TCTCGATTCTCGAACCAACCTCCGAGCCATATCTGATTGTAGACAAGTAAACAAA

CTCGGAGGCGGAAGGGGGAACTGACCCGTTGAACGCCGTCACTGCCGGAACCGA

CGTCGCCGTCACTGAAGAAGAAGGAAGATGCTTCCGAACCACCCAATACAAAAC

CTCACTAATTCCTCGCTGACGCCAGAGCAGACGCCGACGAAACGGGAAAGGAGT

CAAAATACCTTATTCCATCGCCACCACATCATTTGGGCGCTGCTCGCTGATACGC

CGGCGGGAGCGGTGGCAGCCAGGTGTACGCCCCCGCGGACTGCGCGCCGGCTGG

CCGGCCGGCCACCGGGGCCGGGGCCCTTCAATCTCTTAGGGCGTCCCCAACAAG

GCTGATTCAGCTAGCTATTTGAGTGTACACATCAGCATGTATCCTACATGGAGGA

AAGAGAGTATGCATTGAACATTGAGCCGGCTATTTGCTCGTCGCCTATCTAGCAC

ATCACCCAAGGCAGCGCTGTGTCTATGGCCTGGCAGAAAATATTGTTTAAATAAC

AAGTAGCCAGCTTTAGTAGATAGTACTTTCTCTTGCTGGCTTTTTTTTTTTTTGATA

ACAGCTCTTGCTGGCTTTTAGCGTGCCGGCTCCGAGCTACTCCCTCTGTCCCAGA

ATTTGAGTCGCCGGCCAACAGTGAAATGAGAGAGGGGCACGGAGTCCCAACGAC

AGTAATATTGGGACAGGGAGTAGCAGCTATCCAGGACTGCTGTAGACGCCCTTA

GTCCTCGACTCCTCGCAGCCTTTCGCCGTTGAAAGAATCACACCGCCCCCTGCAG

TTACGTGTTAACCCAACCCGGGCCATTGGTCAGTCCCTAACCCGGGCGGTTGACC

GCTAGAAATTAGAATTAACCCTTGGTTAACACCGGTCAAAGCGCACATATGCGGT

GCAATCTAATCGAAGTGGCCGCGTCATAATTACACACGCCCGCTCCTATACGTGT

GCCCCGTTCATACGCATGCTCACCTCGCGCGTTCCCATGAGGTTTCACACCCCTTG

TGGGAATCCAAGGCGTCAGAGATTTATTGATCCCATTTCCCTAGCCTGCCTCGCC

TCTCTATCTACTTGTGTGGAGATTAGAGCACAGCAGCGAGAAAGGGCTTGCAGTC

TATAAAGGCGACAAGAGCCCACACCCTCCTCTCTCTCTCTCTTCTCTCTCTCCATT

TCTCTTCCCTAGGATCAGTGCTAGTGCTTGCAGCGGCCGCGTTCCGAG

實(shí)施例5

包含gPsASGR-BBML的轉(zhuǎn)基因珍珠小米品系

從這些實(shí)驗(yàn)中再生轉(zhuǎn)基因品系，為每個(gè)構(gòu)建體轟擊珍珠小米胚性愈傷組織的兩個(gè)板。對(duì)于這些構(gòu)建體，選擇性標(biāo)記基因是潮霉素抗性的，而不是草丁膦抗性的。5個(gè)cDNA構(gòu)建體品系，總共由13個(gè)植物組成，其是通過胚珠清潔進(jìn)行再生和篩選的，3個(gè)植物顯示出在珠心細(xì)胞中低頻率的小群細(xì)胞質(zhì)分裂細(xì)胞；然而，所有這些不能清楚的解釋為代表一個(gè)超出球形期的有組織的胚胎結(jié)構(gòu)。

9個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因品系(18個(gè)植物)中含有轉(zhuǎn)基因，從有性四倍體珍珠小米產(chǎn)生gPsASGR-BBML，由于缺乏開花或植物的消亡，由6個(gè)植物組成4個(gè)品系沒有被分析。在3個(gè)品系中的4個(gè)植物顯示出在沒有授粉的情況下來自卵細(xì)胞的胚胎形成證據(jù)，和3個(gè)植物在子房分析之前死亡。缺乏授粉的證據(jù)是胚囊中央細(xì)胞極核的持久性。在開花后兩天，使用清潔-雌蕊技術(shù)，對(duì)剩余的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行孤雌繁殖測(cè)定((B.A.Young,R.T.Sherwood,E.C.Bashaw,Can.J.Bot.57:1668-1672(1979))，和通過差異干涉對(duì)比(DIC)或相差光學(xué)器件實(shí)施觀察。在柱頭外露前經(jīng)由包裹頭部，和在開花前去除柱頭/花柱(因?yàn)橹参锸谴迫锵仁斓模@意味著在開花之前柱頭外露)而防止授粉。

如表3中所示，在同一胚囊中發(fā)育胚胎的存在提供了表明胚囊是未授粉的證據(jù)以及所述卵細(xì)胞是孤雌繁殖發(fā)育的證據(jù)，所述胚胎中存在極核(胚胎+PN)。在具有極核的胚囊中胚胎形成的實(shí)例顯示在圖10中。因?yàn)檫@將是在發(fā)生減數(shù)分裂的有性植物中指示孤雌繁殖的，孤雌繁殖衍生的單倍體胚胎是預(yù)期具有母本的半數(shù)染色體數(shù)目和DNA含量(圖10)。子代#105(圖10D)和#106(圖10C)是來自性二倍體(2n＝4x)植物(如：#100(圖10B)，#107(圖10D)和#108(圖10A，10C))子代的一半預(yù)期DNA含量的單倍體(1n＝2x)個(gè)體的實(shí)例。雖然在這些品系(胚囊+PN)中不是所有的胚胎是孤雌繁殖發(fā)育的，這可能是由于該表型的不完全外顯和轉(zhuǎn)基因的分離。雖然在這些品系中不是所有的胚囊是正常發(fā)育的(無胚囊/異常囊結(jié)構(gòu))，這可能是由于通過組織培養(yǎng)，植物的健康狀況不佳，和/或轉(zhuǎn)基因的多效性誘導(dǎo)的變化。關(guān)于這些替代品的進(jìn)一步信息可以通過基因分析而收集。柱頭去除率不是100％，導(dǎo)致偶爾授粉(最后一欄)。

表3.

基于中央細(xì)胞中極核的持久性和胚乳發(fā)育的缺乏，含有結(jié)構(gòu)化成熟胚囊的所有品系(圖11A)，其中3個(gè)獨(dú)立的品系(g3f，g11a，和g52)顯示孤雌繁殖(圖11B，11C)，因此胚乳可以在相同發(fā)育階段的授粉胚囊中容易地被可視化。當(dāng)沒有阻止授粉時(shí)，所有的3個(gè)品系顯示出在第2天胚乳的形成(圖11D)。對(duì)這3個(gè)品系的每個(gè)進(jìn)行至少3個(gè)頭部和150個(gè)子房的分析，其中在開花后第2天，每個(gè)頭部的結(jié)構(gòu)化成熟胚囊的百分比(圖11A)和那些含有孤雌繁殖胚胎的百分比對(duì)品系g11a，g52和g3f分別為66，79，71和35，36，35。經(jīng)由RT-PCR，在開花后第2天用從開放授粉的子房中提取的RNA驗(yàn)證品系g52和g3f的gPsASGR-BBML轉(zhuǎn)基因表達(dá)(圖12)。為了排除通過組織培養(yǎng)選擇和再生所誘導(dǎo)的潛在倍性變化，通過流式細(xì)胞儀分析3個(gè)T₀gPsASGR-BBML品系(圖13A)。所有3個(gè)品系均表現(xiàn)為維持四倍體倍性水平。

作為設(shè)置為系g11a和g52的低發(fā)芽率和低種子的結(jié)果，胚拯救被用于授粉后10-15天的發(fā)育種子和不發(fā)芽成熟的種子，以便于從3系中恢復(fù)子代。通過流式細(xì)胞術(shù)分析的種子顯示出減數(shù)分裂的子代的生產(chǎn)(圖14)。

給紅色I(xiàn)A4X植物授粉，所述植物是含有顯性等位基因Rpl的有性四倍體品系，所述等位基因提供了在中脈和葉鞘中的深紅色色素沉淀(W.W.Hanna,G.W.Burton,J Hered.83:386-388(1992))，在多個(gè)頭部和天數(shù)被用于部分地補(bǔ)償所述轉(zhuǎn)基因品系的潛在花粉不育。植物g11a放置了總共9個(gè)種子，兩個(gè)幸存的子代在溫室中種植。植物g52放置了97個(gè)種子，31個(gè)幸存的子代在溫室中種植。植物g3f放置了數(shù)百個(gè)種子，其中194個(gè)是隨機(jī)抽取餓，107個(gè)幸存的在溫室中種植。

所有子代進(jìn)行分析覆蓋gPsASGR-BBML開放閱讀框的一個(gè)3,694bp擴(kuò)增子的遺傳，所述閱讀框從起始密碼子下游5個(gè)堿基對(duì)開始和擴(kuò)增到3'非編碼區(qū)(ORF擴(kuò)增子)。這兩個(gè)g11a的子代沒有表現(xiàn)出轉(zhuǎn)基因的遺傳。所有的g52子代顯示中脈的紅色色素沉淀；這些都是衍生自具有紅色I(xiàn)A4X花粉的g52有性胚囊的授粉。所述子代植物中的9個(gè)具有至少一個(gè)ORF擴(kuò)增子的拷貝。所述g3f子代植物具有綠色和紅色色素沉淀混合的中脈。26個(gè)g3f子代植物具有至少一個(gè)ORF擴(kuò)增子的拷貝。

來自品系g52的所有子代植物測(cè)定孤雌繁殖(表4，圖15B)，其表明了僅遺傳ORF擴(kuò)增子的子代在開花后2天顯示孤雌繁殖。在來自沒有遺傳ORF擴(kuò)增子的21個(gè)g52子代的791個(gè)結(jié)構(gòu)化成熟性胚囊中，沒有胚胎形成被識(shí)別。在來自遺傳ORF擴(kuò)增子的9個(gè)g52子代的90個(gè)性胚囊顯示胚胎發(fā)育和極核。在多種g52子代中，表示胚胎發(fā)育的胚珠百分比是介于從12％至53％。

從g3f品系產(chǎn)生的子代植物的一個(gè)子集被測(cè)定孤雌繁殖(表5，圖15C)。在來自沒有遺傳ORF擴(kuò)增子的28個(gè)g3f子代的總數(shù)951個(gè)結(jié)構(gòu)化成熟性胚囊中，沒有胚胎形成被識(shí)別。26個(gè)遺傳ORF擴(kuò)增子的子代中的3個(gè)在孤雌繁殖評(píng)價(jià)中是不可用的，因?yàn)樗鼈儧]有花。剩下的23個(gè)遺傳ORF擴(kuò)增子的子代中，19個(gè)顯示孤雌繁殖，和4個(gè)沒有顯示孤雌繁殖。觀察到胚胎發(fā)育的結(jié)構(gòu)化成熟胚囊的百分比范圍為從1‰至52‰的顯示孤雌繁殖的各種g3f子代。在攜帶該轉(zhuǎn)基因但是不顯示孤雌繁殖的4個(gè)子代中，植物123，144和159通過RT-PCR分析測(cè)定轉(zhuǎn)基因的表達(dá)(圖16)。在所有的3個(gè)子代中，在開花當(dāng)天在未授粉的子房中檢測(cè)gPsASGR-BBML表達(dá)。在植物123，144和159中，2個(gè)從5'非編碼區(qū)至3'非編碼區(qū)覆蓋gPsASGR-BBML cDNA轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因特異性擴(kuò)增子被測(cè)序，伴隨著也顯示孤雌繁殖的植物105。所有的序列被認(rèn)為是相同于衍生自BC₇和BC₈無融合生殖植物的PsASGR-BBM cDNA序列。

由于g3f子代是紅色和綠色色素沉淀混合的中脈，綠色表型的倍性水平的測(cè)定是必需的(表6)。經(jīng)由流式細(xì)胞術(shù)，使用高粱作為染色體組大小的參考，6個(gè)子代均在染色體組大小中如被分析的二倍體/雙單倍體(圖13B-C)。通過與預(yù)測(cè)二倍體/雙單倍體和四倍體子代混合以產(chǎn)生3個(gè)峰(圖13D)，二倍體/雙單倍體子代被進(jìn)一步證實(shí)。所有6個(gè)單倍體子代攜帶ORF擴(kuò)增子；所述花的4個(gè)單倍體子代，所有均顯示孤雌繁殖(圖15C)。使用RNAi-BBM-3p構(gòu)建體的RNAi基因敲減方法，在無融合生殖Fi轉(zhuǎn)基因品系中評(píng)估PsASGR-BBML在無融合生殖發(fā)育中的作用。因?yàn)镻.squamulatum的直接轉(zhuǎn)化和無融合生殖再生是不可能的，用于產(chǎn)生具有PsASGR-BBML減數(shù)表達(dá)的無融合生殖Fi植物的可替代方法和篩選方案被使用。經(jīng)過篩選，3個(gè)植物，其中每一個(gè)是由不同的品系衍生的，基于在授粉當(dāng)天的PsASGR-BBML表達(dá)的半定量分析，具有ASGR+/RNAi+的基因型顯示減少的PsASGR-BBML基因表達(dá)(表7，圖17)，相比于ASGR+/RNAi-對(duì)照基因型。發(fā)現(xiàn)3個(gè)PsASGR-BBML減少表達(dá)的Fi植物含有與對(duì)照植物相同的具有無孢子生殖胚囊形成的胚珠的百分比(表7)。然后用紅IA4X花粉將植物授粉，并且基于缺乏紅色色素沉淀的中脈和均勻的表型而發(fā)現(xiàn)子代是衍生自無融合生殖的。然而，組織學(xué)觀察表明，在開花后2天顯示孤雌繁殖胚胎發(fā)育的子房數(shù)量和在那些胚胎中細(xì)胞數(shù)量是在PsASGRBBML減少的表達(dá)品系中顯著減少的(表7，圖18)。

攜帶gPsASGR-BBML轉(zhuǎn)基因和產(chǎn)生與授粉無關(guān)的胚胎形成和二倍體/雙單倍體子代，稍微低外顯率的有性轉(zhuǎn)基因品系分析，表明單獨(dú)的PsASGR-BBML基因能夠促進(jìn)性四倍體珍珠小米的孤雌繁殖，盡管所述珍珠小米是通常不顯示此特征的植物。沒有T₀品系或來自T₀品系的子代表現(xiàn)出此特征的完全外顯率；在原始T₀品系和品系g3f和g52子代范圍內(nèi)，這個(gè)不完全外顯率可能是由于轉(zhuǎn)基因分離，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平，和/或與PsASGRBBML相互作用的未知遺傳因素。盡管在沒有表現(xiàn)出孤雌繁殖的子代中沒有識(shí)別轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的定量是困難的，由于在結(jié)構(gòu)化成熟性胚囊的百分比的變化和無法驗(yàn)證RNA是從處于相同發(fā)育階段的子房提取的。含有g(shù)PsASGR-BBML轉(zhuǎn)基因的單份拷貝或使用特定卵細(xì)胞啟動(dòng)子的具有不同表達(dá)水平的gPsASGRBBML轉(zhuǎn)基因表達(dá)的自交品系產(chǎn)生將是有益于確認(rèn)這些問題的。

倍性水平?jīng)]有發(fā)現(xiàn)對(duì)PsASGR-BBML轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)孤雌繁殖是至關(guān)重要的，因?yàn)閺膅3f產(chǎn)生的4個(gè)染色體減少二倍體/雙單倍體子代顯示出孤雌繁殖水平與未減數(shù)四倍體子代相類似的范圍。雖然大多數(shù)天然無融合生殖是多倍體，來自幾個(gè)物種的自然種群和實(shí)驗(yàn)恢復(fù)的無融合生殖二倍體/雙單倍體已經(jīng)被識(shí)別。例如，多倍體無融合生殖植物可以產(chǎn)生二倍體/雙單倍體子代，或通過不完全減數(shù)分裂和孤雌繁殖基因位點(diǎn)的遺傳分離((R.D.Noyes,J.D.Wagner,American Journal of Botany 101:1-10(2014))，或通過攜帶無融合生殖基因座的減數(shù)卵細(xì)胞的孤雌繁殖發(fā)育(M.Dujardin,W.W.Hanna,Theor Appl Genet 72:33-36(1986))。

顯示PsASGRBBML完全基因敲減的Fi無孢子生殖轉(zhuǎn)基因品系的缺乏妨礙了確定PsASGR-BBML是否是在植物程序中誘導(dǎo)孤雌繁殖所需的唯一基因，其中所述程序是用于通過ASGR遺傳的無融合生殖途徑。然而，考慮到在開花后2天表示孤雌繁殖胚胎發(fā)育的子房數(shù)和在那些胚胎中的細(xì)胞數(shù)量是在FiPsASGR-BBML-減數(shù)-表達(dá)品系中顯著減少的，PsASGRBBML顯然是無融合生殖的生殖通路中孤雌繁殖的一個(gè)重要角色。

雖然AP2轉(zhuǎn)錄因子的BBM狀進(jìn)化枝成員已經(jīng)注意到在體細(xì)胞胚胎發(fā)生和細(xì)胞增殖中的作用，這些結(jié)果首次揭示了在孤雌繁殖中PsASGRBBML的作用。值得注意的是，與更遠(yuǎn)親物種稻米相比，玉米和高粱均沒有更關(guān)聯(lián)與PsASGR-BBML的PsASGR-BBML蛋白。因此，這種新發(fā)現(xiàn)的作用可以具有關(guān)于基因工程無融合生殖到作物物種中能力的一個(gè)主要影響。這種技術(shù)因此也可以被用作單倍體誘導(dǎo)的替代方法以便于迅速的獲得進(jìn)行繁殖的純合品系。

表4.在開花后2天來自g52子代的清潔子房中孤雌繁殖的可視化確定。

*在不同的天數(shù)從2個(gè)頭部收集的組合的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析

表5.在開花后2天來自g3f子代的清潔子房中孤雌繁殖的可視化確定。

N/A＝植物沒有開花或收集的子房在-50處理之外不包含>15個(gè)結(jié)構(gòu)化成熟性胚囊。

*來自兩個(gè)獨(dú)立收集的頭部相組合的數(shù)據(jù)。

⁰具有沒有顯示預(yù)期的孤雌繁殖的gASGR-BBM轉(zhuǎn)基因植物。

具有2倍倍性水平的植物。

表6.或通過流式細(xì)胞儀或根尖染色體計(jì)數(shù)而確定具有綠色色素沉著的中脈的g3f子代的倍性水平。

*由染色體根尖數(shù)確定的倍性水平。

表7.來自選擇的Fi RNAi植物的PsASGR-BBML表達(dá)和胚胎發(fā)育的分析。

實(shí)施例6

包含gPsASGR-BBML的轉(zhuǎn)基因水稻品系

在珍珠小米轉(zhuǎn)化中使用的染色體組PsASGR-BBM構(gòu)建體，在對(duì)pCambial300的多重克隆位點(diǎn)使用酶類，為了水稻的轉(zhuǎn)化而轉(zhuǎn)移所述構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包括了3,540bp的編碼區(qū)(外顯子：內(nèi)含子)上游的一個(gè)2074bp的ASGR-BBM啟動(dòng)子(p208)(含有一個(gè)6個(gè)殘基GGATCC BamHI限制位點(diǎn)序列)加上610bp的3'非編碼區(qū)以及駐留在藍(lán)色腳本質(zhì)粒中(Oryza sativa Japonicacv.Nipponbare)?；赑CR分析，16個(gè)不同的水稻品系被發(fā)現(xiàn)含有PsASGR-BBM的完整編碼區(qū)構(gòu)造體。從水稻種子發(fā)育的4個(gè)不同品系中分離RNA，并且PsASGR-BBM轉(zhuǎn)基因的表達(dá)是由非定量RT-PCR測(cè)定的。所有的4個(gè)品系顯示PsASGR-BBM轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。使用～5個(gè)解剖的發(fā)育水稻胚胎的流式細(xì)胞儀被用于確定單倍體(1n/1c)子代是否是從攜帶PsASGR-BBM轉(zhuǎn)基因的水稻轉(zhuǎn)基因品系產(chǎn)生(圖19)。高粱被用作樣品的對(duì)照?；谶@個(gè)分析，8個(gè)品系顯示出單倍體子代的生產(chǎn)。

實(shí)施例7

玉米和其他農(nóng)作物中的單倍體誘導(dǎo)

本發(fā)明可以被用作用于在玉米和其他谷物中單倍體誘導(dǎo)的替代方法。當(dāng)用作授粉者時(shí)，玉米的特定品系已經(jīng)被識(shí)別，導(dǎo)致來自母本種子的單倍體子代的低(2-8％)頻率恢復(fù)(Chang M.and Coe E.H.,“Doubled haploids,”ppl27-142,inMolecular Genetic Approaches to Maize Improvement,Kritz A.L.and Larkins B,Eds,Springer)。這些品系在北美和歐洲的商業(yè)玉米育種計(jì)劃中被廣泛的應(yīng)用。

在育種中單倍體誘導(dǎo)的優(yōu)點(diǎn)是，一旦染色體數(shù)目是從單倍體加倍到二倍體，不同的基因組合可以被固定在每個(gè)品系中。這種純合自交品系的快速恢復(fù)允許自交親本的選擇，其可以生成高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的雜交種。玉米的多個(gè)誘導(dǎo)品系已經(jīng)被識(shí)別，和至少一種報(bào)告的單倍體誘導(dǎo)機(jī)制是染色體消除(Zhang Z.et al.,Plant Cell Reports 27:1851-1860(2008))。授粉后染色體消除更可能導(dǎo)致雄性比本文所描述的發(fā)明對(duì)單倍體子代的貢獻(xiàn)，其中避免了卵細(xì)胞的受精作用。

使用本發(fā)明的單倍體誘導(dǎo)可以在除玉米之外的其它作物中應(yīng)用，其中誘導(dǎo)物品系不是已知的。如果卵細(xì)胞是從減數(shù)分裂衍生產(chǎn)物形成的和是單倍體的，任何雜合個(gè)體將在每個(gè)卵細(xì)胞中產(chǎn)生獨(dú)特的基因組合。一旦染色體通過化學(xué)處理被人為的增加了一倍，每一個(gè)獨(dú)特的個(gè)體單倍體將成為純合的和可繁殖的。通過本文描述的方法，純合的品系可以更快速的形成而用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

實(shí)施例8

在缺少授粉的情況下，ASGR-BBML的表達(dá)對(duì)誘導(dǎo)的卵細(xì)胞劃分

本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步使用是作為無融合生殖的一個(gè)組成部分。不完全減數(shù)分裂和孤雌繁殖是功能性配子體無融合生殖所必需的。不完全減數(shù)分裂可以通過影響減數(shù)分裂的突變的組合而實(shí)現(xiàn)(Crismani W.et al.,J.Exp.Bot.64:55-65(2013))，具有在大孢子中染色體非減數(shù)效益，即，是有絲分裂而不是減數(shù)分裂。假定一個(gè)配子體注定通過遺傳改變的體細(xì)胞(Grimanelli D.,Curr.Opin.Plant Biol.15:57-62(2012))也導(dǎo)致未減數(shù)的孢子樣細(xì)胞，其潛在的能夠產(chǎn)生未減數(shù)配子(卵細(xì)胞)。用任何手段形成未減數(shù)的卵細(xì)胞，ASGR-BBML的適當(dāng)時(shí)間和空間表達(dá)可以誘導(dǎo)卵細(xì)胞表現(xiàn)為受精卵和在沒有受精的情況下分裂。未減數(shù)卵細(xì)胞的分裂以形成種子胚胎部分滿足了無融合生殖的條件，只要種子的胚乳也可以完全的發(fā)育以產(chǎn)生一個(gè)可行的繁殖。

實(shí)施例9

無融合生殖在高效種子生產(chǎn)中的應(yīng)用

無融合生殖導(dǎo)致母株的子代遺傳特性。母株可以是高度雜合的，但是由于無融合生殖繞過了減數(shù)分裂，在種子衍生的子代中沒有性狀的分離。無融合生殖可以被用于在雜交作物中更有效地雜交種子生產(chǎn)，如玉米等，而消除了對(duì)在隔離生長(zhǎng)中使用分離的父本和母本以產(chǎn)生雜交種子的需求。無融合生殖也可以被用于雜合作物種子的孤雌繁殖，所述雜合作物如土豆等，其通常是通過塊莖，器官而無融合生殖的，所述器官可以攜帶和跨代傳播疾病的。無融合生殖還可以促進(jìn)作物中雜交種的發(fā)育，其中由于缺乏可以在商業(yè)規(guī)模上容易雜交的親本品系，雜交種目前無法應(yīng)用。無融合生殖可以被用作育種工具以增加和測(cè)試大量經(jīng)由有性生殖所產(chǎn)生的但是通過無融合生殖增加的新的雜交種。本發(fā)明，即未受精的卵細(xì)胞發(fā)育成胚胎，是無融合生殖或通過種子的克隆繁殖的一個(gè)重要組成部分。

在上面描述的各種方法和技術(shù)提供了實(shí)施本發(fā)明的多種方式。當(dāng)然，可以理解的是，根據(jù)本文描述的任何特定實(shí)施方案，不需要實(shí)現(xiàn)所描述的所有目標(biāo)或優(yōu)點(diǎn)。因此，例如，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，這些方法可以以如下的方式實(shí)施，所述方式是獲得或優(yōu)選如本文所教導(dǎo)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)或一群優(yōu)點(diǎn)而沒有必要獲得如本文所教導(dǎo)或建議的其它目的或優(yōu)點(diǎn)。各種替代方式在本文中被提及。應(yīng)該理解的是，一些優(yōu)選的實(shí)施方案具體的包括一個(gè)，另一個(gè)，或若干個(gè)特征，而其它具體的排除一個(gè)，另一個(gè)，或若干個(gè)特征，而仍然其它通過包含一個(gè)，另一個(gè)，或若干個(gè)有益的特征以減輕特定的特征。

此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到來自不同實(shí)施方案的各種特征的適用性。類似地，以上所討論的各種要素，特征或步驟，以及每一類這些要素，特征或步驟的其它已知等價(jià)物，可以由在本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員按照本文所描述的原理實(shí)施的方法以各種組合而應(yīng)用。在不同的實(shí)施方案中，各種要素，特征和步驟中的某些將被明確的包括和其它被特異的排除。

雖然本申請(qǐng)已經(jīng)在某些實(shí)施方案和實(shí)施例的上下文中被公開，應(yīng)當(dāng)被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的是，本申請(qǐng)的實(shí)施方案延伸超出具體公開的實(shí)施方案到其它替代實(shí)施方案和/或應(yīng)用和修改及其等同物。

在一些實(shí)施方案中，表示成分?jǐn)?shù)量、特性的數(shù)字，例如分子量，反應(yīng)條件等，用于描述和宣稱本申請(qǐng)的某些實(shí)施方案，在某些情況下應(yīng)被理解為被術(shù)語(yǔ)“約”所修飾。因此，在一些實(shí)施方案中，在書面的說明書和所附的權(quán)利要求書中陳述的數(shù)值參數(shù)是近似值，其可以取決于通過特定實(shí)施方式力求獲得的所需性質(zhì)而變化。在一些實(shí)施方案中，所述數(shù)值參數(shù)應(yīng)該根據(jù)所報(bào)道的顯著數(shù)字的數(shù)目和通過應(yīng)用普通的四舍五入技術(shù)而解釋。盡管在本申請(qǐng)的一些實(shí)施方案中列出廣泛范圍的數(shù)值和參數(shù)是近似值，在具體實(shí)施例中列出的數(shù)值是被盡可能精確地執(zhí)行。

在一些實(shí)施方案中，在描述本申請(qǐng)一個(gè)具體實(shí)施方案的上下文中使用的術(shù)語(yǔ)“一”和“一個(gè)”和“該”和類似物(特別是在某些以下權(quán)利要求的上下文中)可以被解釋為涵蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)。本文數(shù)值的范圍敘述是僅意欲于用作對(duì)落入在該范圍內(nèi)的每一個(gè)單獨(dú)數(shù)值分別提及的速記方法。除非本文另有說明，每個(gè)單獨(dú)的數(shù)值被結(jié)合到本說明書中，就好像它是在本文中單獨(dú)列舉的。本文所描述的所有方法可以以任何合適的順序進(jìn)行，除非本文另有說明或另外與上下文有明顯的矛盾。提供給相對(duì)于本文某些實(shí)施方案的任何和所有實(shí)施例，或示例性語(yǔ)言(例如，“如”)的應(yīng)用，僅僅是意欲更好地說明本申請(qǐng)，并且不造成對(duì)所要求的其它的本申請(qǐng)范圍的限制。說明書中的語(yǔ)言不應(yīng)當(dāng)被解釋為表示本申請(qǐng)實(shí)施所必須的任何非要求保護(hù)的元素。

本申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施方式在本文中被描述，其包括用于實(shí)施本申請(qǐng)的發(fā)明人已知的最佳模式。在閱讀前面的描述后，這些優(yōu)選實(shí)施方案的變體將變得對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是顯而易見的?？梢灶A(yù)期的是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)?shù)氖褂眠@樣的變體，并且本申請(qǐng)可以以本文具體描述之外的其它方式來實(shí)施。因此，本申請(qǐng)的許多實(shí)施方案包括由適用的法律所允許的所附權(quán)利要求書中列舉主題的所有修改和等同物。此外，在其所有可能變體中上述要素的任何組合是被本申請(qǐng)所包括的，除非本文另有說明或另外與上下文有明顯矛盾。

所有的專利，專利申請(qǐng)，專利申請(qǐng)出版物和其他材料，如文章，書籍，說明書，出版物，文件，事物和/或類似物，本文的參考文獻(xiàn)因此為了所有的目的通過引用而以全文并入本文，除非與此相關(guān)的任何起訴提交歷史，任何與本申請(qǐng)文件不符合或相沖突的，或任何可能對(duì)現(xiàn)在或以后與本申請(qǐng)文件相關(guān)的權(quán)利要求書的最廣泛范圍具有限制影響的。通過舉例的方式，在與任何摻入物質(zhì)相關(guān)的描述，定義和/或術(shù)語(yǔ)應(yīng)用與本申請(qǐng)文件相關(guān)部分之間可能存在任何不一致或沖突，以在本申請(qǐng)文件中描述，定義和/或術(shù)語(yǔ)應(yīng)用為準(zhǔn)。

最后，應(yīng)該理解的是，本文所描述的本申請(qǐng)的實(shí)施方案是對(duì)本申請(qǐng)實(shí)施方案原理的說明?？梢允褂玫钠渌薷目梢允窃诒旧暾?qǐng)的范圍內(nèi)。因此，以舉例的方式，但不是限制性的，本申請(qǐng)實(shí)施方案的替代性配置可以根據(jù)本文的教導(dǎo)而應(yīng)用。因此，本申請(qǐng)的實(shí)施方案是不限于精確的如顯示和描述的實(shí)施方案。